JPH0898690A - 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子操作技術を使つて作成したコスミドベ
クターを用いる外来ＤＮＡの遺伝子バンクを簡単かつ効
率よく得る製造法である。 【構成】 同一の方向性を持つたラムダフアージまたは
ラムドイドフアージのｃｏｓを少なくとも３個有し、２
種類の制限酵素で切ることによつて得られる、それぞれ
ｃｏｓを少なくとも１個もしくは２個持つた右腕と左腕
との間に、３５〜４５Ｋｂｐの長さの種々の外来ＤＮＡ
断片を挿入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングで形質
導入フアージ粒子に変え、次いでラムダフアージが溶原
化している大腸菌にクローン化したのち誘発をかけて、
組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏパツケージングで形質
導入フアージ粒子に変えることによつて、外来ＤＮＡの
遺伝子バンクを製造するものである。 【効果】 ３５〜４５ＫｂｐのＤＮＡ断片として、ゲノ
ムＤＮＡの遺伝子バンクを簡単かつ効率よく製造するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作技術に関し、
さらに詳しくは遺伝子操作技術を使つて作成した新規コ
スミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ヒトをはじめとする哺乳動物の遺伝子の
大きさは２０キロ塩基対（以下、キロ塩基対をＫｂｐと
略す）を越えるものが少なくない。現在、広く使われて
いるラムダベクターにクローン化できるＤＮＡの大きさ
は２０Ｋｂｐなので、これより大きい遺伝子全体を機能
のある形でクローン化することはできない。

【０００３】ラムダフアージのｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎ
ｄ ｓｉｔｅ（以下ｃｏｓと略す）を有するベクター、
すなわちコスミドベクターを使えば３５〜４５Ｋｂｐの
大きさのＤＮＡをクローン化できる。種々のベクターの
中で、コスミドベクターが最も大きい長さのＤＮＡをク
ローン化できるが、長いゲノムＤＮＡの調製がむずかし
いことや、インサートのないベクターだけのバツクグラ
ンドが高いこと、また効率が良くないことなどが障害に
なつて、コスミドベクターの利用は進まなかつた。とこ
ろが、〔イシユ−ホロウイツツ アンド バーク（Ｉｓ
ｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒｋｅ）〕は、ホスフ
アターゼを利用してベクターに方向性を持たせる工夫を
し、ベクターだけのバツクグランドの値を下げるととも
にクローン化の効率を上げることに成功した〔デー・イ
シユ−ホロウイツツ アンド ジエー・エフ・バーク：
ヌクレイツク アシツズ リサーチ（Ｄ．Ｉｓｈ−Ｈｏ
ｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｊ．Ｆ．Ｂｕｒｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），９，２８８９（１９８
１）〕。

【０００４】イシユ−ホロウイツツ アンド バーク
（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒｋｅ）法によ
るゲノムＤＮＡの遺伝子バンクの製造法は以下のとおり
である（たとえば、現在、広く使われているコスミドベ
クターの１つであるｐＪＢ−８を例にとる）。ｐＪＢ−
８は５．４４Ｋｂｐの大きさで、制限酵素ＢａｍＨＩ、
ＨｉｎｄIII ，Ｓａ１Ｉでそれぞれ１カ所切断され、ラ
ムダフアージのｃｏｓを１個有するコスミドベクターで
ある。

【０００５】（１）ｐＪＢ−８をＨｉｎｄIII で切断す
ることによつて直線状ＤＮＡとし、次に、ホスフアター
ゼ処理によつてＨｉｎｄIII の切断片を不活化する。そ
して、ＢａｍＨＩで切断することによつて２個のＤＮＡ
断片が得られ、ｃｏｓを含む大きなＤＮＡ断片（５．４
Ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法によつて単離す
る。得られたｃｏｓを含むＤＮＡ断片（５．４Ｋｂｐ）
が、ラムダフアージの左腕に相当する。

【０００６】（２）ｐＪＢ−８をＳａｌＩで切断するこ
とによつて直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼで処
理することによつてＳａｌＩの切断片を不活化する。そ
して、ＢａｍＨＩで切断することによつて２個のＤＮＡ
断片が得られ、ｃｏｓを含む小さなＤＮＡ断片（２．３
４Ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法によつて単離す
る。得られたｃｏｓを含むＤＮＡ断片（２．３４Ｋｂ
ｐ）が、ラムダフアージの右腕に相当する。

【０００７】（３）たとえば、ヒトのゲノムＤＮＡを制
限酵素Ｓａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩで部分的に切断し、
３５〜４５Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を分画する。こ
の３５〜４５Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、（１）と
（２）で別々に調製した左腕と右腕との間に、連結酵素
（Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ）で挿入させて、組換え体ＤＮ
Ａを調製する。 （４）組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージン
グで形質導入フアージ粒子に変え、次いで大腸菌に感染
させることによりヒトのゲノムＤＮＡの遺伝子バンクが
製造できる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】以上がイシユ−ホロウ
イツツ アンド バーク（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ＆
Ｂｕｒｋｅ）法によるゲノムＤＮＡの遺伝子バンクの
製造法であるが、次の４つの問題点がある。第１に、ｐ
ＪＢ−８はｃｏｓが１つしかなく、左腕と右腕とを別々
に調製しなければならない。第２に、左腕と右腕につい
て、それぞれｃｏｓを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動で分離しなければならない。第３に、ｐＪＢ−
８の左腕の長さは５．４Ｋｂｐ、右腕の長さは２．３４
Ｋｂｐであり、左腕と右腕との長さが異なるので、３５
〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡに連結する確率も異なり、
左腕と右腕の混合する比率を検討しなければならない。
第４に、この製造法で得られた遺伝子バンクにおいて
は、組換え体ＤＮＡは大腸菌内でプラスミドとして複製
し、大腸菌より共有結合で閉鎖された環状のプラスミド
ＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）として分離精製するが、組換
え体ＤＮＡを形質導入フアージ粒子としてゲノムＤＮＡ
の遺伝子バンクを製造することはできない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決するために、同一の方向性を持つたラムダフ
アージまたはラムドイドフアージのｃｏｓを少なくとも
３個有し、２種類の制限酵素で切ることによつて得られ
る、ｃｏｓを少なくとも１個もしくは２個持つた長さの
ほぼ等しい右腕と左腕とが等モルできることを特徴とす
る新規コスミドベクターを作成し、このコスミドベクタ
ーを用いることによつて外来ＤＮＡ遺伝子バンクの製造
法を完成するに至った。

【００１０】本発明に用いられるコスミドベクターは、
同一分子内に同一の方向性を持つた少なくとも３個のｃ
ｏｓが存在し、２種類の制限酵素で切ることによつて得
られる、ｃｏｓを少なくとも１個もしくは２個持つた長
さのほぼ等しい右腕と左腕とが等モルできるので、右腕
と左腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲル
電気泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕の
長さがほぼ等しいので、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮ
ＡにＴ４−ＤＮＡリガーゼによつて連結される程度もほ
ぼ等しいと考えてよく、２種類の制限酵素で切断してで
きた右腕と左腕の等モル混合物を、そのまま３５〜４５
ＫｂｐのゲノムＤＮＡと連結すれば、組換え体ＤＮＡの
半分が形質導入フアージ粒子に変わり得ることが期待で
きる。このように、本発明のコスミドベクターを用いれ
ば、３５〜４５ＫｂｐのＤＮＡ断片として、ゲノムＤＮ
Ａの遺伝子バンクをより簡単、かつより効率よく製造で
きる。

【００１１】そして、さらに本発明のベクターは、同一
分子内に同一の方向性を持つた少なくとも３個のｃｏｓ
を有するので、組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツ
ケージングで形質導入フアージ粒子に変え、大腸菌に感
染させると、組換え体ＤＮＡは大腸菌内で２個のｃｏｓ
を持つたプラスミドＤＮＡとして複製する。この段階で
は、プラスミドＤＮＡとしての外来ＤＮＡの遺伝子バン
クであるが、ラムダフアージが溶原化している大腸菌を
宿主として用いた場合には、加温もしくは紫外線照射す
ると言つたような誘発をかけることにより、溶原化して
いたラムダフアージは溶菌化サイクルに入り、大腸菌内
でラムダフアージが増殖し、最終的に大腸菌が溶菌して
ラムダフアージ粒子が外へ出てくる。この時に、大腸菌
内で２個のｃｏｓを持つたプラスミドＤＮＡとして存在
している組換え体ＤＮＡも、ｃｏｓを２個持つているた
めにラムダフアージの頭の部分に取込まれて、ｉｎ ｖ
ｉｖｏパツケージングで形質導入フアージ粒子に変換さ
れる。このようにして、形質導入フアージ粒子として外
来ＤＮＡの遺伝子バンクを製造できる。

【００１２】哺乳動物の培養細胞への遺伝子移入におい
て、染色体を用いる方法は、プラスミドＤＮＡやゲノム
ＤＮＡを用いる方法と比較すると、（１）遺伝子移入の
効率と頻度とが常に１０倍から１００倍高く、（２）安
定なトランスホーマント・クローンが多く得られる点で
優れている〔レーウイス、ダブリユー・エイチ、スリニ
バサン ピー・アール：ストケ エヌ アンド シミノ
ビツチ、エル：ソマトセル ジエネテイツクス（Ｌｅｗ
ｉｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｓ
ｔｏｋｏｅ，Ｎ．，＆ Ｓｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ，
Ｌ、：Ｓｏｍａｔ、ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．，６，３３
３，（１９８０）〕。

【００１３】多分、このことは、染色体ではＤＮＡがク
ロマチン・タンパク質で密に包み込まれたクロマチン構
造をとり、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）の
攻撃から守られていることと関係があると思われる。ま
た、密なクロマチン構造をとることによつて細胞への取
込みが容易になつているのかもしれない。しかし、染色
体のままではＤＮＡを組換えることができず、また、実
験に必要なだけの大量の染色体を細胞から調製すること
も容易ではない。いま、ラムダフアージ粒子の構成に着
目すると、ラムダフアージのＤＮＡは外被タンパク質に
よつて密に包込まれており、クロマチン・タンパク質に
包込まれている染色体ＤＮＡと状況がよく似ている。

【００１４】また、ラムダフアージベクターを用いて、
ＤＮＡ組換えでラムダフアージ粒子として遺伝子バンク
を作成する方法はすでに確立している。石浦らは、ＨＳ
Ｖ−１のＴＫ遺伝子を組込んだラムダベクターＣｈａｒ
ｏｎ４Ａの組換え体（ラムダフアージ粒子）を用いて、
Ｌｔｋ^- 細胞へのＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の移入を検討し
たところ、（１）遺伝子移入の効率は１０^-5で、裸のＤ
ＮＡそのままの場合に比べて１桁高いが、染色体による
場合に比べて１桁低い、（２）形質転換細胞のコロニー
はＤＮＡで得られたものに比べて大きく、そのクローン
の多くは非選択培地でも安定に保たれると、予想どおり
の結果を得た〔イシウラ エム等：モレキユラー セル
ラー バイオロジー（Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ、Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），２，６０７
（１９８２）〕。

【００１５】しかし、ラムダベクターで作成した遺伝子
バンクでの本質的な問題点は、ラムダベクターにクロー
ン化できるＤＮＡの大きさは最大２０Ｋｂｐなので、目
的の遺伝子がこれより大きい場合には機能のある形でそ
の遺伝子をクローン化することができないことである。
そこで、本発明の少なくともｃｏｓ３個持つたコスミド
ベクターは、３５〜４５Ｋｂｐの外来ＤＮＡをクローン
化できるとともに、形質導入フアージ粒子として遺伝子
バンクを製造できるという点で優れており、細胞への遺
伝子移入に大きな力を発揮するものと思われる。

【００１６】本発明の新規コスミドベクターの１つであ
る、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r を図
１に示す。ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ
^r は、コスミドベクターであるｐＲＨ（−４４）もしく
はｐＬＨ（＋１２９）由来の同一方向性のあるｃｏｓ３
個と〔ミワ アンド マツバラ、ジーン、Ｍｉｗａ＆
Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｇｅｎｅ，２０，２６７（１９８
２）〕、Ｔｎ９０３由来のネオマイシン耐性遺伝子（ｎ
ｅｏ^r ）〔オカ、スギサキ アンド タカナミ、ジヤー
ナル オブ モレキユラー バイオロジー（Ｏｋａ，Ｓ
ｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．，１４７、２１７（１９８１）〕、ｐＮＴ−
３１由来のクロラムフエニコール耐性遺伝子（ｃｍ^r ）
〔トミザワ アンド イトウ プロシーデイング オブ
ナシヨナル アカデミ オブサイエンシズ ユー・エス
・エー〔Ｔｏｍｉｚａｗａ ＆ Ｉｔｏｈ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，
６０９６（１９８１）〕、ｐＢＲ−３２７由来のアンピ
シリン耐性遺伝子（Ａｐ^r ）及び複製開始点（ｏｒｉ）
〔ソベロン、カバラビアス アンド ボリバー、ジーン
（Ｓｏｂｅｒｏｎ，Ｃａｖａｒｒｕｂｉａｓ ＆ Ｂｏ
ｌｉｖａｒ，Ｇｅｎｅ），９，２８７（１９８０）〕と
からなる。大きさは４．９Ｋｂｐであり、制限酵素Ｃｌ
ａＩ、ＢａｍＨＩによつてそれぞれ１カ所切断される。
本ベクターを用いるゲノムＤＮＡ（外来ＤＮＡ）の遺伝
子バンクの製造法を示せば以下のようになる（図２）。

【００１７】（１）ｐＤｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r
／ｎｅｏ^r をＣｌａＩで切断することによつて直線状Ｄ
ＮＡとし、次に、ホスフアターゼ処理によつてＣｌａＩ
の切断片を不活化する。そして、ＢａｍＨＩで切断する
ことによつて、それぞれｃｏｓを少なくとも１個もしく
は２個持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕とを調製す
る。（２）外来ＤＮＡをＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩな
どで限定消化し、３５〜４５Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断
片を調製する。（３）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ
断片を（１）で調製した左腕と右腕との間にＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼで挿入させて、組換え体ＤＮＡを調製する。
（４）組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージン
グで形質導入フアージ粒子に変え、ラムダフアージが溶
原化している大腸菌に感染させる。（５）この形質導入
体ＤＮＡは、ベクター由来のＡｐ^r、ｃｍ^r とｏｒｉを
含むので、アンピシリンもしくはクロラムフエニコール
で選択することによつて、２個のｃｏｓを持つた組換え
体ＤＮＡをプラスミドとして持つ大腸菌のみを選択的に
生かすことができる。（６）次に、トランスホーマント
（大腸菌）に、加温もしくは紫外線照射すると言つたよ
うな誘発をかけて溶原化していたラムダフアージを溶菌
化サイクルに移行させることによつて、２個のｃｏｓ持
つた組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏパツケージングで
形質導入フアージ粒子に変換できる。この形質導入フア
ージ粒子内には、１個のｃｏｓ及びＡｐ ^r 、ｏｒｉ、外
来ＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡが包込まれている。こ
のようにしてゲノムＤＮＡ（外来ＤＮＡ）の遺伝子バン
クを形質導入フアージ粒子として製造することができ
る。

【００１８】また、本発明者らは哺乳動物細胞に対する
選択マーカーを持つていて、哺乳動物細胞への遺伝子移
入を目的とするコスミドベクター、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／
ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r （図３）を作成した。
ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ
^r は、ｐＲＨ（−４４）もしくはｐＬＨ（＋１２９）由
来の同一方向性のあるｃｏｓ３個と、Ｔｎ９０３由来の
ｎｅｏ^r 、ｐＮＴ−３１由来のｃｍ^r 、ｐＢＲ−３２７
由来のＡｐ^r とｏｒｉ及びｐＴＫ−４由来のＴＫ遺伝子
〔イシウラ エムら、モレキユラー セルラー バイオ
ロジー、Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，６０７（１９８２）〕
とからなる。

【００１９】このコスミドベクターは、前記したｐＴｃ
ｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r と同様に、ゲノ
ムＤＮＡ遺伝子バンクを製造できる。すなわち、同一の
方向性を持つた３個のｃｏｓがあり、ＣｌａＩとＢａｍ
ＨＩで切断することにより、それぞれｃｏｓを１個もし
くは２個持つた右腕と左腕とが等モルでき、ＢａｍＨＩ
サイトに３５〜４５Ｋｂｐの大きさのゲノムＤＮＡを挿
入させた組換え体ＤＮＡを作成できる。そして、この組
換え体ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングによ
つて形質導入フアージ粒子に変換し、大腸菌（ラムダフ
アージが溶原化している）に移すことができ、組換え体
ＤＮＡを含む大腸菌は、アンピシリンもしくはクロラム
フエニコールで選択することによつて得ることができ
る。

【００２０】次に、トラスホーマント（大腸菌）に誘発
をかけて、２個のｃｏｓを持つた組換え体ＤＮＡをｉｎ
ｖｉｖｏパツケージングで形質導入フアージ粒子に変
換して、遺伝子バンクを製造できる。さらに、この形質
導入フアージ粒子は、ＴＫ遺伝子を持つので、哺乳動物
の培養細胞へ遺伝子移入した際に、チミジンキナーゼ
（ＴＫ）活性をマーカーとすることによつて、ベクター
由来の組換え体ＤＮＡの移入の判定が培養細胞レベルで
可能であるという利点がある。

【００２１】本発明は、かかる新規コスミドベクターを
用いる遺伝子バンクの製造法に関するものであるが、本
発明に用いられるｃｏｓとしては、ラムダフアージまた
はラムドイドフアージ由来のものが挙げられる。特に、
ラムダフアージ由来のｃｏｓが好ましいものとして挙げ
られる。また、本発明のコスミドベクターで形質導入フ
アージ粒子として遺伝子バンクを製造するためには、同
一分子内に同一の方向性を持つたｃｏｓ３個ベクター中
に存在すれば充分であるが、３個以上ｃｏｓがベクター
中にあつてもかまわない。

【００２２】本発明のベクターは、２種類の制限酵素で
切ることによつて、それぞれｃｏｓを少なくとも１個も
しくは２個持つた右腕と左腕ができるのであるが、この
２種類の制限酵素の組合せとしては、ＰｖｕIIとＢａｍ
ＨＩ、ＰｖｕIIとＢｇ１II、ＣｌａＩとＢａｍＨＩ、Ｃ
ｌａＩとＢｇｌIIなどを挙げることができる。勿論、こ
の他にも組合せは考えることができるので、これらに限
定されるものではない。本発明のベクター中には、ベク
ター由来のＤＮＡ断片が挿入されたことを、判定するた
めには一般的に薬剤耐性による選択が行われる。従っ
て、本発明のベクター中にも薬剤耐性を発現するＤＮＡ
断片が組込まれていることが好ましい。

【００２３】薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、テ
トラサイクリン耐性、ネオマイシン（カナマイシン）耐
性、もしくはクロラムフエニコール耐性など通常の抗生
物質耐性が挙げられる。ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃ
ｍ^r ／ｎｅｏ^r 及び、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ
／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r はアンピシリン耐性遺伝子、クロラ
ムフエニコール耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子
を有している。本発明のベクターを用いてゲノムＤＮＡ
（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクを製造し、哺乳動物の培
養細胞へ遺伝子（遺伝子バンク）移入する際には、ベク
ター由来のＤＮＡ断片が挿入されたことを判定するため
に特定の生理機能を発現するＤＮＡ断片が本発明のベク
ター中に組込まれているのが好ましい。

【００２４】特定の生理機能を発現せしめる遺伝子とし
ては、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフエラー
ゼ（ｎｅｏ）遺伝子〔オカ、スギサキ アンド タカナ
ミ、ジヤナール モレキユラー バイオロジー（Ｏｋ
ａ，Ｓｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１４７，２１７（１９８１）〕、
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子〔ウイグラー、エム
等、セル（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ），１４，７２５（１９７８）、アデニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子〔ウイグラ
ー、エム等、プロシーデイングス オブ ナシヨナル
アカデミ オブ サイエンシズ ユー・エス・エー（Ｗ
ｉｇｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７６，１３７３
（１９７９）〕、ヒポキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランンスフエラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝子〔グラ
フ、エル・エイチ・ジユニア等、ソマテイツク セルラ
ー ジエネテイクス（Ｇｒａｆ，Ｌ．Ｈ．Ｊｒ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．），
５，１０３１（１９７９）〕、キサンチングアニンホス
ホリボシトランスフエラーゼ（ＸＧＰＲＴ又はｇｐｔ）
遺伝子〔ベルグ、ピー等、モレキユラー セルラー バ
イオロジー（Ｂｅｒｇ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），１，４４９（１９８１）〕な
どが挙げられる。本発明の新規コスミドベクターｐＴｃ
ｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r はＴＫ遺
伝子を有している。

【００２５】さらに、本発明のベクター中には、Ｃｏｌ
ＥＩ由来の複製機能を有する遺伝子画分を有することが
好ましい。本発明において用いられる外来ＤＮＡの例と
しては、細菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物
もしくは各種フアージ等に由来するＤＮＡが挙げられ
る。また、本発明において用いられる制限酵素（ＤＮＡ
断片の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有
する酵素）や制限酵素により切断されて生じるＤＮＡ接
着末端と、これと相補的な関係のある他のＤＮＡ断片接
着末端を結合させるために用いる酵素（リガーゼ）、あ
るいは互いに相補的でないＤＮＡ末端同志を結合させる
ためにＤＮＡ末端同志を互いに相補的な接着末端にする
酵素、あるいはこれらを結合させるリガーゼについては
すでに良く知られ、数多くの酵素が市販され、それらを
用いる手法等についても広く開示されている〔モレキユ
ラー クローニング コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー、マニアテイス、テイ等（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．），（１９８２）〕ので、それ
らを利用すればよい。

【００２６】本発明のベクターを用い、ゲノムＤＮＡ
（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクを作成することによつ
て、有用物質を発現せしめる特定の遺伝子を効率よく見
出すことが可能である。この特定の遺伝子とは、細菌、
糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物あるいは各種フ
アージ等に由来するＤＮＡがあり、具体的な有用物質と
しては、例えば各種ホルモン、酵素、さらには抗生物質
やアミノ酸などの合成系酵素等が挙げられる。

【００２７】以下、実施例を挙げて本発明をいっそう詳
細に説明する。 実施例１ ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ
^r の作成及び調製（図４、図５及び図６） （ａ）ｐＨＳｃｏｓの作成及び調製 （１）作成 コスミドベクターであるｐＲＨ（−４４）１０μｇを、
反応混液１００μl〔１５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１０
０μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、６９ユニツトの制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社
製）と２時間反応させて完全に消化した。反応終了後、
等量の水飽和フエノールで抽出を行い、水層をセカンダ
リブタノールで濃縮後、０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと２倍容量のエタノールを加えて、ＤＮＡを沈澱と
して得、９５％エタノールで洗つたのち、水流ポンプで
乾燥を行い、沈澱を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡからなる水溶液（以下、
１０ｔ／０．１Ｅと略す）７μl （〜１μｇ／μl ）に
溶解させた。

【００２８】次に、このＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶
液１μl （〜１μｇ）を反応混液２５μl 〔５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭＭｇＳＯ₄ 、
０．１ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、８０μＭｄ
ＡＴＰ、８０μＭｄＣＴＰ、８０μＭｄＧＴＰ、８０μ
ＭｄＴＴＰ〕で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）と２２℃で
３０分間反応させて、互いに相補鎖が存在する２本鎖Ｄ
ＮＡ断片（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を、両端がそろ
つた２本鎖ＤＮＡ断片（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）に変え
た。反応終了後、反応液を６５℃で１０分間熱処理して
Ｋｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。

【００２９】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μ
ｇ）と、ＳａｌＩリンカー〔ｄ（ｐＧ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｃ−Ｃ）〕２μｇとを、反応混液２０μl 〔５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１０ｍＭＭｇＣｌ
₂ 、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴ
Ｐ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結した。そ
の後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得た。

【００３０】このＤＮＡ沈澱を、反応混液６００μl
〔１５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭＤＴＴ、１００μ
ｇ／ｍｌＢＳＡ〕で１０００ユニツトの制限酵素Ｓａ１
Ｉ（Ｔａｋａｒａ社製）と３７℃で４時間反応させて消
化した後、０．８％調製用アガロースゲルにかけて、１
０ｍＡで１２時間電気泳動した。分解されたＤＮＡ断片
は臭化エチジウム染色と長波長紫外線照明によつて見え
てくる。ｃｏｓ及びｏｒｉ、ＡｐからなるＤＮＡ断片
（３．８９Ｋｂｐ）を含有するゲルを切り出したのち、
５倍容量の抽出液〔０．５ＭＮＨ₄ ＯＡｃ、１ｍＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５）：水飽和フエノール＝１：１〕の存
在下で、ゲルをすりつぶしてＤＮＡを溶出させた。

【００３１】そして、溶出液をセカンダリーブタノール
で濃縮後、０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容
量のエタノールを加えてＤＮＡ沈澱として得た。このＤ
ＮＡ沈澱を反応混液２０μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ〕で、６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと
１２℃で１７．５時間反応させ、ｃｏｓおよびｏｒｉ、
Ａｐ^r からなるＤＮＡ断片（３．８９Ｋｂｐ）を閉環化
させた。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。

【００３２】（２）トランスホーメーシヨン このＤＮＡ溶液１０μl を大腸菌ＨＢ１０１のｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ１００μl （対数増殖期の大腸菌
ＨＢ１０１を０〜４℃で０．１ＭＣａＣｌ₂ 溶液で１５
分間処理後、もとの培養液の１／１０容量の０．１ＭＣ
ａＣｌ₂ ／１４％グリセロール溶液に再懸濁し、−７０
℃に保存）とよく混合し、０℃で１０分間、続いて３７
℃で５分間保温して、ＤＮＡを大腸菌内に取込ませた
後、これにＬ−ブロス（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％
グルコース）２ｍｌを加えて、３７℃で１時間振とう培
養した。この菌体懸濁液を２０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬ−プレート（Ｌ−プロースに寒天を１％添加
したプレート）上にまき、３７℃で２４〜４８時間培養
し、アンピシリン耐性のクローンを得た。

【００３３】３）少量培養、及び少量ＤＮＡ調製 Ａｐ^r であるクローンをＬ−ブロス２ｍｌ中（Ａｐ２０
μｇ／ｍｌ含有）で３７℃、一晩振とうして、増殖させ
た。培養液１．５ｍｌをエツペンドルフチユーブにと
り、机上遠心分離機にかけて集菌後、この菌体を抽出液
〔８％シヨ糖、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５
０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）〕０．３５ｍｌに再懸濁させた。次
に、リゾチーム溶液２５μl 〔１０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え混合したの
ち、チユーブを沸騰水中に４０秒間おいた。そして、直
ちにチユーブを４℃にて遠心分離機（２１，０００ｒｐ
ｍ、１５分間）にかけて上澄液を得、これにＲＮａｓｅ
Ａ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｔ／０．１Ｅ）０．５μ
l を加えて３７℃で１時間保温してＲＮＡを分解させ
た。その後、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ２０μl
に溶解させて、プラスミドＤＮＡ溶液を得た。

【００３４】（４）プラスミドＤＮＡの特性化 そして、このプラスミドＤＮＡ溶液１μl 又は２μl を
制限酵素ＨｉｎｄIII、ＳａｌＩ、ＰｖｕII、ＰｓｔＩ
などで消化したのち、０．４〜１．５％アガロースゲル
電気泳動〔４０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．１５）；１０ｍＡ、１２
〜２４時間〕にかけた。分解されたＤＮＡ断片は臭化エ
チジウム染色と長波長紫外線照射によつて検出できる。
このようにして、プラスミドＤＮＡの制限地図を作成す
ることによつて、各クローンが持つているプラスミドＤ
ＮＡを特性化した。そして、ｐＲＨ（−４４）のＢａｍ
ＨＩサイトとＳａｌＩサイトの間のＤＮＡ断片（０．３
１Ｋｂｐ）を欠き、その場所にＳａｌＩリンカーが挿入
されたプラスミド：ｐＨＳｃｏｓ（図４）を持つ大腸菌
を得た。

【００３５】（５）大量培養、及びプラスミドＤＮＡの
調製 この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙ
ｐｔｏｎｅ、０．１％酵母エキス、０．２％グルコー
ス、０．１％ＮＨ₄ Ｃｌ、０．３％ＮａＣｌ、０．０１
％Ｎａ₂ ＳＯ₄ 、０．０８％ＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ、
１．５２％Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ、０．３％ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ）１l 中（Ａｐ２０μｇ／ｍｌ含有）で、３７
℃で振とう培養し、６００ｎｍでの吸光度（Ａ₆₀₀ ）が
１．０になつた時点で、クロラムフエニコールを１００
μｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、さらに１５時間
３７℃で振とう培養した。培養終了後、遠心分離機
（６，０００ｒｐｍ、１０分間）にかけて集菌を行い、
次に菌体を２５％シヨ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）からなる等張緩衝液１８ｍｌに再懸濁液
した。これに、リゾチーム溶液〔５ｍｇ／ｍｌ、０．２
５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕３．６ｍｌを加
え、おだやかに混合し、０℃で５分間おいたのち、０．
２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液７．２ｍｌを加え、
おだやかに混合し、０℃で５分間おいた。

【００３６】その後、１０％ＳＤＳ溶液２．７ｍｌと５
ＭＮａＣｌ溶液８．１ｍｌとを加えおだやかに混合し、
０℃で一晩おいた後、遠心分離機（２０，０００ｒｐ
ｍ、４５分間）にかけて粗溶菌液（ｃｌｅａｒｅｄ ｌ
ｙｓａｔｅ）〜３９ｍｌを得た。この粗溶菌液に、ＲＮ
ａｓｅＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｔ／０．１Ｅ）２
０μl を加えて、３７℃にて１時間保温してＲＮＡを分
解させたのち、フエノール抽出で除蛋白を行い、さらに
セフアロース２Ｂのゲル濾過にかけた。プラスミドＤＮ
Ａを含むボイドクラクシヨンから、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、次にＤＮＡを塩化セシウム−臭化エチジ
ウム溶液〔１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．３
７５ｍｌ、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．３０
ｍｌ、Ｈ₂Ｏ６．４５ｍｌ、ＣｓＣl １７．５ｇ、Ｅｔ
Ｂｒ溶液（４ｍｇ／ｍｌ）０．３７５ｍｌ〕で平衡密度
勾配遠心（６０，０００ｒｐｍ、１２時間）にかけた。

【００３７】そうすると、共有結合で閉鎖された環状の
プラスミドＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）は、遠沈管中で長
波長紫外線照射下において、線状のプラスミドＤＮＡ及
び染色体のけい光帯の下にバンド状に見えてくる。この
ｃｃｃ−ＤＮＡのバンドを分画し、ＣｓＣｌ水溶液で飽
和したイソプロパノールで抽出を行つて、臭化エチジウ
ムを取除いた後、１０ｔ／０．１Ｅ１l に対して透析を
行つた。そして、透析内液から、ｃｃｃ−ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ２ｍｌに
溶解させてｐＨＳｃｏｓのプラスミドＤＮＡ溶液を調製
した。

【００３８】（ｂ）ｐＨＢｃｏｓの作成及び調製 ｐＨＳｃｏｓ１０μｇを反応混液４００μl で、１８５
ユニツトのＳａｌＩと３７℃で２時間反応させて消化し
た。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl
（〜１μｇ／μl）に溶解させた。次に、このＳａｌＩ
で消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を反応混液２
５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３
０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕ
ｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０
分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。

【００３９】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させ
て連結した。そして、この反応液１０μl を反応混液５
０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃
で１７．５時間反応させて閉環化した。その後、フエノ
ール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０
μl に溶解させた。

【００４０】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r クローンを得た。そして、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨＳｃｏｓのＳａ
ｌＩサイトのＢａｍＨＩリンカーを挿入させたプラスミ
ド（この場合、ＢａｍＨＩサイトの両側にＳａｌＩサイ
トが再構成される）：ｐＨＢｃｏｓ（図４）を持つ大腸
菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖
させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐ
ＨＢｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

【００４１】（ｃ）ｐＣＨｃｏｓの作成及び調製 コスミドベクターであるｐＬＨ（＋１２９）１０μｇを
反応混液１００μl 〔５０ｍＭＮａＣｌ、１００ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、６９ユニツトの制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ社製）と３７℃で２時間反応さ
せて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱１０ｔ／０．１Ｅ
７μl （〜１μｇ／ｍｌ）に溶解させた。次に、Ｅｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl（〜１μｇ）を、反応
混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃
で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
次に、このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）と、Ｃｌ
ａＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結
した。

【００４２】そして、この反応液１０μl を、反応混液
５０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その後、フエ
ノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２
０μl に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μlで
大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーションした
後、Ａｐ^r クローンを得た。そして、これらのクローン
のもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＬＨ（＋１
２９）のＥｃｏＲＩサイトにＣｌａＩリンカーを挿入さ
せたプラスミド（この場合、ＣｌａＩサイトの両側にＥ
ｃｏＲＩサイトが再構成される。）：ｐＣＨｃｏｓ（図
４）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培
地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを
分離精製してｐＣＨｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製し
た。

【００４３】（ｄ）ｐＣＨ／ＨＢｃｏｓ（ｐＤｃｏｓ）
の作成及び調製 ｐＣＨｃｏｓ２０μｇを、反応混液２００μl 〔６０ｍ
ＭＮａＣｌ、７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
７ｍＭＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢ
ＳＡ）〕で、１１４ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄIII
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及び
１９２ユニツトのＰｖｕII（Ｔａｋａｒａ社製）と３７
℃で２時間反応させて消化したのち、０．８％調製用ア
ガロースゲル電気泳動にかけて、ｃｏｓ及びＡｐ^r 、ｏ
ｒｉを含むＤＮＡ断片（２．５Ｋｂｐ）を分離精製し
て、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／
０．１Ｅ８．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。

【００４４】一方、ｐＨＢｃｏｓ２０μｇを反応混液２
００μl で、１１４ユニツトのＨｉｎｄIII 及び１９２
ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させて消化し
たのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけ
て、ｃｏｓを含むＤＮＡ断片（１．６Ｋｂｐ）を分離精
製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ６．０μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。そして、ｐＣＨｃｏｓのｃｏｓ及びＡｐ^r 、ｏｒｉ
を含むＨｉｎｄIII ／ＰｖｕII断片のＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）と、ｐＨＢｃｏｓのｃｏｓを含むＨｉｎｄ
III ／ＰｖｕII断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と
を、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。

【００４５】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
^r クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びＡｐ
^r 、ｏｒｉを有するプラスミド：ｐＤｃｏｓ（図４）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l
中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＤｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

【００４６】（ｅ）ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r の作成および
調製 コスミドベクターであるｐＨＣ−７９〔ホーン アンド
コリンズ、ジーン（Ｈｏｈｎ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，
Ｇｅｎｅ），１１，２９１（１９８０）〕１０μl を、
反応混液１００μｌ〔５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１００
μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、１５ユニツトの制限酵素Ｃｌａ
Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）と
３７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノー
ル抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／ｍｌ）に溶解
させた。

【００４７】一方、ｐＮＴ−３１ １０μｇを反応混液
２００μl 〔１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、６ｍＭＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭＤＴ
Ｔ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、４０ユニツトの制限
酵素ＴａｑＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製）と６５℃で２時間反応させて消化したのち、
０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｃｍ
^r を含むＤＮＡ断片（０．７９Ｋｂｐ）を分離精製し
て、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／
０．１Ｅ３．０μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
そして、ｐＨＣ−７９をＣｌａＩで消化したＤＮＡ溶液
１μl （〜１μｇ）とｐＮＴ−３１のｃｍ^rを含むＴａ
ｑ−Ｉ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）とを、反応
混液２０μlで６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１
２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、フエ
ノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２
０μl に溶解させた。

【００４８】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、ｃ
ｍ^r かつＡｐ^r クローンを得た。次いで、これらのクロ
ーンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨＣ−
７９のＣｌａＩサイトのｃｍ^rを挿入させたプラスミ
ド：ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r （図５）を持つ大腸菌を得
た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させた
のち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＨＣ−
７９／ｃｍ^r のプラスミドＤＮＡを調製した。

【００４９】（ｆ）ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r Δ（Ｈｉｎｄ
III ）の作成及び調製 ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r １０μｇを、反応混液１００μl
で３５ユニツトのＨｉｎｄlII と３７℃で２時間反応さ
せて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ７μl （〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。次に、この
ＨｉｎｄIII で消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４μ
ｇ）を、反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。

【００５０】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
^r かつｃｍ^r クローンを得た。そして、これらのクロー
ンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨＣ−７
９／ｃｍ^r のＨｉｎｄIII サイトを欠いたプラスミド：
ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r Δ（ＨｉｎｄIII ）（図５）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
して、ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r Δ（ＨｉｎｄIII ）のプラ
スミドＤＮＡを調製した。

【００５１】（ｇ）ｐＵＣ−８／ｃｍ^r の作成及び調製 ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r Δ（ＨｉｎｄlII ）２０μｇを、
反応混液２００μl 〔５０ｍＭ（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、２
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂ 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、２２ユニツトの
制限酵素ＰｓｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消化し
た。そして、さらに反応混液５００μl で、８０ユニツ
トのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて完全に消化
したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にか
けて、ｃｍ^r を含むＤＮＡ断片（１．９Ｋｂｐ）を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１
０ｔ／０．１Ｅ４．０μl（〜１μｇ／μl ）に溶解さ
せた。

【００５２】一方、ｐＵＣ−８〔ジエフエリー ヴイア
イラ アンド ジオチイム メエシング、ジーン（Ｊｅ
ｆｆｅｒｙ Ｖｉｅｉｒａ ＆ Ｊｏａｃｈｉｍ Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ），１９，２５９（１９８２）〕
２０μｇを、反応混液２００μl で、６０ユニツトのＰ
ｓｔＩと３７℃で２時間反応させて完全に消化した。そ
して、さらに反応混液５００μl で、２１５ユニツトの
ＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて完全に消化した
のち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけ
て、Ａｐ^r 、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片（２．７Ｋｂｐ）
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を１０ｔ／０．１Ｅ１４．０μl （〜１μｇ／μl ）
に溶解させた。

【００５３】そして、ｐＨＣ−７９／ｃｍ^r Δ（Ｈｉｎ
ｄIII ）のｃｍ^r を含むＰｓｔ／ＢａｍＨＩ断片のＤＮ
Ａ溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＵＣ−８のＡｐ^r 、ｏ
ｒｉを含むＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μ
l （〜１μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させ
て連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。次に、
このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトラ
ンスホーメーシヨンした後、ｃｍ^r かつＡｐ^r クローン
を得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤ
ＮＡの特性を調べて、Ａｐ^r 、ｏｒｉ及びｃｍ^r を有す
るプラスミド：ｐＵＣ−８／ｃｍ^r （図５）を持つ大腸
菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖
させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、
ｐＵＣ−８／ｃｍ^r のプラスミドＤＮＡを調製した。

【００５４】（ｈ）ｐＵＣ−８／ｃｍ_r Δ（ＥｃｏＲＩ
／ＰｓｔＩ）の作成及び調製 ｐＵＣ−８／ｃｍ^r ２０μｇを反応混液２００μl で、
６０ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で３０分間反応させ
て限定消化した。次いで、フエノール抽出で除蛋白後、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱
を、反応混液２００μl で３５ユニツトのＰｓｔＩと３
７℃で２時間反応させて完全に消化した。そして、フエ
ノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１０μl （〜１μｇ／μ
ｌ）に溶解させた。

【００５５】次に、このＤＮＡ溶液１．５μl （〜１．
５μｇ）を、反応混液３０μl で〔３３ｍＭＴｒｉｓ−
ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９）、６６ｍＭ酢酸カリ、１
０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．５ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍ
ｌＢＳＡ、０．１ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＣＴＰ、
０．１ｍＭｄＧＴＰ、０．１ｍＭｄＴＴＰ〕で、５ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ・Ｌ社製）と、３
７℃で１５分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ
をｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製用ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、Ａｐ^r 、ｏｒｉ及びｃｍ
^r を含むＤＮＡ断片（３．８５Ｋｂｐ）を分離精製し
て、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。

【００５６】そして、このＤＮＡ沈澱を反応混液５０μ
l で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１
７．５時間反応させて閉環化した。その後、フエノール
抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl
に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r かつｃｍ^r クローンを得た。そして、これらのクロ
ーンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＵＣ−
８／ｃｍ^r のＥｃｏＲＩサイトとＰｓｔＩサイトの間の
ＤＮＡ断片（０．７５Ｋｂｐ）を欠いたプラスミド：ｐ
ＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）（図５）
を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１
l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離
精製して、（ｐＵＣ−８／ｃｍ^rΔ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓ
ｔＩ）のプラスミドＤＮＡを調製した。

【００５７】（ｉ）ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ
／ＰｓｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）１０μ
ｇを反応混液１００μl で１５０ユニツトのＢａｍＨＩ
と３７℃で２間反応させて消化した。そして、フエノー
ル抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶
解させた。次に、このＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液
１μl （〜１μｇ）を、反応混液２５μl で、２ユニツ
トのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、
ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変え
た。そして、反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌ
ｅｎｏｗ酵素を失活させた。

【００５８】そして、この反応液１０μl を、反応混液
５０μｌで１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その後、フエ
ノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２
０μl に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μlで
大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした
後、Ａｐ^r かつｃｍ^r クローンを得た。そして、これら
のクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐ
ＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）のＢａｍ
ＨＩサイトを欠いたプラスミド：ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ
（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ）Δ（ＢａｍＨＩ）（図５）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
して、ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ）Δ
（ＢａｍＨＩ）のプラスミドＤＮＡを調製した。

【００５９】（ｊ）ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ
／ＰｓｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）／ＨｉｎｄIII の作成及
び調整 ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）Δ（Ｂ
ａｍＨＩ）１０μｇを反応混液１００μl 〔２０ｍＭＫ
Ｃｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕
で１２５ユニツトの制限酵素ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で完全に消化
した（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）。そして、フエノール抽出
で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を
１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。

【００６０】次に、このＤＮＡ溶液０．４μl （〜０．
４μｇ）とＨｉｎｄIII リンカー〔ｄ（ｐＣ−Ａ−Ａ−
Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl
で、６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時
間反応させて連結した。そして、この反応液１０μl
を、反応混液５０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化した。
その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。

【００６１】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
^r かつｃｍ^r クローンを得た。そして、これらのクロー
ンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＵＣ−８
／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）
のＳｍａＩサイトにＨｉｎｄIII リンカーを挿入させた
プラスミド：ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／Ｐｓ
ｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）／ＨｉｎｄIII （図４及び図
５）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培
地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを
分離精製して、ｐＵＣ−８／ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／Ｐ
ｓｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）／ＨｉｎｄIII のプラスミド
ＤＮＡを調製した。

【００６２】（ｋ）ｐＤｃｏｓ／ｃｍ^r 作成及び調製 ｐＤｃｏｓ１０μｇを反応混液１００μｌで、６０ユニ
ツトのＨｉｎｄIII と３７℃で２時間反応させて消化し
た。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl
（〜１μｇ／μl）に溶解させた。一方、ｐＵＣ−８／
ｃｍ^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）／
ＨｉｎｄIII ２０μｇを反応混液２００μl で、２５０
ユニツトのＨｉｎｄIII と３７℃で２時間反応させて完
全に消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｃｍ^r を含むＤＮＡ断片（１．１５Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ４．０μl （〜１μｇ／μ
l ）に溶解させた。

【００６３】そして、ｐＤｃｏｓをＨｉｎｄIII で消化
したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）とｐＵＣ−８／ｃｍ
^r Δ（ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ）Δ（ＢａｍＨＩ）／Ｈｉ
ｎｄIII のｃｍ^r を含むＨｉｎｄIII 断片のＤＮＡ溶液
１μl （〜１μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応
させて連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。次
に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）を
トランスホーメーシヨンした後、Ａｐ^r かつｃｍ^r クロ
ーンを得た。そして、これらのクローンのもつプラスミ
ドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びＡｐ^r 、ｏ
ｒｉ、ｃｍ^r を有するプラスミド：ｐＤｃｏｓ／ｃｍ^r
（図４）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製して、ｐＤｃｏｓ／ｃｍ^r のプラスミドＤ
ＮＡを調製した。

【００６４】（ｌ）ｐＨＣｃｏｓの作成及び調製 ｐＲＨ（−４４）１０μｇを反応混液１００μl で、２
３ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させて完全
に消化したのち、さらに反応混液２５０μl で、７０ユ
ニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて完全に
消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動
にかけてｃｏｓ及びＡｐ^r 、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片
（２．４８Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ４．０μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶
液１μl （〜１μｇ）を反応混液２５μl で、２ユニツ
トのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させてｃ
ｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変え
た。そして、反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌ
ｅｎｏｗ酵素を失活させた。

【００６５】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）と
ＣｌａＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｔ
−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユニツト
のＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連
結した。そして、この反応液１０μl を、反応混液５０
μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で
１７．５時間反応させて閉環化した。その後、フエノー
ル抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μ
l に溶解させた。

【００６６】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
^r クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＲＨ（−４４）のＰ
ｖｕIIサイトとＢａｍＨＩサイトの間のＤＮＡ断片
（１．７２Ｋｂｐ）を欠き、その場所にＣｌａＩリンカ
ーが挿入されたプラスミド：ｐＨＣｃｏｓ（図６）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
してｐＨＣｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。

【００６７】（ｍ）ｐＢｇｌIIＣｃｏｓの作成及び調製 ｐＨＣｃｏｓ１０μｇを反応混液１００μl で１００ユ
ニツトのＨｉｎｄIIIと３７℃で２時間反応させて消化
した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、該沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＨｉｎ
ｄIII で消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を反応
混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃
で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。

【００６８】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
と、ＢｇｌIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させ
て連結した。そして、この反応液１０μl を、反応混液
５０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その後、フエ
ノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２
０μl に溶解させた。

【００６９】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
^r クローンを得た。そして、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＨＣｃｏｓのＨｉｎ
ｄIII サイトにＢｇｌIIリンカーを挿入させたプラスミ
ド：ｐＢｇｌIIＣｃｏｓ（図６）を持つ大腸菌を得た。
この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l で増殖させたのち、
菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＢｇｌIIＣ
ｃｏｓプラスミドＤＮＡを調製した。

【００７０】（ｎ）ｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ^a の作成
及び調製 ｐＢＲ−３２７ １０μｇを、反応混液１００μl 〔６
０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ
／ｍｌＢＳＡ〕で、５５ユニツトの制限酵素ＡｖａＩと
３７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノー
ル抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶
解させた。次に、このＡｖａＩで消化したＤＮＡ溶液１
μl （〜１μｇ）を、反応混液２５μl で、２ユニツト
のＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃ
ｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変え
た。そして反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅ
ｎｏｗ酵素を失活させた。

【００７１】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させ
て連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混
液６００μl で１０００ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃
で４時間反応させて消化したのち、０．８％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、Ａｐ^r 、ｏｒｉを含むＤ
ＮＡ断片（２．２２Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得た。

【００７２】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で、６
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて閉環化した後、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０
１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐ^r クロー
ンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミド
ＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ３２７のＢａｍＨＩサイ
トとＡｖａＩサイトの間のＤＮＡ断片（１．０５Ｋｂ
ｐ）を欠き、その場所にＢａｍＨＩリンカーを挿入させ
たプラスミド：ｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ^a（図６）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l
中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ^a のプラスミドＤＮＡ
を調製した。

【００７３】（ｏ）ｐＢＲ−３２７／ＢｇｌIIＣｃｏｓ
の作製及び調製 ｐＢｇｌIIＣｃｏｓ２０μｇを反応混液２００μl で、
６５ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反応させて完
全に消化したのち、さらに反応混液５００μlで７７ユ
ニツトのＣｌａＩと３７℃で２時間反応させて完全に消
化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動に
かけて、ｃｏｓを含むＤＮＡ断片（０．９４Ｋｂｐ）を
分離精製して、ＤＮＡエタノール沈澱として得、沈澱を
１０ｔ／０．１Ｅ５．０μl （〜１μｇ／μl ）に溶解
させた。

【００７４】一方、ｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ^a ２０μ
ｇを反応混液２００μl で、７０ユニツトのＰｓｔＩと
３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、さらに
反応混液５００μl で、８５ユニツトのＣｌａＩと３７
℃で２時間反応させて完全に消化したのち、０．８％調
製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｏｒｉを含むＤ
ＮＡ断片（１．４５Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ９．
０μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。

【００７５】そして、ｐＢｇｌIIＣｃｏｓのｃｏｓを含
むＰｓｔ／ＣｌａＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）と、ｐＢＲ−３２７ＢａｍＨＩ^a のｏｒｉを含むＰ
ｓｔＩ／ＣｌａＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。そ
の後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液
１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシ
ヨンした後、Ａｐ^rクローンを得た。次いで、これらの
クローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｃｏ
ｓ及びＡｐ^r 、ｏｒｉを有するプラスミド：ｐＢＲ−３
２７／ＢｇｌIIＣｃｏｓ（図４、図６）を持つ大腸菌を
得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させ
たのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＢ
Ｒ−３２７／ＢｇｌIIＣｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調
製した。

【００７６】（ｐ）ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r
の作成及び調製 ｐＤｃｏｓ／ｃｍ^r ２０μｇを反応混液２００μl で、
３７ユニツトのＣｌａＩと３７℃で２時間反応させて完
全に消化したのち、さらに、反応混液５００μl で１１
０ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて完
全に消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｃｍ^rを含むＤＮＡ断
片（１．５Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、この沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ４．０μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。

【００７７】一方、ｐＢＲ−３２７ＢｇｌIIＣｃｏｓ２
０μｇを反応混液２００μl で、８０ユニツトのＣｌａ
Ｉと３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、さ
らに反応混液５００μl で、２４０ユニツトのＢａｍＨ
Ｉと３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、
０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｃｏ
ｓ及びＡｐ^r 、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片（２．０Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１２μl （〜１μｇ／μl
）に溶解させた。そして、ｐＤｃｏｓ／ｃｍ^r の２個
のｃｏｓ及びｃｍ^r を含むＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ断片の
ＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２７／Ｂ
ｇｌIIＣｃｏｓのｃｏｓおよびＡｐ^r 、ｏｒｉを含むＣ
ｌａＩ／ＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結し
た。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）溶液２０μl に溶解させた。

【００７８】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r 、ｃｍ^r クローンを得た。次いで、これらのクロー
ンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、３個のｃｏ
ｓ及びＡｐ^r 、ｏｒｉ、ｃｍ^rを有するプラスミド：ｐ
ＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r （図４）を持つ大腸菌
を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖さ
せたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐ
ＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r プラスミドＤＮＡを調
製した。

【００７９】（ｑ）ｐＳＶ０１０／ｎｅｏの作製および
調製 ｐＡＯ４３〔オカ、スギサキ アンド タカナミ、ジヤ
ーナル オブ モレキユラー バイオロジー（ＯＫａ，
Ｓｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍｏ
ｌ，Ｂｉｏｌ），１４７，２１４（１９８１）〕２０μ
ｇを、反応混液２００μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ₂ 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、１
５０ユニツトの制限酵素ＡｖａII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反応させ
て消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳
動にかけて、ｎｅｏ^r を含むＤＮＡ断片（１．２４Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ５μl （〜１μｇ／μl ）
に溶解させた。

【００８０】このＤＮＡ溶液２μl （〜２μｇ）を、反
応混液５０μl で、４ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２
２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ
をｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、フエノール抽
出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ１．５μl （〜μｇ／μl ）に溶解
させた。一方、ｐＳＶ０１０｛πＶＸ〔ブライヤン シ
ード、ニユクレイツクアシデズ、リサーチ（Ｂｒａｉｎ
ｓｅｅｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ），１
１，２４２７（１９８３）〕由来のポリリンカーを持つ
たｐＳＶ０１〔チヤン、アール等、プロシーデイング
オブ ナシヨナル アカデミー サイエンシズ ユー・
エス・エー（Ｔｊａｎ，Ｒ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ，Ｎ
ａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７，６４
９１（１９８０）〕の類縁プラスミド｝１０μｇを、反
応混液１００μl で１２９ユニツトのＢａｍＨＩと３７
℃で２時間反応させて消化したのち、フエノール抽出を
行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ
／０．１Ｅ７μl （〜１Ｍｇ／μl ）に溶解させた。

【００８１】このＤＮＡ溶液２μl （〜２μｇ）を反応
混液５０μl で、４ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、フエノール抽出
で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を
１０ｔ／０．１Ｅ１．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解
させた。次に、ｐＡＯ４３のｎｅｏ^r を含むＤＮＡ断片
をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μl （〜１
μｇ）と、ｐＳＶ０１０をＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅ
ｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と
を、反応液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガー
ゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、その沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。

【００８２】そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r かつＫｍ^r （ｎｅｏ^r ）クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ０１０のＢａｍＨＩサイトにｎｅｏ^r を挿入
させたプラスミド：ｐＳＶ０１０／ｎｅｏ^r （図４）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l
中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＳＶ０１０／ｎｅｏ^r のプラスミドＤＮＡを調
製した。

【００８３】（ｒ）ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r
／ｎｅｏ^r の作成及び調製 ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r １０μｇを反応混液
１００μl で、２７ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で３
０分間反応させて限定消化した。そして、フエノール抽
出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解さ
せた。一方、ｐＳＶ０１０／ｎｅｏ^r ２０μｇを反応混
液２００μl で、３２５ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃
で２時間反応させて完全に消化したのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｎｅｏ^r を含むＤ
ＮＡ断片（１．３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ５．０μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。

【００８４】そして、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ
^r をＥｃｏＲＩで限定消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１
μｇ）と、ｐＳＶ０１０／ｎｅｏ^r のｎｅｏ^r を含むＥ
ｃｏＲＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）とを、反
応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと
１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、フ
エノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶
液２０μl に溶解させた。

【００８５】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r 、ｃｍ^r かつＫｍ^r （ｎｅｏ^r ）クローンを得た。
次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特
性を調べて、ｐＴｃｏｓＡｐ^r／ｏｒｉ／ｃｍ^r のＥｃ
ｏＲＩサイトにｎｅｏ^r が挿入されたプラスミド：ｐＴ
ｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r （図１、図
４）を持つ大腸菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院
生命工学工業技術研究所に「微工研菌第７８８８号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７８８８）」として寄託されている。この
大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌
体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＴｃｏｓＡｐ^r
／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r のプラスミドＤＮＡを調製
した。

【００８６】実施例 ２ ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／
ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r の作成および調製（図７） （ａ）ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩの作成及び調製 ｐＴＫ−４〔イシウラ、エム等、モレキユラー アンド
セルラー バイオロジー（Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅ
ｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ）、２、６０７
（１９８２）〕１０μｇを反応混液１００μl で、３．
０ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で３０分間反応させて限
定消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳
動にかけて、６．４３Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１
０ｔ／０．１Ｅ３μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。

【００８７】次に、このＤＮＡ溶液０．４μl （〜０．
４μｇ）と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl
で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間
反応させて連結した。そして、この反応液１０μl を、
反応混液５０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガー
ゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その
後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。

【００８８】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r かつＴｃ^r クローンを得た。そして、これらのクロ
ーンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ−
４のｏｒｉとＴＫとの間のＰｖｕIIサイトにＢａｍＨＩ
リンカーを挿入させたプラスミド：ｐＴＫ−４／Ｂａｍ
ＨＩ（図７）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹ
Ｇ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−
ＤＮＡを分離精製して、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩのプラ
スミドＤＮＡを調製した。

【００８９】（ｂ）ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨ
Ｉの作成及び調製 ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ１０μｇを反応混液１００μl
で９ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応させ
て限定消化したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得た。このエタノール沈澱を反応
混液１００μlで１５ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２
時間反応させて完全に消化したのち、フエノール抽出を
行い、ＤＮＡエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／
０．１Ｅ３μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。

【００９０】次に、このＢａｍＨＩで限定消化し、さら
にＰｖｕIIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素
と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅ
ｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｏｒｉ及びＡ
ｐ^r、ＴＫを含むＤＮＡ断片（４．６７Ｋｂｐ）を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤ
ＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化し
たのち、（この場合、ＢａｍＨＩサイトが再構成され
る）、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μlに溶解させた。

【００９１】そして、このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸
菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、
Ａｐ^r かつＴｃ^s クローンを得た。次いで、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ
−４／ＢａｍＨＩのＰｖｕIIサイトとＢａｍＨＩサイト
（Ｔｃ^r 上）の間のＤＮＡ断片（１．７６Ｋｂｐ）を欠
いたプラスミド：ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ
（図７）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製して、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｎＨ
ＩのプラスミドＤＮＡを調製した。

【００９２】（ｃ）ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／
ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r （２ＢａｍＨＩ）の作成および調製 ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r １０μｇ
を反応混液１００μlで６０ユニツトのＢａｍＨＩと３
７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノール
抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解
させた。一方、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ
２０μｇを反応混液２００μl で２４０ユニツトのＢａ
ｍＨＩと３７℃で２時間反応させて完全に消化したの
ち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、
ＴＫを含むＤＮＡ断片（２．０Ｋｂｐ）を分離精製し
て、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／
０．１Ｅ６．０μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。

【００９３】そして、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ
^r ／ｎｅｏ^r をＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）と、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ
のＴＫを含むＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１
μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結し
た。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）溶液２０μl に溶解させた。

【００９４】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐ^r 、ｃｍ^r かつＫｍ^r （ｎｅｏ^r ）クローンを得た。
次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特
性を調べて、ｐＴｃｏｓＡｐ ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅ
ｏ^r のＢａｍＨＩサイトにＴＫが挿入されたプラスミ
ド：ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ
^r （２ＢａｍＨＩ）（図７）を持つ大腸菌を得た。この
大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌
体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴｃｏｓＡｐ
^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r （２ＢａｍＨＩ）
のプラスミドＤＮＡを調製した。

【００９５】（ｄ）ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／
ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r の作成及び調製 ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ
^r （２ＢａｍＨＩ）１０μｇを反応混液１００μl で、
１４ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応させ
て限定消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．
１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、こ
のＢａｍＨＩで限定消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏ
ｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖ
ｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８
％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、３個のｃｏ
ｓ及びＡｐ^r 、ｏｒｉ、ＴＫ、ｃｍ^r 、ｎｅｏ^r を含む
ＤＮＡ断片（６．９３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得た。

【００９６】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で、６
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させ
た。そして、このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸菌（ＨＢ
１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐ^r 、
ｃｍ^r かつＫｍ^r （ｎｅｏ^r ）クローンを得た。次い
で、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を
調べて、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎ
ｅｏ^r （２ＢａｍＨＩ）のｃｍ^r とＴＫとの間にあるＢ
ａｍＨＩサイトを欠いたプラスミド：ｐＴｃｏｓＡｐ^r
／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r （図３、図７）を持
つ大腸菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に「微工研菌第７８８７号（ＦＥＲＭ
Ｐ−７８８７）」として寄託されている。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏ
ｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r のプラスミドＤＮＡを調
製した。

【００９７】実施例 ３ ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／
ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r によるゲノムＤＮＡ（外来ＤＮＡ）の
遺伝子バンクの製造（図２） （ａ）高分子量のゲノムＤＮＡの調製 ｐＢＲ−３２２の塩基配列を持つ、ヘルペスシンプレツ
クウイルス１型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子の組換え体を移入したマウスＬ細胞（Ｌｔｋ
^- 〔ＨＳＶ−１ＴＫ⁺ 〕）は、１０％仔牛血清を添加し
たイーグルＭＥＭで培養し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏ
ｎｏｌａｙｅｒｓ（１００ｍｍ−プレート９枚、〜１０
⁷ ｃｅｌｌｓ／プレート）とし、ＰＢＳ（１３７ｍＭＮ
ａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＮａ₂ ＨＰＯ₄ 、１ｍＭ
ＫＨ₂ ＰＯ₄ ）で２度洗ったのち、可溶化剤〔１００μ
ｇ／ｍｌ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、０．５％ＳＤＳ、
１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）〕をプレート当たり１．０
ｍｌ加え、６５℃で１５〜３０分間保温して可溶化し
た。

【００９８】この可溶化物は５０ｍｌ容量の遠沈管に移
し、さらに３７℃で一晩保温し、途中、Ｐｒｏｔｉｎａ
ｓｅＫをさらに１００μｇ／ｍｌ添加した。反応後、等
量のトリス緩衝液で飽和したフエノールでおだやかに２
度抽出し、水層を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮａＣｌからなる透
析緩衝液３l に対して４回透析を行つた。透析内液は、
５０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＲＮａｓｅＡ
を加えて、３７℃で３時間保温してＲＮＡを分解した。
反応後、等量のフエノール：クロロホルム混液で２度お
だやかに抽出し、水層を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡからなる水溶液（ＴＥ）３
l に対して９回透析して、精製ＤＮＡ溶液５０ｍｌを得
た。ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍと２８０ｎｍでの吸光度
（ＯＤ）は、１０倍希釈でそれぞれ０．６６７、０．３
６３（ＯＤ₂₈₀ ／ＯＤ₂₆₀ ＝０．５４４）であり、ＤＮ
Ａの濃度は０．６６７×０．０５０（μｇ／l ＯＤ）×
１０＝０．３３４μｇ／μlであつた。

【００９９】（ｂ）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡの
調製 精製したゲノムＤＮＡ溶液５．９８ｍｌ（２ｍｇ）を、
反応混液２９．９６ｍｌ〔５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ₂ 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で１５．６ユニツトの
Ｓａｕ３Ａ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社
製）と３７℃で１時間反応させて限定消化したのち、
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液を１．３ｍｌ加
え、等量のトリス緩衝液飽和フエノールで２度おだやか
に抽出した。そして、水層をセカンダリーブタノールで
１０ｍｌまで濃縮したのち、３．０Ｍ酢酸ナトリウム
１．１ｍｌとエタノール２０ｍｌを加え、エタノール沈
澱としてゲノムＤＮＡを得、７０％エタノールで洗つた
のち、水流ポンプにて乾燥を行い、エタノール沈澱をＴ
Ｅ２ｍｌに溶解させた。

【０１００】次に、このＤＮＡ溶液３００μl を５〜２
５％シヨ糖密度勾配遠心〔２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、５ｍＭＥＤＴＡ、ベツクマンＳＷ２
８；２０，０００ｒｐｍ、９時間、２０℃〕にかけて３
０滴ごとに分画した。各分画２０μl を０．４％アガロ
ースゲル電気泳動にかけて長さを測定し、３５〜４５Ｋ
ｂｐの大きさのＤＮＡ分画を集めたのち、ＴＥ３l に対
して３回透析を行った。そして、透析内液をフエノール
抽出後、水層をセカンダリーブタノールで濃縮し、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱をＴＥ１ｍｌに溶解
させて、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ溶液を得た。
ＤＮＡ溶液のＯＤ₂₆₀ 及びＯＤ₂₈₀ は５０倍希釈でそれ
ぞれ０．２１６、０．１１２（ＯＤ₂₈₀ ／ＯＤ₂₆₀ ＝
０．５１９）であり、ＤＮＡの濃度は０．２１６×０．
０５０（μｇ／l ＯＤ）×５０＝０．５４μｇ／μl で
あつた。

【０１０１】（ｃ）コスミドベクターＤＮＡの調製 ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r ４０μｇ
を反応混液４００μlで８０ユニツトのＣｌａＩと３７
℃で２時間反応させて消化した。その後、フエノール抽
出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１
０ｔ／０．１Ｅ１００μl に溶解させた。このＣｌａＩ
で消化したＤＮＡ溶液９５μl を、反応混液５００μl
〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、０．１ｍＭＺｎＣｌ₂ 、１ｍＭスペルジミ
ン〕で、６ユニツトのホスフアターゼ（Ｃａｌｆ ｉｎ
ｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａ
ｔａｓｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
製）と、３７℃で１５分間反応後、５６℃で１５分間反
応後、さらに６ユニツトのホスフアターゼを加え、３７
℃で１５分間反応させて、ＣｌａＩの切断片を不活化し
た。

【０１０２】その後、Ｈ₂ Ｏ４００μl 、ＳＴＥ〔１０
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭＮａＣ
ｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ〕１００μl 、１０％ＳＤＳ５０
μl を加え、６８℃で１５分間保温して、ホスフアター
ゼを失活させた。そして、フエノール抽出で除蛋白後、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．
１Ｅ３０μl に溶解した。次に、このＣｌａＩで消化
し、ホスフアターゼで不活化したＤＮＡ溶液３０μl
を、反応混液５００μl で、１７６ユニツトのＢａｍＨ
Ｉと３７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエ
ノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ３０μl に溶解させて、コ
スミドベクターＤＮＡ溶液を得た（０．６９μｇ／μl
）。

【０１０３】（ｄ）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡと
コスミドベクターＤＮＡとの連結 （ｂ）で調製した３５〜４５Ｋｂｐのゲノム溶液２．６
１μl （１．４μｇ）と、（ｃ）で調製したコスミドベ
クターＤＮＡ０．８６μl （０．５９μｇ）とを、反応
混液１０μl で５．９ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ
と１２℃で１７．５時間反応させて連結した。反応終了
後、反応液を４℃で保存した。

【０１０４】（ｅ）パッケージング抽出液の調製 （１）ＢＨＢ２６９０から超音波処理して得られる菌体
抽出液の調製 大腸菌ＢＨＢ２６９０をＮＺＹ培地（１％ＮＺａｍｉｎ
ｅ、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．２％
ＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ、ｐＨ７．５）１００ｍｌで一晩
培養した液のＯＤ₆₀₀ を測定後、あらかじめ３２℃に保
温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｌ（２l フラスコ中）
に最初のＯＤ₆₀₀ が０．０２５になるように菌を接種
し、３２℃で振とう培養を開始した。そして、ＯＤ₆₀₀
が、０．３になった時点で（培養開始から２時間４０分
後）、４５℃で１５分間おきプロフアージの誘導を行っ
た。その後、培養温度を３８〜３９℃に変え、さらに３
時間激しく振とう培養した（培養液の少量にクロロホル
ムを一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。

【０１０５】培養終了後、６，０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離機にかけて集菌を行い、菌体を２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭβ
−メルカプトエタノールからなる緩衝液３．６ｍｌに懸
濁液させた。そして、４℃以下で超音波処理（最大出力
で５秒間×２０回）を行つたのち、２０，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離機にかけて（４℃）、上澄液〜３ｍ
ｌを得た。次に、上澄液３ｍｌに等量の上記緩衝液とパ
ツケージング緩衝液〔６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、５０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭプトレシ
ン、２０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、３０ｍＭＡＴＰ、３０ｍＭβ
−メルカプトエタノール〕０．５ｍｌを加えたのち、１
５μl ずつ１．５ｍｌのエツペンドルフチユーブに分注
し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−７０℃で保存した。

【０１０６】（２）ＢＨＢ２６８８から凍結・融解によ
つて得られる菌体抽出液の調製 大腸菌２６８８を、ＮＺＹ培地１００ｍｌで一晩培養し
た液のＯＤ₆₀₀ を測定したのち、あらかじめ３２℃に保
温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｌ（２l フラスコ中）
に最初のＯＤ₆₀₀ が０．０２５になるように菌を接種
し、３２℃で振とう培養を開始した。そして、ＯＤ₆₀₀
が０．３になった時点で（培養開始から２時間４０分
後）、４５℃で１５分間おきプロフアージの誘導を行つ
た。その後、培養温度を３８〜３９℃に変え、さらに３
時間激しく振とう培養した（培養液の少量にクロロホル
ムを一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。

【０１０７】培養終了後、６，０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離機にかけて集菌を行い、菌体をシヨ糖溶液〔１
０％シヨ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）〕３ｍｌに懸濁させたのち、０．５ｍｌずつエツペ
ンドルフチユーブ６本にとり、この各々のチユーブにリ
ゾチーム溶液〔２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）〕２５μl を加え（４℃）、おだや
かに混合し、すばやく液体窒素中にて凍結させた。次
に、チユーブを氷上において抽出物を融解させたのち、
各チユーブにパツケージング緩衝液２５μl を加えて混
合した。そして、各抽出物を一緒にして、２１，０００
ｒｐｍで１時間（４℃）遠心分離機にかけて上澄液を
得、これの１０μl ずつを１．５ｍｌのエツペンドルフ
チユーブに分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−７０
℃で保存した。

【０１０８】（ｆ）ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージング −７０℃に保存しておいたＢＨＢ２６９０とＢＨＢ２６
８８の菌体抽出液を氷上におき、まず先に融解するＢＨ
Ｂ２６８８の抽出液をＢＨＢ２６９０の抽出液に加え
て、おだやかに混合した。ほぼ全部融解したところで、
（ｄ）で調製した組換え体ＤＮＡ溶液２．５μl （０．
５μｇ）を加えてよく混合したのち、室温で１時間反応
させてｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングを行つた。反応
終了後、ＳＭ溶液〔０．５８％ＮａＣｌ、０．２％Ｍｇ
ＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）０．０１％ゲラチン〕１ｍｌとクロロホルム一
滴を加えて混合した。そして、エツペンドルフチユーブ
を机上遠心機に３０秒間かけて、上澄液を形質導入フア
ージ粒子溶液として得た。

【０１０９】（ｇ）形質導入及びプレーテイング 大腸菌ＨＢ１０１のＬ−ブロス（マルトース０．４％添
加）で一晩培養した液２００μl を机上遠心機にかけて
集菌を行い、その菌体を１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 溶液１００
μl に再懸濁した。次に、この菌体懸濁液１００μl に
ＳＭ溶液で１０倍希釈した形質導入フアージ粒子溶液１
００μl を加え、３７℃で１５分間保温して形質導入を
行つたのち、さらにＬ−ブロス１．１ｍｌを加え、３７
℃で４５分間振とう培養した。そして、この菌体懸濁液
を１００μl ずつアンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有する
１００ｍｍのＬ−プレートに塗布し、プレートを３７℃
で一晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてＬ
−ブロス（アンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有）で増殖さ
せた。また、プレート当たりのコロニー数は２０〜１０
０個であった。

【０１１０】（ｈ）トランスホーマントの培養及び、そ
れの持つプラスミドＤＮＡの調製と特性化 （ｇ）で得られたアンピシリン耐性コロニー（トランス
ホーマント）２０個を、Ｌ−ブロス（アンピシリン２０
μｇ／ｍｌ含有）２ｍｌで一晩培養した後、各培養液
１．５ｍｌのエツペンドルフチユーブにとり、机上遠心
機にかけて集菌した。これらの菌体を溶液Ｉ〔５０ｍＭ
グルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１
００μl に再懸濁したのち、室温で５分間おいた。次
に、溶液II（０．２ＮＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）２００μ
l を加えておだやかに混合し、氷上に５分間おいたの
ち、溶液III〔５Ｍ酢酸カリ（ｐＨ４．８）〕１５０μl
を加えておだやかに混合し、氷上に５分間おいた。そ
して、エツペンドルフチユーブを机上遠心機にかけて上
澄液を得、これに２倍容量のエタノールを加えて、プラ
スミドＤＮＡをエタノール沈澱として得た。

【０１１１】各トランスホーマントのもつプラスミドＤ
ＮＡを少量の１０ｔ／０．１Ｅに溶解させたのち、サイ
ズマーカーＤＮＡ（ラムダＤＮＡ：４８Ｋｂｐ、ラムダ
ＤＮＡをＨｉｎｄIII で消化したもの：２２．３Ｋｂ
ｐ、９．５Ｋｂｐ）と一緒に、０．４％アガロースゲル
電気泳動にかけたところ、アンピシリン耐性コロニー２
０個のうち、すべてが２２．３Ｋｂｐ〜４８Ｋｂｐの大
きさのところにプラスミドＤＮＡの存在が認められた。
この段階では、組換え体ＤＮＡはプラスミドとして存在
しており、外来ＤＮＡの遺伝子バンクはプラスミドＤＮ
Ａとして製造されている。

【０１１２】（ｉ）形質導入及びｉｎ ｖｉｖｏパツケ
ージング 大腸菌ＨＢ１０１にラムダフアージが溶原化している菌
株ＬＮ９００〔ＨＢ１０１（λＣＩ^ts、Ｔｃ^r ）：３０
℃ではラムダフアージは溶原化しているが、３７℃では
ラムダフアージは溶菌化サイクルに移行する。また、テ
トラサイクリン耐性である。〕をＬ−ブロス（マルトー
ス０．４％添加）にて３０℃で一晩培養した。その培養
液２００μl を机上遠心機にかけて集菌を行い、その菌
体を１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 溶液１００μl に再懸濁した。

【０１１３】次に、この菌体懸濁液１００μl に、
（ｆ）で調製した形質導入フアージ粒子溶液（ＳＭ溶液
で１０倍希釈）１００μl を加え、３０℃で１５分間保
温して形質導入を行つたのち、さらにＬ−ブロス１．１
ｍｌを加え、３０℃で４５分間振とう培養した。その
後、最終濃度が２０μｇ／ｍｌになるようにアンピシリ
ン及びクロラムフエニコールを添加し、全液量２ｍｌ
（Ｌ−ブロス：マルトース０．４％添加）で３０℃にお
いて一晩培養した。

【０１１４】次に、この培養液２５μl を、あらかじめ
３０℃に保温しておいたＬ−ブロス（マルトース０．４
％、アンピシリン２０μｇ／ｍｌ、クロラムフエニコー
ル２０μｇ／ｍｌ添加）５ｍｌに接種し、３０℃で振と
う培養を開始した。そして、ＯＤ₆₀₀ が０．３になった
時点で（培養開始から３時間後）、４０℃で１０分間お
いてインダクシヨン（誘発）を行つたのち、培養温度を
３７℃に変えて３０分間振とう培養した。そして、この
培養液１００μl に、あらかじめ３７℃に保温しておい
たＬ−ブロス（マルトース０．４％添加）９．９ｍｌを
加え、さらに３７℃で２時間振とう培養したのち、クロ
ロホルムを数滴加えて混合した。

【０１１５】次に、この液を遠心分離機（４，５００ｒ
ｐｍ、１０分間）にかけて、上澄液を形質導入フアージ
粒子溶液として得た。また、この形質導入フアージ粒子
溶液５０μl に、３０℃で一晩培養しておいた大腸菌Ｌ
Ｎ９００の培養液１ｍｌを加え、３０℃で５分間保温し
て形質導入を行つたのち、この菌体懸濁液を５０μlず
つＬ−プレート（アンピシリン２０μｇ／μl 含有）に
塗布し、プレートを３０℃において一晩おいたところ、
プレート当たり１，０００〜３，０００個のコロニーが
認められた。この段階において、組換え体ＤＮＡは形質
導入フアージ粒子として存在しており、外来ＤＮＡの遺
伝子バンクは形質導入フアージ粒子として製造される。

【図面の簡単な説明】

【図１】新規コスミドベクターｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒ
ｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r を示すものである。

【図２】図１の新規コスミドベクターを用いるゲノムＤ
ＮＡの遺伝子バンクの製造方法を示すものである。

【図３】新規コスミドベクターｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒ
ｉ^r ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^rを示すものである。

【図４】ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r ／ｎｅｏ^r
の作成方法を示すものである。

【図５】図４に続くｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r
／ｎｅｏ^r の作成方法を示すものである。

【図６】図５に続くｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ｃｍ^r
／ｎｅｏ^r の作成方法を示すものである。

【図７】ｐＴｃｏｓＡｐ^r ／ｏｒｉ／ＴＫ／ｃｍ^r ／ｎ
ｅｏ^r の作成方法を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 善雄 大阪府箕面市半町２−22−28

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 同一の方向性を持つたラムダフアージま
   たはラムドイドフアージのｃｏｓを少なくとも３個有
   し、２種類の制限酵素で切ることによつて得られる、そ
   れぞれｃｏｓを少なくとも１個もしくは２個持つた右腕
   と左腕との間に、３５〜４５Ｋｂｐの長さの種々の外来
   ＤＮＡ断片を挿入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージング
   で形質導入フアージ粒子に変え、次いでラムダフアージ
   が溶原化している大腸菌にクローン化したのち誘発をか
   けて、組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏパツケージング
   で形質導入フアージ粒子に変えることによつて、外来Ｄ
   ＮＡの遺伝子バンクを製造することを特徴とする新規コ
   スミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法。
2. 【請求項２】 外来ＤＮＡが、細菌、糸状菌、酵母など
   の微生物、高等動植物もしくは各種フアージ等に由来す
   るＤＮＡである請求項１記載の遺伝子バンクの製造法。