JPH0898695A - 組換えメルサシジンおよびその製造方法 - Google Patents
組換えメルサシジンおよびその製造方法Info
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- JPH0898695A JPH0898695A JP7232356A JP23235695A JPH0898695A JP H0898695 A JPH0898695 A JP H0898695A JP 7232356 A JP7232356 A JP 7232356A JP 23235695 A JP23235695 A JP 23235695A JP H0898695 A JPH0898695 A JP H0898695A
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 メチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌に対する食
品防腐用または動物もしくはヒトにおける黄色ブドウ球
菌感染症の処置用の抗生物質として有用である、メルサ
シジンの大量生産を可能にするプレメルサシジンもしく
はプロメルサシジンまたはそれらをコードするＤＮＡの
提供。 【解決手段】 プレメルサシジンもしくはプロメルサシ
ジンまたはそれらをコードするＤＮＡ、これらのいずか
のＤＮＡを含有するベクター、これらのいずれかのベク
ターを含有する宿主細胞、ならびに上述のＤＮＡ配列を
含有する適当な宿主細胞を適当な条件下に培養する工程
およびプレメルサシジン、プロメルサシジンまたは成熟
メルサシジンを単離する工程を包含するプレメルサシジ
ン、プロメルサシジンまたは成熟メルサシジンの製造方
法。
品防腐用または動物もしくはヒトにおける黄色ブドウ球
菌感染症の処置用の抗生物質として有用である、メルサ
シジンの大量生産を可能にするプレメルサシジンもしく
はプロメルサシジンまたはそれらをコードするＤＮＡの
提供。 【解決手段】 プレメルサシジンもしくはプロメルサシ
ジンまたはそれらをコードするＤＮＡ、これらのいずか
のＤＮＡを含有するベクター、これらのいずれかのベク
ターを含有する宿主細胞、ならびに上述のＤＮＡ配列を
含有する適当な宿主細胞を適当な条件下に培養する工程
およびプレメルサシジン、プロメルサシジンまたは成熟
メルサシジンを単離する工程を包含するプレメルサシジ
ン、プロメルサシジンまたは成熟メルサシジンの製造方
法。
Description
【０００１】本発明はとくに、ペプチド抗生物質メルサ
シジンの構造遺伝子配列に関する。配列決定により、プ
レメルサシジンは異常に長い４８個のアミノ酸のリーダ
ー配列と成熟ランチビオティックへの生合成時に修飾さ
れる２０個のアミノ酸のプロペプチド部分から構成され
ることが明らかにされた。
シジンの構造遺伝子配列に関する。配列決定により、プ
レメルサシジンは異常に長い４８個のアミノ酸のリーダ
ー配列と成熟ランチビオティックへの生合成時に修飾さ
れる２０個のアミノ酸のプロペプチド部分から構成され
ることが明らかにされた。
【０００２】メルサシジンは殺菌性ペプチド群の一つ、
とくにこれらのペプチドが稀なアミノ酸、ランチオニン
および／または３−メチルランチオニンを含有すること
を表すためにランチビオティックと命名された群に属す
る。そのほかデヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン
のような修飾されたアミノ酸が通常存在するが、一方Ｓ
-アミノビニルシステインやリジノアラニンは一部のラ
ンチビオティックのみに見出される［G. Jung (1991),
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30：1051−1068］。ラン
チビオティックはグラム陽性菌によって産生され、リボ
ソームで合成されるプレペプチドに由来する。ランチビ
オティックの構造遺伝子はこれまで、細菌の染色体（た
とえばスブチリンおよびシンナマイシン）上に見出され
るか、またはトランスポゾン（たとえばナイシン）もし
くは大プラスミド（たとえばエピデルミンおよびＰｅｐ
５）のような可動性要素に結合している。プレペプチド
は、産生細胞から排出されたのちに切断されるＮ−末端
リーダー配列と、翻訳後に成熟ランチビオティックに修
飾されるＣ−末端プロペプチドから構成される［G.Jung
(1991)、前出］。修飾の第一工程においては、セリン
およびスレオニン残基が脱水されてそれぞれデヒドロア
ラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）を
与える［H.-P. Weilら(1990), Eur. J. Biochem. 194：
217−223］。ついで、システイン残基のＳＨ−基がＤｈ
ａまたはＤｈｂ残基の二重結合と反応して、それぞれラ
ンチオニンまたはメチルランチオニンを形成する。
とくにこれらのペプチドが稀なアミノ酸、ランチオニン
および／または３−メチルランチオニンを含有すること
を表すためにランチビオティックと命名された群に属す
る。そのほかデヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン
のような修飾されたアミノ酸が通常存在するが、一方Ｓ
-アミノビニルシステインやリジノアラニンは一部のラ
ンチビオティックのみに見出される［G. Jung (1991),
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30：1051−1068］。ラン
チビオティックはグラム陽性菌によって産生され、リボ
ソームで合成されるプレペプチドに由来する。ランチビ
オティックの構造遺伝子はこれまで、細菌の染色体（た
とえばスブチリンおよびシンナマイシン）上に見出され
るか、またはトランスポゾン（たとえばナイシン）もし
くは大プラスミド（たとえばエピデルミンおよびＰｅｐ
５）のような可動性要素に結合している。プレペプチド
は、産生細胞から排出されたのちに切断されるＮ−末端
リーダー配列と、翻訳後に成熟ランチビオティックに修
飾されるＣ−末端プロペプチドから構成される［G.Jung
(1991)、前出］。修飾の第一工程においては、セリン
およびスレオニン残基が脱水されてそれぞれデヒドロア
ラニン（Ｄｈａ）またはデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）を
与える［H.-P. Weilら(1990), Eur. J. Biochem. 194：
217−223］。ついで、システイン残基のＳＨ−基がＤｈ
ａまたはＤｈｂ残基の二重結合と反応して、それぞれラ
ンチオニンまたはメチルランチオニンを形成する。
【０００３】メルサシジンは、Bacillus spec. HIL Y-8
5,54728の培養上清から単離され、メチシリン抵抗性黄
色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するその顕著なインビボ
効果によって注目された［S. Chatterjeeら (1992), J.
Antibiotics 45：839−845］。これは単離されている
限りの最も小さいランチビオティック（１８２５Da）で
あり、２０アミノ酸のプロペプチドから合成され、３個
のメチルランチオニン残基、１個のデヒドロアラニンお
よび１個のＳ−アミノビニル−２−メチルシステインを
含有する（図１Ａ）［S. Chatterjee (1992), J. Antib
iotics 45：832−838］。メルサシジンは正味の電荷を
もたず、全体的に疎水性の性質を有する。最近の結果で
はメルサシジンがペプチドグリカンの生合成を妨害する
ことが指摘されている。これは、ＭＲＳＡに対して現在
用いられている抗生物質とは異なる機構を介してトラン
スグリコシレーションのレベルで生じるものと考えられ
る。
5,54728の培養上清から単離され、メチシリン抵抗性黄
色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するその顕著なインビボ
効果によって注目された［S. Chatterjeeら (1992), J.
Antibiotics 45：839−845］。これは単離されている
限りの最も小さいランチビオティック（１８２５Da）で
あり、２０アミノ酸のプロペプチドから合成され、３個
のメチルランチオニン残基、１個のデヒドロアラニンお
よび１個のＳ−アミノビニル−２−メチルシステインを
含有する（図１Ａ）［S. Chatterjee (1992), J. Antib
iotics 45：832−838］。メルサシジンは正味の電荷を
もたず、全体的に疎水性の性質を有する。最近の結果で
はメルサシジンがペプチドグリカンの生合成を妨害する
ことが指摘されている。これは、ＭＲＳＡに対して現在
用いられている抗生物質とは異なる機構を介してトラン
スグリコシレーションのレベルで生じるものと考えられ
る。
【０００４】したがって、本発明は、図２に示すアミノ
酸１番から６８番までのアミノ酸配列を有するプレメル
サシジン、ならびに図２に示すアミノ酸４９番から６８
番までのアミノ酸配列を有するプロメルサシジンに関す
る。
酸１番から６８番までのアミノ酸配列を有するプレメル
サシジン、ならびに図２に示すアミノ酸４９番から６８
番までのアミノ酸配列を有するプロメルサシジンに関す
る。
【０００５】本発明の更なる実施態様は、プレメルサシ
ジンまたはプロメルサシジンをコードするＤＮＡであ
り、とくに図２に示すプレメルサシジンをコードする２
２番から２２５番まで、またはプロメルサシジンをコー
ドする１６６番から２２５番までのヌクレオチド配列を
有するＤＮＡ、このＤＮＡを含有するベクター、ならび
にこのベクターを含有する宿主細胞である。
ジンまたはプロメルサシジンをコードするＤＮＡであ
り、とくに図２に示すプレメルサシジンをコードする２
２番から２２５番まで、またはプロメルサシジンをコー
ドする１６６番から２２５番までのヌクレオチド配列を
有するＤＮＡ、このＤＮＡを含有するベクター、ならび
にこのベクターを含有する宿主細胞である。
【０００６】他の実施態様は、本技術分野の熟練者には
一般的に知られている遺伝子工学的方法によって、すな
わち、プレメルサシジンまたはプロメルサシジンをコー
ドする上記ＤＮＡを含有する適当な宿主細胞を適当な条
件下に培養し、ついで上記宿主細胞、好ましくはグラム
陽性細菌たとえばバチルス、ストレプトミセスまたはス
トレプトコッカスによって発現されるプレメルサシジ
ン、プロメルサシジンまたは成熟メルサシジンを単離す
ることによる、プレメルサシジン、プロメルサシジンま
たは成熟メルサシジンの製造方法である。
一般的に知られている遺伝子工学的方法によって、すな
わち、プレメルサシジンまたはプロメルサシジンをコー
ドする上記ＤＮＡを含有する適当な宿主細胞を適当な条
件下に培養し、ついで上記宿主細胞、好ましくはグラム
陽性細菌たとえばバチルス、ストレプトミセスまたはス
トレプトコッカスによって発現されるプレメルサシジ
ン、プロメルサシジンまたは成熟メルサシジンを単離す
ることによる、プレメルサシジン、プロメルサシジンま
たは成熟メルサシジンの製造方法である。
【０００７】最後に、本発明のプレメルサシジンもしく
はプロメルサシジンまたはそれらの遺伝子は、たとえば
ＷＯ９０／００５５８に記載のようにして、成熟メルサ
シジンの製造に使用することができる。
はプロメルサシジンまたはそれらの遺伝子は、たとえば
ＷＯ９０／００５５８に記載のようにして、成熟メルサ
シジンの製造に使用することができる。
【０００８】たとえば、成熟メルサシジンは、とくにメ
チシリン抵抗性黄色ブドウ球菌に対する食品防腐用のペ
プチド抗生物質として、または動物もしくはヒトにおけ
る黄色ブドウ球菌感染症の処置のための抗生物質として
有用である。本発明はさらにアミノ酸配列が修飾され、
卓越した抗生物質スペクトルまたは異なる効力を有する
メルサシジン誘導体を得るために使用することができ
る。さらに本発明は遺伝子工学によりメルサシジンおよ
びその誘導体を大量に生産する方法を開くものである。
チシリン抵抗性黄色ブドウ球菌に対する食品防腐用のペ
プチド抗生物質として、または動物もしくはヒトにおけ
る黄色ブドウ球菌感染症の処置のための抗生物質として
有用である。本発明はさらにアミノ酸配列が修飾され、
卓越した抗生物質スペクトルまたは異なる効力を有する
メルサシジン誘導体を得るために使用することができ
る。さらに本発明は遺伝子工学によりメルサシジンおよ
びその誘導体を大量に生産する方法を開くものである。
【０００９】実施例 １．メルサシジンの構造遺伝子のクローニング メルサシジンプロペプチドの推定配列（図１Ｂ）は、メ
ルサシジンの構造とランチビオティックの生合成につい
ての一般情報に基づいて推論された。記載されたプロー
ブは PCR-MateR（Applied Biosystems, Weiterstadt, F
RG）により、バチルスの好むコドン利用に基づき５１−
塩基ゲスマーとして合成され、ジゴキシゲニン（Boehri
nger Mannheim, Mannheim, FRG）によって標識された
（図１Ｂ）。アミノブチリル残基（Ａｂｕ−メチルラン
チオニンの半分）はスレオニンに由来し、一方アラニン
残基（Ａｌａ−メチルランチオニンの半分）はプロペプ
チド中においてはシステインとしてコードされる。末端
環構造を形成するＳ−アミノビニル−２−メチルシステ
インは多分Ｃ−末端Ｓ−アミノビニルシステインを含有
するエピデルミンについて明らかにされているように
［T. Kupkeら(1961)、J.Bacteriol. 174：5354−536
1］、酸化的に脱炭酸されたメチルランチオニンから形
成されるものと思われる。
ルサシジンの構造とランチビオティックの生合成につい
ての一般情報に基づいて推論された。記載されたプロー
ブは PCR-MateR（Applied Biosystems, Weiterstadt, F
RG）により、バチルスの好むコドン利用に基づき５１−
塩基ゲスマーとして合成され、ジゴキシゲニン（Boehri
nger Mannheim, Mannheim, FRG）によって標識された
（図１Ｂ）。アミノブチリル残基（Ａｂｕ−メチルラン
チオニンの半分）はスレオニンに由来し、一方アラニン
残基（Ａｌａ−メチルランチオニンの半分）はプロペプ
チド中においてはシステインとしてコードされる。末端
環構造を形成するＳ−アミノビニル−２−メチルシステ
インは多分Ｃ−末端Ｓ−アミノビニルシステインを含有
するエピデルミンについて明らかにされているように
［T. Kupkeら(1961)、J.Bacteriol. 174：5354−536
1］、酸化的に脱炭酸されたメチルランチオニンから形
成されるものと思われる。
【００１０】産生株中にプラスミドは検出できなかった
ので、１回だけクロロホルム抽出と沈澱を行い、ついで
ＤＮＡを平衡化緩衝液中に溶解し、Quiagen-tipR 100
カラム（Diagen, Hilden, FRG）上で精製したほかは Ma
rmur［J. Marmur(1961)，J.Mol. Biol. 3：208−218］
の記載に従って染色体ＤＮＡを調製した。Hind IIIによ
る染色体の制限消化の２kbバンドのみを５１℃でサザン
ブロット［E. M. Southern (1975), J. Mol. Biol. 9
8：503−517］によりプローブとハイブリダイズさせ
た。サイズ１.９〜２.３kbの範囲のフラグメントをゲル
から切り出し、BIOTRAPR（Schleicher & Schuell, Dass
el, FRG）で溶出し、大腸菌内でpUC 18［C.Yanisch-Per
ronら(1985), Gene 33：103−109］中にサブクローニン
グした。数個の組換えコロニーのプラスミドをBirnboim
& Dolyの方法［H. C. Birnboim &J. Doly (1979), Nuc
l. Acids Res. 7：1513−1523］によって調製し、Hind
IIIで消化し、ゲスマーをプローブとして調べた。陽性
シグナルを与えたクローンの一つを、各種酵素での制限
消化ついでサザンブロットによりさらに解析した。最後
に１.３kb EcoRＩ−Hind IIIフラグメントを大腸菌内で
pEMBL 18およびpEMBL19［L. Denteら(1983), Nucl. Aci
ds Res. 11：1645−1655］中にサブクローニングした。
さらに、トランスフォーマーの特定部位の突然変異誘発
キットを用いてEcoRＩ部位のEcoRＶ部位への特定部位の
突然変異を誘発したのち、０.６kb EcoRＶフラグメント
をベクターpCU１［J. Augustinら(1992), Eur. J. Bioc
hem. 204：1149−1154］にクローニングした。
ので、１回だけクロロホルム抽出と沈澱を行い、ついで
ＤＮＡを平衡化緩衝液中に溶解し、Quiagen-tipR 100
カラム（Diagen, Hilden, FRG）上で精製したほかは Ma
rmur［J. Marmur(1961)，J.Mol. Biol. 3：208−218］
の記載に従って染色体ＤＮＡを調製した。Hind IIIによ
る染色体の制限消化の２kbバンドのみを５１℃でサザン
ブロット［E. M. Southern (1975), J. Mol. Biol. 9
8：503−517］によりプローブとハイブリダイズさせ
た。サイズ１.９〜２.３kbの範囲のフラグメントをゲル
から切り出し、BIOTRAPR（Schleicher & Schuell, Dass
el, FRG）で溶出し、大腸菌内でpUC 18［C.Yanisch-Per
ronら(1985), Gene 33：103−109］中にサブクローニン
グした。数個の組換えコロニーのプラスミドをBirnboim
& Dolyの方法［H. C. Birnboim &J. Doly (1979), Nuc
l. Acids Res. 7：1513−1523］によって調製し、Hind
IIIで消化し、ゲスマーをプローブとして調べた。陽性
シグナルを与えたクローンの一つを、各種酵素での制限
消化ついでサザンブロットによりさらに解析した。最後
に１.３kb EcoRＩ−Hind IIIフラグメントを大腸菌内で
pEMBL 18およびpEMBL19［L. Denteら(1983), Nucl. Aci
ds Res. 11：1645−1655］中にサブクローニングした。
さらに、トランスフォーマーの特定部位の突然変異誘発
キットを用いてEcoRＩ部位のEcoRＶ部位への特定部位の
突然変異を誘発したのち、０.６kb EcoRＶフラグメント
をベクターpCU１［J. Augustinら(1992), Eur. J. Bioc
hem. 204：1149−1154］にクローニングした。
【００１１】２．メルサシジン構造遺伝子、ｍｒｓＡの
ヌクレオチド配列 上記０.６kbのフラグメントをＡ.Ｌ.Ｆ自動ＤＮＡシー
ケンサー（Pharmacia,Brussels, Belgium）によって二
重鎖ＤＮＡからジデオキシチェーンターミネーター法
［F. Sangerら(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
4：5463−5467］を用いて配列決定した。プライミング
には、AutoReadR 配列決定キット（Pharmacia, Brussel
s, Belgium）のユニバーサルおよびリバーサルプライマ
ーと２つの合成オリゴヌクレオチド、 ５′−（ＴＣＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＧ）３′ および ５′−（ＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣ）３′ を使用した。メルサシジン構造遺伝子、ｍｒｓＡのヌク
レオチド配列は図２に示す。リボソーム結合部位の可能
性がある部位（ＡＧＧ ＧＧＧ）はオープンリーディン
グフレームのＡＴＧ開始コドンの８塩基対上流に見出さ
れた。配列のＣ末端部分は、報告されているメルサシジ
ンの一次構造［S. Chatterjeeら(1992), J. Antibiotic
s 45：832−838］およびその提案されたプロペプチド配
列に一致する。Ｎ末端部分は４８個のアミノ酸リーダー
配列から構成される（図２、矢印）。プロメルサジンは
２０個のアミノ酸から構成される。したがって、プレペ
プチドの完全長は６８アミノ酸であり、分子量は７２２
８Daと計算される。ＴＡＡ（オーカー）終止コドンの８
塩基下流に自由エネルギー値−８６.７kJmol-1、ステム
サイズ１４塩基対のヘアピン構造が見出され、これは、
続いてＴＴＴＡＴＴ配列が存在するので（図２）転写時
にｒｈｏ−非依存性ターミネーターとして働くものと思
われる。
ヌクレオチド配列 上記０.６kbのフラグメントをＡ.Ｌ.Ｆ自動ＤＮＡシー
ケンサー（Pharmacia,Brussels, Belgium）によって二
重鎖ＤＮＡからジデオキシチェーンターミネーター法
［F. Sangerら(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
4：5463−5467］を用いて配列決定した。プライミング
には、AutoReadR 配列決定キット（Pharmacia, Brussel
s, Belgium）のユニバーサルおよびリバーサルプライマ
ーと２つの合成オリゴヌクレオチド、 ５′−（ＴＣＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＧ）３′ および ５′−（ＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣ）３′ を使用した。メルサシジン構造遺伝子、ｍｒｓＡのヌク
レオチド配列は図２に示す。リボソーム結合部位の可能
性がある部位（ＡＧＧ ＧＧＧ）はオープンリーディン
グフレームのＡＴＧ開始コドンの８塩基対上流に見出さ
れた。配列のＣ末端部分は、報告されているメルサシジ
ンの一次構造［S. Chatterjeeら(1992), J. Antibiotic
s 45：832−838］およびその提案されたプロペプチド配
列に一致する。Ｎ末端部分は４８個のアミノ酸リーダー
配列から構成される（図２、矢印）。プロメルサジンは
２０個のアミノ酸から構成される。したがって、プレペ
プチドの完全長は６８アミノ酸であり、分子量は７２２
８Daと計算される。ＴＡＡ（オーカー）終止コドンの８
塩基下流に自由エネルギー値−８６.７kJmol-1、ステム
サイズ１４塩基対のヘアピン構造が見出され、これは、
続いてＴＴＴＡＴＴ配列が存在するので（図２）転写時
にｒｈｏ−非依存性ターミネーターとして働くものと思
われる。
【００１２】３．メルサシジンプレペプチドの性質 ランチビオティックは２群に分類されてきた［G. Jung
(1991)、前出］。Ａ型のランチビオティックは感受性の
細菌の膜に一過性の開口を形成する線状の両性ペプチド
である［H.-C. Sahl(1991), Pore formation in bacter
ial membranesby cationic lantibiotics, 347−358頁,
In G. Jung & H.-G. Sahl(編), Nisinand novel lanti
biotics, Escom, Leiden］。Ｂ型のランチビオティック
はストレプトミセスによって産生される球状のペプチド
で、分子量は２１００Da未満、それらのアミノ酸配列お
よび頭部尾部縮合を含む環構造に関して高度な相同性を
示す［G. Jung(1991)、前出］。現在まで、メルサシジ
ンはいずれの群にも分類できていなかった［G. Bierbau
m & H.-G. Sahl(1993), Zbl. Bakt. 278：1−22］。こ
の点でメルサシジンのプレペプチド配列のＡおよびＢ型
ランチビオティックの場合との比較はとくに興味があ
る。
(1991)、前出］。Ａ型のランチビオティックは感受性の
細菌の膜に一過性の開口を形成する線状の両性ペプチド
である［H.-C. Sahl(1991), Pore formation in bacter
ial membranesby cationic lantibiotics, 347−358頁,
In G. Jung & H.-G. Sahl(編), Nisinand novel lanti
biotics, Escom, Leiden］。Ｂ型のランチビオティック
はストレプトミセスによって産生される球状のペプチド
で、分子量は２１００Da未満、それらのアミノ酸配列お
よび頭部尾部縮合を含む環構造に関して高度な相同性を
示す［G. Jung(1991)、前出］。現在まで、メルサシジ
ンはいずれの群にも分類できていなかった［G. Bierbau
m & H.-G. Sahl(1993), Zbl. Bakt. 278：1−22］。こ
の点でメルサシジンのプレペプチド配列のＡおよびＢ型
ランチビオティックの場合との比較はとくに興味があ
る。
【００１３】ランチビオティックのリーダー配列の２つ
の共通の特性がメルサシジンに保存されている。すなわ
ち、ｉ）リーダー配列中にはシステインがないこと［G.
Jung(1991)、前出］、ならびに ii）リーダー配列のＣ
末端部分にα−ヘリックス傾向が予想されること、であ
る。このような構造要素は、トリフルオロエタノール／
水混合物中における円二色性測定によりＡ型ランチビオ
ティックのリーダーペプチドに予測され証明されている
［A.G. Beck-Sickinger & G. Jung (1991), Synthesis
and conformational analysis of lantibiotic leader
-, pro- and prepeptides, 218−230頁, In G. Jung &
H.-G. Sahl（編）, Nisin and novel lantibiotics, Es
com, Leiden］。他のすべての点で、メルサシジンのリ
ーダー配列はこれまでに報告されている限りのＡ型ラン
チビオティックのリーダー配列とは異なっている。図３
に示すように、それは長さおよび電荷分布（４８アミノ
酸／１２電荷）の点で、Ｂ型のランチビオティック、シ
ンナマイシンの異常に長い５９アミノ酸のリーダー配列
（１１電荷）にむしろ類似している［C. Kalettaら(198
9), Pep5, a new lantibiotic: structural gene isola
tion and prepeptidesequence. Arch. Microbiol. 152:
16−19］。これに反し、典型的な高度荷電Ａ型ランチ
ビオティックのリーダー配列、たとえばPep５のリーダ
ーペプチドは、わずか２６個の総アミノ酸中１０個の荷
電残基を含有している［Kalettaら(1989)、前出］。Ａ
型ランチビオティックの保存配列（たとえば、ＦＤ／Ｎ
ＬＤ／Ｅモチーフ）はメルサシジンのリーダーペプチド
中には見出されない。メルサシジンリーダー配列のプロ
テアーゼ切断部位（-4Ｍ--3Ｅ--2Ａ--1Ａ-+1Ｃ）はＡ型
ランチビオティックの保存部位とは異なっている（図
３）。ここには、本発明者らはナイシン型の切断部位
（−１、陽性に荷電したアミノ酸；−２、プロリン；−
３、陰性に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸；−
４、疎水性アミノ酸）またはラクチシン４８１［J.-C.
Piardら(1993), J. Biol. Chem., 268: 16361−16368］
もしくはストレプトコクシンＡ-ＦＦ２２［W.L. Hynes
ら(1993), Appl. Env. Microbiol. 59: 1969−1971］の
疎水性グリシン含有切断部位のいずれかを見出してい
る。シンナマイシンの（-3Ａ--2Ｆ--1Ａ）切断部位［C.
Kalettaら(1989)、前出］はＳｅｃ経路を介して分泌さ
れるタンパク質についての（-3Ａ--2Ｘ- -1Ａ）の法則に
一致している。結論として、メルサシジンプレペプチド
は、Ａ型ランチビオティックのリーダー配列の保存配列
とは全くホモロジーを示さない。シンナマイシンのプレ
ペプチドとは長さおよび電荷分布で類似性があるが、ア
ミノ酸レベルでは明瞭な配列のホモロジーはない。メル
サシジンはＡ型ランチビオティックより小さく、陽性に
荷電しておらず、膜を脱分極しないで、むしろペプチド
グリカンの生合成を阻害する。これは、リーダーペプチ
ドの性質に加えて、メルサシジンがＡ型のランチビオテ
ィックよりもＢ型のランチビオティックに類似している
ことを示している。同じく細胞壁の生合成を阻害する他
のランチビオティックであるアクタガルジン［S. Somma
ら(1977), Antimicrob. Agents Chemother. 11: 396−4
01］の配列および架橋パターンが最近解明された。メル
サシジンと比較すると、一つの環は両ランチビオティッ
クでほぼ完全に保存されていることが明かである。これ
までに性質が明らかにされたＢ型ランチビオティック、
デュラマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、アンコベニンとシンナマイ
シンの高いホモロジーを考慮すると、これらのペプチド
もまた、エピデルミンとガリデルミンまたはナイシンＡ
とナイシンＺについて観察されているのと同様に、構造
変異体とみなすことが可能であろう。したがって、本発
明者らは、メルサシジンとアクタガルジンはＢ型ランチ
ビオティックとともに分類すべきであること、およびＢ
型ランチビオティックの名称をデュラマイシンの構造変
異体のみに確保しておくべきではなく、低電荷で酵素活
性を阻害する小さな球状のランチビオティックからなる
ものとすることを提案する。
の共通の特性がメルサシジンに保存されている。すなわ
ち、ｉ）リーダー配列中にはシステインがないこと［G.
Jung(1991)、前出］、ならびに ii）リーダー配列のＣ
末端部分にα−ヘリックス傾向が予想されること、であ
る。このような構造要素は、トリフルオロエタノール／
水混合物中における円二色性測定によりＡ型ランチビオ
ティックのリーダーペプチドに予測され証明されている
［A.G. Beck-Sickinger & G. Jung (1991), Synthesis
and conformational analysis of lantibiotic leader
-, pro- and prepeptides, 218−230頁, In G. Jung &
H.-G. Sahl（編）, Nisin and novel lantibiotics, Es
com, Leiden］。他のすべての点で、メルサシジンのリ
ーダー配列はこれまでに報告されている限りのＡ型ラン
チビオティックのリーダー配列とは異なっている。図３
に示すように、それは長さおよび電荷分布（４８アミノ
酸／１２電荷）の点で、Ｂ型のランチビオティック、シ
ンナマイシンの異常に長い５９アミノ酸のリーダー配列
（１１電荷）にむしろ類似している［C. Kalettaら(198
9), Pep5, a new lantibiotic: structural gene isola
tion and prepeptidesequence. Arch. Microbiol. 152:
16−19］。これに反し、典型的な高度荷電Ａ型ランチ
ビオティックのリーダー配列、たとえばPep５のリーダ
ーペプチドは、わずか２６個の総アミノ酸中１０個の荷
電残基を含有している［Kalettaら(1989)、前出］。Ａ
型ランチビオティックの保存配列（たとえば、ＦＤ／Ｎ
ＬＤ／Ｅモチーフ）はメルサシジンのリーダーペプチド
中には見出されない。メルサシジンリーダー配列のプロ
テアーゼ切断部位（-4Ｍ--3Ｅ--2Ａ--1Ａ-+1Ｃ）はＡ型
ランチビオティックの保存部位とは異なっている（図
３）。ここには、本発明者らはナイシン型の切断部位
（−１、陽性に荷電したアミノ酸；−２、プロリン；−
３、陰性に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸；−
４、疎水性アミノ酸）またはラクチシン４８１［J.-C.
Piardら(1993), J. Biol. Chem., 268: 16361−16368］
もしくはストレプトコクシンＡ-ＦＦ２２［W.L. Hynes
ら(1993), Appl. Env. Microbiol. 59: 1969−1971］の
疎水性グリシン含有切断部位のいずれかを見出してい
る。シンナマイシンの（-3Ａ--2Ｆ--1Ａ）切断部位［C.
Kalettaら(1989)、前出］はＳｅｃ経路を介して分泌さ
れるタンパク質についての（-3Ａ--2Ｘ- -1Ａ）の法則に
一致している。結論として、メルサシジンプレペプチド
は、Ａ型ランチビオティックのリーダー配列の保存配列
とは全くホモロジーを示さない。シンナマイシンのプレ
ペプチドとは長さおよび電荷分布で類似性があるが、ア
ミノ酸レベルでは明瞭な配列のホモロジーはない。メル
サシジンはＡ型ランチビオティックより小さく、陽性に
荷電しておらず、膜を脱分極しないで、むしろペプチド
グリカンの生合成を阻害する。これは、リーダーペプチ
ドの性質に加えて、メルサシジンがＡ型のランチビオテ
ィックよりもＢ型のランチビオティックに類似している
ことを示している。同じく細胞壁の生合成を阻害する他
のランチビオティックであるアクタガルジン［S. Somma
ら(1977), Antimicrob. Agents Chemother. 11: 396−4
01］の配列および架橋パターンが最近解明された。メル
サシジンと比較すると、一つの環は両ランチビオティッ
クでほぼ完全に保存されていることが明かである。これ
までに性質が明らかにされたＢ型ランチビオティック、
デュラマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、アンコベニンとシンナマイ
シンの高いホモロジーを考慮すると、これらのペプチド
もまた、エピデルミンとガリデルミンまたはナイシンＡ
とナイシンＺについて観察されているのと同様に、構造
変異体とみなすことが可能であろう。したがって、本発
明者らは、メルサシジンとアクタガルジンはＢ型ランチ
ビオティックとともに分類すべきであること、およびＢ
型ランチビオティックの名称をデュラマイシンの構造変
異体のみに確保しておくべきではなく、低電荷で酵素活
性を阻害する小さな球状のランチビオティックからなる
ものとすることを提案する。
【００１４】
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル配列：Yes アンチセンス：Yes 配列の特徴： 特徴を表す記号：exon 存在位置：１..17 配列： TCTCTTCCAT TTTTTTG 17
【００１５】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル配列：Yes アンチセンス：Yes 配列の特徴： 特徴を表す記号：exon 存在位置：１..19 配列： AAATCAAATT AACAAATAC 19
【００１６】配列番号：３ 配列の長さ：２８８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ ハイポセティカル配列：No アンチセンス：Yes 起源： 科学名：メルサシジン 株名：バチルス 生物個体名：ＨＩＬ Ｙ−８５,５４７２８ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＲＢＳ 存在位置：１..21 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：22..225 配列の特徴： 特徴を表す記号：Terminator 存在位置：208..288 配列： CTTAATAAGG GGGTGAATAC A ATG AGT CAA GAA GCT ATC ATT CGT TCA TGG 51 Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp 1 5 10 AAA GAT CCT TTT TCC CGT GAA AAT TCT ACA CAA AAT CCA GCT GGT AAC 99 Lys Asp Pro Phe Ser Arg Glu Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn 15 20 25 CCA TTC AGT GAG CTG AAA GAA GCA CAA ATG GAT AAG TTA GTA GGT GCG 147 Pro Phe Ser Glu Leu Lys Glu Ala Gln Met Asp Lys Leu Val Gly Ala 30 35 40 GGA GAC ATG GAA GCA GCA TGT ACT TTT ACA TTG CCT GGT GGC GGC GGT 195 Gly Asp Met Glu Ala Ala Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly 45 50 55 GTT TGT ACT CTA ACT TCT GAA TGT ATT TGT TAATTTGATT TATATAGGCT 245 Val Cys Thr Leu Thr Ser Glu Cys Ile Cys 60 65 GTTTCCCTTC AGAAGGAACA GCCTATATTT TATTATATAA ACT 288
【００１７】配列番号：４ 配列の長さ：６８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp Lys Asp Pro Phe Ser Arg Glu 5 10 15 Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn Pro Phe Ser Glu Leu Lys Glu Ala 20 25 30 Gln Met Asp Lys Leu Val Gly Ala Gly Asp Met Glu Ala Ala Cys Thr Phe 35 40 45 50 Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly Val Cys Thr Leu Thr Ser Glu Cys Ile Cys 55 60 65
【図１】Ａ）ランチビオティック、メルサシジンの構
造。 Ｂ）プレペプチドの推定配列およびその構造遺伝子の同
定に用いられた５１塩基ゲスマーの配列。
造。 Ｂ）プレペプチドの推定配列およびその構造遺伝子の同
定に用いられた５１塩基ゲスマーの配列。
【図２】ランチビオティック、メルサシジンの構造遺伝
子ｍｒｓＡのヌクレオチド配列およびそのプレペプチド
の推定アミノ酸配列。ＡＴＧ開始コドン前面のリボソー
ム結合部位は四角で囲み、プロセッシング部位には矢印
を付した。推定ｒｈｏ−非依存性ターミネーターには下
線を付した。
子ｍｒｓＡのヌクレオチド配列およびそのプレペプチド
の推定アミノ酸配列。ＡＴＧ開始コドン前面のリボソー
ム結合部位は四角で囲み、プロセッシング部位には矢印
を付した。推定ｒｈｏ−非依存性ターミネーターには下
線を付した。
【図３】数種のランチビオティックのリーダー配列の比
較。保存配列はボールド体で示した。
較。保存配列はボールド体で示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/315 8318−4Ｈ 14/32 8318−4Ｈ 14/36 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (10)
- 【請求項１】 図２のアミノ酸１番目から６８番目まで
に示すアミノ酸配列を有するプレメルサシジン。 - 【請求項２】 図２のアミノ酸４９番目から６８番目ま
でに示すアミノ酸配列を有するプロメルサシジン。 - 【請求項３】 請求項１のプレメルサシジンをコードす
るＤＮＡ。 - 【請求項４】 図２の核酸２２番目から２２５番目まで
に示す核酸配列を有するプレメルサシジンをコードする
ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項２のプロメルサシジンををコード
するＤＮＡ。 - 【請求項６】 図２の核酸１６６番目から２２５番目ま
でに示す核酸配列を有するプロメルサシジンをコードす
るＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項３〜６のいずれかに記載のＤＮＡ
を含有するベクター。 - 【請求項８】 請求項７のベクターを含有する宿主細
胞。 - 【請求項９】 （ａ）請求項３〜６に記載のＤＮＡ配列
を含有する適当な宿主細胞を適当な条件下に培養する工
程および（ｂ）プレメルサシジン、プロメルサシジンま
たは成熟メルサシジンを単離する工程を包含するプレメ
ルサシジン、プロメルサシジンまたは成熟メルサシジン
の製造方法。 - 【請求項１０】 成熟メルサシジンの製造のための請求
項１または２に記載のプレメルサシジンまたはプロメル
サシジンの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94114298A EP0700998B1 (en) | 1994-09-12 | 1994-09-12 | Recombinant mersacidin and a method for production |
| DE94114298:6 | 1994-09-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0898695A true JPH0898695A (ja) | 1996-04-16 |
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ID=8216276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7232356A Pending JPH0898695A (ja) | 1994-09-12 | 1995-09-11 | 組換えメルサシジンおよびその製造方法 |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0700998B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0898695A (ja) |
| KR (1) | KR100394289B1 (ja) |
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| CZ (1) | CZ285741B6 (ja) |
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| HU (1) | HU216619B (ja) |
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| NZ (1) | NZ272960A (ja) |
| PT (1) | PT700998E (ja) |
| RU (1) | RU2198924C2 (ja) |
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| US6861236B2 (en) | 2002-05-24 | 2005-03-01 | Applied Nanosystems B.V. | Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way |
| GB0406870D0 (en) * | 2004-03-26 | 2004-04-28 | Novacta Biosystems Ltd | Improvements relating to the production of lantibiotics |
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| GB0714029D0 (en) | 2007-07-18 | 2007-08-29 | Novacta Biosystems Ltd | Lantibiotic-based compounds having antimicrobial activity |
| GB0714030D0 (en) | 2007-07-18 | 2007-08-29 | Novacta Biosystems Ltd | The use of type-B lantibiotic-based compounds having antimicrobial activity |
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- 1994-09-12 PT PT94114298T patent/PT700998E/pt unknown
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- 1994-09-12 DE DE69433357T patent/DE69433357T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-12 EP EP94114298A patent/EP0700998B1/en not_active Expired - Lifetime
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