JPH089618B2 - ホリニン酸の分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は（6S）−ホニリン酸又はその塩、特にそのホ
リニン酸−カルシウム、−マグネシウム、−カリウム及
び−ナトリウムの製造方法に関する。

ホリニン酸はＮ−（５−ホルミル−（6R,S）−5,6,7,
8−テトラヒドロ−プテロイル）−Ｌ−グルタミン酸
（５−CHO−（6R,S）−H₄PteGlu））である。Ｎ−（５
−ホルミル−（6S）−5,6,7,8−テトラヒドロプテロイ
ル）−Ｌ−グルタミン酸（５−CHO−（6S）−H₄PteGl
u）はシトロボルム−因子（＝リューコストック−シト
ロボルムに関する増殖因子）である。

ホリニン酸は２個の不斉中心を有する。その際葉酸、
すなわちＮ−（プテロイル）−Ｌ−グルタミン酸からホ
リニン酸を合成することに基づきグルタミン酸−残基中
に含有する光学的に活性なＣ−原子はＬ−型で存在す
る。一方プテロイル−残基の5,6−位にある二重結合を
水素化することによって生じる光学的に活性なＣ−原子
は６−位にラセミ性の（6R,S）−型で存在する。したが
って合成ホリニン酸（＝ロイコボリン）は２個のジアス
テレオマーの1:1−混合物から成る。

ロイコボリンは巨大赤芽球性葉酸欠乏−貧血の処置用
薬剤として、癌治療（ロイコボリン救済）に於ける葉酸
−拮抗剤、特にアミノプテリン及びメトトレキセートの
相容性の及び自己免疫疾患、たとえば乾癬及びリュウマ
チ性関節炎の処置の増強用解毒剤として並びに特定の駆
虫剤、たとえば化学療法に於けるトリメトプリム−スル
ファメトキサゾールの相容性の増強用解毒剤としてます
ます重要になっている。

自然に存在するものの中で、たとえば肝臓中にホリニ
ン酸はＳ−型でしか存在しない。葉酸補因子としてロイ
コボリンの生化学作用は、その５−CHO−（6S）−H₄PeG
lu含有率に基づいている。これに対して反対の（Ｒ）−
型−５−CHO−（6R）−H₄PeGluは全く物質代謝をせずか
つ徐々にウリンによって沈澱する。これは生化学的に有
効でない。J.A.ストロウ（Straw）等、癌研究44,3114
（1984）。

したがって５−ホルミル−（6R,S）−5,6,7,8−テト
ラヒドロプテロイル−Ｌ−グルタミン酸の分離に及び５
−ホルミル−（6S）−5,6,7,8−テトラヒドロプテロイ
ル−Ｌグルタミン酸の不斉合成に及び生理学的に活性な
型の単離に数倍の努力が払われている。D.コスリヒ（Co
sulich）等、J.Amer.Chem.Soc.74,4215−16（1952），
米国特許第2,688,018号明細書には、水性溶液から５−
ホルミル−（6R,S）−5,6,7,8−テトラヒドロプテロイ
ル−Ｌ−グルタミン酸のアルカリ土類−塩、たとえばカ
ルシウム−又はストロンチウム−塩の分別結晶による分
離を行うことが述べられている。B.コスリヒ等によって
開示された条件下で所望される分離は、実現できない。
pH7−８で水からたとえば５−ホルミル−（6R,S）−5,
6,7,8−テトラヒドロプテロイル−Ｌ−グルタミン酸の
カルシウム−塩の晶出で常に再び純粋な6R,S−型が得ら
れる。たとえばこれはキラルHPLC−カラムのクロマトグ
ラフィー分析によって並びに旋光度によって定量的に検
出することができる。その際５−CHO−（6R,S）−H₄Pte
Gluの粗製又は純粋なカルシウム−塩を結晶化に使用す
るかどうかは重要でなく、常に光学的に純粋な（6R,S）
−型に戻る。（6R,S）−ホリニン酸アルカリ土類塩の過
飽和水性溶液に純正な（6S）−ホリニン酸アルカリ土類
塩を結晶種として加えた場合、（6S）−型の分離及び増
加を達成することもできない。したがって今日まで不斉
合成はＮ−（５−ホルミル−（6S）−5,6,7,8−テトラ
ヒドロプテロイル）−Ｌ−グルタミン酸を得るための唯
一の可能性として残る。しかし（6S）−ホリニン酸の不
斉合成の従来公知の方法は、工業的規模でこの化合物の
製造に不適当である。したがって今日まで（6S）−ホリ
ニン酸を収得するための工業的に使用できる方法はな
い。

したがって（6S）−ホリニン酸及びその塩の簡単な工
業的に使用できかつ経済的方法を得ることが課題であ
る。

本発明者は驚くべきことに（6R,S）−ホリニン酸のア
ルカリ土類塩、たとえばカルシウム−，マグネシウム−
又はストロンチウム−Ｎ−（５−ホルミル−（6R,S）−
5,6,7,8−テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−グルタミナ
ート（＝（6R,S）−ホリニン酸アルカリ土類塩）を好ま
しくは水から、無機又は有機塩基の存在下にアルカリ性
媒体中で再結晶した場合先ず主に（6S）型が晶出し、こ
の際結晶形の（6S）−型含有率が85％及びそれ以上で得
られうることを見い出した。

（6S）−型が著しく増加された、高い（6S）−型含有
率を有するホリニン酸アルカリ土類塩を、場合により好
ましくは水からほぼ中性pHで更に再結晶して光学的に純
粋な（6S）−ホリニン酸アルカリ土類塩に変えることが
できる。

結晶化にあたり収率をアルカリ土類−イオン、たとえ
ば塩化−カルシウム、−マグネシウム又は−ストロンチ
ウムの添加によって改善することができる。

したがって本発明の対象は、（6R,S）−ホリニン酸の
アルカリ土類塩を再結晶し、場合によりホリニン酸アル
カリ土類塩から酸を遊離する及び（又は）場合によりそ
のアルカリ塩に変えることによって（6S）−ホリニン酸
又はその塩を製造するにあたり、再結晶を塩基の存在下
に実施することを特徴とする上記化合物の製造方法であ
る。

更に本発明の対象は、得られた結晶を塩基の存在下に
又はほぼ中性pH−値で少なくとももう一回再結晶する方
法である。好ましい実施形態によれば、再結晶を付加的
にアルカリ土類−イオンの存在下に実施する。

本法に関する出発材料として純粋な（6R,S）−ホニリ
ン酸アルカリ土類塩及び粗製の（6R,S）−ホリニン酸ア
ルカリ土類塩が適当である。

この方法によってＮ−（５−ホルミル−6S）−5,6,7,
8−テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−グルタミン酸のカ
ルシウム−及びマグネシウム−塩が初めて工業的に入手
できる。

ホリニン酸のアルカリ土類塩としてホリニン酸−カル
シウム、−マグネシウム、−ストロンチウム及び−バリ
ウムが挙げられる。ホリニン酸−カルシウム及び−マグ
ネシウムが好ましい。というのはこれを続いて行われる
分離後そのまま薬剤として使用することができるからで
ある。一方たとえばストロンチウム−及び特にバリウム
−塩は次いで他の、生理学的に妥当な塩に変えられる。

無機又は有機塩基としてたとえば次のものが挙げられ
る： 水酸化アルカリ、たとえば水酸化−ナトリウム、−カ
リウム及び−リチウム、水酸化アルカリ土類、たとえば
特に水酸化−カルシウム及び−マグネシウム、アンモニ
ア、ヒドラジン、水溶性有機塩基、特に簡単な第一、第
二、第三アミン、たとえばメチルアミン、ジメチルアミ
ン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミ
ン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルア
ミン、メチルエチルアミン、アミノアルコール、たとえ
ばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノ
ールアミン、プロパノールアミン、ブタノールアミン、
ジヒドロキシプロピルアミン（2,3−ジヒドロキシプロ
ピルアミン、セリノール）、トリヒドロキシブチルアミ
ン（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、
グルカミン、Ｎ−メチル−グルカミン、ヘテロ環状アミ
ン、たとえばピロリジン、ピペリジン、モルホリン又は
ピペラジン。

本発明による方法に従う最初の再結晶を、8.5から12
の間、好ましくは9.0から10.5の間のpH−値で実施す
る。より一層低いpHの場合、結晶形での（6S）−型の明
らかな増加は起きず、より一層高いpHの場合、ホリニン
酸の安定性は著しく小さくなり、更にアルカリ土類塩は
ほとんど結晶化しない。（6S）−フォリン酸アルカリ土
類塩から（6R）−ホリニン酸塩の残存量を除去するため
に、次の再結晶をほぼ中性媒体中で、たとえば6.5ない
し8.5のpH−範囲で実施することができる。再結晶に於
いて対応するアルカリ土類−イオンの添加によって溶解
積が急速に得られ、それによって収率を上昇することが
できる。アルカリ土類−イオン、好ましくはCa,Mg,Srを
任意の易溶性塩の形で、たとえば塩化物、硫酸塩又は硝
酸塩の形で加える。これを一般にホリニン酸塩の0.2な
いし４倍量で使用する。

本発明の対象は、また本発明による方法によって初め
て工業的に入手できる（6S）−ホリニン酸塩、特にホリ
ニン酸カルシウム及び（6S）−ホリニン酸並びにその製
造方法とは無関係に新規のマグネシウム塩及び良好に入
手できる（6S）−ホリニン酸アルカリ土類塩から、たと
えば再度塩となして容易に得られる新規（6S）−ホリニ
ン酸−ナトリウム及び−カリウムである。（6S）−ホリ
ニン酸マグネシウムは極めて重要である。というのは2g
/100mlより大きいその同等に良好な水溶性及びその高い
相容性によって、注射溶液の製造に適する出発材料を形
成するからである。更に多く同じことが（6S）−ホリニ
ン酸−ナトリウム及びカリウムに対してもいえる。（6
S）−ホリニン酸カルシウムは20℃で0.95％水性溶液し
か形成することができない。このことは注射溶液の製造
を困難にする。

次の例は本発明を説明するためのものである。： 例１ （6S）−ホリニン酸カルシウム 1.結晶化： 50〜60℃の熱水約１中の粗（6R,S）−ホリニン酸カ
ルシウム100gに塩化カルシウム（CaCl₂・2H₂O）12−36g
を加え、30℃で水性アンモニア（25％）の添加によって
pH10に調整し、18℃で晶出させる。18−20時間後、沈澱
した生成物を瀘取し、希塩化カルシウム−溶液で、次い
で無水エタノールで洗滌する。88％（6S）−ホリニン酸
カルシウム及び12％（6R）−ホリニン酸カルシウムを含
有するホリニン酸カルシウム41gが得られる。光学的収
率72％。

2.結晶化： 88％（6S）−ホリニン酸塩を含有する、1.結晶化から
の粗（6S）−ホリニン酸カルシウム40gを55〜60℃で水
に溶解し、徐々に水性塩酸（20％）をpH 6.1になるまで
加え、次いで塩化カルシウム40〜160gを加える。55℃で
苛性ソーダ溶液の添加によって溶液のpHを７〜7.5に調
整する。約35℃で純正な（6S）−ホリニン酸カルシウム
を結晶種として加えて、18〜20℃で生成物が晶出する。

約40時間後と、晶出した生成物を瀘取し、水性エタノ
ールで洗滌し、乾燥する。

（Ｓ）−ホリニン酸塩含有率98％を有する（Ｓ）−ホ
リニン酸カルシウム30.4gが得られる。光学的収率:79〜
81％。

3.結晶化： （6S）−型含有率94〜98％を有する（6S）−ホリニン
酸カルシウム10gを熱水中に溶解し、塩化カルシウム10g
を加え、pH7.0〜7.5及び18−20℃で晶出させる。３〜４
日後、生成物を瀘取し、少量の水で、次いで湿潤エタノ
ールで洗滌し、乾燥する。

純粋な（6S）−ホリニン酸カルシウム8gが得られる。

（6S）−ホリニン酸カルシウム含有率＝99−100面積
％ 水中での溶解度:20℃で0.95g/100ml及び40℃で1.5g/1
00ml 比旋光度〔α〕²α⁰：−15°（無水Ca−塩に対して） 注釈： ホリニン酸カルシウム含有率：スタンダートに対して
HPLCを用いて測定。

（6S）−型含有率：キラルカラムの使用下にHPLCを用
いて測定（レゾルボシル（Resolvosil）−BSA−７）。

例２ 種々の塩基の存在下に結晶化して（6R,S）−ホリニン酸
カルシウムの分離 1.塩基の存在下に再結晶。

（6R,S）−ホリニン酸カルシウム30gを50℃で水200−
300ml中に溶解し、30〜40℃で（6R,S）−ホリニン酸カ
ルシウムモルあたり塩基0.5−0.6当量を加える。

溶液を室温で５〜17時間攪拌する。通常直ちに自発結
晶化が生じる。結晶を瀘取し、少量の５％塩化カルシウ
ム−溶液で、次いでエタノールで洗滌し、乾燥する。

結果は表１から明らかである。

2.1.に従って得られた粗（6S）−ホリニン酸カルシウム
の再結晶 前記方法１に従って得られた粗（6S）−ホリニン酸カ
ルシウムを塩化カルシウム１−４部の添加下にpH 6.5〜
7.5で水から再結晶する。その際少量の難溶性分画を濾
過によって分離する。濾液から蒸発し、冷却した後に純
粋な（6S）−ホリニン酸カルシウムが晶出する。

（6S）−ホリニン酸カルシウム含有率＝99.9面積％ 例３ （6S）−ホリニン酸マグネシウム 1.結晶化： （6R,S）−ホリニン酸ナトリウムの水性溶液から塩化
マグネシウムで沈澱させて製造された（6R,S）−ホリニ
ン酸マグネシウム30gを熱水中に溶解し、塩化マグネシ
ウム100gを加え、水性水酸化ナトリウムの添加によって
pH10に調整する。攪拌下16−18℃に冷却する。

いく日か後、晶出した粗（6S）−ホリニン酸マグネシ
ウムを瀘取し、エタノールを洗滌し、乾燥する。（Ｓ）
−ホリニン酸塩含有率80％を有するホリニン酸マグネシ
ウムが得られる。

2.再結晶： 塩化マグネシウムの添加下に少量の水からほぼ中性pH
で再結晶して、粗製のものから理論値の95％より多い
（6S）−ホリニン酸塩含有率を有する純粋な（6S）−ホ
リニン酸マグネシウムが得られる。水中での溶解度:20
℃で2.4g/100ml 例４ （6S）−ホリニン酸ナトリウム （6S）−ホリニン酸カルシウムの実質上飽和された水
性溶液をイオン交換体−カラムによって抽出濾過する。
このカラムはNa⁽⁺⁾−型のカチオン交換樹脂で、たとえ
ばアンバーライト（Amberlite）IR−120、Na⁽⁺⁾−型で
充填されている。溶離液を濃縮する。エタノールの添加
によって（6S）−ホリニン酸ナトリウムを沈澱させる。
（6S）−ホリニン酸ナトリウムは容易に水に溶ける。

これに代えて（6S）−ホリニン酸ナトリウムを等量の
水酸化ナトリウム中に（6S）−ホリニン酸を溶解しても
得ることができる。

これに必要な（6S）−ホリニン酸は例６に従って得ら
れる。

例５ （6S）−ホリニン酸カリウム 例６に従って得られた（6S）−ホリニン酸を等量の水
性水酸化カリウムに溶解して、この化合物が得られる。

その濃縮された水性溶液から、エタノール、イソプロ
パノール又はアセトンを添加して（6S）−ホリニン酸カ
リウムを沈澱させることができる。

（6S）−ホリニン酸カリウムは容易に水に溶ける。

例６ （6S）−ホリニン酸 （6S）−ホリニン酸カルシウムの水性溶液に慎重に希
塩酸を加える。この場合（6S）−ホリニン酸を沈澱さ
せ、濾過によって得られる。

（6S）−ホリニン酸は全く水に溶けない。

フロントページの続き (72)発明者 ムエルデル・ギュンテル ドイツ連邦共和国、デー‐7708 テンゲ ン‐ビュースリンゲン、フォル・ヘギン （番地無し)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（6R,S）−ホリニン酸のアルカリ土類塩を
   結晶化し、場合によりホリニン酸アルカリ土類塩から酸
   を遊離する及び（又は）場合によりそのアルカリ塩に変
   えることによって（6S）−ホリニン酸又はその塩を製造
   するにあたり、結晶化を塩基の存在下に実施することを
   特徴とする、上記化合物の製造方法。
2. 【請求項２】得られた結晶を塩基の存在下に又はほぼ中
   性pH−値で少なくとももう一回結晶化する、請求の範囲
   １記載の方法。
3. 【請求項３】結晶化を付加的なアルカリ土類−イオンの
   存在下に実施する、請求の範囲１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】（6S）−ホリニン酸のマグネシウム塩。
5. 【請求項５】（6S）−ホリニン酸のナトリウム−及びカ
   リウム塩。