JPH089638B2 - 融合蛋白質、組換ｄｎａ、組換ベクター、微生物、融合蛋白の取得法及びｈｉｖ−抗体−検出試薬 - Google Patents
融合蛋白質、組換ｄｎａ、組換ベクター、微生物、融合蛋白の取得法及びｈｉｖ−抗体−検出試薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＨＩＶ１及びＨＩＶ２の
ｇａｇ−、ｅｎｖ−及びｐｏｌ−域からのポリペプチド
の、宿主細胞としての微生物中での発現の改良に関す
る。更に、本発明は人体液中の抗−ＨＩＶ−抗体の検出
法及び検出試薬に関する。
ｇａｇ−、ｅｎｖ−及びｐｏｌ−域からのポリペプチド
の、宿主細胞としての微生物中での発現の改良に関す
る。更に、本発明は人体液中の抗−ＨＩＶ−抗体の検出
法及び検出試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＩＶ１又はＨＩＶ２での感染は通常人
体液中の抗−ＨＩＶ−抗体の存在により証明される。抗
−ＨＩＶ−抗体の検出のためにはＨＩＶ−ポリペプチド
が必要である。従って、エイズ（ＡＩＤＳ）−試験を多
数実施するためには、免疫原として作用するＨＩＶ−ポ
リペプチドを十分量で製造することが必要である。この
製造は一般にバクテリア中での遺伝子技術的方法により
行なわれる。
体液中の抗−ＨＩＶ−抗体の存在により証明される。抗
−ＨＩＶ−抗体の検出のためにはＨＩＶ−ポリペプチド
が必要である。従って、エイズ（ＡＩＤＳ）−試験を多
数実施するためには、免疫原として作用するＨＩＶ−ポ
リペプチドを十分量で製造することが必要である。この
製造は一般にバクテリア中での遺伝子技術的方法により
行なわれる。
【０００３】こうして、西独特許公開第３７２４０１６
号公報から“非融合蛋白質”（非相同融合部分なし）と
してＨＩＶ１及びＨＩＶ２からの抗原の大腸菌中での発
現は公知である。この方法の欠点は、多くの場合ＨＩＶ
−ポリペプチドの発現が非常にわずかに行なわれるにす
ぎないということである。更に、ＨＩＶ−ポリペプチド
はしばしばその疎水性により難溶性であり、これにより
精製することが困難である。
号公報から“非融合蛋白質”（非相同融合部分なし）と
してＨＩＶ１及びＨＩＶ２からの抗原の大腸菌中での発
現は公知である。この方法の欠点は、多くの場合ＨＩＶ
−ポリペプチドの発現が非常にわずかに行なわれるにす
ぎないということである。更に、ＨＩＶ−ポリペプチド
はしばしばその疎水性により難溶性であり、これにより
精製することが困難である。
【０００４】更に、ＨＩＶ−ポリペプチドをＨＩＶ−部
分とバクテリアポリペプチド部分とを有する融合蛋白質
として製造することも公知である。これにより、多くの
場合発現の程度の改良が達せられる。こうして、ヨーロ
ッパ公開特許第３１６６５９号明細書から、ＨＩＶ１及
びＨＩＶ２からの決定基、特にマウスのジヒドロフォレ
ートレダクターゼ又は大腸菌クロラムフェニコール−ア
セチルトランスフェラーゼから由来する担体ポリペプチ
ド部分及び親和性−ポリペプチド部分、有利にヒスチジ
ン残基を有するペプチドを有する融合蛋白質の発現が公
知である。しかしながら、抗−ＨＩＶ−抗体の検出のた
めにこの種の融合蛋白質を使用することは制限される。
それというのも使用した融合パートナーに対する抗体が
人正常血清中に生じることがあり、このことは誤まった
プラスのテスト結果に導びくためである。
分とバクテリアポリペプチド部分とを有する融合蛋白質
として製造することも公知である。これにより、多くの
場合発現の程度の改良が達せられる。こうして、ヨーロ
ッパ公開特許第３１６６５９号明細書から、ＨＩＶ１及
びＨＩＶ２からの決定基、特にマウスのジヒドロフォレ
ートレダクターゼ又は大腸菌クロラムフェニコール−ア
セチルトランスフェラーゼから由来する担体ポリペプチ
ド部分及び親和性−ポリペプチド部分、有利にヒスチジ
ン残基を有するペプチドを有する融合蛋白質の発現が公
知である。しかしながら、抗−ＨＩＶ−抗体の検出のた
めにこの種の融合蛋白質を使用することは制限される。
それというのも使用した融合パートナーに対する抗体が
人正常血清中に生じることがあり、このことは誤まった
プラスのテスト結果に導びくためである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、ＨＩＶ−融合ポリペプチドがＨＩＶ−テストを妨害
することのある免疫学的決定基を有することにより人−
正常血清と反応する、ということなしに、ＨＩＶ−融合
ポリペプチドの高い発現を達成することである。
は、ＨＩＶ−融合ポリペプチドがＨＩＶ−テストを妨害
することのある免疫学的決定基を有することにより人−
正常血清と反応する、ということなしに、ＨＩＶ−融合
ポリペプチドの高い発現を達成することである。
【０００６】
【問題を解決するための手段】従って、本発明の課題は
Ｎ−末端成分としてテトラペプチド配列 ＮＨ２−Ｍｅ
ｔ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを含有かつこのＮ−末端配
列Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ＬｅｕとＨＩＶからの抗原との間に
５０個より多くのアミノ酸を有さない、ＨＩＶ１又は／
及びＨＩＶ２のｅｎｖ−、ｇａｇ−又は／及びｐｏｌ−
域からの抗原免疫原決定基を少なくとも１つ有する融合
蛋白質である。
Ｎ−末端成分としてテトラペプチド配列 ＮＨ２−Ｍｅ
ｔ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを含有かつこのＮ−末端配
列Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ＬｅｕとＨＩＶからの抗原との間に
５０個より多くのアミノ酸を有さない、ＨＩＶ１又は／
及びＨＩＶ２のｅｎｖ−、ｇａｇ−又は／及びｐｏｌ−
域からの抗原免疫原決定基を少なくとも１つ有する融合
蛋白質である。
【０００７】Ｎ−末端成分として大腸菌からのラクトー
スペルミアーゼ（ｌａｃＹ）のアミノ酸配列ＮＨ２−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＬｅｕがＨＩＶ１又は／及びＨ
ＩＶ２の抗原又は／及び免疫原決定基を少なくとも１つ
有するＨＩＶ一融合蛋白質の安定性を高め、こうして宿
主細胞としての大腸菌中での発現度の明らかな改良に作
用する。こうしてテトラペプチド配列ＮＨ２−Ｍｅｔ−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＬｅｕのＮ−末端融合によりＨＩＶ１
及びＨＩＶ２融合蛋白質の発現度は好適な発現ベクター
の使用において約１０のファクターで高められる。人正
常血清中では、この種の本発明による融合蛋白質に対す
る高められた反応性は全く見い出されない。
スペルミアーゼ（ｌａｃＹ）のアミノ酸配列ＮＨ２−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＬｅｕがＨＩＶ１又は／及びＨ
ＩＶ２の抗原又は／及び免疫原決定基を少なくとも１つ
有するＨＩＶ一融合蛋白質の安定性を高め、こうして宿
主細胞としての大腸菌中での発現度の明らかな改良に作
用する。こうしてテトラペプチド配列ＮＨ２−Ｍｅｔ−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−ＬｅｕのＮ−末端融合によりＨＩＶ１
及びＨＩＶ２融合蛋白質の発現度は好適な発現ベクター
の使用において約１０のファクターで高められる。人正
常血清中では、この種の本発明による融合蛋白質に対す
る高められた反応性は全く見い出されない。
【０００８】更に、本発明による融合蛋白質は付加的な
成分として多くの、有利に４〜３０の帯電した親水性ア
ミノ酸のクラスターを有する。このようにして、疎水性
ＨＩＶ−融合蛋白質の溶解性は著しく改良されることが
でき、かつこれにより不溶性蛋白質−凝集物の形成は十
分に、もしくは完全に阻止され、このことにより単離及
びＨＩＶ−テストにおける使用に関して、この融合蛋白
質の取り扱かい易さは改良された。
成分として多くの、有利に４〜３０の帯電した親水性ア
ミノ酸のクラスターを有する。このようにして、疎水性
ＨＩＶ−融合蛋白質の溶解性は著しく改良されることが
でき、かつこれにより不溶性蛋白質−凝集物の形成は十
分に、もしくは完全に阻止され、このことにより単離及
びＨＩＶ−テストにおける使用に関して、この融合蛋白
質の取り扱かい易さは改良された。
【０００９】特に有利であるのは、Ｃ−末端が塩基性ア
ミノ酸（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）４〜３０の連続を有してい
る本発明による融合蛋白質である。このことにより蛋白
質の等電点を著しく塩基性の値に移動させ、これにより
イオン交換クロマトグラフィーによる精製を著しく容易
にする。Ｃ−末端ポリ（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）−尾部は場合
によりあとからカルボキシペプチダーゼＢで酵素法によ
り再び除去することができる（Ｂｒｅｗｅｒ及びＳａｓ
ｓｅｎｆｅｌｄ、Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ、ヨーロッパ公
開特許第００８９６２６Ａ２号明細書；Ｂｒｅｗｅｒ及
びＳａｓｓｅｎｆｅｌｄ、Ｇｅｎｅ、第３２巻、１９８
４年、第３２１〜３２７頁；Ｂｒｅｗｅｒ及びＳａｓｓ
ｅｎｆｅｌｄ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、第３巻、１９８５年、第１１９〜１２２
頁）。
ミノ酸（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）４〜３０の連続を有してい
る本発明による融合蛋白質である。このことにより蛋白
質の等電点を著しく塩基性の値に移動させ、これにより
イオン交換クロマトグラフィーによる精製を著しく容易
にする。Ｃ−末端ポリ（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）−尾部は場合
によりあとからカルボキシペプチダーゼＢで酵素法によ
り再び除去することができる（Ｂｒｅｗｅｒ及びＳａｓ
ｓｅｎｆｅｌｄ、Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ、ヨーロッパ公
開特許第００８９６２６Ａ２号明細書；Ｂｒｅｗｅｒ及
びＳａｓｓｅｎｆｅｌｄ、Ｇｅｎｅ、第３２巻、１９８
４年、第３２１〜３２７頁；Ｂｒｅｗｅｒ及びＳａｓｓ
ｅｎｆｅｌｄ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、第３巻、１９８５年、第１１９〜１２２
頁）。
【００１０】本発明による融合蛋白質はＨＩＶ１又は／
及びＨＩＶ２のｅｎｖ−、ｇａｇ−又は／及びｐｏｌ−
域からの免疫原決定基少なくとも１つを含有する。この
種の決定基をコードするＤＮＡ−配列はＨＩＶ１もしく
はＨＩＶ２のプロウィルスゲノムから通常の分子生物学
的方法により得られる。この種のＤＮＡ配列は読み取り
枠中のテトラペプチド配列ＮＨ２−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ（ＭＹＹＬ）をコードする配列の後方で好
適な発現ベクター中にコードされることができ、こうし
て本発明による融合蛋白質をコードする組換遺伝子が得
られる。ＨＩＶ１−ゲノムからはＤＮＡ−配列域Ａ′、
Ｂ′及びＣ′が有利である。
及びＨＩＶ２のｅｎｖ−、ｇａｇ−又は／及びｐｏｌ−
域からの免疫原決定基少なくとも１つを含有する。この
種の決定基をコードするＤＮＡ−配列はＨＩＶ１もしく
はＨＩＶ２のプロウィルスゲノムから通常の分子生物学
的方法により得られる。この種のＤＮＡ配列は読み取り
枠中のテトラペプチド配列ＮＨ２−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ（ＭＹＹＬ）をコードする配列の後方で好
適な発現ベクター中にコードされることができ、こうし
て本発明による融合蛋白質をコードする組換遺伝子が得
られる。ＨＩＶ１−ゲノムからはＤＮＡ−配列域Ａ′、
Ｂ′及びＣ′が有利である。
【００１１】ＤＮＡ−配列Ａ′はＨＩＶ１のｇａｇ−域
からの長さ約９６０ＢｐのＰｖｕ／ＢｇＩＩＩ−フラグ
メントであり、かつアミノ酸３１８個をコードする。
Ａ′はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたＤＮＡ配列Ａ
中に包含され、この配列ＡはＮ−末端テトラペプチド配
列ＭＹＹＬ、ベクターのアミノ酸３個、ＨＩＶ１のｇａ
ｇ−域からのアミノ酸３１７個及びアミノ酸１３個のＣ
−末端ベクター配列からなるアミノ酸配列１（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）を有する融合蛋白質をコードする。
からの長さ約９６０ＢｐのＰｖｕ／ＢｇＩＩＩ−フラグ
メントであり、かつアミノ酸３１８個をコードする。
Ａ′はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されたＤＮＡ配列Ａ
中に包含され、この配列ＡはＮ−末端テトラペプチド配
列ＭＹＹＬ、ベクターのアミノ酸３個、ＨＩＶ１のｇａ
ｇ−域からのアミノ酸３１７個及びアミノ酸１３個のＣ
−末端ベクター配列からなるアミノ酸配列１（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）を有する融合蛋白質をコードする。
【００１２】ＤＮＡ配列Ｂ′はＨＩＶ１のｐｏｌ−域か
らの長さ約７１０ＢｐのＰｖｕＩＩ／ＢｓｐＭＩ−フラ
グメントであり、これはアミノ酸２３４個をコードす
る。Ｂ′はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０中に図示されたＤ
ＮＡ−配列Ｂ中に包含され、このＤＮＡ−配列ＢはＮ−
末端テトラペプチド配列ＭＹＹＬ、ベクターのアミノ酸
３個、ＨＩＶ１のｐｏｌ−域からのアミノ酸２３４個及
びアミノ酸６個のＣ−末端ベクター配列からなるアミノ
酸配列２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する融合蛋白
質をコードする。
らの長さ約７１０ＢｐのＰｖｕＩＩ／ＢｓｐＭＩ−フラ
グメントであり、これはアミノ酸２３４個をコードす
る。Ｂ′はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０中に図示されたＤ
ＮＡ−配列Ｂ中に包含され、このＤＮＡ−配列ＢはＮ−
末端テトラペプチド配列ＭＹＹＬ、ベクターのアミノ酸
３個、ＨＩＶ１のｐｏｌ−域からのアミノ酸２３４個及
びアミノ酸６個のＣ−末端ベクター配列からなるアミノ
酸配列２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する融合蛋白
質をコードする。
【００１３】ＤＮＡ配列Ｃ′はＨＩＶ１のｅｎｖ−域か
らの長さ約３１０ＢｐのＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フ
ラグメントであり、これはアミノ酸１０１個をコードす
る。ＤＮＡ−配列Ｃ′はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示
されたＤＮＡ−配列Ｃ中に包含され、このＤＮＡ−配列
ＣはＮ−末端テトラペプチド配列ＭＹＹＬ、ベクターの
アミノ酸２２個、ＨＩＶ１のｅｎｖ−域からのアミノ酸
１０１個及びアミノ酸１２個のＣ−末端ベクター配列か
らなるアミノ酸配列３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有
する融合ポリペプチドをコードする。
らの長さ約３１０ＢｐのＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フ
ラグメントであり、これはアミノ酸１０１個をコードす
る。ＤＮＡ−配列Ｃ′はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示
されたＤＮＡ−配列Ｃ中に包含され、このＤＮＡ−配列
ＣはＮ−末端テトラペプチド配列ＭＹＹＬ、ベクターの
アミノ酸２２個、ＨＩＶ１のｅｎｖ−域からのアミノ酸
１０１個及びアミノ酸１２個のＣ−末端ベクター配列か
らなるアミノ酸配列３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有
する融合ポリペプチドをコードする。
【００１４】構造により必然的にペプチド配列ＭＹＹＬ
をコードするＤＮＡ−配列とＨＩＶ−ＤＮＡの間で、Ｈ
ＩＶ−ＤＮＡ−フラグメントの３′−側に更にベクター
からの配列域がある。このベクター配列は有利にアミノ
酸約５０個より多くをコードすべきではない。このアミ
ノ酸配列が人抗体から認識され、こうしてＨＩＶ−テス
トにおいて妨害する抗原決定基を形成することができな
いということは重要である。
をコードするＤＮＡ−配列とＨＩＶ−ＤＮＡの間で、Ｈ
ＩＶ−ＤＮＡ−フラグメントの３′−側に更にベクター
からの配列域がある。このベクター配列は有利にアミノ
酸約５０個より多くをコードすべきではない。このアミ
ノ酸配列が人抗体から認識され、こうしてＨＩＶ−テス
トにおいて妨害する抗原決定基を形成することができな
いということは重要である。
【００１５】免疫原ＨＩＶ−決定基をコードするＤＮＡ
−配列は以下に詳細を記載するように合成オリゴヌクレ
オチドからも製造することができる。ＨＩＶ２のｅｎｖ
−域から合成的に製造されたＤＮＡ−配列Ｄ′（例２参
照）はアミノ酸１１５個をコードする。Ｄ′はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２中に示されたＤＮＡ−配列Ｄ中に包含
され、このＤＮＡ−配列ＤはＮ−末端テトラペプチド配
列ＭＹＹＬ、ベクターのアミノ酸２個、ＨＩＶ２のｅｎ
ｖ−域からのアミノ酸１１５個及びアミノ酸９個のＣ−
末端ベクター配列からなるアミノ酸配列４（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４）を有する融合ポリペプチドをコードす
る。
−配列は以下に詳細を記載するように合成オリゴヌクレ
オチドからも製造することができる。ＨＩＶ２のｅｎｖ
−域から合成的に製造されたＤＮＡ−配列Ｄ′（例２参
照）はアミノ酸１１５個をコードする。Ｄ′はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２中に示されたＤＮＡ−配列Ｄ中に包含
され、このＤＮＡ−配列ＤはＮ−末端テトラペプチド配
列ＭＹＹＬ、ベクターのアミノ酸２個、ＨＩＶ２のｅｎ
ｖ−域からのアミノ酸１１５個及びアミノ酸９個のＣ−
末端ベクター配列からなるアミノ酸配列４（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４）を有する融合ポリペプチドをコードす
る。
【００１６】更に、本発明はＮ−末端融合配列の他に同
時にＨＩＶ１及び／又はＨＩＶ２のｇａｇ−、ｐｏｌ−
及びｅｎｖ−域の多数の抗原決定基を有する“多官能性
ＨＩＶ−融合蛋白質”の製造及び使用にも関する。この
ことは多くの異なるＨＩＶ−ポリペプチドもしくは蛋白
質のかわりに、わずかに１つの多官能性ＨＩＶ−融合蛋
白質を発酵させ、精製し、かつＨＩＶ−抗体検出テスト
に使用することができるという利点を有し、このことは
著しい費用の減少を意味する。多官能性融合蛋白質がＨ
ＩＶ１及びＨＩＶ２の決定基を含有しているのが特に有
利であり、こうしてテストにおいてＨＩＶ１及びＨＩＶ
２に対する抗体を同時に検出可能である。多官能性融合
蛋白質は免疫原としても、特にＨＩＶ−ワクチンのため
の免疫原としても興味深い。アミノ酸配列及びこれをコ
ードする特に有利な多官能性融合蛋白質のＤＮＡ配列は
配列記録のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜８もしくはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１３〜１６から明らかである。アミノ酸配
列５はＨＩＶ１のｅｎｖ−（アミノ酸１０１）及びｇａ
ｇ−（アミノ酸３１７）域からの決定基を有するＨＩＶ
−融合蛋白質を示す。このアミノ酸配列はＤＮＡ−配列
Ｃ′及びＡ′を包含するＤＮＡ−配列Ｅに相応する。ア
ミノ酸配列６及びこれをコードするＤＮＡ−配列Ｆ（Ｄ
ＮＡ−配列Ｄ′及びＢ′を有する）はＨＩＶ２のｅｎｖ
−域（アミノ酸１１４）及びＨＩＶ１のｐｏｌ−域（ア
ミノ酸２３４）からの決定基を有するＨＩＶ−融合蛋白
質を示す。アミノ酸配列７及びこれをコードするＤＮＡ
−配列Ｇ（ＤＮＡ−配列Ｄ′、Ｂ′、Ｃ′及びＡ′を有
する）はＨＩＶ２のｅｎｖ−域（アミノ酸１１４）並び
にＨＩＶ１のｐｏｌ−（アミノ酸２３４）、ｅｎｖ−
（アミノ酸１０１）及びｇａｇ−（アミノ酸３１７）域
からの決定基を有するＨＩＶ−融合蛋白質を示す。
時にＨＩＶ１及び／又はＨＩＶ２のｇａｇ−、ｐｏｌ−
及びｅｎｖ−域の多数の抗原決定基を有する“多官能性
ＨＩＶ−融合蛋白質”の製造及び使用にも関する。この
ことは多くの異なるＨＩＶ−ポリペプチドもしくは蛋白
質のかわりに、わずかに１つの多官能性ＨＩＶ−融合蛋
白質を発酵させ、精製し、かつＨＩＶ−抗体検出テスト
に使用することができるという利点を有し、このことは
著しい費用の減少を意味する。多官能性融合蛋白質がＨ
ＩＶ１及びＨＩＶ２の決定基を含有しているのが特に有
利であり、こうしてテストにおいてＨＩＶ１及びＨＩＶ
２に対する抗体を同時に検出可能である。多官能性融合
蛋白質は免疫原としても、特にＨＩＶ−ワクチンのため
の免疫原としても興味深い。アミノ酸配列及びこれをコ
ードする特に有利な多官能性融合蛋白質のＤＮＡ配列は
配列記録のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５〜８もしくはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１３〜１６から明らかである。アミノ酸配
列５はＨＩＶ１のｅｎｖ−（アミノ酸１０１）及びｇａ
ｇ−（アミノ酸３１７）域からの決定基を有するＨＩＶ
−融合蛋白質を示す。このアミノ酸配列はＤＮＡ−配列
Ｃ′及びＡ′を包含するＤＮＡ−配列Ｅに相応する。ア
ミノ酸配列６及びこれをコードするＤＮＡ−配列Ｆ（Ｄ
ＮＡ−配列Ｄ′及びＢ′を有する）はＨＩＶ２のｅｎｖ
−域（アミノ酸１１４）及びＨＩＶ１のｐｏｌ−域（ア
ミノ酸２３４）からの決定基を有するＨＩＶ−融合蛋白
質を示す。アミノ酸配列７及びこれをコードするＤＮＡ
−配列Ｇ（ＤＮＡ−配列Ｄ′、Ｂ′、Ｃ′及びＡ′を有
する）はＨＩＶ２のｅｎｖ−域（アミノ酸１１４）並び
にＨＩＶ１のｐｏｌ−（アミノ酸２３４）、ｅｎｖ−
（アミノ酸１０１）及びｇａｇ−（アミノ酸３１７）域
からの決定基を有するＨＩＶ−融合蛋白質を示す。
【００１７】更に、本発明の課題は本発明による融合蛋
白質をコードする組換ＤＮＡ−分子である。このＤＮＡ
−配列はテトラペプチド配列ＮＨ２−ＭｅＬ−Ｔｙｒ−
Ｔｙｒ−ＬｅｕをコードするＤＮＡ−配列、場合により
構成により導入されたベクター配列、ＨＩＶ−決定基を
コードするＤＮＡ−配列及び場合により多くの帯電した
アミノ酸のクラスターをコードするＤＮＡ−配列からな
る。これに関する例はアミノ酸配列８及びこれをコード
するＤＮＡ−配列Ｈ（ＤＮＡ−配列Ｄ′、Ｂ′及び
Ｃ′、並びにＤＮＡ配列Ａ′の大部分を有する）であ
り、これはＨＩＶ２のｅｎｖ−域（アミノ酸１１４）、
ＨＩＶ１のｐｏｌ−（アミノ酸２３４）、ｅｎｖ−（ア
ミノ酸１０１）及びｇａｇ−（アミノ酸２８７）からの
決定基並びにＣ−末端ポリ（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）−配列
（アミノ酸１３）を有するＨＩＶ−融合蛋白質を示す。
白質をコードする組換ＤＮＡ−分子である。このＤＮＡ
−配列はテトラペプチド配列ＮＨ２−ＭｅＬ−Ｔｙｒ−
Ｔｙｒ−ＬｅｕをコードするＤＮＡ−配列、場合により
構成により導入されたベクター配列、ＨＩＶ−決定基を
コードするＤＮＡ−配列及び場合により多くの帯電した
アミノ酸のクラスターをコードするＤＮＡ−配列からな
る。これに関する例はアミノ酸配列８及びこれをコード
するＤＮＡ−配列Ｈ（ＤＮＡ−配列Ｄ′、Ｂ′及び
Ｃ′、並びにＤＮＡ配列Ａ′の大部分を有する）であ
り、これはＨＩＶ２のｅｎｖ−域（アミノ酸１１４）、
ＨＩＶ１のｐｏｌ−（アミノ酸２３４）、ｅｎｖ−（ア
ミノ酸１０１）及びｇａｇ−（アミノ酸２８７）からの
決定基並びにＣ−末端ポリ（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）−配列
（アミノ酸１３）を有するＨＩＶ−融合蛋白質を示す。
【００１８】免疫原ＨＩＶ−決定基をコードするＤＮＡ
−配列は前記のように、プロウィルスＤＮＡから直接又
は化学的遺伝子合成により得られる。第１図は本発明に
より特に有利なプロウィルスＤＮＡ−配列が由来するＨ
ＩＶ１の領域もしくは相応するＨＩＶ２の領域を示す。
発現の更なる改良のためには相応するＨＩＶ−ポリペプ
チドをコードする合成ＤＮＡ−配列を宿主有機体（例え
ば大腸菌）の専門家に公知のコドン利用を考慮して製造
することができる。更に、合成遺伝子の設計の際には二
次構造の形成を最少とし、有利に好適な単独の制限切断
位を導入することもできるように考慮する。合成ＤＮＡ
−配列Ｄ′の製造のために使用したデスオキシオリゴヌ
クレオチド及びクローン化法は第２図、配列記録１７〜
２６及び例２．２中に詳細に記載されている。
−配列は前記のように、プロウィルスＤＮＡから直接又
は化学的遺伝子合成により得られる。第１図は本発明に
より特に有利なプロウィルスＤＮＡ−配列が由来するＨ
ＩＶ１の領域もしくは相応するＨＩＶ２の領域を示す。
発現の更なる改良のためには相応するＨＩＶ−ポリペプ
チドをコードする合成ＤＮＡ−配列を宿主有機体（例え
ば大腸菌）の専門家に公知のコドン利用を考慮して製造
することができる。更に、合成遺伝子の設計の際には二
次構造の形成を最少とし、有利に好適な単独の制限切断
位を導入することもできるように考慮する。合成ＤＮＡ
−配列Ｄ′の製造のために使用したデスオキシオリゴヌ
クレオチド及びクローン化法は第２図、配列記録１７〜
２６及び例２．２中に詳細に記載されている。
【００１９】更に、本発明の課題は１つ又は複数の本発
明による組換ＤＮＡ−配列のコピー少なくとも１つを有
する組換ベクターである。このベクターは宿主細胞のゲ
ノム中に統合されることができ（例えば、大腸菌中のバ
クテリオファージ入のベクター）、有利にはこのベクタ
ーは染色体外に、特に有利には高いコピー数で存在す
る。この組換ベクターは有利には微生物、特に大腸菌中
での遺伝子発現のために好適であり、このために必要な
遺伝技術要素（例えば複製のオリジン、選択マーカー、
プロモーター、ターミネーター等）を有する。
明による組換ＤＮＡ−配列のコピー少なくとも１つを有
する組換ベクターである。このベクターは宿主細胞のゲ
ノム中に統合されることができ（例えば、大腸菌中のバ
クテリオファージ入のベクター）、有利にはこのベクタ
ーは染色体外に、特に有利には高いコピー数で存在す
る。この組換ベクターは有利には微生物、特に大腸菌中
での遺伝子発現のために好適であり、このために必要な
遺伝技術要素（例えば複製のオリジン、選択マーカー、
プロモーター、ターミネーター等）を有する。
【００２０】特に有利であるのは、その中で本発明によ
る融合蛋白質をコードするＤＮＡ−配列が調節可能なプ
ロモーターの制御下にある（例えば大腸菌中の遺伝子発
現のためのｔｒｐ／ｌａｃ−融合プロモーター）ベクタ
ーである。更に、組換ベクターが融合遺伝子の３′−末
端に転写ターミネーターを１個又は複数個有する場合が
有利である（例えば大腸菌ｒｒｎＢリボゾームＲＮＡオ
ペロンからのターミネーターＴ１及びＴ２、Ｂｒｏｓｉ
ｕｓ等著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１４８巻、１９
８１年、第１０７〜１２７頁）。大腸菌中の特に好適な
発現ベクターの例は調節可能なｔｒｃ−プロモーター及
びターミネーターＴ１及びＴ２を有するｐＫＫ２３３−
２（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ） である。
る融合蛋白質をコードするＤＮＡ−配列が調節可能なプ
ロモーターの制御下にある（例えば大腸菌中の遺伝子発
現のためのｔｒｐ／ｌａｃ−融合プロモーター）ベクタ
ーである。更に、組換ベクターが融合遺伝子の３′−末
端に転写ターミネーターを１個又は複数個有する場合が
有利である（例えば大腸菌ｒｒｎＢリボゾームＲＮＡオ
ペロンからのターミネーターＴ１及びＴ２、Ｂｒｏｓｉ
ｕｓ等著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１４８巻、１９
８１年、第１０７〜１２７頁）。大腸菌中の特に好適な
発現ベクターの例は調節可能なｔｒｃ−プロモーター及
びターミネーターＴ１及びＴ２を有するｐＫＫ２３３−
２（ＬＫＢ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ） である。
【００２１】本発明のもう１つの課題は本発明による組
換ベクター又は本発明による組換ＤＮＡ−分子で形質転
換した微生物である。有利には、この微生物は大腸菌細
胞である。
換ベクター又は本発明による組換ＤＮＡ−分子で形質転
換した微生物である。有利には、この微生物は大腸菌細
胞である。
【００２２】大腸菌株としては、例えば菌株ＲＭ８２
ｌａｃ＋（ＥＤ８６５４のメチオニン及びラクトースの
復帰突然変異体、Ｍｕｒｒａｙ等著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．、第１５０巻、１９７７年、第５３〜６１
頁）、ＨＢ１０１（Ｍａｎｉａｔｉｓ等著、１９８２
年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
社、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨ
ーク）、及びＫ１６５（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ及びＶａｎ
Ｂｏｇｅｌｅｎ著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１００巻、１９８１
年、第８８４〜９００頁）、並びに他の菌株が好適であ
る。
ｌａｃ＋（ＥＤ８６５４のメチオニン及びラクトースの
復帰突然変異体、Ｍｕｒｒａｙ等著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．、第１５０巻、１９７７年、第５３〜６１
頁）、ＨＢ１０１（Ｍａｎｉａｔｉｓ等著、１９８２
年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
社、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨ
ーク）、及びＫ１６５（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ及びＶａｎ
Ｂｏｇｅｌｅｎ著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１００巻、１９８１
年、第８８４〜９００頁）、並びに他の菌株が好適であ
る。
【００２３】本発明の有利な実施形においては形質転換
された大腸菌株を更なる適合性プラスミドで共形質転換
する。ラクトースにより調節可能なプロモーター（例え
ば、ｌａｃ−プロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃ−融合プロ
モーター）の使用の際に、適合性プラスミドは例えばｌ
ａｃＩ−（Ｆａｂａｕｇｈ著、Ｎａｔｕｒｅ第２７４
巻、１９７８年、第７６５〜７６９頁）又はｌａｃＩｑ
−リプレッサー遺伝子（Ｃａｌｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ第２
７４巻、１９７８年、第７６２〜７６５頁）を含有す
る。例えばプラスミドｐＦＤＸ５００はｌａｃＩｑ−リ
プレッサー遺伝子を含有するｐＡＣＹＣ１７７−誘導体
（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．第１３４巻、１９７８年、第１１４１〜１１５６
頁）又は大腸菌ＪＭ１０９からのＦ′−エピソーム（Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等著、Ｇｅｎｅ第３３巻、
１９８５年、第１０３〜１０９頁）を含有する。
された大腸菌株を更なる適合性プラスミドで共形質転換
する。ラクトースにより調節可能なプロモーター（例え
ば、ｌａｃ−プロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃ−融合プロ
モーター）の使用の際に、適合性プラスミドは例えばｌ
ａｃＩ−（Ｆａｂａｕｇｈ著、Ｎａｔｕｒｅ第２７４
巻、１９７８年、第７６５〜７６９頁）又はｌａｃＩｑ
−リプレッサー遺伝子（Ｃａｌｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ第２
７４巻、１９７８年、第７６２〜７６５頁）を含有す
る。例えばプラスミドｐＦＤＸ５００はｌａｃＩｑ−リ
プレッサー遺伝子を含有するｐＡＣＹＣ１７７−誘導体
（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．第１３４巻、１９７８年、第１１４１〜１１５６
頁）又は大腸菌ＪＭ１０９からのＦ′−エピソーム（Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等著、Ｇｅｎｅ第３３巻、
１９８５年、第１０３〜１０９頁）を含有する。
【００２４】そのようなリプレッサープラスミドの付加
的な存在はＨＩＶ−融合蛋白質の発現を改良することが
できる。しかしながら、付加的に大腸菌中にまれなｔ−
ＲＮＡ・Ａｒｇ（アンチコドン：ＡＧＡ、ＡＧＧ）に関
する遺伝子を含有する共形質転換リプレッサープラスミ
ド、例えばｄｎａＹ−ｌａｃＩｑ−プラスミドｐＵＢＳ
５００（ヨーロッパ公開特許第０３６８３４２号明細
書）を使用することもできる。ＨＩＶ−融合蛋白質の発
現がｄｎａＹ−ｌａｃＩｑ−プラスミドの存在により更
に改良されることができるということが意外にも見い出
された。
的な存在はＨＩＶ−融合蛋白質の発現を改良することが
できる。しかしながら、付加的に大腸菌中にまれなｔ−
ＲＮＡ・Ａｒｇ（アンチコドン：ＡＧＡ、ＡＧＧ）に関
する遺伝子を含有する共形質転換リプレッサープラスミ
ド、例えばｄｎａＹ−ｌａｃＩｑ−プラスミドｐＵＢＳ
５００（ヨーロッパ公開特許第０３６８３４２号明細
書）を使用することもできる。ＨＩＶ−融合蛋白質の発
現がｄｎａＹ−ｌａｃＩｑ−プラスミドの存在により更
に改良されることができるということが意外にも見い出
された。
【００２５】更なる本発明の課題はＨＩＶ−融合蛋白質
の取得法であり、この方法においては好適な微生物、有
利に大腸菌細胞を、本発明によるＨＩＶ−融合蛋白質を
コードする遺伝子がその上に存在する本発明による組換
ＤＮＡ−分子又はベクターで形質転換し、かつこの融合
蛋白質を通常の生物学的方法により細胞又は培地から獲
得する。
の取得法であり、この方法においては好適な微生物、有
利に大腸菌細胞を、本発明によるＨＩＶ−融合蛋白質を
コードする遺伝子がその上に存在する本発明による組換
ＤＮＡ−分子又はベクターで形質転換し、かつこの融合
蛋白質を通常の生物学的方法により細胞又は培地から獲
得する。
【００２６】この際、分離手段、例えば帯電アミノ酸の
クラスターを有する本発明による融合蛋白質はイオン交
換クロマトグラフィーにより他の細胞性成分から容易に
分離される。
クラスターを有する本発明による融合蛋白質はイオン交
換クロマトグラフィーにより他の細胞性成分から容易に
分離される。
【００２７】本発明によるＨＩＶ−融合蛋白質を取得す
るための有利な方法においては、増殖期の間融合蛋白質
をコードする遺伝子の発現を、例えばリプレッサーの存
在により抑圧する。次いで、遺伝子発現は誘発におい
て、例えば誘発剤の添加によりはじめて開始する。
るための有利な方法においては、増殖期の間融合蛋白質
をコードする遺伝子の発現を、例えばリプレッサーの存
在により抑圧する。次いで、遺伝子発現は誘発におい
て、例えば誘発剤の添加によりはじめて開始する。
【００２８】更に、組換融合蛋白質をコードする遺伝子
及びリプレッサー遺伝子が同時に（例えば１つのプラス
ミド上で、又は２つの適合性プラスミド上で）この中に
存在する微生物を使用する方法が有利である。こうし
て、リプレッサープラスミド、例えばｌａｃＩｑ−リプ
レッサープラスミドｐＦＤＸ５００で共形質転換された
細胞からＨＩＶ−融合蛋白質を取得することができる。
このようにして、遺伝子発現のより良好な抑圧を増殖期
の間達成することができる。
及びリプレッサー遺伝子が同時に（例えば１つのプラス
ミド上で、又は２つの適合性プラスミド上で）この中に
存在する微生物を使用する方法が有利である。こうし
て、リプレッサープラスミド、例えばｌａｃＩｑ−リプ
レッサープラスミドｐＦＤＸ５００で共形質転換された
細胞からＨＩＶ−融合蛋白質を取得することができる。
このようにして、遺伝子発現のより良好な抑圧を増殖期
の間達成することができる。
【００２９】微生物が本発明による組換遺伝子、リプレ
ッサー遺伝子及び付加的に大腸菌ｄｎａＹ−遺伝子（ｔ
ＲＮＡ・Ａｒｇ）を含有する方法も有利である。このた
めには、例えばＤＦＤＸ５００のかわりにｄｎａＹ−ｌ
ａｃＩｑ−プラスミドｐＵＢＳ５００で共形質転換され
た細胞を使用することができる。形質転換した微生物中
のｄｎａＹ−遺伝子の存在は本発明による融合蛋白質の
発現の更なる上昇に導びくことができる。
ッサー遺伝子及び付加的に大腸菌ｄｎａＹ−遺伝子（ｔ
ＲＮＡ・Ａｒｇ）を含有する方法も有利である。このた
めには、例えばＤＦＤＸ５００のかわりにｄｎａＹ−ｌ
ａｃＩｑ−プラスミドｐＵＢＳ５００で共形質転換され
た細胞を使用することができる。形質転換した微生物中
のｄｎａＹ−遺伝子の存在は本発明による融合蛋白質の
発現の更なる上昇に導びくことができる。
【００３０】更に、本発明の課題は抗−ＨＩＶ−抗体の
測定用試薬である。
測定用試薬である。
【００３１】この試薬は、 （ａ） ＨＩＶ１又は／及びＨＩＶ２の抗原又は／及び
免疫原決定基を少なくとも１つ有し、かつ固相に結合し
ているか又は恒温保持工程の間好適な特異的固相に容易
に軽く結合するように変性されている融合蛋白質１種又
は複数種、 （ｂ） 融合蛋白質の抗原決定基への抗−ＨＩＶ−抗体
の生理学的結合を容認し、かつ同時に非特異的結合を抑
圧する恒温保持緩衝液、 （ｃ） 抗原−結合抗体を認識するための検出試薬及び （ｄ） 結合した特異的抗体の定量用システム、を含有
する。
免疫原決定基を少なくとも１つ有し、かつ固相に結合し
ているか又は恒温保持工程の間好適な特異的固相に容易
に軽く結合するように変性されている融合蛋白質１種又
は複数種、 （ｂ） 融合蛋白質の抗原決定基への抗−ＨＩＶ−抗体
の生理学的結合を容認し、かつ同時に非特異的結合を抑
圧する恒温保持緩衝液、 （ｃ） 抗原−結合抗体を認識するための検出試薬及び （ｄ） 結合した特異的抗体の定量用システム、を含有
する。
【００３２】この抗原は、例えば抗原−ハプテン−複合
体として存在していてよく、一方ハプテンと反応する分
子が固相上に固定されている。有利に、本発明による抗
原がビオチンと複合体を形成し、これによりストレプト
アビジンで被覆された反応容器に高い親和性で結合す
る。しかしながら、抗原を他の通常公知の方法により固
体マトリックスに直接結合することも同様に可能である
（比較例６）。恒温保持緩衝剤としてはすべての免疫化
学反応に通常使用される緩衝液が好適である。１０％小
牛血清及び０．０５％ツウィーン２０を含有するＰＢＳ
（０．１５ｍｏｌ／ｌ Ｎａ−ホスフェート、０．９％
ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用するのが有利である。
体として存在していてよく、一方ハプテンと反応する分
子が固相上に固定されている。有利に、本発明による抗
原がビオチンと複合体を形成し、これによりストレプト
アビジンで被覆された反応容器に高い親和性で結合す
る。しかしながら、抗原を他の通常公知の方法により固
体マトリックスに直接結合することも同様に可能である
（比較例６）。恒温保持緩衝剤としてはすべての免疫化
学反応に通常使用される緩衝液が好適である。１０％小
牛血清及び０．０５％ツウィーン２０を含有するＰＢＳ
（０．１５ｍｏｌ／ｌ Ｎａ−ホスフェート、０．９％
ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用するのが有利である。
【００３３】抗原−結合抗体を認識するための検出試薬
としては酵素（例えばペルオキシダーゼ）と人−ＩｇＧ
のＦｃγ−部に対するポリクローナル抗体とからなる複
合体又は酵素結合ＨＩＶ−抗原が好適である。
としては酵素（例えばペルオキシダーゼ）と人−ＩｇＧ
のＦｃγ−部に対するポリクローナル抗体とからなる複
合体又は酵素結合ＨＩＶ−抗原が好適である。
【００３４】抗−Ｆｃγ−抗体もしくはＨＩＶ−抗原結
合酵素で分解され、その反応が測定可能である基質の添
加により、結合した特異的抗−ＨＩＶ−抗体を定量的に
測定することができる。ペルオキシダーゼを酵素として
使用する場合、基質としては例えば登録商標ＡＢＴＳ
（２，２′−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩）が好適
である。
合酵素で分解され、その反応が測定可能である基質の添
加により、結合した特異的抗−ＨＩＶ−抗体を定量的に
測定することができる。ペルオキシダーゼを酵素として
使用する場合、基質としては例えば登録商標ＡＢＴＳ
（２，２′−アジノ−ジ−［３−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩）が好適
である。
【００３５】次の実施例は本発明を配列記録１〜２６及
び図１及び図２との関連において明らかにする（この際
ＡＳ：アミノ酸、Ｂ：塩基を表わす）。
び図１及び図２との関連において明らかにする（この際
ＡＳ：アミノ酸、Ｂ：塩基を表わす）。
【００３６】ＨＩＶ１のｇａｇ−域からの決定基（ＡＳ
８〜ＡＳ３２４、Ｂ２０〜Ｂ９７２）を有するＨＩＶ−
融合蛋白質（ＨＩＶ１ｇａｇ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１
５）のアミノ酸−配列（１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
及びＤＮＡ−配列（Ａ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９； ＨＩＶ１のＰＯＬ−域からの決定基（ＡＳ８〜２４１、
Ｂ２１〜７２５）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ
１ｐｏｌ−ｐ３２）のアミノ酸−配列（２）；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２及びＤＮＡ−配列（Ｂ）；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１０； ＨＩＶ１のｅｎｖ−域からの決定基（ＡＳ２７〜１２
７、Ｂ７９〜３８３）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（Ｈ
ＩＶ１ｅｎｖ−ｇｐ４１）のアミノ酸−配列（３）；Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＤＮＡ−配列（Ｃ）；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１１； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域からの決定基（ＡＳ７〜１２１、
Ｂ１９〜３６３）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ
２ｅｎｖ−ｇｐ３２）のアミノ酸−配列（４）；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４及びＤＮＡ−配列（Ｄ）；ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１２； ＨＩＶ１のｅｎｖ−域及びｇａｇ−域からの決定基（Ａ
Ｓ２７〜４４５、Ｂ７９〜１３３５）を有するＨＩＶ−
融合蛋白質（ＨＩＶ１（ｅｎｖ−ｇｐ４１）−（ｇａｇ
−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１５））のアミノ酸−配列
（５）；ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５及びＤＮＡ−配列
（Ｅ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域及びＨＩＶ１のｐｏｌ−域からの
決定基（ＡＳ７〜３５９、Ｂ１９〜１０７９）を有する
ＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−
ＨＩＶ１（ｐｏｌ−ｐ３２））のアミノ酸−配列
（６）；ＳＥＱ ＩＤＮＯ：６及びＤＮＡ−配列
（Ｆ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域及びＨＩＶ１のｐｏｌ−、ｅｎｖ
−及びｇａｇ−域からの決定基（ＡＳ６〜７８６、Ｂ１
９〜２３５８）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ２
（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌ−ｐ３２）−
（ｅｎｖ−ｇｐ４１）−（ｇａｇ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ
１５））のアミノ酸−配列（７）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：７及びＤＮＡ−配列（Ｇ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１５； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域、ＨＩＶ１のｐｏｌ−、ｅｎｖ−
及びｇａｇ−域からの決定基（ＡＳ７〜７５６、Ｂ１９
〜２２６８）及びＣ末端ポリ（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）−配列
（ＡＳ７５８〜末端、Ｂ２２７２〜末端）を有するＨＩ
Ｖ−融合蛋白質（ＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＨＩ
Ｖ１（ｐｏｌ−ｐ３２）−（ｅｎｖ−ｇｐ４１）−（ｇ
ａｇ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）−ポリ（Ｌｙｓ、Ａｒ
ｇ））のアミノ酸−配列（８）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８及びＤＮＡ−配列（Ｈ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ 合成ＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＤＮＡ−配列
（Ｄ′）の合成のために使用されたデスオキシオリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１７〜２６。
８〜ＡＳ３２４、Ｂ２０〜Ｂ９７２）を有するＨＩＶ−
融合蛋白質（ＨＩＶ１ｇａｇ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１
５）のアミノ酸−配列（１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
及びＤＮＡ−配列（Ａ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９； ＨＩＶ１のＰＯＬ−域からの決定基（ＡＳ８〜２４１、
Ｂ２１〜７２５）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ
１ｐｏｌ−ｐ３２）のアミノ酸−配列（２）；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２及びＤＮＡ−配列（Ｂ）；ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１０； ＨＩＶ１のｅｎｖ−域からの決定基（ＡＳ２７〜１２
７、Ｂ７９〜３８３）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（Ｈ
ＩＶ１ｅｎｖ−ｇｐ４１）のアミノ酸−配列（３）；Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＤＮＡ−配列（Ｃ）；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１１； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域からの決定基（ＡＳ７〜１２１、
Ｂ１９〜３６３）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ
２ｅｎｖ−ｇｐ３２）のアミノ酸−配列（４）；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４及びＤＮＡ−配列（Ｄ）；ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１２； ＨＩＶ１のｅｎｖ−域及びｇａｇ−域からの決定基（Ａ
Ｓ２７〜４４５、Ｂ７９〜１３３５）を有するＨＩＶ−
融合蛋白質（ＨＩＶ１（ｅｎｖ−ｇｐ４１）−（ｇａｇ
−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１５））のアミノ酸−配列
（５）；ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５及びＤＮＡ−配列
（Ｅ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域及びＨＩＶ１のｐｏｌ−域からの
決定基（ＡＳ７〜３５９、Ｂ１９〜１０７９）を有する
ＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−
ＨＩＶ１（ｐｏｌ−ｐ３２））のアミノ酸−配列
（６）；ＳＥＱ ＩＤＮＯ：６及びＤＮＡ−配列
（Ｆ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域及びＨＩＶ１のｐｏｌ−、ｅｎｖ
−及びｇａｇ−域からの決定基（ＡＳ６〜７８６、Ｂ１
９〜２３５８）を有するＨＩＶ−融合蛋白質（ＨＩＶ２
（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌ−ｐ３２）−
（ｅｎｖ−ｇｐ４１）−（ｇａｇ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ
１５））のアミノ酸−配列（７）；ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：７及びＤＮＡ−配列（Ｇ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１５； ＨＩＶ２のｅｎｖ−域、ＨＩＶ１のｐｏｌ−、ｅｎｖ−
及びｇａｇ−域からの決定基（ＡＳ７〜７５６、Ｂ１９
〜２２６８）及びＣ末端ポリ（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）−配列
（ＡＳ７５８〜末端、Ｂ２２７２〜末端）を有するＨＩ
Ｖ−融合蛋白質（ＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＨＩ
Ｖ１（ｐｏｌ−ｐ３２）−（ｅｎｖ−ｇｐ４１）−（ｇ
ａｇ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）−ポリ（Ｌｙｓ、Ａｒ
ｇ））のアミノ酸−配列（８）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８及びＤＮＡ−配列（Ｈ）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ 合成ＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＤＮＡ−配列
（Ｄ′）の合成のために使用されたデスオキシオリゴヌ
クレオチドのヌクレオチド配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１７〜２６。
【００３７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（アミノ酸配列
１）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸３
３７、鎖数：１本鎖
１）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸３
３７、鎖数：１本鎖
【００３８】
【化１１】
【００３９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（アミノ酸配列
２）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸２
４７、鎖数：１本鎖
２）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸２
４７、鎖数：１本鎖
【００４０】
【化１２】
【００４１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（アミノ酸配列
３）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸１
３９、鎖数：１本鎖
３）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸１
３９、鎖数：１本鎖
【００４２】
【化１３】
【００４３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（アミノ酸配列
４）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸１
３０、鎖数：１本鎖
４）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸１
３０、鎖数：１本鎖
【００４４】
【化１４】
【００４５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（アミノ酸配列
５）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸４
５８、鎖数：１本鎖
５）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸４
５８、鎖数：１本鎖
【００４６】
【化１５】
【００４７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（アミノ酸配列
６）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸３
７６、鎖数：１本鎖
６）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸３
７６、鎖数：１本鎖
【００４８】
【化１６】
【００４９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（アミノ酸配列
７）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸７
９９、鎖数：１本鎖
７）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸７
９９、鎖数：１本鎖
【００５０】
【化１７】
【００５１】
【化１８】
【００５２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（アミノ酸配列
８）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸７
７０、鎖数：１本鎖
８）、配列の型：アミノ酸配列、配列長さ：アミノ酸７
７０、鎖数：１本鎖
【００５３】
【化１９】
【００５４】
【化２０】
【００５５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ヌクレイン酸配
列Ａ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩基
対１０１４、鎖数：１本鎖
列Ａ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩基
対１０１４、鎖数：１本鎖
【００５６】
【化２１】
【００５７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ヌクレイン酸
配列Ｂ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対７４４、鎖数：１本鎖
配列Ｂ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対７４４、鎖数：１本鎖
【００５８】
【化２２】
【００５９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ヌクレイン酸
配列Ｃ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対４２０、鎖数：１本鎖
配列Ｃ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対４２０、鎖数：１本鎖
【００６０】
【化２３】
【００６１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ヌクレイン酸
配列Ｄ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対３９３、鎖数：１本鎖
配列Ｄ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対３９３、鎖数：１本鎖
【００６２】
【化２４】
【００６３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（ヌクレイン酸
配列Ｅ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対１３７７、鎖数：１本鎖
配列Ｅ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対１３７７、鎖数：１本鎖
【００６４】
【化２５】
【００６５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ヌクレイン酸
配列Ｆ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対１１３１、鎖数：１本鎖
配列Ｆ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対１１３１、鎖数：１本鎖
【００６６】
【化２６】
【００６７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５（ヌクレイン酸
配列Ｇ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対２４００、鎖数：１本鎖
配列Ｇ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対２４００、鎖数：１本鎖
【００６８】
【化２７】
【００６９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（ヌクレイン酸
配列Ｈ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対２３１３、鎖数：１本鎖
配列Ｈ）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：塩
基対２３１３、鎖数：１本鎖
【００７０】
【化２８】
【００７１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７（オリゴヌクレ
オチド１）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対１００、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド１）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対１００、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００７２】
【化２９】
【００７３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８（オリゴヌクレ
オチド２）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対１００、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド２）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対１００、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００７４】
【化３０】
【００７５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（オリゴヌクレ
オチド３）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対９６、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド３）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対９６、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００７６】
【化３１】
【００７７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０（オリゴヌクレ
オチド４）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対９７、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド４）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対９７、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００７８】
【化３２】
【００７９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（オリゴヌクレ
オチド５）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対４８、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド５）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対４８、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００８０】
【化３３】
【００８１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（オリゴヌクレ
オチド６）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対９６、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド６）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対９６、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００８２】
【化３４】
【００８３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３（オリゴヌクレ
オチド７）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対４８、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド７）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対４８、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００８４】
【化３５】
【００８５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４（オリゴヌクレ
オチド８）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対５０、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド８）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対５０、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００８６】
【化３６】
【００８７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５（オリゴヌクレ
オチド９）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対１００、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド９）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長さ：
塩基対１００、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００８８】
【化３７】
【００８９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６（オリゴヌクレ
オチド１０）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長
さ：塩基対５０、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
オチド１０）、配列の型：ヌクレオチド配列、配列長
さ：塩基対５０、鎖数：１本鎖、トポロジー：直鎖状
【００９０】
【化３８】
【００９１】
【実施例】例 １ １． ＨＩＶ−抗原 ＤＮＡ操作に当り、文献に記載の標準方法を利用した
［Ｍａｎｉａｔｉｓ 及びその他共著、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（１９８２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ ｙｏｒｋ在及びＳｈｅ
ｒｍａｎ及びその他共著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅ
ａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８６），Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ在］。
［Ｍａｎｉａｔｉｓ 及びその他共著、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（１９８２），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ ｙｏｒｋ在及びＳｈｅ
ｒｍａｎ及びその他共著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅ
ａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８６），Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ在］。
【００９２】１．１ 使用したＨＩＶ１−ＤＮＡフラグ
メントの特徴 使用したＨＩＶ１プロウィルスＤＮＡはＢ．Ｈ．ハーン
研究室（Ｈａｈｎ，アラバマ・アット・バーミンガム大
学，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ在）からのＨＩＶ１
−λファージクローンλＷＦ１．１３から由来する。λ
ＷＦ１．１３クローンは交換されていないほぼ完全なプ
ロウィルスＤＮＡ（長さ約９ｋＢｐのＳｓｔＩ／Ｓｓｔ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼフラグメント）を含有する。
このプロウィルスＤＮＡはＡＩＤＳで死亡した患者の末
梢血液細胞からのウィルス単離体から由来する。λＷＦ
１．１３ＤＮＡの部分域（長さ約９ｋＢｐのＳｓｔＩ／
ＳｓｔＩ−，長さ約５．３ｋＢｐのＳｓｔＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ−及び長さ約３．７ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／ＳｓｔＩ−
フラグメント）をＰｒｏｆ． Ｄｒ・Ｈ．ヴォルフ（Ｗ
ｏｌｆ） の研究室（Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ在）でＥ．コリベクター
ｐＵＣ１８の長さ約２．７ｋＢｐのＳｓｔＩ一もしくは
ＳｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ−ベクターフラグメント［Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他共著、Ｇｅｎｅ３
３，１０２〜１１９（１９８５），Ｖｉｅｉｒａ及びＭ
ｅｓｓｉｎｇ共著、Ｇｅｎｅ１９，２５９〜２６８（１
９８２）］にサブクローン化した。この構造はｐＵＣ１
８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／ＳｓｔＩ−９，ｐＵＣ１８
＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ−１９及びｐＵＣ
１８＿ＷＦ１１３＿ＥｃｏＲＩ／ＳｓｔＩ−２８と表わ
された。ＨＩＶＩ−融合蛋白質の発現に使用されるレト
ロウィルスＤＮＡの部分領域ｇａｇ−（約９６０Ｂｐの
ＰｖｕＩＩ／ＢｇｌＩＩ−フラグメント）、ｐｏｌ−
（約７１０ＢｐのＰｖｕＩＩ／ＢｓｐＭＩ−フラグメン
ト）及びｅｎｖ領域（約３１０ＢｐのＲｓａＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−フラグメント）のＤＮＡ配列はザンガーによ
るジデオキシ連鎖切断反応［Ｓａｎｇｅｒ及びその他共
著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４３，１６１〜１７８
（１９８０）］により配列決定した。ＨＩＶゲノム上で
のこれらのＤＮＡ−フラグメントの局在化は図１から明
らかである。ｇａｇ領域からのフラグメントＡ′はＤＮ
Ａ配列Ａ中に含まれかつ融合蛋白質１のＨＩＶ１免疫原
決定因子をコードする。ｐｏｌ領域からのフラグメント
Ｂ′はＤＮＡ配列Ｂ中に包含されかつ融合蛋白質２のＨ
ＩＶ１免疫原決定因子をコードする。ｅｎｖ領域からの
フラグメントＣ′はＤＮＡ配列Ｃ中に包含されかつ融合
蛋白質３のＨＩＶ１免疫原決定因子をコードする。
メントの特徴 使用したＨＩＶ１プロウィルスＤＮＡはＢ．Ｈ．ハーン
研究室（Ｈａｈｎ，アラバマ・アット・バーミンガム大
学，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ在）からのＨＩＶ１
−λファージクローンλＷＦ１．１３から由来する。λ
ＷＦ１．１３クローンは交換されていないほぼ完全なプ
ロウィルスＤＮＡ（長さ約９ｋＢｐのＳｓｔＩ／Ｓｓｔ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼフラグメント）を含有する。
このプロウィルスＤＮＡはＡＩＤＳで死亡した患者の末
梢血液細胞からのウィルス単離体から由来する。λＷＦ
１．１３ＤＮＡの部分域（長さ約９ｋＢｐのＳｓｔＩ／
ＳｓｔＩ−，長さ約５．３ｋＢｐのＳｓｔＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ−及び長さ約３．７ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／ＳｓｔＩ−
フラグメント）をＰｒｏｆ． Ｄｒ・Ｈ．ヴォルフ（Ｗ
ｏｌｆ） の研究室（Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔ，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ在）でＥ．コリベクター
ｐＵＣ１８の長さ約２．７ｋＢｐのＳｓｔＩ一もしくは
ＳｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ−ベクターフラグメント［Ｙａｎ
ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他共著、Ｇｅｎｅ３
３，１０２〜１１９（１９８５），Ｖｉｅｉｒａ及びＭ
ｅｓｓｉｎｇ共著、Ｇｅｎｅ１９，２５９〜２６８（１
９８２）］にサブクローン化した。この構造はｐＵＣ１
８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／ＳｓｔＩ−９，ｐＵＣ１８
＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ−１９及びｐＵＣ
１８＿ＷＦ１１３＿ＥｃｏＲＩ／ＳｓｔＩ−２８と表わ
された。ＨＩＶＩ−融合蛋白質の発現に使用されるレト
ロウィルスＤＮＡの部分領域ｇａｇ−（約９６０Ｂｐの
ＰｖｕＩＩ／ＢｇｌＩＩ−フラグメント）、ｐｏｌ−
（約７１０ＢｐのＰｖｕＩＩ／ＢｓｐＭＩ−フラグメン
ト）及びｅｎｖ領域（約３１０ＢｐのＲｓａＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−フラグメント）のＤＮＡ配列はザンガーによ
るジデオキシ連鎖切断反応［Ｓａｎｇｅｒ及びその他共
著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４３，１６１〜１７８
（１９８０）］により配列決定した。ＨＩＶゲノム上で
のこれらのＤＮＡ−フラグメントの局在化は図１から明
らかである。ｇａｇ領域からのフラグメントＡ′はＤＮ
Ａ配列Ａ中に含まれかつ融合蛋白質１のＨＩＶ１免疫原
決定因子をコードする。ｐｏｌ領域からのフラグメント
Ｂ′はＤＮＡ配列Ｂ中に包含されかつ融合蛋白質２のＨ
ＩＶ１免疫原決定因子をコードする。ｅｎｖ領域からの
フラグメントＣ′はＤＮＡ配列Ｃ中に包含されかつ融合
蛋白質３のＨＩＶ１免疫原決定因子をコードする。
【００９３】１．２ ウィルス単離体ＷＦ１．１３のｅ
ｎｖ領域からの、使用されるＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡ
のサブクローン化（ＤＮＡ配列Ｃ′） プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＥｃｏＲＩ／Ｓｓ
ｔＩ−２８から約３１０Ｂｐの“エンベロープ”領域の
ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントを単離し、か
つ２．７ｋＢｐのｐＵＣ１８ＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ベクターフラグメントに連結した（構造：ｐＵＣ
１８＿ＷＦ１１３＿ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）。ウィ
ルス単離体ＷＦ１．１３のＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−
フラグメントのサブクローン化ＤＮＡ配列は部位１６３
８〜１９４３のウィルス単離体ＷＭＪ−１のＤＮＡ配列
に相当する［Ｓｔａｒｃｉｃｈ及びその他共著、Ｃｅｌ
ｌ，４５，６３７〜６４８（１９８６）］。プラスミド
ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩか
ら長さ約３１０のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグ
メントを単離し、かつ引続いてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断した５．２ｋＢｐのｐＵＲ２８８［Ｒｕｅ
ｔｈｅｒ及びＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ共著、ＥＭＢＯ
Ｊｏｕｒｎａｌ，２，１７９１〜１７９４（１９８
３）］のベクターフラグメントに連結した（構造：ｐＵ
Ｒ２８８＿ＷＦ１１３＿ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ）。再構成により生成したＤＮＡ転移を配列決定し
た。
ｎｖ領域からの、使用されるＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡ
のサブクローン化（ＤＮＡ配列Ｃ′） プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＥｃｏＲＩ／Ｓｓ
ｔＩ−２８から約３１０Ｂｐの“エンベロープ”領域の
ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントを単離し、か
つ２．７ｋＢｐのｐＵＣ１８ＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ベクターフラグメントに連結した（構造：ｐＵＣ
１８＿ＷＦ１１３＿ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）。ウィ
ルス単離体ＷＦ１．１３のＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−
フラグメントのサブクローン化ＤＮＡ配列は部位１６３
８〜１９４３のウィルス単離体ＷＭＪ−１のＤＮＡ配列
に相当する［Ｓｔａｒｃｉｃｈ及びその他共著、Ｃｅｌ
ｌ，４５，６３７〜６４８（１９８６）］。プラスミド
ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩか
ら長さ約３１０のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグ
メントを単離し、かつ引続いてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断した５．２ｋＢｐのｐＵＲ２８８［Ｒｕｅ
ｔｈｅｒ及びＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ共著、ＥＭＢＯ
Ｊｏｕｒｎａｌ，２，１７９１〜１７９４（１９８
３）］のベクターフラグメントに連結した（構造：ｐＵ
Ｒ２８８＿ＷＦ１１３＿ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ）。再構成により生成したＤＮＡ転移を配列決定し
た。
【００９４】１．３ ウィルス単離体ＷＦ１．１３のｇ
ａｇ領域からの、使用されるＨＩＶ１−ｐ１７−ｐ２４
−ｐ１５のサブクローン化（ＤＮＡ配列Ａ′） プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−１９をＰＶｕＩＩで消化させ、ＤＮＡ末端にＥｃ
ｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′）を設
け、プラスミドＤＮＡをＢｇＩＩＩで後切断しかつＢｇ
ＩＩＩ切断位の突出５′末端をクレノウポリメラーゼで
充填した。その後、ＥｃｏＲＩで後切断し、約９６０Ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ／ＢｇＩＩＩ（ブラント）−フラグメン
トを単離しかつ約４．６ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ（ブラント）ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ−ベク
ターフラグメント（例２．４参照）に連結した（構造：
ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１
５）。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ブラント）ｐＫＫ
２３３−２／ＭＹＹＬベクターフラグメントを製造する
にはプラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬをＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化させ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断位の突出５′末
端をクレノウポリメラーゼで充填し、プラスミドＤＮＡ
をＥｃｏＲＩで後切断し、かつその後でベクターフラグ
メントを単離した。
ａｇ領域からの、使用されるＨＩＶ１−ｐ１７−ｐ２４
−ｐ１５のサブクローン化（ＤＮＡ配列Ａ′） プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−１９をＰＶｕＩＩで消化させ、ＤＮＡ末端にＥｃ
ｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′）を設
け、プラスミドＤＮＡをＢｇＩＩＩで後切断しかつＢｇ
ＩＩＩ切断位の突出５′末端をクレノウポリメラーゼで
充填した。その後、ＥｃｏＲＩで後切断し、約９６０Ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ／ＢｇＩＩＩ（ブラント）−フラグメン
トを単離しかつ約４．６ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ（ブラント）ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ−ベク
ターフラグメント（例２．４参照）に連結した（構造：
ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ−ｐ１７−ｐ２４−ｐ１
５）。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ブラント）ｐＫＫ
２３３−２／ＭＹＹＬベクターフラグメントを製造する
にはプラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬをＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化させ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断位の突出５′末
端をクレノウポリメラーゼで充填し、プラスミドＤＮＡ
をＥｃｏＲＩで後切断し、かつその後でベクターフラグ
メントを単離した。
【００９５】１．４ ウィルス単離体ＷＦ１．１３のｐ
ｏｌ領域からの、使用されるＨＩＶ１ｐｏｌ−ｐ３２Ｄ
ＮＡのサブクローン化（ＤＮＡ配列Ｂ′） プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−１９から、使用される約７１０ＢｐのＰｖｕＩＩ
／ＢｓｐＭＩ−フラグメントを含有する、ＨＩＶＩの
“ｐｏｌ”領域からの約９７０ＢｐのＡｓｐ７１８Ｉ／
ＮｄｅＩ−フラグメントを単離し、突出している５′末
端をクレノウポリメラーゼで充填しかつｐＵＣ１８ベク
ター［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他共著、
前記文献（１９８５）］のＨｉｎｃＩＩ切断部位に連結
した（構造：ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＩＮＴ）。
ｏｌ領域からの、使用されるＨＩＶ１ｐｏｌ−ｐ３２Ｄ
ＮＡのサブクローン化（ＤＮＡ配列Ｂ′） プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−１９から、使用される約７１０ＢｐのＰｖｕＩＩ
／ＢｓｐＭＩ−フラグメントを含有する、ＨＩＶＩの
“ｐｏｌ”領域からの約９７０ＢｐのＡｓｐ７１８Ｉ／
ＮｄｅＩ−フラグメントを単離し、突出している５′末
端をクレノウポリメラーゼで充填しかつｐＵＣ１８ベク
ター［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ及びその他共著、
前記文献（１９８５）］のＨｉｎｃＩＩ切断部位に連結
した（構造：ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＩＮＴ）。
【００９６】プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＩＮ
ＴをＰＶｕＩＩで消化させ、ＤＮＡ末端にＥｃｏＲＩリ
ンカー（５′ーＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ−３′）を設け、
プラスミド−ＤＮＡをＢｓｐＭＩで消化させかつＢｓｐ
ＭＩ切断位の突出５′末端をクレノウポリメラーゼで充
填した。その後、ＥｃｏＲＩで後切断し、約７２０Ｂｐ
のＥｃｏＲＩ／ＢｓｐＭＩ（ブラント）−フラグメント
を単離し、かつ４．６ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ（ブラント）−ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬベクタ
ーフラグメントに連結した（構造：ｐＫＫ２３３−２／
ＭＹＹＬ−ｐｏｌ−ｐ３２）。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−（ブラント）−ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬベク
ターフラグメントを製造するに当り、プラスミドｐＫＫ
２３３−２／ＭＹＹＬをＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ切断部位の突出５′末端をＳ１−ヌクレア
ーゼで除去し、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで後切断し、かつそ
の後ベクターフラグメントを単離した。
ＴをＰＶｕＩＩで消化させ、ＤＮＡ末端にＥｃｏＲＩリ
ンカー（５′ーＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ−３′）を設け、
プラスミド−ＤＮＡをＢｓｐＭＩで消化させかつＢｓｐ
ＭＩ切断位の突出５′末端をクレノウポリメラーゼで充
填した。その後、ＥｃｏＲＩで後切断し、約７２０Ｂｐ
のＥｃｏＲＩ／ＢｓｐＭＩ（ブラント）−フラグメント
を単離し、かつ４．６ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ（ブラント）−ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬベクタ
ーフラグメントに連結した（構造：ｐＫＫ２３３−２／
ＭＹＹＬ−ｐｏｌ−ｐ３２）。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−（ブラント）−ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬベク
ターフラグメントを製造するに当り、プラスミドｐＫＫ
２３３−２／ＭＹＹＬをＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ切断部位の突出５′末端をＳ１−ヌクレア
ーゼで除去し、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで後切断し、かつそ
の後ベクターフラグメントを単離した。
【００９７】例 ２ ＨＩＶ２抗原 ２．１ 抗原域の選択及び遺伝子設計 ＨＩＶ２ ＤＮＡ配列（Ｌ．Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ研究
グループが発表）及びその誘導蛋白質配列［Ｇｕｙａｄ
ｅｒ及びその他共著、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６６２〜
６６８（１９８７）］に基いて、ＨＩＶ２“エンベロー
プ”蛋白質ｇｐ３２のトランスメンブラン域から、抗原
インデックス分析［Ｊａｍｅｓｏｎ及びＷｏｌｆ共著、
ＣＡＢＩＯＳ，４，１８１〜１８６（１９８８）；Ｗｏ
ｌｆ及びその他共著、ＣＡＢＩＯＳ，４，１８７〜１９
１（１９８８）］によりアミノ酸４８〜１６２のＨＩＶ
２ｇｐ３２域を選択した。合成ＨＩＶ２−ｇｐ３２部分
遺伝子を“コドン使用法”に関して、ＨＩＶ２−ｇｐ３
２部分蛋白質の発現用の宿主微生物Ｅ．コリ及び酵母の
有用なコドンに適合させた。遺伝子設計では二次構造の
形成を最小にし、かつ更に融合蛋白質に関して好適な単
一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入した。
グループが発表）及びその誘導蛋白質配列［Ｇｕｙａｄ
ｅｒ及びその他共著、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６６２〜
６６８（１９８７）］に基いて、ＨＩＶ２“エンベロー
プ”蛋白質ｇｐ３２のトランスメンブラン域から、抗原
インデックス分析［Ｊａｍｅｓｏｎ及びＷｏｌｆ共著、
ＣＡＢＩＯＳ，４，１８１〜１８６（１９８８）；Ｗｏ
ｌｆ及びその他共著、ＣＡＢＩＯＳ，４，１８７〜１９
１（１９８８）］によりアミノ酸４８〜１６２のＨＩＶ
２ｇｐ３２域を選択した。合成ＨＩＶ２−ｇｐ３２部分
遺伝子を“コドン使用法”に関して、ＨＩＶ２−ｇｐ３
２部分蛋白質の発現用の宿主微生物Ｅ．コリ及び酵母の
有用なコドンに適合させた。遺伝子設計では二次構造の
形成を最小にし、かつ更に融合蛋白質に関して好適な単
一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入した。
【００９８】２．２ 遺伝子合成 合成ＤＮＡ配列Ｄ′の製造に使われるデオキシオリゴヌ
クレオチド及びクローン化法は配列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１７〜２６及び図２に図示されている。
クレオチド及びクローン化法は配列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１７〜２６及び図２に図示されている。
【００９９】原理： それぞれ５個のデオキシオリゴヌクレオチドを末端にそ
れぞれ好適な制限切断部位を有する２個の約２００Ｂｐ
の遺伝子ブロックに接合し、ゲル電気泳動により精製
し、制限酵素で切断しかつＥ．コリｐＵＣ１８ベクター
のポリリンカー領域中にサブクローン化した。ＤＮＡ配
列決定により、サブクローン化した両方の遺伝子ブロッ
クのＤＮＡ配列を確定した。その後、両方のＤＮＡフラ
グメントをｐＵＣ１８ベクター中で単一ＫｐｎＩ切断部
位を介して連結した（構造：ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２＿ｇ
ｐ３２）。
れぞれ好適な制限切断部位を有する２個の約２００Ｂｐ
の遺伝子ブロックに接合し、ゲル電気泳動により精製
し、制限酵素で切断しかつＥ．コリｐＵＣ１８ベクター
のポリリンカー領域中にサブクローン化した。ＤＮＡ配
列決定により、サブクローン化した両方の遺伝子ブロッ
クのＤＮＡ配列を確定した。その後、両方のＤＮＡフラ
グメントをｐＵＣ１８ベクター中で単一ＫｐｎＩ切断部
位を介して連結した（構造：ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２＿ｇ
ｐ３２）。
【０１００】２．３ プラスミドｐＵＣ１８＿Ｈ１Ｖ２
−ｇｐ３２の構成 Ａ） デオキシオリゴヌクレオチド１（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１７）、２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、１０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、９（ＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：２５）及び８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（図２
参照）を反応バッチ（反応緩衝液：１２．５ｍｏｌ／１
トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０及び１２．５ｍｏｌ／１
ＭｇＣｌ２）中でアニーリングし、ハイブリッド化生
成物をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化させ、約２００Ｂ
ｐのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ−フラグメントを単離しかつ
ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化させたｐＵＣ１８−ベク
ターフラグメント中にサブクローン化した（構造：ｐＵ
Ｃ１８＿ＨＩＶ２／ＢＫ）。
−ｇｐ３２の構成 Ａ） デオキシオリゴヌクレオチド１（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１７）、２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、１０
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、９（ＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：２５）及び８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（図２
参照）を反応バッチ（反応緩衝液：１２．５ｍｏｌ／１
トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０及び１２．５ｍｏｌ／１
ＭｇＣｌ２）中でアニーリングし、ハイブリッド化生
成物をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化させ、約２００Ｂ
ｐのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ−フラグメントを単離しかつ
ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化させたｐＵＣ１８−ベク
ターフラグメント中にサブクローン化した（構造：ｐＵ
Ｃ１８＿ＨＩＶ２／ＢＫ）。
【０１０１】Ｂ） デオキシオリゴヌクレオチド３（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２０）、７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、６（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２２）及び５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
１）（図２参照）を前記のＡ）に記載したようにアニー
リングし、ハイブリッド化生成物をＫｐｎＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化させ、約２００ＢｐのＫｐｎＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−フラグメントを単離し、かつＫｐｎＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８−ベクターフラグメ
ント中にサブクローン化した（構造：ｐＵＣ１８＿ＨＩ
Ｖ２／ＫＨ）。
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２０）、７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、６（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２２）及び５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
１）（図２参照）を前記のＡ）に記載したようにアニー
リングし、ハイブリッド化生成物をＫｐｎＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩで消化させ、約２００ＢｐのＫｐｎＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−フラグメントを単離し、かつＫｐｎＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８−ベクターフラグメ
ント中にサブクローン化した（構造：ｐＵＣ１８＿ＨＩ
Ｖ２／ＫＨ）。
【０１０２】Ｃ） プラスミドｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２／
ＫＨから約２００ＢｐのＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フ
ラグメントを単離しかつ約２．７ＫＢｐのＫｐｎＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２／ＢＫ−ベクター
フラグメントに連結した（構造：ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２
−ｇｐ３２）。
ＫＨから約２００ＢｐのＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フ
ラグメントを単離しかつ約２．７ＫＢｐのＫｐｎＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２／ＢＫ−ベクター
フラグメントに連結した（構造：ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２
−ｇｐ３２）。
【０１０３】構造ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２−ｇｐ３２中で
はＨＩＶ２−ｇｐ３２ＤＮＡはｌａｃ−プロモータ／オ
ペレータ制御下にある。ＨＩＶ２−ｇｐ３２ＤＮＡはｐ
ＵＣ１８ポリリンカーのｌａｃＺ−α−ペプチドと転写
解読枠を形成し、それ故Ｅ．コリ中で発現させる際にｌ
ａｃＺ（αペプチド）−ＨＩＶ２−ｇｐ３２融合蛋白質
が合成される。Ｎ末端ｌａｃＺ（αペプチド）部はアミ
ノ酸１３個である。
はＨＩＶ２−ｇｐ３２ＤＮＡはｌａｃ−プロモータ／オ
ペレータ制御下にある。ＨＩＶ２−ｇｐ３２ＤＮＡはｐ
ＵＣ１８ポリリンカーのｌａｃＺ−α−ペプチドと転写
解読枠を形成し、それ故Ｅ．コリ中で発現させる際にｌ
ａｃＺ（αペプチド）−ＨＩＶ２−ｇｐ３２融合蛋白質
が合成される。Ｎ末端ｌａｃＺ（αペプチド）部はアミ
ノ酸１３個である。
【０１０４】２．４ 基本発現プラスミドｐＫＫ２３３
−２／ＭＹＹＬの構成 Ｅ．コリＡＴＧ発現ベクターｐＫＫ２３３−２（ｔｒｃ
−プロモータ、ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポ
リリンカー、５Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子及び転写ターミネー
タＴ１及びＴ２を有するｒｒｎＢフラグメント）はＬＫ
Ｂファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌ
ａ）に由来する。ｐＫＫ２３３−２中の単一のＥｃｏＲ
Ｉ制限切断部位をＥｃｏＲＩによる制限切断、突出５′
末端のクレノウポリメラーゼによる充填及び引続く“ブ
ラントエンド”連結により破壊した（構造：ｐＫＫ２３
３−２／Ｅ）。プラスミドｐＫＫ２３３−２／Ｅ中のＮ
ｃｏＩ−ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリンカーをＮｃ
ｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリン
カーと交換した（構造：ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹ
Ｌ）。これは、Ｎ末端がラクトースパーミアーゼ（ｌａ
ｃＹ）のＮ末端アミノ酸４個で開始する融合蛋白質の構
成を可能にする。
−２／ＭＹＹＬの構成 Ｅ．コリＡＴＧ発現ベクターｐＫＫ２３３−２（ｔｒｃ
−プロモータ、ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポ
リリンカー、５Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子及び転写ターミネー
タＴ１及びＴ２を有するｒｒｎＢフラグメント）はＬＫ
Ｂファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌ
ａ）に由来する。ｐＫＫ２３３−２中の単一のＥｃｏＲ
Ｉ制限切断部位をＥｃｏＲＩによる制限切断、突出５′
末端のクレノウポリメラーゼによる充填及び引続く“ブ
ラントエンド”連結により破壊した（構造：ｐＫＫ２３
３−２／Ｅ）。プラスミドｐＫＫ２３３−２／Ｅ中のＮ
ｃｏＩ−ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリンカーをＮｃ
ｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリン
カーと交換した（構造：ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹ
Ｌ）。これは、Ｎ末端がラクトースパーミアーゼ（ｌａ
ｃＹ）のＮ末端アミノ酸４個で開始する融合蛋白質の構
成を可能にする。
【０１０５】プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬを
製造するに当り、プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＥをＮ
ｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、約４．６ｋＢｐ
のｐＫＫ２３３−２／Ｅ ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ−ベク
ターフラグメントを単離し、かつＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ
−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリンカーと連結させ
た。ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
ポリリンカーはハイブリッド化により次の２つのデオキ
シオリゴヌクレオチドから製造した。
製造するに当り、プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＥをＮ
ｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、約４．６ｋＢｐ
のｐＫＫ２３３−２／Ｅ ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ−ベク
ターフラグメントを単離し、かつＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ
−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩポリリンカーと連結させ
た。ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
ポリリンカーはハイブリッド化により次の２つのデオキ
シオリゴヌクレオチドから製造した。
【０１０６】 ＸｂａＩ （ＮｃｏＩ） ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ ＣＡＴＧＴＡＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡ ＡＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡ ＭｅｔＴｙｒＴｙｒＬｅｕ −−−−−−＞ ２．５ プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩ
Ｖ２−ｇｐ３２の構成約４．６ｋＢｐのｐＫＫ２３３−
２／ＭＹＹＬ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩベクターフ
ラグメントにｐＵＣ１８＿ＨＩＶ−ｇｐ３２からの約４
００ＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメント
を連結した。ｌａｃＹ−ＨＩＶ２融合蛋白質４はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４にかつコードするＤＮＡ配列ＤはＳＥ
Ｑ ＩＤＮＯ：１２に示されている。
Ｖ２−ｇｐ３２の構成約４．６ｋＢｐのｐＫＫ２３３−
２／ＭＹＹＬ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩベクターフ
ラグメントにｐＵＣ１８＿ＨＩＶ−ｇｐ３２からの約４
００ＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメント
を連結した。ｌａｃＹ−ＨＩＶ２融合蛋白質４はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４にかつコードするＤＮＡ配列ＤはＳＥ
Ｑ ＩＤＮＯ：１２に示されている。
【０１０７】２．６ ＨＩＶ２−ｇｐ３２融合蛋白質を
Ｅ．コリ中で発現 宿主菌株として公知のＥ．コリＫ１２菌株ＲＭ８２１ａ
ｃ＋［ｍｅｔ＋，ｌａｃ＋ＥＤ８６５４の復帰変異体；
Ｍｕｒｒａｙ 及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，１５０，５３〜６１（１９７７）］、ＨＢ１
０１［Ｍａｎｉａｔｉｓ 及びその他共著、前記文献
（１９８２）］及びＫ１６５［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ 及
び Ｖａｎ Ｂｏｇｅｌｅｎ 共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１００，８
８４〜９００（１９８１）］を使用した。ＨＩＶ２−ｇ
ｐ３２融合蛋白質の発現はｌａｃＩｑリプレッサープラ
スミドｐＦＤＸ５００（前記文献、第８頁参照）の不存
在及び存在において試験した。ＲＭ８２ｌａｃ＋、ＨＢ
１０１及びＫ１６５もしくはｌａｃＩｑリプレッサープ
ラスミドｐＦＤＸ５００で同時形質転換されたＲＭ８２
ｌａｃ＋、ＨＢ１０１及びＫ１６５をそれぞれＨＩＶ２
−ｇｐ３２発現プラスミドｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２−ｇｐ
３２及びｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩＶ２−ｇｐ
３２で形質転換し、かつ引続いて５０ｍｇ／ｌアンピシ
リンもしくは５０ｍｇ／ｌアンピシリン＋５０ｍｇ／ｌ
カナマイシンを追加したＤＹＴ培地（１１当りバクトト
リプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣ１５ｇ）中
３０℃で培養した。光学密度０．６〜０．８／５５０ｎ
ｍの達成後、細胞をＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド、最終濃度１ｍｍｏｌ／ｌ）で
誘導した。５〜２０時間の誘導後に試料１ｍｌを採取
し、細胞を遠心分離し、１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝
液ｐＨ６．８で洗浄しかつ更に加工処理するまで−２０
℃で貯蔵した。
Ｅ．コリ中で発現 宿主菌株として公知のＥ．コリＫ１２菌株ＲＭ８２１ａ
ｃ＋［ｍｅｔ＋，ｌａｃ＋ＥＤ８６５４の復帰変異体；
Ｍｕｒｒａｙ 及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，１５０，５３〜６１（１９７７）］、ＨＢ１
０１［Ｍａｎｉａｔｉｓ 及びその他共著、前記文献
（１９８２）］及びＫ１６５［Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ 及
び Ｖａｎ Ｂｏｇｅｌｅｎ 共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１００，８
８４〜９００（１９８１）］を使用した。ＨＩＶ２−ｇ
ｐ３２融合蛋白質の発現はｌａｃＩｑリプレッサープラ
スミドｐＦＤＸ５００（前記文献、第８頁参照）の不存
在及び存在において試験した。ＲＭ８２ｌａｃ＋、ＨＢ
１０１及びＫ１６５もしくはｌａｃＩｑリプレッサープ
ラスミドｐＦＤＸ５００で同時形質転換されたＲＭ８２
ｌａｃ＋、ＨＢ１０１及びＫ１６５をそれぞれＨＩＶ２
−ｇｐ３２発現プラスミドｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２−ｇｐ
３２及びｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩＶ２−ｇｐ
３２で形質転換し、かつ引続いて５０ｍｇ／ｌアンピシ
リンもしくは５０ｍｇ／ｌアンピシリン＋５０ｍｇ／ｌ
カナマイシンを追加したＤＹＴ培地（１１当りバクトト
リプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣ１５ｇ）中
３０℃で培養した。光学密度０．６〜０．８／５５０ｎ
ｍの達成後、細胞をＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド、最終濃度１ｍｍｏｌ／ｌ）で
誘導した。５〜２０時間の誘導後に試料１ｍｌを採取
し、細胞を遠心分離し、１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝
液ｐＨ６．８で洗浄しかつ更に加工処理するまで−２０
℃で貯蔵した。
【０１０８】２．７ 細胞砕壊、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロッ
ト分析 細胞ペレットを１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ
６．８及び１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ０．２５ｍｌ中に
再懸濁させ、かつ細胞を超音波処理により砕解した。遠
心分離後、上澄みに１／５容量の５×ＳＤＳ試料緩衝液
（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス／
ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％メルカプトエタ
ノール、１０％グリセリン、０．００１％ブロムフェノ
ールブルー）を加え、不溶の細胞砕解フラクションを
０．３ｍｌの１×ＳＤＳ試料緩衝液及び６ｍｏｌ／ｌ尿
素中に再懸濁させ、試料を９５℃で５分間恒温保持し、
遠心分離し、蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０〜６８５（１９７０）］、かつ引続
いてクマシーブリリアントブルーＲで染色した。交互に
もしくは平行して電気泳動により分離した蛋白質をニト
ロセルロースフィルター上に移し、固定させ［Ｔｏｗｂ
ｉｎ及びその他共著、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，７６，４３５０（１９７９）］かつヒトＨＩ
Ｖ１もしくはＨＩＶ１及びＨＩＶ２血清のパネルに対す
るＨＩＶ融合蛋白質の免疫反応性を確認した。
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロッ
ト分析 細胞ペレットを１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ
６．８及び１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ０．２５ｍｌ中に
再懸濁させ、かつ細胞を超音波処理により砕解した。遠
心分離後、上澄みに１／５容量の５×ＳＤＳ試料緩衝液
（１×ＳＤＳ試料緩衝液：５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス／
ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％メルカプトエタ
ノール、１０％グリセリン、０．００１％ブロムフェノ
ールブルー）を加え、不溶の細胞砕解フラクションを
０．３ｍｌの１×ＳＤＳ試料緩衝液及び６ｍｏｌ／ｌ尿
素中に再懸濁させ、試料を９５℃で５分間恒温保持し、
遠心分離し、蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し［Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０〜６８５（１９７０）］、かつ引続
いてクマシーブリリアントブルーＲで染色した。交互に
もしくは平行して電気泳動により分離した蛋白質をニト
ロセルロースフィルター上に移し、固定させ［Ｔｏｗｂ
ｉｎ及びその他共著、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，７６，４３５０（１９７９）］かつヒトＨＩ
Ｖ１もしくはＨＩＶ１及びＨＩＶ２血清のパネルに対す
るＨＩＶ融合蛋白質の免疫反応性を確認した。
【０１０９】構成物ｐＵＣ１８＿ＨＩＶ２−ｇｐ３２に
関しては試験したＥ．コリ宿主菌株中でＥ．コリの全蛋
白質に対して０．１〜１％の非常に僅かなＨＩＶ２−ｇ
ｐ３２発現がそれぞれ認められた。ｌａｃＩｑリプレッ
サープラスミドｐＦＤＸ５００の存在においては発現値
＜０．１％が明らかになった。
関しては試験したＥ．コリ宿主菌株中でＥ．コリの全蛋
白質に対して０．１〜１％の非常に僅かなＨＩＶ２−ｇ
ｐ３２発現がそれぞれ認められた。ｌａｃＩｑリプレッ
サープラスミドｐＦＤＸ５００の存在においては発現値
＜０．１％が明らかになった。
【０１１０】構成物ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩ
Ｖ２−ｇｐ３２に関しては菌株Ｋ１６５中でｌａｃＩｑ
リプレッサープラスミドの不存在において最良の発現値
（Ｅ．コリ全蛋白質に対して５〜１０％）が認められ
た。ｌａｃＩｑリプレッサープラスミドｐＦＤＸ５００
の存在では発現値は２〜５％に低下した。
Ｖ２−ｇｐ３２に関しては菌株Ｋ１６５中でｌａｃＩｑ
リプレッサープラスミドの不存在において最良の発現値
（Ｅ．コリ全蛋白質に対して５〜１０％）が認められ
た。ｌａｃＩｑリプレッサープラスミドｐＦＤＸ５００
の存在では発現値は２〜５％に低下した。
【０１１１】ＨＩＶ２−ｇｐ３２ポリペプチドはＥ．コ
リ中で専ら不溶性の蛋白質の凝集物［“封入体”“屈折
体”（ＲＢｓ）：Ｍａｒｓｔｏｎ著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，２４０，１〜１２（１９８６）］として合成さ
れ、これは不溶性細胞砕壊フラクションから１×ＳＤＳ
試料緩衝液もしくは６ｍｏｌ／ｌ尿素を含有する１×Ｓ
ＤＳ試料緩衝液で溶解した。ＨＩＶ２−ｇｐ３２融合蛋
白質はヒトＨＩＶ２血清とだけ反応し、かつウエスタン
ブロット分析においてヒトＨＩＶ１血清との交叉反応を
呈示しなかった。
リ中で専ら不溶性の蛋白質の凝集物［“封入体”“屈折
体”（ＲＢｓ）：Ｍａｒｓｔｏｎ著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．，２４０，１〜１２（１９８６）］として合成さ
れ、これは不溶性細胞砕壊フラクションから１×ＳＤＳ
試料緩衝液もしくは６ｍｏｌ／ｌ尿素を含有する１×Ｓ
ＤＳ試料緩衝液で溶解した。ＨＩＶ２−ｇｐ３２融合蛋
白質はヒトＨＩＶ２血清とだけ反応し、かつウエスタン
ブロット分析においてヒトＨＩＶ１血清との交叉反応を
呈示しなかった。
【０１１２】２．８ ＨＩＶ２−ｇｐ３２ポリペプチド
の大規模な精製 プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩＶ２−ｇ
ｐ３２で形質転換されたＥ．コリＫ１６５細胞を５１−
発酵槽中の５０ｍｇ／ｌアンピシリン及び１％グルコー
スを含有するＤＹＴ培地で３０℃でｐＨ安定化下（ｐＨ
７．５；接種菌１％静置予備培地）に培養した。光学密
度０．８〜１．０／５５０ｎｍを達成したら細胞を１ｍ
ｍｏｌ／ｌ ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導した。誘導期
１５時間後に細胞（バイオマス収量：湿潤時重量２０ｇ
／発酵培地１）を遠心分離により収獲し、かつ１０ｍｍ
ｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８で洗った。細胞壁を
リゾチームで消化させ、かつ引続いて細胞を機械的に
（フレンチプレス）砕壊した。その後、不溶性ＨＩＶ２
−ｇｐ３２ＲＢｓを、遠心分離しかつ洗浄した細胞砕壊
フラクションから６〜８ｍｏｌ／ｌ尿素で抽出し（ヨー
ロッパ特許公開第０３６１４７５号明細書、例１参
照）、かつ引続いて常法により［イオン交換クロマトグ
ラフィ及び６〜８ｍｍｏｌ／ｌ尿素中でゲル濾過、Ｍａ
ｒｓｔｏｎ及びその他共著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ２，８００〜８０４（１９８４）；Ｃａｂｒａｄｉ
ｌｌａ及びその他共著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４，１２８〜１３３（１９８６）］純度＞９８％に精製
した。
の大規模な精製 プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩＶ２−ｇ
ｐ３２で形質転換されたＥ．コリＫ１６５細胞を５１−
発酵槽中の５０ｍｇ／ｌアンピシリン及び１％グルコー
スを含有するＤＹＴ培地で３０℃でｐＨ安定化下（ｐＨ
７．５；接種菌１％静置予備培地）に培養した。光学密
度０．８〜１．０／５５０ｎｍを達成したら細胞を１ｍ
ｍｏｌ／ｌ ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導した。誘導期
１５時間後に細胞（バイオマス収量：湿潤時重量２０ｇ
／発酵培地１）を遠心分離により収獲し、かつ１０ｍｍ
ｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８で洗った。細胞壁を
リゾチームで消化させ、かつ引続いて細胞を機械的に
（フレンチプレス）砕壊した。その後、不溶性ＨＩＶ２
−ｇｐ３２ＲＢｓを、遠心分離しかつ洗浄した細胞砕壊
フラクションから６〜８ｍｏｌ／ｌ尿素で抽出し（ヨー
ロッパ特許公開第０３６１４７５号明細書、例１参
照）、かつ引続いて常法により［イオン交換クロマトグ
ラフィ及び６〜８ｍｍｏｌ／ｌ尿素中でゲル濾過、Ｍａ
ｒｓｔｏｎ及びその他共著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ２，８００〜８０４（１９８４）；Ｃａｂｒａｄｉ
ｌｌａ及びその他共著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
４，１２８〜１３３（１９８６）］純度＞９８％に精製
した。
【０１１３】例 ３ ＨＩＶ１−ｇｐ４１融合蛋白質 ３．１ プラスミド：ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿Ｒｓａ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ 構造ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（例１参照）中にＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡ（Ｒｓａ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメント）が１ａｃプロモー
タの制御下に存在する。ＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡはｐ
ＵＣ１８ポリリンカーのｌａｃＺ−αペプチドＤＮＡと
転写解読枠を形成し、それ故Ｅ．コリ中で発現させる際
にＮ末端及びＣ末端にＨＩＶ１ＤＮＡでコードされなか
ったアミノ酸をそれぞれ１７個及び８３個含有するｌａ
ｃＺ（αペプチド）−ＨＩＶ１−ｇｐ４１融合蛋白質が
合成される。しかしながらこのＨＩＶ１−ｇｐ４１ポリ
ペプチドの発現は試験Ｅ．コリ宿主菌株ＪＭ１０９、Ｈ
Ｂ１０１及びＲＭ８２ｌａｃ＋中で付加的なｌａｃＩｑ
リプレッサープラスミドの不存在及び存在において
（Ｆ′エピソーム ＪＭ１０９中もしくはプラスミドｐ
ＦＤＸ５００との同時形質転換、例２参照）検出限界下
にあった。
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ 構造ｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＲｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（例１参照）中にＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡ（Ｒｓａ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメント）が１ａｃプロモー
タの制御下に存在する。ＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡはｐ
ＵＣ１８ポリリンカーのｌａｃＺ−αペプチドＤＮＡと
転写解読枠を形成し、それ故Ｅ．コリ中で発現させる際
にＮ末端及びＣ末端にＨＩＶ１ＤＮＡでコードされなか
ったアミノ酸をそれぞれ１７個及び８３個含有するｌａ
ｃＺ（αペプチド）−ＨＩＶ１−ｇｐ４１融合蛋白質が
合成される。しかしながらこのＨＩＶ１−ｇｐ４１ポリ
ペプチドの発現は試験Ｅ．コリ宿主菌株ＪＭ１０９、Ｈ
Ｂ１０１及びＲＭ８２ｌａｃ＋中で付加的なｌａｃＩｑ
リプレッサープラスミドの不存在及び存在において
（Ｆ′エピソーム ＪＭ１０９中もしくはプラスミドｐ
ＦＤＸ５００との同時形質転換、例２参照）検出限界下
にあった。
【０１１４】３．２ プラスミドｐＫＫ２３３−２／Ｍ
ＹＹＬ−ｇｐ４１の構成 約４．６ｋＢｐのｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ Ｅｃｏ
ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ベクターフラグメント（構造ｐ
ＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ、例２参照）にプラスミドｐ
ＵＲ２８８＿ＷＦ１１３＿ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
からの約３２０ＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フ
ラグメント（例１参照）を連結する。このプラスミドに
はＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡがｔｒｃプロモータの制御
下に存在する。ＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡはプラスミド
ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ中のポリリンカーのｌａｃ
Ｙ ＤＮＡと転写解読枠を形成し、それ故Ｅ．コリ中で
発現させる際に、ラクトースパーミアーゼ（ｌａｃＹ）
の４個のＮ末端アミノ酸ＭｅｔＴｙｒＴｙｒＬｅｕ、融
合部位に構造に由来する２２個のアミノ酸、エンベロー
プｇｐ４１膜蛋白質からの１０１個のアミノ酸及びＣ末
端に構造上のアミノ酸１２個より成るＨＩＶ１−ｇｐ４
１融合蛋白質が形成する。この蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列ＣはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及びそれから誘導
される蛋白質配列３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され
ている。
ＹＹＬ−ｇｐ４１の構成 約４．６ｋＢｐのｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ Ｅｃｏ
ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ベクターフラグメント（構造ｐ
ＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ、例２参照）にプラスミドｐ
ＵＲ２８８＿ＷＦ１１３＿ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
からの約３２０ＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フ
ラグメント（例１参照）を連結する。このプラスミドに
はＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡがｔｒｃプロモータの制御
下に存在する。ＨＩＶ１−ｇｐ４１ＤＮＡはプラスミド
ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ中のポリリンカーのｌａｃ
Ｙ ＤＮＡと転写解読枠を形成し、それ故Ｅ．コリ中で
発現させる際に、ラクトースパーミアーゼ（ｌａｃＹ）
の４個のＮ末端アミノ酸ＭｅｔＴｙｒＴｙｒＬｅｕ、融
合部位に構造に由来する２２個のアミノ酸、エンベロー
プｇｐ４１膜蛋白質からの１０１個のアミノ酸及びＣ末
端に構造上のアミノ酸１２個より成るＨＩＶ１−ｇｐ４
１融合蛋白質が形成する。この蛋白質をコードするＤＮ
Ａ配列ＣはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及びそれから誘導
される蛋白質配列３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され
ている。
【０１１５】プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ−
ｇｐ４１で形質転換したＥ．コリＨＢ１０１宿主細胞で
はｌａｃＩｑリプレッサープラスミドｐＦＤＸ５００
（同時形質転換）が存在する場合だけＨＩＶ１−ｇｐ４
１融合蛋白質が合成した（発現高さ：Ｅ．コリ全蛋白質
に対して１〜２％）。発現分析（細胞培養、誘導、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析）を例２に記
載したように実施した。
ｇｐ４１で形質転換したＥ．コリＨＢ１０１宿主細胞で
はｌａｃＩｑリプレッサープラスミドｐＦＤＸ５００
（同時形質転換）が存在する場合だけＨＩＶ１−ｇｐ４
１融合蛋白質が合成した（発現高さ：Ｅ．コリ全蛋白質
に対して１〜２％）。発現分析（細胞培養、誘導、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析）を例２に記
載したように実施した。
【０１１６】付加的に宿主細胞中にＥ．コリ中で稀なア
ルギニン−ｔＲＮＡ・Ａｒｇ（アンチコドン：ＡＧＡ、
ＡＧＧ）の遺伝子を導入する場合に、ＨＩＶ１−ｇｐ４
１融合蛋白質の発現をＥ．コリ全蛋白質の２０％以上に
高めることができ驚異的であった。これは、プラスミド
ｐＦＤＸ５００（前記文献、第８頁参照）の代りにｄｎ
ａＹ−ｌａｃＩｑ−プラスミドｐＵＢＳ５００（ヨーロ
ッパ公開特許第０３６８３４２号公報）で同時形質転換
することにより達成された。
ルギニン−ｔＲＮＡ・Ａｒｇ（アンチコドン：ＡＧＡ、
ＡＧＧ）の遺伝子を導入する場合に、ＨＩＶ１−ｇｐ４
１融合蛋白質の発現をＥ．コリ全蛋白質の２０％以上に
高めることができ驚異的であった。これは、プラスミド
ｐＦＤＸ５００（前記文献、第８頁参照）の代りにｄｎ
ａＹ−ｌａｃＩｑ−プラスミドｐＵＢＳ５００（ヨーロ
ッパ公開特許第０３６８３４２号公報）で同時形質転換
することにより達成された。
【０１１７】例 ４ “多官能性”ＨＩＶ融合蛋白質 原理： レコンビナントＤＮＡ工学により、数種のプロウィルス
遺伝子領域のＤＮＡ部分域から成りかつ転写解読枠を形
成する人工ＨＩＶ融合遺伝子を製造する。これにより、
１つのウィルスの異なるレトロウィルス蛋白質の所望の
抗原域（例えばＨＩＶ１のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ領
域から）及び／又は例えばＨＩＶ１及びＨＩＶ２のよう
な２種のウィルスの所望の抗原域を有する多官能性ＨＩ
Ｖ融合蛋白質が生成する。多官能性融合抗原の開発は生
産上の理由（経費節約）で非常に興味深い。更に、これ
らの融合抗原では構成の際にもたらされる外来蛋白質配
列の割合が減少した。
遺伝子領域のＤＮＡ部分域から成りかつ転写解読枠を形
成する人工ＨＩＶ融合遺伝子を製造する。これにより、
１つのウィルスの異なるレトロウィルス蛋白質の所望の
抗原域（例えばＨＩＶ１のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ領
域から）及び／又は例えばＨＩＶ１及びＨＩＶ２のよう
な２種のウィルスの所望の抗原域を有する多官能性ＨＩ
Ｖ融合蛋白質が生成する。多官能性融合抗原の開発は生
産上の理由（経費節約）で非常に興味深い。更に、これ
らの融合抗原では構成の際にもたらされる外来蛋白質配
列の割合が減少した。
【０１１８】４．１ ＨＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−Ｈ
ＩＶ１（ｐｏｌｐ３２）融合蛋白質 発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２
＿ｐｏｌｐ３２の構成 プラスミドｐＵＣ＿ＷＦ１１３＿ＩＮＴ（例１参照）を
ＢａｍＨＩ及びＢＳｐＭＩで消化させ、ＢａｍＨＩ−及
びＢｓｐＭＩ切断部位の突出５′末端をクレノウポリメ
ラーゼで充填し、約７３０ＢｐのＢａｍＨＩ（ブラン
ト）／ＢｓｐＭＩ（ブラント）−フラグメントを単離し
かつ発現ベクターのｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩ
Ｖ２−ｇｐ３２（例２参照）の単一のＥｃｏＲＶ切断部
位に連結した。所望の構造、ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹ
Ｌ＿ｇｐ３２＿ｐｏｌｐ３２（挿入されたＢａｍＨＩ
（ブラント）／ＢｓｐＭＩ（ブラント）−フラグメント
の正しい配向）は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及
びＸｂａＩで切断することにより確定した。コードする
ＤＮＡ配列ＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４から及びＨＩ
Ｖ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２）融
合抗原６の蛋白質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６から明
らかである。
ＩＶ１（ｐｏｌｐ３２）融合蛋白質 発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２
＿ｐｏｌｐ３２の構成 プラスミドｐＵＣ＿ＷＦ１１３＿ＩＮＴ（例１参照）を
ＢａｍＨＩ及びＢＳｐＭＩで消化させ、ＢａｍＨＩ−及
びＢｓｐＭＩ切断部位の突出５′末端をクレノウポリメ
ラーゼで充填し、約７３０ＢｐのＢａｍＨＩ（ブラン
ト）／ＢｓｐＭＩ（ブラント）−フラグメントを単離し
かつ発現ベクターのｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ＨＩ
Ｖ２−ｇｐ３２（例２参照）の単一のＥｃｏＲＶ切断部
位に連結した。所望の構造、ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹ
Ｌ＿ｇｐ３２＿ｐｏｌｐ３２（挿入されたＢａｍＨＩ
（ブラント）／ＢｓｐＭＩ（ブラント）−フラグメント
の正しい配向）は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及
びＸｂａＩで切断することにより確定した。コードする
ＤＮＡ配列ＦはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４から及びＨＩ
Ｖ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２）融
合抗原６の蛋白質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６から明
らかである。
【０１１９】４．２ ＨＩＶ１（ｅｎｖｇｐ４１）−
（ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）融合蛋白質 発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ４１
−ｐ２４の構成 プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−１９（例１参照）をＢｇＩＩＩで消化させ、Ｂｇ
ＩＩＩ切断部位の突出５′末端をクレノウポリメラーゼ
で充填し、該プラスミドをＰｖｕＩＩで後切断し、約９
６０のＰｖｕＩＩ／ＢｇＩＩＩ（ブラント）−フラグメ
ントを単離しかつ発現ベクターｐＫＫ２３３−２／ＭＹ
ＹＬ＿ｇｐ４１（例３参照）のＨＩＶ１−ｇｐ４１の単
一のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部
位の突出５′末端の充填後に連結した。所望の構造ｐＫ
Ｋ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ４１＿ｐ２４（挿入した
ＰｖｕＩＩ／ＢｇｌＩＩ（ブラント）−フラグメントの
正しい配向）は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及び
ＰｓｔＩで制限分析することにより確定した。コードす
るＤＮＡ配列ＥはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３にかつＨＩ
Ｖ１（ｅｎｖｇｐ４１）−（ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ
１５）融合蛋白質の蛋白質配列５はＳＥＱＩＤ ＮＯ：
５に示されている。
（ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）融合蛋白質 発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ４１
−ｐ２４の構成 プラスミドｐＵＣ１８＿ＷＦ１１３＿ＳｓｔＩ／Ｅｃｏ
ＲＩ−１９（例１参照）をＢｇＩＩＩで消化させ、Ｂｇ
ＩＩＩ切断部位の突出５′末端をクレノウポリメラーゼ
で充填し、該プラスミドをＰｖｕＩＩで後切断し、約９
６０のＰｖｕＩＩ／ＢｇＩＩＩ（ブラント）−フラグメ
ントを単離しかつ発現ベクターｐＫＫ２３３−２／ＭＹ
ＹＬ＿ｇｐ４１（例３参照）のＨＩＶ１−ｇｐ４１の単
一のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部
位の突出５′末端の充填後に連結した。所望の構造ｐＫ
Ｋ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ４１＿ｐ２４（挿入した
ＰｖｕＩＩ／ＢｇｌＩＩ（ブラント）−フラグメントの
正しい配向）は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及び
ＰｓｔＩで制限分析することにより確定した。コードす
るＤＮＡ配列ＥはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３にかつＨＩ
Ｖ１（ｅｎｖｇｐ４１）−（ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ
１５）融合蛋白質の蛋白質配列５はＳＥＱＩＤ ＮＯ：
５に示されている。
【０１２０】４．３ ＨＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−Ｈ
ＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−ｅｎｖｇｐ４１−ｇａｇｐ１７
−ｐ２４−ｐ１５）融合蛋白質 発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２
＿ｐｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４の構成 プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２（例４．１参照）からは約４．７ｋＢｐのＢ
ｇｌＩＩ／ＰｖｕＩ−ベクターフラグメントをかつプラ
スミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ４１＿ｐ２４
（例４．２参照）からは約２．２ｋＢｐのＢａｍＨＩ／
ＰｖｕＩ−ベクターフラグメントを単離した。その後、
両方のベクターフラグメントを連結しかつ所望のプラス
ミド構造（ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４）を制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ及びＰｖｕＩで制限分析する
ことにより確定した。コードするＤＮＡ配列ＧはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５にかつそれから誘導したＨＩＶ２
（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−ｅｎｖ
ｇｐ４１−ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）融合蛋白質
７の蛋白質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示した。
ＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−ｅｎｖｇｐ４１−ｇａｇｐ１７
−ｐ２４−ｐ１５）融合蛋白質 発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２
＿ｐｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４の構成 プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２（例４．１参照）からは約４．７ｋＢｐのＢ
ｇｌＩＩ／ＰｖｕＩ−ベクターフラグメントをかつプラ
スミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ４１＿ｐ２４
（例４．２参照）からは約２．２ｋＢｐのＢａｍＨＩ／
ＰｖｕＩ−ベクターフラグメントを単離した。その後、
両方のベクターフラグメントを連結しかつ所望のプラス
ミド構造（ｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４）を制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ及びＰｖｕＩで制限分析する
ことにより確定した。コードするＤＮＡ配列ＧはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１５にかつそれから誘導したＨＩＶ２
（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−ｅｎｖ
ｇｐ４１−ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）融合蛋白質
７の蛋白質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示した。
【０１２１】多官能性ＨＩＶ融合蛋白質を発現するに当
り、ｄｎａＹ−ｌａｃＩｑプラスミドｐＵＢＳ５００で
同時形質転換したＥ．コリＲＭ８２ｌａｃ＋細胞を使用
した。融合蛋白質はＥ．コリの全蛋白質の２０％まで合
成し、不溶性（ＲＢｓ）かつ免疫学的に活性であった。
融合蛋白質中に存在するＨＩＶ１のｇａｇ−、ｐｏｌ−
及びｅｎｖ領域及びＨＩＶ２のｅｎｖ−領域の抗原決定
因子はすべて免疫学的に反応性である。検出は特異的な
モノクロナール抗体（ｇａｇ）及びヒトＨＩＶ１（ｅｎ
ｖ、ｐｏｌ）及びＨＩＶ２（ｅｎｖ）血清を介して行な
った。発現分析（細胞培養、誘導、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びウエスタンブロット分析）は例２と同様に実施した。
り、ｄｎａＹ−ｌａｃＩｑプラスミドｐＵＢＳ５００で
同時形質転換したＥ．コリＲＭ８２ｌａｃ＋細胞を使用
した。融合蛋白質はＥ．コリの全蛋白質の２０％まで合
成し、不溶性（ＲＢｓ）かつ免疫学的に活性であった。
融合蛋白質中に存在するＨＩＶ１のｇａｇ−、ｐｏｌ−
及びｅｎｖ領域及びＨＩＶ２のｅｎｖ−領域の抗原決定
因子はすべて免疫学的に反応性である。検出は特異的な
モノクロナール抗体（ｇａｇ）及びヒトＨＩＶ１（ｅｎ
ｖ、ｐｏｌ）及びＨＩＶ２（ｅｎｖ）血清を介して行な
った。発現分析（細胞培養、誘導、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びウエスタンブロット分析）は例２と同様に実施した。
【０１２２】例 ５ 精製手段を有するＨＩＶポリペプチド プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４−ポリＡｒｇＬｙｓ プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４の単一のＡｐａＩ切断部
位中に１３個の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）を
コードするポリリンカーを連結した。
ｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４−ポリＡｒｇＬｙｓ プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ＿ｇｐ３２＿ｐ
ｏｌｐ３２＿ｇｐ４１＿ｐ２４の単一のＡｐａＩ切断部
位中に１３個の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）を
コードするポリリンカーを連結した。
【０１２３】 ｄｎａＹ−ｌａｃＩｑプラスミドｐＵＢＳ５００で同時
形質転換されているＲＭ８２ｌａｃ＋細胞中のＨＩＶ２
（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−ｅｎｖ
ｇｐ４１−ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５−ポリ（Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ）融合蛋白質の発現及びこの融合蛋白質のヒ
トＨＩＶ１及びＨＩＶ２血清に対する免疫学的挙動はＨ
ＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−
ｅｎｖｇｐ４１−ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）融合
蛋白質に相当した（例４参照）。コードするＤＮＡ配列
ＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６からかつそれから誘導さ
れるＨＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ
３２−ｅｎｖｇｐ４１−ｇ ａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１
５ポリ（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）融合蛋白質の蛋白質配列８は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から明らかである。
形質転換されているＲＭ８２ｌａｃ＋細胞中のＨＩＶ２
（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−ｅｎｖ
ｇｐ４１−ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５−ポリ（Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ）融合蛋白質の発現及びこの融合蛋白質のヒ
トＨＩＶ１及びＨＩＶ２血清に対する免疫学的挙動はＨ
ＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ３２−
ｅｎｖｇｐ４１−ｇａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１５）融合
蛋白質に相当した（例４参照）。コードするＤＮＡ配列
ＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６からかつそれから誘導さ
れるＨＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶ１（ｐｏｌｐ
３２−ｅｎｖｇｐ４１−ｇ ａｇｐ１７−ｐ２４−ｐ１
５ポリ（Ａｒｇ−Ｌｙｓ）融合蛋白質の蛋白質配列８は
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から明らかである。
【０１２４】例 ６ 抗−ＨＩＶ−抗体の免疫学的測定 微量滴定板（Ｄｉｎａｔｅｃｈ）に塗布するために、１
００ｍｍｏｌ／ｌ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
中の抗原含有溶液を濃度４μｇ／ｍｌに稀釈しかつ室温
で１８時間恒温保持する。
００ｍｍｏｌ／ｌ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
中の抗原含有溶液を濃度４μｇ／ｍｌに稀釈しかつ室温
で１８時間恒温保持する。
【０１２５】引続いて室温で１時間牛血清アルブミン
（１０ｍｇ／ｍｌ）と共にリン酸塩で緩衝させた食塩溶
液（ＰＢＳ：０．１５ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム；
０．９％ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）中で後恒温保持する
（１０ｍｇ／ｍｌ）と共にリン酸塩で緩衝させた食塩溶
液（ＰＢＳ：０．１５ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム；
０．９％ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）中で後恒温保持する
【０１２６】ヒト血清又はヒト血しょうと恒温保持する
前及び試験段階の間にそれぞれ３回０．５％ツィーン２
０含有脱鉱物水で洗浄する
前及び試験段階の間にそれぞれ３回０．５％ツィーン２
０含有脱鉱物水で洗浄する
【０１２７】試料（ヒト血清又はヒト血しょう）を１０
％牛血清を含有するＰＢＳ中で１００倍に稀釈しかつ３
７℃で２時間塗布した微量滴定板で恒温保持する。引続
いて３回洗浄溶液（脱鉱物水中０．５％ツィーン２０）
で洗浄する。
％牛血清を含有するＰＢＳ中で１００倍に稀釈しかつ３
７℃で２時間塗布した微量滴定板で恒温保持する。引続
いて３回洗浄溶液（脱鉱物水中０．５％ツィーン２０）
で洗浄する。
【０１２８】第２段階でペルオキシダーゼ及びヒトＩｇ
ＧのＦｃγ部に対するポリクロナール抗体の複合体（Ｐ
ＯＤ複合体）（ＰＢＳ１ｍｌ当りペルオキシダーゼ約３
０ｍＵ）と共に３７℃で１時間恒温保持しかつ洗浄溶液
で３回洗浄する。
ＧのＦｃγ部に対するポリクロナール抗体の複合体（Ｐ
ＯＤ複合体）（ＰＢＳ１ｍｌ当りペルオキシダーゼ約３
０ｍＵ）と共に３７℃で１時間恒温保持しかつ洗浄溶液
で３回洗浄する。
【０１２９】基質溶液［１．６ｍｍｏｌ／ｌ ＡＢＴＳ
（登録商標：２，２′−アジノ−ジ−［３−エチルベン
ゾチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム
塩）；９５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ４．４；３．１ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム］を
加え、室温で１時間恒温保持しかつ試料中に存在する特
異的抗体の尺度として４９２ｎｍで吸光度を測定する。
結果を表Ｉに示す。
（登録商標：２，２′−アジノ−ジ−［３−エチルベン
ゾチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム
塩）；９５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ４．４；３．１ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム］を
加え、室温で１時間恒温保持しかつ試料中に存在する特
異的抗体の尺度として４９２ｎｍで吸光度を測定する。
結果を表Ｉに示す。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】表Ｉから、使用した蛋白質配列１、２、３
及び４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３及び４参照）
を含有するＨＩＶ１及びＨＩＶ２融合蛋白質はヒト正常
血清と免疫学的交叉反応をしないことが明らかである。
及び４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３及び４参照）
を含有するＨＩＶ１及びＨＩＶ２融合蛋白質はヒト正常
血清と免疫学的交叉反応をしないことが明らかである。
【０１３２】例 ７ ウエスタンブロット測定［Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、９
２、３７７〜３９１（１９８３）の方法による］ 抗原特異的免疫反応を検出するに当り、抗体含有試料を
室温で一晩、０．０５％ツィーン２０含有ＰＢＳ中で抗
原担持ニトロセルロース片と一緒に恒温保持する。
２、３７７〜３９１（１９８３）の方法による］ 抗原特異的免疫反応を検出するに当り、抗体含有試料を
室温で一晩、０．０５％ツィーン２０含有ＰＢＳ中で抗
原担持ニトロセルロース片と一緒に恒温保持する。
【０１３３】３回洗浄後ＰＯＤ複合体（例６参照；約５
０ｍＵ／ｍｌ）と恒温保持する。洗浄溶液（例６）で更
に３回洗浄した後で４−クロル−１−ナフトールを加
え、室温で１５分間恒温保持しかつ色形成を視覚的に測
定する。
０ｍＵ／ｍｌ）と恒温保持する。洗浄溶液（例６）で更
に３回洗浄した後で４−クロル−１−ナフトールを加
え、室温で１５分間恒温保持しかつ色形成を視覚的に測
定する。
【０１３４】色濃度に応じて免疫反応を陰性（−）、弱
い（＋／−）、明瞭（＋）、強い（＋＋）及び非常に強
い（＋＋＋）に区分した。結果を表ＩＩに示す。
い（＋／−）、明瞭（＋）、強い（＋＋）及び非常に強
い（＋＋＋）に区分した。結果を表ＩＩに示す。
【０１３５】表ＩＩは、本発明による融合蛋白質が特異
的にモノクロナール及びポリクロナール抗−ＨＩＶ−抗
体と反応することを示す。
的にモノクロナール及びポリクロナール抗−ＨＩＶ−抗
体と反応することを示す。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】例 ８ ヒト血清又はヒト血しょう中の抗−ＨＩＶ−抗体の測定
用試薬 試薬は次のものを含有する： 溶液１： １０％牛血清を含有する恒温保持用緩衝液（ＰＢＳ）中
の抗原及びビオチンからの複合体０．１〜１μｇ／ｍｌ 溶液２： ＰＢＳ中のＰＯＤ複合体（ペルオキシダーゼと、ヒトＩ
ｇＧのＦｃγ部に対するポリクロナール抗体からの複合
体、ＰＯＤ３０ｍＵ／ｍｌ）基質溶液［１．６ｍｍｏｌ
／ｌ ＡＢＴＳ（登録商標）；リン酸塩−クエン酸塩緩
衝液ｐＨ４．４；３．１ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウ
ム］試料０．０１ｍｌをストレプタビジンで塗布したポ
リスチレン小管（ヨーロッパ特許公開第０２６９０９２
号明細書により製造）中に装入しかつ室温で１時間溶液
１ １ｍｌと一緒に恒温保持する。０．０５％ツィーン
２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後で室温で１時間
溶液２ １ｍｌと一緒に恒温保持する。０．０５％ツィ
ーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄後、室温で１時間
溶液２と恒温保持しかつ再度３回洗浄する。基質溶液
［１．６ｍｍｏｌ／ｌ ＡＢＴＳ（登録商標）；９５ｍ
ｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩−緩衝液ｐＨ４．４；
３．１ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム］を加え、室温
で１時間恒温保持しかつ試料中に存在する特異的抗体の
尺度として４９２ｎｍの吸光度を測定する。
用試薬 試薬は次のものを含有する： 溶液１： １０％牛血清を含有する恒温保持用緩衝液（ＰＢＳ）中
の抗原及びビオチンからの複合体０．１〜１μｇ／ｍｌ 溶液２： ＰＢＳ中のＰＯＤ複合体（ペルオキシダーゼと、ヒトＩ
ｇＧのＦｃγ部に対するポリクロナール抗体からの複合
体、ＰＯＤ３０ｍＵ／ｍｌ）基質溶液［１．６ｍｍｏｌ
／ｌ ＡＢＴＳ（登録商標）；リン酸塩−クエン酸塩緩
衝液ｐＨ４．４；３．１ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウ
ム］試料０．０１ｍｌをストレプタビジンで塗布したポ
リスチレン小管（ヨーロッパ特許公開第０２６９０９２
号明細書により製造）中に装入しかつ室温で１時間溶液
１ １ｍｌと一緒に恒温保持する。０．０５％ツィーン
２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後で室温で１時間
溶液２ １ｍｌと一緒に恒温保持する。０．０５％ツィ
ーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄後、室温で１時間
溶液２と恒温保持しかつ再度３回洗浄する。基質溶液
［１．６ｍｍｏｌ／ｌ ＡＢＴＳ（登録商標）；９５ｍ
ｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩−緩衝液ｐＨ４．４；
３．１ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム］を加え、室温
で１時間恒温保持しかつ試料中に存在する特異的抗体の
尺度として４９２ｎｍの吸光度を測定する。
【図１】図１はＨＩＶ１ゲノム上のＨＩＶ−決定基の位
置を示す図である。
置を示す図である。
【図２】図２はＨＩＶ２（ｅｎｖ−ｇｐ３２）−ＤＮＡ
−配列（Ｄ′）を製造するためのクローン化法を示す図
である。
−配列（Ｄ′）を製造するためのクローン化法を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (14)
- 【請求項１】 Ｎ−末端成分としてテトラペプチド配列
ＮＨ２−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを含有し、か
つこのＮ−末端配列Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−ＬｅｕとＨＩＶか
らの抗原との間に５０個より多くのアミノ酸を有さない
ことを特徴とするＨＩＶ１又は／及びＨＩＶ２のｅｎｖ
−、ｇａｇ−又は／及びｐｏｌ−域からの抗原又は／及
び免疫原決定基を少なくとも１つ有する融合蛋白質。 - 【請求項２】 ＨＩＶ１のｇａｇ−域からの決定基を有
するアミノ酸配列１ 【化１】 を有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項３】 ＨＩＶ１のｐｏｌ−域からの決定基を有
するアミノ酸配列２ 【化２】 を有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項４】 ＨＩＶ１のｅｎｖ−域からの決定基を有
するアミノ酸配列３ 【化３】 を有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項５】 ＨＩＶ２のｅｎｖ−域からの決定基を有
するアミノ酸配列４ 【化４】 を有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項６】 ＨＩＶ１のｅｎｖ−域及びｇａｇ−域か
らの決定基を有するアミノ酸配列５ 【化５】 を有する請求項１による融合蛋白質。 - 【請求項７】 ＨＩＶ２のｅｎｖ−域及びＨＩＶ１のｐ
ｏｌ−域からの決定基を有するアミノ酸配列６ 【化６】 を有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項８】 ＨＩＶ２のｅｎｖ−域、ＨＩＶ１のｐｏ
ｌ−域、ｅｎｖ−域及びｇａｇ−域からの決定基を有す
るアミノ酸配列７ 【化７】 【化８】 を有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項９】 ＨＩＶ２のｅｎｖ−域、ＨＩＶ１のｐｏ
ｌ−域、ｅｎｖ−域及びｇａｇ−域を有するアミノ酸配
列８ 【化９】 【化１０】 を有し、かつＣ−末端はポリ（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）配列を
有する請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項１０】 請求項１から９までのいずれか１項記
載の融合蛋白質をコードすることを特徴とする組換ＤＮ
Ａ。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の組換ＤＮＡ−配列１
つ又は複数のコピーを少なくとも１つ有することを特徴
とする組換ベクター。 - 【請求項１２】 請求項１０による組換ＤＮＡ又は請求
項１１による組換ベクターで形質転換されていることを
特徴とする微生物。 - 【請求項１３】 微生物を請求項１０記載の組換ＤＮＡ
又は請求項１１による組換ベクターで形質転換し、請求
項１記載の融合蛋白質を通常の生物学的方法により細胞
又は培地から取得することを特徴とする請求項１から９
までのいずれか１項記載の融合蛋白質の取得法。 - 【請求項１４】（ａ） 請求項１から９までのいずれか
１項記載のＨＩＶ１又は／及びＨＩＶ２の抗原又は／及
び免疫原決定基を少なくとも１つ有し、かつ固相に結合
しているか又は恒温保持工程の間好適な特異的固相に容
易に軽く結合するように変性されている融合蛋白質１種
又は複数種、 （ｂ） 融合蛋白質の抗原決定基への抗−ＨＩＶ−抗体
の生理学的結合を容認し、かつ同時に非特異的結合を抑
圧する恒温保持緩衝液、 （ｃ） 抗原−結合抗体を認識するための検出試薬及び （ｄ） 結合した特異的抗体の定量用システム、 を含有することを特徴とするＨＩＶ−抗体−検出試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4002636A DE4002636A1 (de) | 1990-01-30 | 1990-01-30 | Expression von hiv1- und 2-polypeptiden und deren verwendung |
| DE4002636.1 | 1990-01-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211098A JPH04211098A (ja) | 1992-08-03 |
| JPH089638B2 true JPH089638B2 (ja) | 1996-01-31 |
Family
ID=6399047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0440207B1 (ja) |
| JP (1) | JPH089638B2 (ja) |
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| DE (2) | DE4002636A1 (ja) |
| ES (1) | ES2074591T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2887063B2 (ja) * | 1993-12-28 | 1999-04-26 | 日清製粉株式会社 | グリセンチンの製造方法 |
| DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
| US5935824A (en) * | 1996-01-31 | 1999-08-10 | Technologene, Inc. | Protein expression system |
| US6525173B1 (en) * | 1997-01-02 | 2003-02-25 | Universidade Federal De Minas Gerais | Process for expression and production of recombinant protein hybrid protein (p24/p17) derived from human immunodeficiency viruses (HIV-1) |
| US6271354B1 (en) | 1997-04-03 | 2001-08-07 | Thomas Jefferson University | Chimeric viral proteins |
| US20050033022A1 (en) * | 1997-09-26 | 2005-02-10 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins |
| JP5052732B2 (ja) | 2000-08-14 | 2012-10-17 | アメリカ合衆国 | 遺伝的免疫化のための免疫原性を強化するＨＩＶＥｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌの改変 |
| TW200409815A (en) * | 2002-12-12 | 2004-06-16 | Dev Center Biotechnology | Human T-lymphotrophic virus (HTLV) fusion protein, nucleic acid and vector encoding the protein, and kit for testing human T-lymphotrophic virus using the protein |
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|---|---|---|---|---|
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| US5124255A (en) * | 1988-03-11 | 1992-06-23 | Abbott Laboratories | CKS method of protein synthesis |
| CU22222A1 (es) * | 1989-08-03 | 1995-01-31 | Cigb | Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes |
-
1990
- 1990-01-30 DE DE4002636A patent/DE4002636A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-01-25 US US07/648,796 patent/US5310876A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-30 AT AT91101224T patent/ATE123523T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-30 DE DE59105636T patent/DE59105636D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-30 ES ES91101224T patent/ES2074591T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-30 EP EP91101224A patent/EP0440207B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-30 JP JP3009782A patent/JPH089638B2/ja not_active Ceased
Also Published As
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|---|---|
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| EP0440207A2 (de) | 1991-08-07 |
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| ES2074591T3 (es) | 1995-09-16 |
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| EP0440207A3 (en) | 1993-04-28 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A045 | Written measure of dismissal of application [lapsed due to lack of payment] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20060823 |