JPH0892291A - Ｐｒｌｔｓ蛋白質およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】肺癌、肝癌および大腸癌における染色体上の共
通欠失領域に存在する新規蛋白質をコードする遺伝子、
該遺伝子がコードする蛋白質（ＰＲＬＴＳ蛋白質）、ま
たは該蛋白質と結合する抗体を用いた癌の診断方法等を
提供することにある。 【構成】ヒト第８番染色体について、詳細な遺伝子地図
を作製して、肺癌、肝癌および大腸癌の組織の染色体を
解析し、新規蛋白質をコードする遺伝子をクローニング
し構造決定した。該遺伝子由来のＤＮＡプローブを用い
て遺伝子解析を行った結果、肺癌、肝癌および大腸癌組
織に遺伝子変異を確認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＰＲＬＴＳ蛋白質、それ
をコードする遺伝子ＤＮＡおよび該ＤＮＡを用いる遺伝
子解析法に関し、医薬の分野で利用される。

【０００２】

【従来の技術】癌の発症には細胞の蛋白質の変異が重要
な役割を演ずるという考え方は古くから知られている。
近年の遺伝子工学の発達は特定蛋白質をコードする遺伝
子ＤＮＡの増幅や癌細胞における遺伝子変異の解析を可
能にし、癌研究の分野においても飛躍的な発展をもたら
した。これまでに細胞の癌化、癌細胞の異常増殖に関与
すると考えられている蛋白質をコードする遺伝子（癌遺
伝子）の解析、同定が進み、その数は数十に及んでい
る。一方これと反対に作用するもの（癌抑制遺伝子）が
ここ数年脚光を浴びており、これまでに癌抑制遺伝子と
して、網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子（Friend,S.H.et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9095, 1987)、大腸
癌のｐ５３遺伝子（Lane,D.P. et al., Nature, 278, 2
61, 1979) およびＡＰＣ遺伝子( Kenneth,W.K., et al,
Science 253, 661, 1991)、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺
伝子(Call,K.M. et al., Cell, 60, 509, 1990) などが
発見されており、 ｐ５３遺伝子の場合には、変異遺伝子
を家系を通じて伝えている例がある（”Li-Fraumeni 症
候群”(Makin, D. et al, Science 250, 1233, 1990; S
rivastava,S. et al, Nature348, 747, 1990 ) ）こと
が知られている。また、癌の発生、進展悪性化、転移な
どには一つの遺伝子の異常だけでなく複数の遺伝子の異
常が関与していることが次第に明らかになりつつあり、
さらに多くの未同定の癌遺伝子、癌抑制遺伝子が存在す
るものと考えられている。それらの発見、解明は研究、
臨床の専門家はもとより全世界の人々から期待されてい
るところである。

【０００３】ヒト第８番染色体上には約４５００個の遺
伝子が存在すると推測されており、これまでに Langer-
Gideorn 症候群、Werner 症候群、色素性網膜炎などの
遺伝病の原因遺伝子の存在が示唆されている。すでに本
発明者らおよびその他の研究者らは同じくヒト第８番染
色体短腕上に肺癌(Ohata H. et al., Genes Chromosome
s & Cancer 7, 85-88, 1993)、肝癌(Emi M.et al.,Gene
s Chromosomes & Cancer 7, 152-157, 1993)、大腸癌(F
ujiwara Y. et al., Cancer Res. 53, 1172-1174, 199
3) のほか前立腺癌（Bererheim U.et al., Genes Chrom
osomes & Cancer3, 215-220, 1991 ）、膀胱癌（Knowle
s M.A.et al ,Oncogene 8, 1357-1364,1993）などを含
む多くの癌において高頻度に欠失している部位があり、
従ってこの欠失部位に様々な癌に関与する重要な癌抑制
遺伝子の存在が予測されることを示している(Emi M.et
al., Cancer Res. 52, 5368-5372, 1992) 。このためこ
の部位に存在する原因遺伝子を単離し、蛋白質を同定す
ることは、今や世界中の医師や研究者のみならず一般の
人々にとっても重要な問題として期待されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、肺
癌、肝癌、大腸癌および前立腺癌その他の癌に関わる新
規な蛋白質と、それをコードする遺伝子、さらにそれら
を用いた癌の検査方法、診断方法等を提供することにあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト第８
番染色体短腕における肺癌、肝癌および大腸癌での共通
欠失領域をさらに限局化した。すなわち、ヒト第８番染
色体のＤＮＡ断片を導入したコスミド・クローンを多数
作成し、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法（Ｆ
ＩＳＨ法；Inazawa etal., Genomics, 10, 1075-1078,
1991 ）によって染色体上での存在位置を決定した。こ
れらのマーカーの中から、個体によって制限酵素断片の
長さが異なる性質（ＲＦＬＰ：Restriction Fragment L
ength Polymorphism：制限酵素断片長多型）を持つも
の、すなわちＲＦＬＰマーカーを選び出した。

【０００６】ＲＦＬＰマーカーは、これを用いることに
よって両親から受け継いだ２本の相同染色体を多型性の
差により識別できる（ただし、両方が同じ多型パターン
を示す場合には識別できない： not informative ）と
いう特徴を有している。この２本の相同染色体の多型性
パターンの差（ヘテロ接合性）が、正常組織で存在し、
癌組織で消失している現象（ＬＯＨ：loss of heterozy
gosity) が検出されることは、片方の染色体でそのＲＦ
ＬＰマーカー部位が欠失していることを意味する。また
一般的に、一対の染色体のうち一方の欠失と他方の変異
などによる両方の染色体上の癌抑制遺伝子の不活化が癌
化につながるものと考えられており、多くの癌に共通し
て欠失している領域に癌抑制遺伝子が存在しているもの
と考えられている。本発明者らは、このようにして得た
詳細な染色体地図とＲＦＬＰマーカーを使用して、約１
００例の肝細胞癌、約１２０例の大腸癌および約５０例
の非小細胞肺癌について第８番染色体短腕のＬＯＨを調
べた結果、これらに共通する最も限局化された欠失領域
が明らかとなった。肝癌（ＨＣＣ,Human Hepatocellula
r Carcinoma ）および肺癌（ＬＣ,Lung Cancer）におけ
る第８番染色体染色体短腕の部分的欠失を図１に示し
た。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持
を表している。大腸癌（ＣＲＣ,Colorectal Cancer) に
おける第８番染色体染色体短腕の部分的欠失を図２に示
した。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保
持を表している。プローブとした各コスミドのクローン
名と、決定された染色体上の位置およびＬＯＨについて
の一覧を表１に示した。

【０００７】

【表１】

【０００８】これらの領域は互いに一致しており、共通
する最も限局化された欠失領域（８ｐ２１．３〜８ｐ２
２）をカバーする２つのＹＡＣクローン（Ｙ７３８、Ｙ
８１２）を単離した（図３）。このＹＡＣのＤＮＡをコ
スミドにサブクローニングすることにより共通欠失領域
をカバーするコスミドコンティグを構築した。これらの
コスミドからエクソンアンプリフィケーション法により
エクソンとなりうるＤＮＡ断片を選び出した。次いで、
そのＤＮＡ断片をプローブとしてｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることにより、共通欠失領域に存在
する遺伝子に由来する複数のｃＤＮＡクローンを得た。
これらのｃＤＮＡクローンをプローブとして、腫瘍組織
特異的な遺伝子再構成が検出されるか否かをサザンブロ
ット解析によって調べた結果、1 個のｃＤＮＡクローン
をプローブとしてもちいたとき、１例の肺非小細胞癌に
おいて明らかな遺伝子再構成が認められた。このクロー
ンはＰＤＧＦ（Platelet Derived Growth Factor, 血小
板由来増殖因子）レセプターb （ＰＤＧＦＲ−b ）（Ya
rden Y. et al., Nature 323, 226-232, 1986 ）および
fms-like tyrosine kinase （ｆｌｔ）（Shibuya M. e
t al., Oncogene 5, 519-524, 1990）のＮ末端ドメイン
（細胞外ドメイン）と有意な類似を示す新規な蛋白質を
コードしていた。この蛋白質をＰＲＬＴＳ（PDGF recep
tor beta-like tumor suppressor）蛋白質と名付けた。
本遺伝子のコーディング領域の塩基配列について肝細胞
癌、肺非小細胞癌、大腸癌について変異の有無を調べた
ところ、３例の明らかな遺伝子変異が同定された。これ
らのことから、本蛋白質の欠損や異常およびこれをコー
ドする遺伝子ＤＮＡの欠失や変異が肝細胞癌、肺非小細
胞癌を含む多くの癌の進展に深く関与していることが明
らかとなった。

【０００９】本発明は、例えば本蛋白質の欠損や異常の
有無あるいはそれをコードする遺伝子の欠失や変異の有
無を調べることによって、少なくとも肝細胞癌、肺非小
細胞癌、大腸癌のリスク診断、早期発見、経過観察、治
療方針の決定、予後の推定などの困難な問題に対する解
決方法と材料を提供し、この分野の技術を飛躍的に進歩
させ得るという点できわめて重要である。すなわち本発
明は（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部また
は一部を含むＰＲＬＴＳ蛋白質、（２）配列番号２ない
し９に記載の遺伝子ＤＮＡの全部または一部を含むＤＮ
Ａ、（３）配列番号２に記載のＤＮＡの、全部または一
部を含むベクター、およびそれを保持する形質転換体、
（４）形質転換体を用いるＰＲＬＴＳ蛋白質の製造方
法、（５）配列番号１に記載の蛋白質に結合する抗体、
（６）配列番号２ないし９に記載のＤＮＡの全部または
一部またはその相補配列を含む一本鎖ＤＮＡを使用する
ことを特徴とする遺伝子解析方法からなる。本発明の蛋
白質とＤＮＡは、アミノ酸または塩基を１もしくは複数
個、付加、欠失もしくは置換された実質的に同等なもの
も本発明に含まれる。

【００１０】本発明のＤＮＡの全部またはその一部また
はその相補配列を含む一本鎖ＤＮＡをプライマーまたは
プローブとして用いることにより、遺伝子解析、診断に
利用することができる。「一部」とは、プライマーまた
はプローブとして使用するオリゴヌクレオチドが本発明
のＤＮＡ配列をもとに少なくとも約６個の対応する塩基
配列からなり、好ましくは少なくとも約８個の塩基配
列、さらに好ましくは約１０〜１２個の、さらに好まし
くは約１５〜２５個の塩基配列からなる対応するポリヌ
クレオチドを意味する。このＤＮＡがコードするＰＲＬ
ＴＳ蛋白質は全部または一部をエピトープとして用い
て、抗体の作成およびその抗体を用いる研究用、診断用
試薬として利用することができる。「エピトープ」と
は、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、６個のアミノ
酸で構成されるポリペプチドが抗体と結合することは公
知である（公表特許公報60-500684 号）。ＰＲＬＴＳ蛋
白質の一部とは、本発明のＰＲＬＴＳ蛋白質のアミノ酸
配列に基づいて、連続してなる少なくとも６個のアミノ
酸、好ましくは少なくとも約８〜１０個のアミノ酸、さ
らに好ましくは、少なくとも約１１〜２０個のアミノ酸
からなるポリペプチドを意味する。また約２０個以上の
アミノ酸からなるポリペプチドであっても使用できるこ
とは言うまでもない。

【００１１】以下に本発明を詳細に説明する。 （１）ｃＤＮＡクローンの単離 ヒト第８番染色体のコスミド・クローンは、例えばヒト
第８番染色体だけを含むヒト−マウスの雑種細胞から染
色体ＤＮＡを抽出し、時野らの報告した方法(Tokino et
al., Am.J.Hum.Genet., 48, 258-268, 1991) により、
その染色体ＤＮＡ断片をｐＷＥＸ１５などのベクターに
組み込むことにより作成することができる。この中か
ら、全ヒトＤＮＡをプローブとしてコロニーハイブリダ
イゼーションを行って、ヒト染色体由来の挿入配列（イ
ンサート）を持つクローンを選び出すことができる。こ
うして得られるヒト第８番染色体由来ＤＮＡを含む多数
のコスミド・クローンについて、ＦＩＳＨ法により、染
色体上の位置を決定してマーカーとし、詳細な物理的染
色体地図を作成することができる。また、制限酵素を用
いて切断した断片長のパターンからＲＦＬＰマーカーを
選別することができる（Nakamura etal., Am.J.Hum.Gen
et.43, 854-859,1988) 。この地図とＲＦＬＰマーカー
を利用して癌患者癌組織のＤＮＡについてＬＯＨ（ヘテ
ロ接合性の消失）を調べ、癌組織における染色体上の共
通欠失領域を第８番染色体のｐ２１．３〜２２付近のき
わめて小さい領域に限局化することができる。この領域
のゲノムＤＮＡを有するＹＡＣクローンを選び出し、次
いでこのＹＡＣクローンのＤＮＡをもとにコスミドライ
ブラリーを作製し、この限局化された共通欠失領域のコ
スミド・コンティグを構築することができる。さらにコ
スミド・クローンの制限酵素断片からエクソンアンプリ
フィケーション法（Buckler etal, Proc.Natl.Acad Sc
i.USA, 88, 4005-4009, 1991）によってエクソンとなり
うる配列を有するＤＮＡ断片を選び出すことができる。
このようにして得られたＤＮＡ断片をプローブとしてｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、
ヒト第８番染色体のｐ２１．３〜２２付近の限局化され
た領域に存在する遺伝子のｃＤＮＡをクローニングする
ことができる。これらのｃＤＮＡのうち、癌組織特異的
な遺伝子再構成に含まれている配列を有するクローンを
サザンブロット解析により選択することができる。ｃＤ
ＮＡの塩基配列は常法に従って決定することができる
（Maniatis,J. et al. Molecular Cloning 2nd.ed., Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.1989)。この
ようにして得られた遺伝子ＤＮＡのクローンは、その配
列についてのＳＳＣＰ法( Orita,M. et al, Genomics,
5, 874-879, 1984 )( Orita,M. et al. Cell, 60, 509-
520, 1990 ) 、RNase Protection法( Winter, E., Peru
cho,M. etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575-
7579, 1985 )( Myers,R.M., et al. Science, 230, 124
2-1246, 1985 ) などを用いた癌患者での異常の有無、
異常の出現頻度の検索により、目的の原因遺伝子のクロ
ーンであることを確かめることができる。

【００１２】（２）遺伝子の全構造の確認 上記の方法により得られるｃＤＮＡは、配列番号２の新
規なＤＮＡ配列であることが確認され、それがコードす
る新規な蛋白質のアミノ酸配列は配列番号１の如く演繹
された。本発明者らは、配列番号１で示される配列の全
部または一部を含む蛋白質をＰＲＬＴＳ蛋白質と命名
し、以下ＰＲＬＴＳ蛋白質と記載する。さらにゲノムＤ
ＮＡの塩基配列を解析し、ｃＤＮＡの塩基配列と比較す
ることによって、イントロン−エクソン結合部を確認し
て、イントロン／エクソンを含む配列番号３、４、５、
６、７、８および９の構造を明らかした。

【００１３】（３）組換え発現ベクターとその形質転換
体 上記記載の方法により得られたヒトＰＲＬＴＳ蛋白質を
コードする遺伝子ＤＮＡあるいはその断片を適切なベク
ターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入す
ることにより形質転換体を得ることができる。これを常
法により培養し培養物よりヒトＰＲＬＴＳ蛋白質を大量
に生産することができる。さらに具体的には、ヒトＰＲ
ＬＴＳ蛋白質をコードするＤＮＡまたはその断片を、そ
の発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵素
とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して
組換え発現ベクターを作成することができる。使用でき
るベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミドｐ
ＲＢ３２２，ｐＵＣ１８，枯草菌由来のプラスミドｐＵ
Ｂ１１０，酵母菌由来のプラスミドｐＲＢ１５，バクテ
リオファージλｇｔ１０，λｇｔ１１あるいはＳＶ４０
などが挙げられるが宿主内で複製、増幅可能なベクター
であれば特に限定されない。プロモーターおよびターミ
ネーターに関してもヒトＰＲＬＴＳ蛋白質をコードする
ＤＮＡ塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したもの
であれば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合わ
せも可能である。用いるＤＮＡはヒトＰＲＬＴＳ蛋白質
をコードするＤＮＡであれば何れでも良く、配列番号
２、３、４、５、６、７、８または９記載の塩基配列に
限定されるものではなく、意図的であるか否かにかかわ
らず塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、付加あるいは
これらが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであっ
てもよい。これらＤＮＡの調製は生物学的手法、化学的
手法などいずれを用いてもよい。

【００１４】このようにして得られた組換え発現ベクタ
ーはコンピテント細胞法（J. Mol.Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. N
atl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベク
ター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入
し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯
草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得られた形
質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養され
る。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、
必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物からのＰＲ
ＬＴＳ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精製法を適宜
組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法とし
ては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲルろ過法、電気泳動法、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどが挙
げられる。

【００１５】（４）抗体の作成 抗体は、ＰＲＬＴＳ蛋白質の全部あるいは一部分を抗原
として、通常の方法で作成することができる。例えば、
ポリクローナル抗体はマウス、モルモット、ウサギ等の
動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などに複数回接種
し十分に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離し
て作製する。なお、市販のアジュバントも使用できる。
モノクローナル抗体は、例えば、ＰＲＬＴＳ蛋白質で免
疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞と
の細胞融合により得られるハイブリドーマを作成後、該
ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与
マウス腹水から調製することができる。

【００１６】抗原とするＰＲＬＴＳ蛋白質は必ずしも全
アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペ
プチド、その変異体、誘導体、あるいは他のペプチドと
の融合ペプチドであってもよく、調製法は生物学的手
法、化学合成手法いずれでもよい。これら抗体はヒト生
体試料中のＰＲＬＴＳ蛋白質の同定や定量を可能とし癌
診断試薬などに使用できる。ＰＲＬＴＳ蛋白質の免疫学
的測定法は、公知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光
抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法
においても実施できる。

【００１７】（５）ヒト癌組織の遺伝子解析 遺伝子解析される生体試料はヒト正常組織、各種ヒト癌
組織をはじめヒト血液、体液、分泌液などを用いること
ができる。ＤＮＡの抽出・調製は、たとえば佐藤ら（Sa
to T., et al. Cancer Res., 50, 7184, 1990 ）の方法
で行う。本発明により提供されるヒトＰＲＬＴＳ蛋白質
をコードする遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片をプローブと
して、または該遺伝子ＤＮＡの中から適切な位置の塩基
配列を適宜選択し、その合成オリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして用いることにより該遺伝子の変異の有無を
解析することができる。また、試料中の該遺伝子におけ
る挿入、欠失などの異常もこれらの解析により検知する
ことができる。選択する塩基配列の部位は該遺伝子のエ
クソン部分、イントロン部分あるいは両部分の結合部分
など、いずれも選択し得る。また用いる塩基配列を人為
的に改変したものを用いることができるのは言うまでも
なく、これにより対応する遺伝子変異を検出することが
できる。解析の方法としては、例えば選ばれた２種の配
列のプライマーによりＰＣＲ法で部分配列を増幅させ、
増幅産物の塩基配列を直接解析するか、あるいはこの増
幅産物を前記と同様にプラスミドに組み込み、宿主細胞
を形質転換させて培養し、得られるクローンの塩基配列
を解析することができる。あるいはまた、LigaseChain
Reaction 法(Wu et al., Genomics, 4, 560-569, 1989)
、さらに、変異配列特異的ＰＣＲ法(Ruano and Kidd,
Nucleic Acid Research, 17, 8392, 1989) 、(C.R.Newt
on et al., Nucleic Acid Research, 17, 2503-2517, 1
989) を利用することにより試料中の該遺伝子の特定の
変異の有無を直接検出することができる。また同様に、
選ばれたＤＮＡ配列あるいはこれに由来するＲＮＡ配列
を含むプローブを用いて、ＳＳＣＰ法、RNase-Protecti
on法により点突然変異の検出を行うことができる。また
これらのプローブを用いることにより、サザンハイブリ
ダイゼーション法での試料中の該遺伝子の変異の検出、
ノーザンハイブリダイゼーション法での試料中の該遺伝
子の発現量の異常を検出することができる。なお、この
ＰＲＬＴＳ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラ
スミドを保有するEscherichia coli 68cDNA は通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM B
P-4658として平成６年４月２７日寄託された。

【００１８】

【発明の効果】本発明の、ヒトＰＲＬＴＳ蛋白質および
該蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの、全部またはその
一部を含むものは、癌の研究試薬、検査・診断試薬およ
び治療薬として期待される。

【００１９】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００２０】（実施例１）ヒト第８番染色体特異的コス
ミド・クローンの単離と染色体地図の作成 時野らの方法(Tokino et al., Am.J.Hum.Genet., 48, 2
58-268, 1991) によりヒト第８番染色体特異的コスミド
クローンを単離した。すなわち、ヒト染色体のうち第８
番染色体のみを保有するヒト・マウス雑種細胞株Ａ９ｎ
ｅｏ８／ｔ（Koi et al, Jpn.J.Cancer Res. 80, 413-4
18, 1989）の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで適
度に切断し、断片の末端をｄＡＴＰとｄＧＴＰを用いた
部分的 fill in によって処理した。このうち３５〜４
２ｋｂのサイズの断片を分画し、予め制限酵素ＸｈｏＩ
で切断し同様に末端をｄＣＴＰとｄＴＴＰを用いた部分
的fill in によって処理したコスミドベクターｐＷＥ
Ｘ１５に挿入した。こうして得られたコスミド・クロー
ンの中から、３２Ｐラベルしたヒト染色体ＤＮＡをプロ
ーブとしたコロニーハイブリダイゼーション法で、ヒト
のＤＮＡ断片を含むクローンを選び出すことによってヒ
ト第８番染色体特異的コスミド・クローンを単離した。
これらのコスミド・クローンのＤＮＡ断片がハイブリダ
イズする染色体上の位置はＦＩＳＨ法(Inazawa et al.,
Genomics, 10, 1075-1078, 1991) によって決定した。
染色体上の位置を決定したコスミド・クローン（コスミ
ド・マーカー）について、ＲＦＬＰを検出しうるか否か
を、既知の方法(Nakamura et al., Am.J.Hum.Genet., 4
3, 854-859, 1988) によって検索した。制限酵素は、Ｍ
ｓｐ I，ＴａｑI，ＢｇｌII，Ｐｓｔ I，ＰｖｕII，Ｒ
ｓａ I，ＥｃｏＲ Iのいずれかを用いた。

【００２１】（実施例２）ヒト第８番染色体短腕上のコ
スミド・マーカーの座位の順序の決定 本研究者らによって（Emi M.et al., Cancer Res. 52,
5368-5372, 1992 ）発見されたヒト第８番染色体短腕上
の肝細胞癌、大腸癌、肺非小細胞癌での共通欠失領域
（８ｐ２１−８ｐ２３）をさらに絞り込むために、実施
例１で得られたこの領域の１４個の多型性を示すコスミ
ドマーカー（ＲＦＬＰマーカー）の順序を決定した（表
１）。このうち４つの座位（ＣＩ８−１９０，ＣＩ８−
２４５，ＣＩ８−４８７，ＭＳＲ−３２）の順序はすで
に本発明者らの遺伝的連鎖解析によって決定されており
（Emi et al, Genomics 15, 530-534, 1993) 、ＣＩ８
−１９０とＭＳＲ−３２の座位の間の遺伝学的距離は１
０ｃＭと見積もられた。これらを含むそれぞれのコスミ
ドマーカーの組み合わせでマルチカラーＦＩＳＨ法（In
azawa et al, Jpn.J.Cancer Res.,20, 1248-1252, 199
2; Inazawa et al, Cytogenet. Cell Genet., 65, 130-
135, 1994) をくり返し行うことによって、これらのマ
ーカーの相対的位置関係を解析した。その結果、これら
１４個のＲＦＬＰマーカー（ＣＩ８−は省略して番号の
みで示す）の順序は、セントロメア−１３０８−１０１
３−１９０−（１３１２，２４３９）−（２４５，４８
７）−１０５１−（２６４４，ＭＳＲ３５，ＭＳＲ３
２）−２０１４−２１９５−１３４４−テロメア、と決
定された。ただし、ここでは括弧でくくったマーカーの
相互の位置はこの方法では分離しなかった。

【００２２】（実施例３）肝細胞癌、肺非小細胞癌およ
び大腸癌におけるヒト第８番染色体短腕の共通欠失領域
の限局化 肝細胞癌１０２症例、肺非小細胞癌５３症例および大腸
癌１２３症例の手術材料より腫瘍組織を得た。対応する
正常組織あるいは末梢血サンプルを各々の患者より得
た。これらの組織、サンプルよりＤＮＡを既知の方法(S
ato et al., Cancer Res., 50, 7184-7189, 1990) で抽
出した。ＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、１．０％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに
０．１Ｎ−ＮａＯＨ／０．１Ｍ−ＮａＣｌでサザントラ
ンスファーした(Sato et al., CancerRes., 50, 7184-7
189, 1990) 。これらのメンブレンに対して、実施例２
で順序が決定された１４個のＲＦＬＰマーカーをプロー
ブとしてサザンハイブリダイゼーション(Sato et al.,
CancerRes., 50, 7184-7189, 1990) を行うことにより
ＬＯＨ（ヘテロ接合性の消失）を検索した（表１）。肝
細胞癌においては９３例で少なくとも１つのマーカーに
よりヘテロ接合性を識別可能(informative) であり、そ
のうち３４例（３７％）で少なくとも１つのマーカーに
よりＬＯＨが検出された。肺非小細胞癌では５６例が少
なくとも１つのマーカーについて informative であ
り、そのうち２６例（４６％）で少なくとも１つのマー
カーがＬＯＨを検出した。大腸癌では１１５例が少なく
とも１つのマーカーについて informative であり、そ
のうち６４例（５４％）で少なくとも１つのマーカーが
ＬＯＨを検出した。

【００２３】上記の結果からヒト第８番染色体短腕（８
ｐ）に部分的欠失があると判定できる例、すなわち２つ
以上のマーカーでヘテロ接合性を識別可能(informativ
e) であり、なおかつ欠失部分（ＬＯＨ検出）と保持部
分（ＬＯＨ不検出）とを示す例を集めて解析した。その
結果、肝細胞癌（ＨＣＣ）では１１例でＣＩ８−２４５
とＣＩ８−２６４４の２つのマーカー間に共通欠失領域
が限局化された（図１）。同様に、肺非小細胞癌（Ｌ
Ｃ）では１２例でＣＩ８−１０５１とＣＩ８−２６４４
の２つのマーカー間に共通欠失領域が限局化された（図
１）。大腸癌（ＣＲＣ）では２５例でＣＩ８−２４５と
ＣＩ８−２６４４の２つのマーカー間に共通欠失領域が
限局化された（図２）。これら３つの組織の癌において
欠失領域は共通しており、肺非小細胞癌では特に狭い領
域に限局化された。

【００２４】（実施例４）パルスフィールドゲル電気泳
動（ＰＦＧＥ）による物理的地図の作製 実施例３において限局化された共通欠失領域について、
この領域の１２個のＤＮＡマーカーをもちいたＰＦＧＥ
解析によって物理的地図を作製した。もちいたＤＮＡマ
ーカーのうち８個はＬＯＨの検討にもちいられた多型性
を示すコスミド・クローンである。その他の４つの非多
型マーカー（ＣＩ８−１１９５，ＣＩ８−２４２９，Ｃ
Ｉ８−２００３，ＣＩ８−１３７２）はマルチカラーＦ
ＩＳＨ法によってＣＩ８−１３１２およびｃＭＳＲ−３
２に対する相対的位置を決定した。ゲノムＤＮＡを７種
の希な切断点を持つ制限酵素で切断してＰＦＧＥにか
け、各ＤＮＡマーカーをプローブとしてサザンブロット
解析をおこなった。１２種のＤＮＡマーカーの各々によ
って同定されるゲノムＤＮＡ断片のサイズを図４にまと
めた。このＰＦＧＥマップにはギャップは認められず、
ｃＭＳＲ−３２とＣＩ８−２４２９を除くすべてのマー
カーの順序が明確となった。非小細胞肺癌に認められた
最も狭く限局化された共通欠失領域（ＣＩ８−１０５１
とＣＩ８−２６４４の間）はおよそ６００ｋｂと見積も
られた。

【００２５】（実施例５）共通欠失領域のコスミド・コ
ンティグの作製 この６００ｋｂ領域に存在する遺伝子を単離するため、
本発明者らはコスミドマーカーＣＩ８−４８からＣＩ８
−２００３にまたがるゲノム領域を含む、Ｙ８１２とＹ
７３８の２つのＹＡＣクローンを単離した（図３）。こ
の２つのＹＡＣクローンのＤＮＡをもとにコスミド・ラ
イブラリーを作製し、ヒトＤＮＡを有するクローンを７
４個得た。これら７４個のコスミドクローンのコスミド
・コンティグマップをサザンハイブリダイゼーション法
によって構築した。

【００２６】（実施例６）共通欠失領域からの遺伝子の
単離 実施例５で得られたコスミド・コンティグから共通欠失
領域全体をカバーする３４個のコスミドクローンを選
び、エクソン・アンプリフィケーション法（Buckler et
al, Proc.Natl.Acad Sci.USA, 88, 4005-4009, 1991）
によりエクソンとなりうる配列を検索した。その結果、
５４個のエクソン様ＤＮＡ断片が得られた。これらのＤ
ＮＡ断片をプローブとして胎児肺由来、または胎児脳由
来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。これに
より６種の異なったｃＤＮＡクローンが得られた。

【００２７】（実施例７）癌組織における遺伝子再構成
の検出 ６種のｃＤＮＡクローン各々をプローブとしたとき腫瘍
組織特異的遺伝子再構成が検出されるかどうかを検討し
た。すなわち、癌組織および対応する正常組織のＤＮＡ
の制限酵素（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕIIま
たはＰｓｔＩ）断片に対してこれらのｃＤＮＡクローン
のＤＮＡをプローブとしたサザンブロット解析をおこな
い、癌細胞に生じている欠失、重複、増幅、転座などの
大きな構造的遺伝子異常、いわゆる遺伝子再構成の検出
を行った。肝細胞癌１０２症例、肺非小細胞癌７０症例
および大腸癌１２３症例からなる２９５症例のＤＮＡパ
ネルについて検討した。その結果、１つのｃＤＮＡクロ
ーンをプローブとしたとき肺非小細胞癌１症例において
遺伝子再構成が検出された（図５）。腫瘍組織と正常組
織のＤＮＡのサザンブロットのパターンの比較から、こ
の遺伝子再構成は腫瘍組織特異的におこっていることが
示された。このクローンはコスミドｃＣＩ８−３０６８
由来の配列を含んでおり、ｃＣＩ８−３０６８はマルチ
カラーＦＩＳＨによりｃＣＩ８−１０５１とｃＣＩ−２
６４４の中間に位置することから前述の共通欠失領域に
由来することが確かめられた。この症例では両外側のマ
ーカーｃＣＩ８−２４５（Ｄ８Ｓ３３５）およびｃＭＳ
Ｒ−３２（ＭＳＲ）についてＬＯＨが認められているの
で、このｃＤＮＡを含む座位に”ｔｗｏ ｈｉｔ”の体
細胞変異が生じていることが明らかである。

【００２８】（実施例８）ｃＤＮＡの構造 このｃＤＮＡクローンは胎児肺ｃＤＮＡライブラリーか
ら単離され、１５０２ｂｐよりなり、６１ｂｐの５′非
翻訳領域、１１２８ｂｐのコーディング領域、３１３ｂ
ｐの３′非翻訳領域を含む新規なＤＮＡ塩基配列である
ことを確認した（配列番号２）。このｃＤＮＡ配列に含
まれるオープンリーディングフレームは、３７５アミノ
酸よりなる新規な蛋白質（ＰＲＬＴＳ蛋白質：配列番号
１）をコードしていた。

【００２９】（実施例９）染色体ＤＮＡの構造決定 エクソン周辺のゲノムＤＮＡの配列は実施例８で得られ
たｃＤＮＡと、コスミド・クローンのゲノムＤＮＡの配
列とを比較することによって７個のエクソンの存在を確
認した。各エクソンを含むゲノムＤＮＡの配列を配列番
号３、４、５、６、７、８および９に示す。これら配列
表のアミノ酸番号は、配列番号１の番号と統一させて、
ＰＲＬＴＳ蛋白質としての位置番号を示した。

【００３０】（実施例１０）腫瘍組織における遺伝子変
異の検出 肝細胞癌４８症例、肺非小細胞癌３１症例および大腸癌
２８症例のＤＮＡについて single strand conformatio
n polymorphism (SSCP) 解析( Orita,M. et al, Genomi
cs, 5, 874-879, 1984 )( Orita,M. et al. Cell, 60,
509-520, 1990) 、を行って本遺伝子の変異を検索し
た。実施例９で得られたゲノムＤＮＡ配列から設計した
ＰＣＲプライマー（配列番号１０／１１、１２／１３、
１４／１５、１６／１７、１８／１９、２０／２１）を
用いて各々のエクソンを増幅しＳＳＣＰ解析をおこなっ
た。配列番号１０−２１の塩基配列は、配列番号３−９
に基づいて合成されたもので下記の関係を有する。 配列番号10＝配列番号4、 No. 3- 24 配列番号11＝配列番号4、 No.281-300 アンチセンス 配列番号12＝配列番号5、 No. 49- 71 配列番号13＝配列番号5、 No.393-415 アンチセンス 配列番号14＝配列番号6、 No. 5- 24 配列番号15＝配列番号6、 No.207-231 アンチセンス 配列番号16＝配列番号7、 No. 34- 53 配列番号17＝配列番号7、 No.372-393 アンチセンス 配列番号18＝配列番号8、 No. 5- 24 配列番号19＝配列番号8、 No.191-211 アンチセンス 配列番号20＝配列番号9、 No. 21- 41 配列番号21＝配列番号9、 No.263-285 アンチセンス ＳＳＣＰ解析の結果電気泳動パターンに変化が認められ
たＰＣＲ産物はクローニングし塩基配列を決定した。そ
の結果、大腸癌（ＣＲＣ）１例と肝細胞癌（ＨＣＣ）１
例においてアミノ酸置換を伴う点突然変異が、肝細胞癌
（ＨＣＣ）１例において２塩基の欠失変異が見出された
（表２）。腫瘍の塩基配列を対応する正常組織の配列と
比較することにより、これらの変異が腫瘍組織のみに存
在することが確認された。

【００３１】

【表２】

【００３２】大腸癌の１症例、ＣＲＣ２０ではＣからＴ
への点突然変異の結果、コドン２３のヒスチジンからチ
ロシンへの変化がもたらされている。この症例では腫瘍
ＤＮＡの塩基配列に正常のＣを含む配列が検出されず、
対立アレルに欠失が起こっていることが示された。肝細
胞癌ＨＣＣ７４ではＣからＴへの点突然変異の結果、コ
ドン３０２のバリンからアラニンへの変化が起こってい
た。もう一例の肝細胞癌ＨＣＣ１０７ではコドン１７５
における２塩基の欠失変異によりフレームシフトが起こ
り、下流で停止コドンを生じていた。これらの症例にお
いても腫瘍細胞に対立アレルの欠失が起こっていた。

【００３３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３７５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー 配列 Met Lys Val Trp Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val His Glu Ala Leu 1 5 10 15 Glu Asp Val Thr Gly Gln His Leu Pro Lys Asn Lys Arg Pro Lys Glu 20 25 30 Pro Gly Glu Asn Arg Ile Lys Pro Thr Asn Lys Lys Val Lys Pro Lys 35 40 45 Ile Pro Lys Met Lys Asp Arg Asp Ser Ala Asn Ser Ala Pro Lys Thr 50 55 60 Gln Ser Ile Met Met Gln Val Leu Asp Lys Gly Arg Phe Gln Lys Pro 65 70 75 80 Ala Ala Thr Leu Ser Leu Leu Ala Gly Gln Thr Val Glu Leu Arg Cys 85 90 95 Lys Gly Ser Arg Ile Gly Trp Ser Tyr Pro Ala Tyr Leu Asp Thr Phe 100 105 110 Lys Asp Ser Arg Leu Ser Val Lys Gln Asn Glu Arg Tyr Gly Gln Leu 115 120 125 Thr Leu Val Asn Ser Thr Ser Ala Asp Thr Gly Glu Phe Ser Cys Trp 130 135 140 Val Gln Leu Cys Ser Gly Tyr Ile Cys Arg Lys Asp Glu Ala Lys Thr 145 150 155 160 Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Leu Phe Val Pro 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Phe Asp Val Val Tyr Leu Asn Pro Asp Arg Gln Ala 180 185 190 Val Val Pro Cys Arg Val Thr Val Leu Ser Ala Lys Val Thr Leu His 195 200 205 Arg Glu Phe Pro Ala Lys Glu Ile Pro Ala Asn Gly Thr Asp Ile Val 210 215 220 Tyr Asp Met Lys Arg Gly Phe Val Tyr Leu Gln Pro His Ser Glu His 225 230 235 240 Gln Gly Val Val Tyr Cys Arg Ala Glu Ala Gly Gly Arg Ser Gln Ile 245 250 255 Ser Val Lys Tyr Gln Leu Leu Tyr Val Ala Val Pro Ser Gly Pro Pro 260 265 270 Ser Thr Thr Ile Leu Ala Ser Ser Asn Lys Val Lys Ser Gly Asp Asp 275 280 285 Ile Ser Val Leu Cys Thr Val Leu Gly Glu Pro Asp Val Glu Val Glu 290 295 300 Phe Thr Trp Ile Phe Pro Gly Gln Lys Asp Glu Arg Pro Val Thr Ile 305 310 315 320 Gln Asp Thr Trp Arg Leu Ile His Arg Gly Leu Gly His Thr Thr Arg 325 330 335 Ile Ser Gln Ser Val Ile Thr Val Glu Asp Phe Glu Thr Ile Asp Ala 340 345 350 Gly Tyr Tyr Ile Cys Thr Ala Gln Asn Leu Gln Gly Gln Thr Thr Val 355 360 365 Ala Thr Thr Val Glu Phe Ser 370 375 。

【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：１５０２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６２．．１１８９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCTGCGTCCC CGCCCCGCNC AGCCGCCGCG CTCCTGCNCT CCGAGGTCCG AGGTTCCCGA 60 G ATG AAG GTC TGG CTG CTG CTT GGT CTT CTG CTG GTG CAC GAA GCG 106 Met Lys Val Trp Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val His Glu Ala 1 5 10 15 CTG GAG GAT GTT ACT GGC CAA CAC CTT CCC AAG AAC AAG CGT CCA AAA 154 Leu Glu Asp Val Thr Gly Gln His Leu Pro Lys Asn Lys Arg Pro Lys 20 25 30 GAA CCA GGA GAG AAT AGA ATC AAA CCT ACC AAC AAG AAG GTG AAG CCC 202 Glu Pro Gly Glu Asn Arg Ile Lys Pro Thr Asn Lys Lys Val Lys Pro 35 40 45 AAA ATT CCT AAA ATG AAG GAC AGG GAC TCA GCC AAT TCA GCA CCA AAG 250 Lys IlePro Lys Met Lys Asp Arg Asp Ser Ala Asn Ser Ala Pro Lys 50 55 60 ACG CAG TCT ATC ATG ATG CAA GTG CTG GAT AAA GGT CGC TTC CAG AAA 298 Thr Gln Ser Ile Met Met Gln Val Leu Asp Lys Gly Arg Phe Gln Lys 65 70 75 CCC GCC GCT ACC CTG AGT CTG CTG GCG GGG CAA ACT GTA GAG CTT CGA 346 Pro Ala Ala Thr Leu Ser Leu Leu Ala Gly Gln Thr Val Glu Leu Arg 80 85 90 95 TGT AAA GGG AGT AGA ATT GGG TGG AGC TAC CCT GCG TAT CTG GAC ACC 394 Cys Lys Gly Ser Arg Ile Gly Trp Ser Tyr Pro Ala Tyr Leu Asp Thr 100 105 110 TTT AAG GAT TCT CGC CTC AGC GTC AAG CAG AAT GAG CGC TAC GGC CAG 442 Phe Lys Asp Ser Arg Leu Ser Val Lys Gln Asn Glu Arg Tyr Gly Gln 115 120 125 TTG ACT CTG GTC AAC TCC ACC TCG GCA GAC ACA GGT GAA TTC AGC TGC 490 Leu Thr Leu Val Asn Ser Thr Ser Ala Asp Thr Gly Glu Phe Ser Cys 130 135 140 TGG GTG CAG CTC TGC AGC GGC TAC ATC TGC AGG AAG GAC GAG GCC AAA 538 Trp Val Gln Leu Cys Ser Gly Tyr Ile Cys Arg Lys Asp Glu Ala Lys 145 150 155 ACG GGC TCC ACC TAC ATC TTT TTT ACA GAG AAA GGA GAA CTC TTT GTA 586 Thr Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Phe Thr Glu Lys Gly Glu Leu Phe Val 160 165 170 175 CCT TCT CCC AGC TAC TTC GAT GTT GTC TAC TTG AAC CCG GAC AGA CAG 634 Pro Ser Pro Ser Tyr Phe Asp Val Val Tyr Leu Asn Pro Asp Arg Gln 180 185 190 GCT GTG GTT CCT TGT CGG GTG ACC GTG CTG TCG GCC AAA GTC ACG CTC 682 Ala Val Val Pro Cys Arg Val Thr Val Leu Ser Ala Lys Val Thr Leu 195 200 205 CAC AGG GAA TTC CCA GCC AAG GAG ATC CCA GCC AAT GGA ACG GAC ATT 730 His Arg Glu Phe Pro Ala Lys Glu Ile Pro Ala Asn Gly Thr Asp Ile 210 215 220 GTT TAT GAC ATG AAG CGG GGC TTT GTG TAT CTG CAA CCT CAT TCC GAG 778 Val Tyr Asp Met Lys Arg Gly Phe Val Tyr Leu Gln Pro His Ser Glu 225 230 235 CAC CAG GGT GTG GTT TAC TGC AGG GCG GAG GCC GGG GGC AGA TCT CAG 826 His Gln Gly Val Val Tyr Cys Arg Ala Glu Ala Gly Gly Arg Ser Gln 240 245 250 255 ATC TCC GTC AAG TAC CAG CTG CTC TAC GTG GCG GTT CCC AGT GGC CCT 874 Ile Ser Val Lys Tyr Gln Leu Leu Tyr Val Ala Val Pro Ser Gly Pro 260 265 270 CCC TCA ACA ACC ATC TTG GCT TCT TCA AAC AAA GTG AAA AGT GGG GAC 922 Pro Ser Thr Thr Ile Leu Ala Ser Ser Asn Lys Val Lys Ser Gly Asp 275 280 285 GAC ATC AGT GTG CTC TGC ACT GTC CTG GGG GAG CCC GAT GTG GAG GTG 970 Asp Ile Ser Val Leu Cys Thr Val Leu Gly Glu Pro Asp Val Glu Val 290 295 300 GAG TTC ACC TGG ATC TTC CCA GGG CAG AAG GAT GAA AGG CCT GTG ACG 1018 Glu Phe Thr Trp Ile Phe Pro Gly Gln Lys Asp Glu Arg Pro Val Thr 305 310 315 ATC CAA GAC ACT TGG AGG TTG ATC CAC AGA GGA CTG GGA CAC ACC ACG 1066 Ile Gln Asp Thr Trp Arg Leu Ile His Arg Gly Leu Gly His Thr Thr 320 325 330 335 AGA ATC TCC CAG AGT GTC ATT ACA GTG GAA GAC TTC GAG ACG ATT GAT 1114 Arg Ile Ser Gln Ser Val Ile Thr Val Glu Asp Phe Glu Thr Ile Asp 340 345 350 GCA GGA TAT TAC ATT TGC ACT GCT CAG AAT CTT CAA GGA CAG ACC ACA 1162 Ala Gly Tyr Tyr Ile Cys Thr Ala Gln Asn Leu Gln Gly Gln Thr Thr 355 360 365 GTA GCT ACC ACT GTT GAG TTT TCC TGACTTGGAA AAGGAAATGT AATGAACTTA 1216 Val Ala Thr Thr Val Glu Phe Ser 370 375 TGGAAAGCCC ATTTGTGTAC ACAGTCAGCT TTGGGGTTCC TTTTATTAGT GCTTTGCCAG 1276 AGGCTGATGT CAAGCACCAC ACCCCAACCC CAGCGTCTCG TGAGTCCGAC CCAGACATCC 1336 AAACTAAAAG GAAGTCATCC AGTCTATTCA CAGAAGTGTT AACTTTTCTA ACAGAAAGCA 1396 TGATTTTGAT TGCTTACCTA CATACGTGTT CCTAGTTTTT ATACATGTGT AAACAATTTT 1456 ATATAATCAA TCATTTCTAT TAAATGAGCA CGTTTTTGTA AAAAAT 1502 。

【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：２８１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon１ 存在位置：９９．．１５０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAATTCCCCA ACTTTTTCCC CCAAACCTTG TTCCTCCTGA AGAAACCGAA TCCTCCCGCT 60 TCGGCGTCCC AGGAGCCCGC CCCTCGCCCG CCGCCTCCCC TGCGTCCCCG CCCCGCNCAG 120 CCGCCGCGCT CCTGCNCTCC GAGGTCCGAG GTTCCCGAGA TNAAGGTCTG GCTGCTGCTT 180 GGTCTTCTGC TGGTGCNCCA AGCGATGGAG GATGGTGAGT GACTCTGGGC GCGGGGCCAC 240 CTAGCTTGGT GCCCTGACTT TAGCCGGGAC CCGAAGTTTT T 281 。

【００３６】配列番号：４ 配列の長さ：３２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon２ 存在位置：１２８．．１９１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAACCTTGTT CCTCCTGAAG AAACCGAATC CTCCCGCTTC GGCGTCCCAG GAGCCCGCCC 60 CTCGCCCGCC GCCTCCCCTG CGTCCCCGCC CCGCGCAGCC GCCGGCTCCT GCGCTCCGAG 120 GTCCGAGGTT CCCGAG ATG AAG GTC TGG CTG CTG CTT GGT CTT CTG CTG GTG 172 Met Lys Val Trp Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val 1 5 10 CAC GAA GCG CTG GAG GAT G GTGAGTGACT CTGGGCGCGG GGCCACCTAG 221 His Glu Ala Leu Glu Asp Val 15 CTTGTGCCCT GACTTTAGCC GGGACCCGAA GCCCCCGCCG CCCTCCTGCC AGCTCTTGGT 281 CTAACGTTCG GCCCTCGGTG GCTCAGCCCC CGCNCCACTG CC 323 。

【００３７】配列番号：５ 配列の長さ：４８６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon ３ 存在位置：７４．．３７１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAAAAGTTAT TGGCCTCAAA TATTCCAAAA ATGTCATTAC TACAGNGNAT TTCTCTCTCC 60 TTACGTTTTG CAG TT ACT GGC CAA CAC CTT CCC AAG AAC AAG CGT CCA AAA 111 Val Thr Gly Gln His Leu Pro Lys Asn Lys Arg Pro Lys 20 25 30 GAA CCA GGA GAG AAT AGA ATC AAA CCT ACC AAC AAG AAG GTG AAG CCC 159 Glu Pro Gly Glu Asn Arg Ile Lys Pro Thr Asn Lys Lys Val Lys Pro 35 40 45 AAA ATT CCT AAA ATG AAG GAC AGG GAC TCA GCC AAT TCA GCA CCA AAG 207 Lys Ile Pro Lys Met Lys Asp Arg Asp Ser Ala Asn Ser Ala Pro Lys 50 55 60 ACG CAG TCT ATC ATG ATG CAA GTG CTG GAT AAA GGT CGC TTC CAG AAA 255 Thr Gln Ser Ile Met Met Gln Val Leu Asp Lys Gly Arg Phe Gln Lys 65 70 75 CCC GCC GCT ACC CTG AGT CTG CTG GCG GGG CAA ACT GTA GAG CTT CGA 303 Pro Ala Ala Thr Leu Ser Leu Leu Ala Gly Gln Thr Val Glu Leu Arg 80 85 90 95 TGT AAA GGG AGT AGA ATT GGG TGG AGC TAC CCT GCG TAT CTG GAC ACC 351 Cys Lys Gly Ser Arg Ile Gly Trp Ser Tyr Pro Ala Tyr Leu Asp Thr 100 105 110 TTT AAG GAT TCT CGC CTC AG GTAANCATTT TTTTTTAAAN CTGTGTAGGG 401 Phe Lys Asp Ser Arg Leu Ser 115 TTGAGGATTT GTAATAGTTC AAAATTCCTT CTTAACTATT ATTACACATT GTTTCTGACA 461 TGTCCCATTT TCCCCTAATA GATCA 486 。

【００３８】配列番号：６ 配列の長さ：２３１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon ４ 存在位置：５３．．２０４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGGCCCCAGC CAGGTCTGAT TTGCTTTGAG TTCATGTGTC TNTTATTCCT NG C GTC 56 Ser Val AAG CAG AAT GAG CGC TAC GGC CAG TTG ACT CTG GTC AAC TCC ACC TCG 104 Lys Gln Asn Glu Arg Tyr Gly Gln Leu Thr Leu Val Asn Ser Thr Ser 120 125 130 135 GCA GAC ACA GGT GAA TTC AGC TGC TGG GTG CAG CTC TGC AGC GGC TAC 152 Ala Asp Thr Gly Glu Phe Ser Cys Trp Val Gln Leu Cys Ser Gly Tyr 140 145 150 ATC TGC AGG AAG GAC GAG GCC AAA ACG GGC TCC ACC TAC ATC TTT TTT 200 Ile Cys Arg Lys Asp Glu Ala Lys Thr Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Phe 155 160 165 ACA G GTAAAATACT TGGTGCATTA ATGGAAC 231 Thr Glu 。

【００３９】配列番号：７ 配列の長さ：４２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon ５ 存在位置：６１．．３５４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GNGTGCTNTN ACTTTGCGTC TCCGGAGTGN ANAAGCCTGT GCTCTTCCTT CCCTTNGCAG 60 AG AAA GGA GAA CTC TTT GTA CCT TCT CCC AGC TAC TTC GAT GTT GTC 107 GluLys Gly Glu Leu Phe Val Pro Ser Pro Ser Tyr Phe Asp Val Val 170 175 180 TAC TTG AAC CCG GAC AGA CAG GCT GTG GTT CCT TGT CGG GTG ACC GTG 155 Tyr Leu Asn Pro Asp Arg Gln Ala Val Val Pro Cys Arg Val Thr Val 185 190 195 200 CTG TCG GCC AAA GTC ACG CTC CAC AGG GAA TTC CCA GCC AAG GAG ATC 203 Leu Ser Ala Lys Val Thr Leu His Arg Glu Phe Pro Ala Lys Glu Ile 205 210 215 CCA GCC AAT GGA ACG GAC ATT GTT TAT GAC ATG AAG CGG GGC TTT GTG 251 Pro Ala Asn Gly Thr Asp Ile Val Tyr Asp Met Lys Arg Gly Phe Val 220 225 230 TAT CTG CAA CCT CAT TCC GAG CAC CAG GGT GTG GTT TAC TGC AGG GCG 299 Tyr Leu Gln Pro His Ser Glu His Gln Gly Val Val Tyr Cys Arg Ala 235 240 245 GAG GCC GGG GGC AGA TCT CAG ATC TCC GTC AAG TAC CAG CTG CTC TAC 347 Glu Ala Gly Gly Arg Ser Gln Ile Ser Val Lys Tyr Gln Leu Leu Tyr 250 255 260 GTG GCG G GTAAGCCTGG CCACCCCTGC CTAGATTCTA GTTAGTCCCC TGGTCAGTTT 404 Val Ala Val 265 CAGGTACTGC TGTTCCCTG 423 。

【００４０】配列番号：８ 配列の長さ：２３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon ６ 存在位置：４６．．１８５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTACACTCGG GGTACTCACT CTGCCTGTTT CGTGCTTGCT TCCAG TT CCC AGT 53 Val Pro Ser GGC CCT CCC TCA ACA ACC ATC TTG GCT TCT TCA AAC AAA GTG AAA AGT 101 Gly Pro Pro Ser Thr Thr Ile Leu Ala Ser Ser Asn Lys Val Lys Ser 270 275 280 285 GGG GAC GAC ATC AGT GTG CTC TGC ACT GTC CTG GGG GAG CCC GAT GTG 149 Gly Asp Asp Ile Ser Val Leu Cys Thr Val Leu Gly Glu Pro Asp Val 290 295 300 GAG GTG GAG TTC ACC TGG ATC TTC CCA GGG CAG AAG gtaagtgttg 195 Glu Val Glu Phe Thr Trp Ile Phe Pro Gly Gln Lys 305 310 TACCTGCATC TCAGCCCCTG CGTCTCAGCC TCTGCATCTC AGCC 239 。

【００４１】配列番号：９ 配列の長さ：５５１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：exon ７ 存在位置：５０．．５５１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATAGCAGCTT GTCCCTCTTG CTTCAGTCTT TGTGGGTGTC GTTAAACAG GAT GAA 55 Asp Glu 315 AGG CCT GTG ACG ATC CAA GAC ACT TGG AGG TTG ATC CAC AGA GGA CTG 103 Arg Pro Val Thr Ile Gln Asp Thr Trp Arg Leu Ile His Arg Gly Leu 320 325 330 GGA CAC ACC ACG AGA ATC TCC CAG AGT GTC ATT ACA GTG GAA GAC TTC 151 Gly His Thr Thr Arg Ile Ser Gln Ser Val Ile Thr Val Glu Asp Phe 335 340 345 GAG ACG ATT GAT GCA GGA TAT TAC ATT TGC ACT GCT CAG AAT CTT CAA 199 Glu Thr Ile Asp Ala Gly Tyr Tyr Ile Cys Thr Ala Gln Asn Leu Gln 350 355 360 GGA CAG ACC ACA GTA GCT ACC ACT GTT GAG TTT TCC TGACTTGGAA 245 Gly Gln Thr Thr Val Ala Thr Thr Val Glu Phe Ser 365 370 375 AAGGAAATGT AATGAACTTA TGGAAAGCCC ATTTGTGTAC ACAGTCAGCT TTGGGGTTCC 305 TTTTATTAGT GCTTTGCCAG AGGCTGATGT CAAGCACCAC ACCCCAACCC CAGCGTCTCG 365 TGAGTCCGAC CCAGACATCC AAACTAAAAG GAAGTCATCC AGTCTATTCA CAGAAGTGTT 425 AACTTTTCTA ACAGAAAGCA TGATTTTGAT TGCTTACCTA CATACGTGTT CCTAGTTTTT 485 ATACATGTGT AAACAATTTT ATATAATCAA TCATTTCTAT TAAATGAGCA CGTTTTTGTA 545 AAAAAT 551 。

【００４２】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACCTTGTTCC TCCTGAAGAA AC 22 。

【００４３】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACCGAGGGCC GAACGTTAGA 20 。

【００４４】配列番号：１２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATTTCTCTCT CCTTACGTTT TGC 23 。

【００４５】配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 TTACAAATCC TCAACCCTAC ACA 23 。

【００４６】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CCCAGCCAGG TCTGATTTGC 20 。

【００４７】配列番号：１５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTTCCATTAA TGCACCAAGT ATTTT 25 。

【００４８】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 AGCCTGTGCT CTTCCTTCCC 20 。

【００４９】配列番号：１７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGGACTAACT AGAATCTAGG CA 22 。

【００５０】配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ACTCGGGGTA CTCACTCTGC 20 。

【００５１】配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGCTGAGATG CAGGTACAAC A 21 。

【００５２】配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CTTCAGTCTT TGTGGGTGTC G 21 。

【００５３】配列番号：２１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTACACAAAT GGGCTTTCCA TAA 23

【図面の簡単な説明】

【図１】 肝細胞癌（ＨＣＣ）および肺癌（ＬＣ）にお
ける第８番染色体染色体短腕の部分的欠失を示した図で
ある。黒丸はヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保
持を表している。共通欠失領域は黒枠で示した。クロー
ン名はクローン番号のみで示してある。

【図２】 大腸癌（ＣＲＣ）における第８番染色体染色
体短腕の部分的欠失を示した図である。黒丸はヘテロ接
合性の消失（ＬＯＨ）、白丸は保持を表している。共通
欠失領域は黒枠で示した。クローン名はクローン番号の
みで示してある。

【図３】 第８番染色体染色体短腕の共通欠失領域に位
置づけられたマーカー、およびこの領域に存在する２つ
のＹＡＣクローンの位置を示した図である。マーカー名
はクローン番号のみで示してある。

【図４】 限局化された共通欠失領域周辺の各ＤＮＡマ
ーカーをプローブとして同定される制限酵素断片のサイ
ズを示した図である。サイズはＫｂで示した。クローン
名はクローン番号のみで示してある。

【図５】 肺癌における遺伝子再構成のサザンブロット
による検出を示した図である。Ｎ、Ｔはそれぞれ正常組
織、癌組織のＤＮＡを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/566 33/574 Ｚ Ａ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部
   または一部を含むＰＲＬＴＳ蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の１も
   しくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換され
   たアミノ酸配列の全部または一部を含むＰＲＬＴＳ蛋白
   質。
3. 【請求項３】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部
   または一部を含むＰＲＬＴＳ蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
4. 【請求項４】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の１も
   しくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換され
   たアミノ酸配列の全部または一部を含むＰＲＬＴＳ蛋白
   質をコードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項３または４に記載のＤＮＡを含有
   するベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のベクターを保持する形
   質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培養し、発
   現産物を回収することを含む請求項１または２に記載の
   蛋白質の製造方法。
8. 【請求項８】 配列番号３ないし９に記載のイントロン
   ＤＮＡの全部または一部またはその相補配列を含むＤＮ
   Ａ。
9. 【請求項９】 配列番号２に記載の塩基配列の全部また
   は一部またはその相補配列を含む１本鎖ＤＮＡからなる
   ＤＮＡプローブ。
10. 【請求項１０】 配列番号２に記載の塩基配列の全部ま
    たは一部またはその相補配列を含む１本鎖ＤＮＡからな
    るＤＮＡプライマー。
11. 【請求項１１】 請求項１または２に記載の蛋白質と結
    合する抗血清またはモノクロナール抗体。
12. 【請求項１２】 請求項３に記載のＤＮＡのゲノム内の
    変異を検出することを含む、癌細胞の識別方法。
13. 【請求項１３】 請求項８または９に記載のＤＮＡを用
    いることを特徴とする請求項１２に記載の識別方法。