JPH089977A - 酵母プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 低温域（例えば１０℃以下）においてより高
いプロモーター活性を有する酵母プロモーターの提供。 【構成】 以下の配列を有するＤＮＡ配列、または以下
の配列と相同性を有しかつプロモーター活性を保持する
配列を有する、ＤＮＡ断片。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】産業上の利用分野 本発明は新規な酵母プロモーターに関し、さらに詳しく
は常温（約３０℃）よりも低温域（例えば１０℃以下）
で高いプロモーター活性を有するビール酵母（Saccharo
myces cerevisiae）由来のプロモーターに関する。

【０００２】背景の技術 近年、遺伝子工学の技術を酵母に応用することにより、
目的とするタンパク質を大量に製造する酵母株の造成が
試みられている。この試みにおいては、目的とするタン
パク質それ自体が有用である場合もあり、また目的とす
るタンパク質が製造されて酵母の性質が改良され、その
酵母の有用性が高められることもある。後者の可能性あ
る具体例としては、酵母を利用したアルコール製造、ア
ミノ酸製造などの代謝産物の製造のほか、発酵食品（例
えば、パン、味噌、醤油）もしくは発酵飲料（例えば、
ビール、ワイン、清酒、焼酎、スピリット類）の製造が
挙げられる。

【０００３】今日まで、遺伝子工学の技術を用い、目的
とするタンパク質を酵母中で大量に発現させることを目
的として、「プロモーター」の開発が精力的に行われて
きた。現在までいくつかの強力なプロモーターが見出さ
れており、酵母中での外来遺伝子の発現に有用であるこ
とが示されている。例えば、サッカロミセス・セレビシ
アエ（Saccharomyces cerevisiae）の遺伝子ＡＤＣ１
（別名ＡＤＨ）、ＧＡＰＤＨ（別名ＧＰＤ）、ＰＧＫ遺
伝子などのプロモーターであって３０℃付近で培養した
酵母から高いプロモーター活性を有するものとして取得
されたものが、酵母での外来遺伝子の発現に使用されて
いる。

【０００４】一方、ビール醸造をはじめとする醸造は、
一般的に、１０℃付近以下の低温で行われる。このよう
な温度で特異的におよび効率的に発現するプロモーター
は取得されていない。また、ビール酵母中で目的とする
タンパク質を発現させることを目的とするビール酵母固
有のプロモーターを利用した発現系の開発もこれまで報
告されていない。更に、実験酵母（Saccharomyces cere
visiae）において、酵母の至適培養温度３０℃から１０
℃への低温ショックにより誘導を受ける遺伝子として、
これまでＴＩＰ１とＮＳＲ１の２種の遺伝子が取得され
ているが、これらについてはプロモーター自体の評価は
実施されていない（蛋白質・核酸・酵素Vol.39 No.5(19
94)）。

【０００５】

【発明の概要】本発明者らは１０℃以下の低温域におい
てプロモーター活性を有するプロモーターを取得するべ
く研究を重ねた。その結果、酵母染色体から当該プロモ
ーターを含むＤＮＡ断片を取得することに成功した。

【０００６】従って、本発明は、１０℃以下の低温域に
おいてプロモーター活性を有するプロモーターを含むＤ
ＮＡ断片の提供を目的とする。

【０００７】本発明によるＤＮＡ断片は、配列番号２に
記載されるＤＮＡ配列、または配列番号２に記載される
ＤＮＡ配列と相同性を有しかつプロモーター活性を保持
する配列を有するもの、である。また、本発明による発
現ベクターは、前記ＤＮＡ断片と、その下流に位置する
外来遺伝子とを含んでなるもの、である。更に、本発明
による宿主は、上記発現ベクター等によって形質転換さ
れたもの、である。

【０００８】本発明によるＤＮＡ断片は常温でよりも低
温域（例えば１０℃以下）において高いプロモーター活
性を有するプロモーターを含んでいる。従って、本発明
によるＤＮＡ断片を外来遺伝子とともに連結したベクタ
ー等を宿主に導入することによって、低温域において高
率で外来遺伝子を発現させることができる。また、培養
温度を制御（例えば常温から低温へ）することにより、
外来遺伝子の発現量を制御することができる。

【０００９】

【発明の具体的説明】

＜プロモーター活性を有するＤＮＡ断片＞本発明による
プロモーター活性を有するＤＮＡ断片は配列番号２で表
されるもの、である。このＤＮＡ断片は酵母において低
温域で発現されるタンパク質（後述するｐ１２タンパク
質）の構造遺伝子の上流に位置するものであり、プロモ
ーター領域を含むものである。この低温域において発現
されるタンパク質のコード領域とプロモーター領域とを
含む塩基配列は配列番号１に記載されている。

【００１０】本発明によるＤＮＡ断片に含まれるプロモ
ーターは、常温（約３０℃）よりも４〜１０℃において
高いプロモーター活性を有する。従って、本発明によれ
ば、常温よりも１０℃以下の温度で高率で外来遺伝子を
発現させることができる。

【００１１】さらに、本発明によるプロモーター活性を
有するＤＮＡ断片には、配列番号２で表される配列に加
えて、配列番号２に記載されるＤＮＡ配列と相同性を有
しかつプロモーター活性を保持する配列も含まれる。こ
のような配列には、配列番号２の配列およびその部分配
列中の塩基のいずれかについて欠失、置換、および付
加、並びにこれらの組み合わせが存在するが、そのプロ
モーター活性を保持する配列も包含される意味に解釈さ
れるべきである。ここで、「プロモーター活性を保持す
る」とは、配列番号２で表される配列が有する３０℃で
のプロモーター活性よりも依然として高いプロモーター
活性を１０℃以下の低温域において示す意味に用いるこ
ととする。

【００１２】なお、本発明において「プロモーター」と
は、宿主細胞中で構造遺伝子に連結したとき、その構造
遺伝子に関して、そのプロモーターが存在しない条件下
の転写、翻訳、またはｍＲＮＡの安定性を増大させる任
意のＤＮＡ配列を意味する。また、「外来遺伝子」と
は、その遺伝子が特定生物に由来するか否かを問わず、
自然界では特定のプロモーターと機能的に共存していな
い任意の遺伝子を意味する。

【００１３】本発明の上記酵母プロモーターを含むＤＮ
Ａ断片は慣用されている核酸合成の手法により全合成さ
れてよく、また下記の寄託微生物より取得されてもよ
い。

【００１４】＜微生物の寄託＞本発明によるプロモータ
ー遺伝子を含むＤＮＡ断片は、後述するプラスミドｐＣ
ＳＰ−Ｐ８に含まれ（実施例４参照）、このプラスミド
ｐＣＳＰ−Ｐ８を含む大腸菌ＥＫＢ５０２株は、平成６
年６月１５日に工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ ＢＰ−４６９８の受託番号のもと、寄託されて
いる。

【００１５】＜形質転換および外来遺伝子の発現等＞本
発明によるプロモーターを含むＤＮＡ断片をその上流に
連結した外来遺伝子（以下「プロモーター連結外来遺伝
子」ということがある）を酵母に導入することにより、
外来遺伝子の発現が本発明によるプロモーターによって
制御されている酵母を取得することができる。

【００１６】このプロモーター連結外来遺伝子を酵母に
導入する方法としては、ANALYTICALBIOCHEMISTRY163,39
1(1987) に記載されているように当業界において慣用さ
れている手法を用いることができる。具体的には、プロ
モーター連結外来遺伝子をベクターに組み込んでこれを
酵母に導入する方法、直接酵母に導入する方法等が挙げ
られる。

【００１７】本発明によれば、プロモーター遺伝子を含
むＤＮＡ断片と、その下流に位置する外来遺伝子とを連
結してなる発現ベクターが提供される。このような発現
ベクターとしては、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断
片と、その下流に位置する外来遺伝子とを連結してなる
ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片がベクターに連結された発
現プラスミドが挙げられる。

【００１８】発現ベクター構築のために用いられるプラ
ミドとしては、例えばＹＲｐ系（酵母染色体のＡＲＳ配
列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、Ｙ
Ｅｐ系（酵母の２μｍＤＮＡの複製起点を持つマルチコ
ピーベクター）、ＹＣｐ系（酵母染色体のＡＲＳ配列を
複製起点として持ち、かつ酵母染色体のセントロメアの
ＤＮＡ配列を持つ酵母用シングルコピーベクター）、Ｙ
Ｉｐ系（酵母の複製起点を持たない酵母染色体組み込み
用ベクター）などの酵母用ベクターとして用いられてい
るものを挙げることができる。これらのベクターおよび
その組み換え体の作製等については医学出版センター
刊、「酵母のニューバイオテクノロジー」、ｐ２８４に
記載されている。

【００１９】連結される外来遺伝子は特に限定されるも
のではないが、例えば、α−アセト乳酸脱炭酸酵素遺伝
子、アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グ
ルコアミラーゼ遺伝子などを用いることができる。連結
される外来遺伝子はそれにコードされている遺伝子産物
の発現を目的とすることに限定されず、アンチセンスＲ
ＮＡによる発現の制御もその目的に含まれる。

【００２０】発現プラスミドには、形質転換体選択のた
めのマーカー遺伝子（例えばＧ４１８耐性遺伝子、セル
レニン耐性遺伝子、銅耐性遺伝子）、形質転換する宿主
の種類に応じたターミネーター（例えばＰＧＫ遺伝子、
ＡＤＣ遺伝子、ＧＰＤ遺伝子のターミネーター）などを
連結することができる。

【００２１】発現プラミドによる形質転換法としては、
例えば、リチウムアセテート法が挙げられるがこれに限
定されるものではない。また酵母に直接ＤＮＡを導入す
る手法としては、薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子
を持つプラスミドと導入する遺伝子ＤＮＡとで同時に酵
母を形質転換する共形質転換法（特公平５−６０９１８
号）を挙げることができる。

【００２２】発現ベクターによって形質転換される宿主
としては好ましくは酵母が挙げられ、具体的には実験酵
母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、ウィスキー酵
母、焼酎酵母などの醸造用酵母のほか、パン酵母などの
食品用酵母、アルコール生産用酵母などの工業用酵母な
どを用いることができる。

【００２３】また、本発明による形質転換された宿主を
培養することによって、タンパク質を製造することがで
きる。発現させることができるタンパク質としては、例
えばビール酵母においては、α−アセト乳酸脱炭酸酵素
遺伝子、アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子、グルコアミラーゼ遺伝子などを好ましくは発現させ
ることができる。培養条件は宿主に応じて適宜決定され
てよいが、本発明によるプロモーターが低温域において
高い活性を有するものであることから、１０℃以下ので
培養が好ましく、より好ましくは４℃である。

【００２４】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。

【００２５】実施例１ ビール酵母が低温において生産
するタンパク質の同定 （１）ビール酵母が生産するタンパク質の調製 ビール酵母を５０ｍｌの最少培地Ａ（０．６７％ イー
ストナイトロジェンベース、２％ グルコース、１０μ
ｇ／ｍｌ アデニル硫酸、１０μｇ／ｍｌ ウラシル、
さらにＬ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン塩酸、Ｌ−
アルギニン塩酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−リジン塩酸、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−バリン、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−ア
ラニン、Ｌ−グリシンを各々１２．５μｇ／ｍｌ含む）
に一白金耳植菌し３０℃で一晩振盪培養した。これから
１０ｍｌずつを３本の１０００ｍｌの最少培地Ａに植菌
し、６００ｎｍにおけるＯＤが約４になるまで３０℃で
静置培養した（培養液１）。

【００２６】この培養液１から４５ｍｌを分取して集菌
し、４５ｍｌの最少培地Ａ（終濃度１．７５ｍｇ／ｍｌ
になるようにＬ−メチオニンを加えたもの）に再懸濁し
た。３０℃で１時間静置培養した後、菌体を集菌し、こ
れを３０℃培養菌体とした。また、培養液１から９００
ｍｌを分取して集菌後９００ｍｌの最少培地Ａに再懸濁
し、１０℃で一晩静置培養した。培地を等量の新鮮な最
少培地Ａに交換し、４℃で一晩静置培養した。この培地
をさらに等量の新しい最少培地Ａ（終濃度１．７５ｍｇ
／ｍｌになるようにＬ−メチオニンを加えたもの）に交
換し、１時間静置培養した後、菌体を集菌し、これを４
℃培養菌体とした。いずれの菌体も、集菌後に５０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した後に、−８
０℃で保存した。

【００２７】酵母菌体からのタンパク質の取得は、ガラ
スビーズ法を用いた。菌体をもとの培地の４０分の１量
の２ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（２０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＣａＣｌ_２）に懸
濁後、直径０．４ｍｍのガラスビーズを液面の１ｍｍ下
まで加え氷中で冷やした。その後６０秒間ボルテックス
を用いて激しく攪拌した後、６０秒間氷中に静置すると
いう操作を８回繰り返した。溶液を回収し菌体破砕液と
した。これに、マイクロコッカルヌクレアーゼ（シグマ
社製）を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加え、４℃
で３０分放置した。次に、ＳＤＳ−２ＭＥ溶液（２％
ＳＤＳ、１０％ ２−メルカプトエタノール）と、ＤＮ
ａｓｅ−ＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ デオキシリボ
ヌクレアーゼＩ、２ｍｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ、
５００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２）をそれぞれ菌体破砕液の１／１０容ず
つ加え、４℃で３０分放置したものを、酵母タンパク質
試料として使用時まで−２０℃で保存した。酵母タンパ
ク質試料は、プロテインアッセイキット（バイオラッド
社製）でタンパク濃度を測定した。

【００２８】（２）ビール酵母が低温的において生産す
るタンパク質の同定 低温特異的にビール酵母が生産するタンパク質は、続生
化学実験講座２タンパク質の化学（上）（東京化学同
人）ｐ１５〜２７記載の二次元電気泳動法（Ｏ’Ｆａｒ
ｒｅｌｌ法）を用いて同定した。一次元目の等電点電気
泳動の両性担体は、アンフォラインｐＨ５−８（ファル
マシア社製）を用いた。３０℃培養菌体または４℃培養
菌体から調製した菌体タンパク質５００μｇをそれぞれ
二次元電気泳動に供し、クーマシーブリリアントブルー
染色後、タンパク質泳動パターンを比較した。その結
果、３０℃培養菌体タンパク質の泳動パターンでは検出
されないが、４℃培養菌体タンパク質の泳動パターンで
現われる分子量１２ｋＤａのタンパク質（以下「ｐ１２
タンパク質」という）のスポットを見い出した。

【００２９】実施例２ ｐ１２タンパク質の部分アミノ
酸配列決定 部分アミノ酸配列の決定は岩松（生化学 ６３、ｐ１３
９（１９９１））のポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤ
Ｆ）膜を利用した方法にしたがって実施した。実施例１
（２）と同様に４℃培養菌体タンパク質の二次元電気泳
動を行い、泳動後エレクトロブロッティングによりｐ１
２タンパク質をゲルよりＰＶＤＦ膜（「ＰｒｏＢｌｏ
ｔ」（アプライド・バイオシステムズ社製））へ転写し
た。エレクトロブロッティング装置としてはザルトブロ
ットＩＩｓ型（ザルトリウス社製）を用い、島津製作所
編の「プロテインシーケンサの試料前処理方法について
実施例１にしたがって、エレクトロブロッティングを１
６０ｍＡで１時間行った。転写後、特開平６−６２８４
９号公報に記載される方法によって、ｐ１２タンパク質
のペプチダーゼ消化ペプチド断片を取得し、アミノ酸配
列決定試験をアプライド・バイオシステムズ社の気相プ
ロテインシークエンサー４７０型をマニュアルにしたが
って用い、自動エドマン分解法により行った。得られた
アミノ酸配列は以下の通りである。

【００３０】 アミノ酸配列１ Asn Ala Asp Ser Gln Gly Glu Ser Phe Ala Asp Gln Ala Arg Asp Tyr Met Gly Ala Ala Lys アミノ酸配列２ Asp Ala Val Glu Tyr Val Ser Gly Arg Ala His Glu Glu Asp Pro Thr Lys アミノ酸配列３ Asp Ala Val Glu Tyr Val Ser Gly Arg Val His Gly Glu アミノ酸配列４ Leu Asn Asp Ala Val Glu Tyr Val アミノ酸配列５ Gly Val Phe Gln Gly Val His アミノ酸配列６ Glu Phe Ile Thr

【００３１】実施例３ ｐ１２タンパク質を産生するＤ
ＮＡ鎖のビール酵母からのクローニング ｐ１２タンパク質を産生するＤＮＡ鎖、すなわち、ビー
ル酵母のＬｇ−ＣＳＰ１遺伝子は以下の方法でクローニ
ングした。 （１）プローブの合成と標識 実施例２で得られた部分アミノ酸配列のうち、アミノ酸
配列１、３および４の情報をもとにアプライド・バイオ
システム社ＤＮＡシンセサイザー「モデル３８０Ｂ」を
用いて、付属のオペレーターマニュアルに従って、以下
のような合成プローブを作製した。精製した合成プロー
ブは、それぞれ独立に［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（〜６００
０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて標識した。

【００３２】 プローブ３（アミノ酸配列４由来） Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｙｒ ５’ ＡＡＴ ＧＡＴ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＴＡ ３’ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ｇ

【００３３】 プローブ３Ｃ（アミノ酸配列３由来） Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ５’ ＣＡＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＴ ＡＣ ３’ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ

【００３４】 プローブ１（アミノ酸配列１由来） Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ ５’ ＧＡＴ ＴＡＴ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣ ３’ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｇ

【００３５】（２）プラークハイブリダイゼーションに
よるクローニング 特開平６−６２８４９号公報記載の、ファージベクター
ＥＭＢＬ３を用いて作製したビール酵母染色体ＤＮＡフ
ァージライブラリー約１０，０００クローンを、ナイロ
ンメンブレン（Ｃｏｌｏｎｙ／ＰｌａｑｕｅＳｃｒｅｅ
ｎ（ＮＥＮ社製））に添付のプロトコールに従って移し
とり、（１）で作製した［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰで標識し
たプローブ３を用いてハイブリダイゼーションを行い、
１７６個の陽性クローンを取得した。次いで、これらの
クローン中で、プローブ１、およびプローブ３Ｃともハ
イブリダイズする６個の陽性クローンを取得した。その
内の１クローンであるφＣＳＰ３を以下の実施例で用い
た。

【００３６】実施例４ Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーター領
域を含むＤＮＡ断片の取得（図３） 実施例３（２）で取得したファージφＣＳＰ３のＤＮＡ
を常法に従って調製し、プローブ１、３、および３Ｃの
全てとハイブリダイズする４．３ｋｂのＳａｌＩ−Ｈｉ
ｎｄ III断片を、ｐＵＣ１１９のＳａｌＩ−Ｈｉｎｄ I
II部位間にサブクローニングし、プラスミドｐφ３ＨＳ
８を作製した。図１にこのプラスミドの挿入断片の制限
地図を示す。

【００３７】このプラスミドを用いて、ｐ１２タンパク
質のコード領域を含む１４０５ｂｐからなる塩基配列を
決定した。配列番号１にその配列を示す。この配列よ
り、ｐ１２タンパク質のコード領域およびプロモーター
領域を推定した。次いで、ｐφ３ＨＳ８の２．３ｋｂ
ＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１１９のＰｓｔＩ部位にサブクロ
ーニングし、プラスミドｐφ３Ｐ１９を作製した。次
に、このプラスミドの１．７ｋｂ ＰｓｔＩーＥｃｏＲ
Ｉ断片を、BluescriptII d ＳＫ＋（ストラタジーン社
製）のＰｓｔＩーＥｃｏＲＩ部位間にサブクローニング
し、プラスミドｐφ３ＰＥ１を作製した。

【００３８】プロモーター領域の３’末端の短縮化は、
ＰＣＲ法を用いて実施した。ＰＣＲ反応に用いたプライ
マーの位置を図２に示す。プロモーター領域の５’側の
プライマー（ＰＣＲプライマー５’）は、プラスミドｐ
φ３Ｐ１９上でプロモーター領域の５’側にあるＰｓｔ
Ｉ部位から決定したＤＮＡ塩基配列をもとに作製した。
また、プロモーター領域の３’側のプライマー（ＰＣＲ
プライマー３’）は翻訳開始点の直前に相当する配列番
号１中の６１２〜６４４の塩基配列と相補的な配列とＨ
ｉｎｄ IIIの認識配列を含む。具体的には、下記の配列
である。

【００３９】 ＰＣＲプライマー５’ ５’ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＣＣＣＴＡＴ ＳａｌＩ ＡＣＴＧＴ ３’

【００４０】 ＰＣＲプライマー３’ ５’ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＧ ＨｉｎｄIII ＴＴＧＴＴＴＧＡ ３’

【００４１】プラスミドｐφ３Ｐ１９から調製した１．
７ｋｂ ＰｓｔＩーＥｃｏＲＩ断片を鋳型として、ＰＣ
Ｒプライマー５’とＰＣＲプライマー３’を用いて取得
したＰＣＲ産物をＥｃｏＴ１４ＩとＨｉｎｄ IIIで切断
し、０．５ｋｂのＥｃｏＴ１４Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片を
取得した。この断片を、プラスミドｐφ３ＰＥ１の４．
１ｋｂ ＥｃｏＴ１４Ｉ−Ｈｉｎｄ III断片と連結し
て、Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーター領域のみを含むプラス
ミドｐＣＳＰ１−Ｐ８を作製した。ＰＣＲ産物の塩基配
列は、Ｔ３プライマー（ストラタジーン社製）および下
記の３種のプライマーを用いた塩基配列決定で、プラス
ミドｐφ３ＨＳ８を鋳型として用いて決定した塩基配列
と同一であることを確認した。

【００４２】 ＰＣＲ産物塩基配列確認用プライマー３（配列番号１の２１８−２３８の相補 配列） ５’ＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＧＣ ３’

【００４３】 ＰＣＲ産物塩基配列確認用プライマー６（配列番号１の５０２−５２２の相補 配列） ５’ＣＴＴＡＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＴＡＴＡＣＧＴ ３’

【００４４】 ＰＣＲ産物塩基配列確認用プライマー７（配列番号１の３６２−３８２の相補 配列） ５’ＡＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＣＡＡＴＡ ３’

【００４５】実施例５ Ｌｇ−ＣＳＰプロモーターを連
結した発現ベクターの作製 （１）Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーターとレポーター遺伝子
の連結（図４） ｐＣＰＳ−Ｐ８をＳｍａＩで切断後、ＸｈｏＩリンカー
（ＣＣＴＣＧＡＧＧ、宝酒造）を連結し、プラスミドｐ
ＣＳＰ１−Ｐ８ＳＸを作製した。このプラスミドから取
得した１．６ｋｂのＸｈｏＩ−Ｈｉｎｄ III断片をｐＡ
Ｘ５０Ｇ２（特公平５−６０９１８公報）の８．４ｋｂ
のＸｈｏＩ−Ｈｉｎｄ III断片と連結し、Ｌｇ−ＣＳＰ
１プロモーターとレポーター遺伝子（ＡＬＤＣ遺伝子）
が連結されたＤＮＡ断片を持つプラスミドＹＥｐＣＰＡ
Ｌ９を作製した。このプラスミドから２．９ｋｂのＸｈ
ｏＩ−ＳａｌＩ断片を取得し、ｐＲＳ４１５のＳａｌＩ
部位に挿入し、ＹＣｐＣＰＡＬ３を作製した。

【００４６】（２）Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーターの短縮
（図５） ｐＣＰＳ−Ｐ８から取得した１．６ｋｂのＰｓｔＩ−Ｈ
ｉｎｄ III断片を、ｐＵＣ１１９のＰｓｔＩ−Ｈｉｎｄ
III部位間に挿入し、プラスミドｐＵＣＰ１を作製し
た。このプラスミドをＢａｍＨＩで切断後、クレノウフ
ラグメント処理したものをセルフライゲーションし、プ
ラスミドｐＵＣＰ１ｄＢ１を作製した。このプラスミド
をＥｃｏＲＩで切断後、クレノウフラグメント処理し、
ＢａｍＨＩリンカー（ＣＧＧＡＴＣＣＧ）を連結して、
プラスミドｐＵＣＰ１ＥＢを作製した。このプラスミド
が持つＬｇ−ＣＳＰ１プロモーター領域の５’側からの
短縮ＤＮＡ断片は、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅ
ｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて、作製した。
具体的には、ｐＵＣＰ１ＥＢをＫｐｎＩとＳａｌＩで切
断した後、エクソヌクレアーゼ IIIで消化したものを、
ヤエナリ（Mung Bean）ヌクレアーゼ処理、クレノウフ
ラグメント処理したものをセルフライゲーションし、プ
ラスミドｐｄＣＰ４７およびｐｄＣＰ５０を作製した。
ｐｄＣＰ４７は、配列番号１の５６から６４４の配列お
よび３’側にＨｉｎｄ III認識部位を持つ塩基配列を持
つプラスミドである。ｐｄＣＰ５０は、配列番号３の４
９１〜６４４の配列および３’側にＨｉｎｄ III認識部
位を持つ塩基配列を持つプラスミドである。

【００４７】（３）プロモーター活性検定用プラスミド
の作製（図６） ｐｄＣＰ４７およびｐｄＣＰ５０をＢａｍＨＩとＨｉｎ
ｄ IIIで切断後、Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーター配列を含
むＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片を取得し、（１）で作
製したＹＣｐＣＰＡＬ３から得られる７．４ｋｂのＢａ
ｍＨＩ−Ｈｉｎｄ III断片と連結し、ＹＣｐｄＣＰＡＬ
４７およびＹＣｐｄＣＰＡＬ５０を作製した。Ｇ４１８
耐性遺伝子は、ｐＡＸ５０Ｇ２をＨｉｎｄ IIIとＳａｃ
Ｉで切断後、クレノウフラグメント処理して取得した
８．５ｋｂ断片と、ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア社製）を
ＰｓｔＩとＸｈｏＩで切断し、クレノウフラグメント処
理して取得した１．１ｋｂ断片を連結して作製したプラ
スミドｐＧＰＤＮＥＯから取得した。ｐＧＰＤＮＥＯか
ら取得した２．５ｋｂのＳａｌＩ断片（Ｇ４１８耐性遺
伝子カセット）を、ＹＣｐｄＣＰＡＬ４７のＸｈｏＩ部
位に挿入し、ＹＣｐｄＣＰＡＬＧ４７を作製した。

【００４８】実施例６ 実験酵母におけるプロモーター
活性試験 実施例５（３）で作製した、短縮したＬｇ−ＣＳＰ１プ
ロモーターにレポーター遺伝子としてＡＬＤＣ遺伝子コ
ード領域を連結したＹＣｐ型プラスミドであるＹＣｐｄ
ＣＰＡＬ４７とＹＣｐｄＣＰＡＬ５０で、それぞれ実験
酵母ＴＤ４（ａ、ｈｉｓ、ｕｒａ、ｌｅｕ、ｔｒｐ）を
リチウムアセテート法（J.Bacteriol.153,163(1983) ）
によって形質転換した。実験酵母ＴＤ４は、サッカロマ
イセス・セレビシエＳ２８８Ｃ（α、ｓｕｃ２、ｍａ
ｌ、ｇａｌ２、ＣＵＰ１：ＡＴＣＣ２６１０８）の変異
株である。得られた２株の形質転換株（ＹＣｐｄＣＰＡ
Ｌ４７／ＴＤ４、ＹＣｐｄＣＰＡＬ５０／ＴＤ４）にお
けるＬｇーＣＳＰ１プロモーターの活性は、レポーター
遺伝子がコードするＡＬＤＣ活性の測定により評価し
た。

【００４９】２株の形質転換株を１１ｍｌの最少培地Ｂ
（実施例１（１）に示した最少培地Ａに１２．５μｇ／
ｍｌになるようにメチオニンを加えた培地）に一白金耳
植菌し３０℃で一晩振盪培養した。これから６ｍｌずつ
を３本の２５０ｍｌの最少培地Ｂに植菌し、６００ｎｍ
におけるＯＤが約２．５になるまで３０℃で一晩静置培
養した。この培養液からそれぞれ５ｍｌを分取して集菌
し、３０℃−０時間菌体とした。また、培養液の残りか
ら菌体を集め２００ｍｌの最少培地Ｂに再懸濁し、１０
０ｍｌずつに分けて、それぞれ１０℃と３０℃で一晩静
置培養し集菌した菌体を、それぞれ１０℃−２４時間菌
体、３０℃−２４時間菌体とした。これらの菌体をグラ
スビーズを用いて破砕したものを酵素液として、特公平
５−６０９１８号公報記載の方法でＡＬＤＣ活性を測定
した。結果は図７に示される通りであった。ＹＣｐｄＣ
ＰＡＬ５０をもつＴＤ４では、３０℃培養と１０℃培養
との間でＡＬＤＣ活性の違いは認められなかったが、Ｙ
ＣｐｄＣＰＡＬ４７をもつ実験酵母ＴＤ４では、低温で
のＡＬＤＣ活性上昇が観察された。

【００５０】実施例７ ビール酵母におけるプロモータ
ー活性試験 ＹＣｐｄＣＰＡＬ４７がもつＬｇ−ＣＳＰ１プロモータ
ーの活性が、実験酵母中のみならずビール酵母中でも観
察されるかについて検討を行った。

【００５１】特開平６−６２８４９号公報中に記載され
ているビール酵母の形質転換法を用いて、慣用されてい
るビール酵母をＹＣｐｄＣＰＡＬＧ４７で形質転換し
た。得られた形質転換株を１０μｇ／ｍｌのＧ４１８を
含む１０ｍｌのＹＰＤ培地（２％ バクトトリプトン、
１％ イーストエクストラクト、２％ グルコース）に
一白金耳植菌し、３０℃で一晩振盪培養した。これから
１．５ｍｌを、１０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む２５０
ｍｌのＹＰＤ培地に植菌し、６００ｎｍにおけるＯＤが
約４になるまで３０℃で一晩静置培養した。この培養液
からそれぞれ５ｍｌを分取して集菌し、３０℃−０時間
菌体とした。また、培養液の残りから菌体を集め、１０
μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む２００ｍｌのＹＰＤ培地に
再懸濁し、１００ｍｌずつに分けて、それぞれ１０℃と
３０℃で一晩静置培養した後、菌体を集菌し、それぞれ
１０℃−２４時間菌体、３０℃−２４時間菌体とした。
これらの菌体をグラスビーズを用いて破砕したものを酵
素液として、特公平５−６０９１８号公報記載の方法で
ＡＬＤＣ活性を測定した。結果は図８に示される通りで
あった。ＹＣｐｄＣＰＡＬＧ４７の持つＬｇ−ＣＳＰ１
プロモーターは、ビール酵母中でも、その下流につなが
れた遺伝子を発現させ、また常温よりも低温で高率で発
現させる活性を有していた。

【００５２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１４０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物名：サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae） 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６５５．．９７８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGGGAGGATC AACTCCGACA GCAAAAGTCC GGACGTTGAC GGAGCCGGTG CACGGCACGG 60 ACTAAAGCCC AAAAAAAAGG GGCGGTGACG TGTGGGTGGC GCCCGGCGGT AGCGATGACG 120 ACTTGTTGAC GGCCCTTGGC TCTTTGCGTA AGGGACAAAA CCAGAACTTG AGGGTGGTAA 180 AAATAGCAAT TTGGATTTGG TAACGGATGC CAGCTATGCT ATTCTTTAAG GGGCGCGGTG 240 TAGGTTGTAG GGGGCTACTA GTAGAAAGTA AAAAACAACC CGGAGAGGGT GAAAGTGGTG 300 ATGTGGCAAC TAGAAGAAGA AGAAGAAAGA AAAAAAAAAA GACACAAACA CAAACAAGAC 360 GTATTGCTAG GTGGTGGGCG GTAAAGTGAT CTACAGCCCC TGGGAATTGC TTTCGGGCGA 420 AGAACAGTTC CCTTCGTCCC TCTCTCTTCT CCTTCTTCCC CCCTCTTAAT CTGGAATCTA 480 GTCCTTGAAT CCTGGATTCA AACGTATAAA TACCACCCTA AGTTGCTTTC TTCTCTCTCA 540 CTTGTATTCT TTCCTCTTGT TTATGTTCTC TCTCATATAA TAAAAAAAAA CCATCTGATT 600 ATTTCATAAT CTCAAACAAC AACTAAAACA AACAAAAAAC AAACTAATAT AACA ATG 657 Met 1 TCT GAC ACA GGT AGA AAA GGA TTC GGC GAC AAG GCT TCT GAG GCT TTG 705 Ser Asp Thr Gly Ser Lys Gly Phe Gly Asp Lys Ala Ser Glu Ala Leu 5 10 15 AAA CCA GAC TCT CAA AAA TCA TAC GCC GAA CAA GGT AAG GAA TTC ATC 753 Lys Pro Asp Ser Gln Lys Ser Tyr Ala Glu Gln Gly Lys Glu Phe Ile 20 25 30 ACC GAC AAG GCC GAC AAG GTC GCC GGT AAG GTC GAA AGC AAC GAC AAC 801 Thr Asp Lys Ala Asp Lys Val Ala Gly Lys Val Glu Ser Asn Asp Asn 35 40 45 AAG GGT GTC TTC CAA GGT GTT CAC GAC TCC GCT CAA CAA GGT AAG GAC 849 Lys Gly Val Phe Gln Gly Val His Asp Ser Ala Gln Gln Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAC GCT GAC AGC CAA GGT GAA TCT TTT GCC GAC CAA GCC AGA GAC TAC 897 Asn Ala Asp Ser Gln Gly Glu Ser Phe Ala Asp Gln Ala Ser Asp Tyr 70 75 80 ATG GGT GCC GCC AAG TCC AAG TTG AAC GAC GCT GTT GAA TAC GTT TCC 945 Met Gly Ala Ala Lys Ser Lys Leu Asn Asp Ala Val Glu Tyr Val Ser 85 90 95 GGA CGT GCT CAC GAA GAA GAC CCA ACC AAG AAG TA AACTCGCTAG 990 Gly Arg Ala His Glu Glu Asp Pro Thr Lys Lys 100 105 CGAGTCTTCT TTGTGGTTAC AAGGTCTTTT TTTTTCCTTG TGATGTGTGA TGTTCCTTAA 1050 TATTATTCGA CGAATAGCAG AATAATGAAA AACTAAAGAA AAAGAGAAAA AAAACAGTTG 1110 AAACAAATGC GGAATTTTAT ATGTATATGT ATTTATGTGT ATATTCTCCT AGCTTAGTTT 1170 AAAAATTAAT GGTTTTTTTA TTTCTAGTTT TTTTTATTTT TATTTTTATT GTACGTACGT 1230 GCTTCGTTCT AGTCTAGTTC TAGCTTAAAC ATGCTACTCG ACTCCTCGTC GTCTACGTCC 1290 GCATTTTCGA TCCTCTGCAG AAGCACCTTT TTCGATGCGC CGAGGTTCTT CATGTAGTCT 1350 GTTTCGAACC CCAGCAGGTT ATCTTTGAAC TTCTTTCTCT TCTTACCGCG GATCC 1405

【００５３】配列番号：２ 配列の長さ：５８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物名：サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae） 配列の特徴 Ｌｇ−ＣＳＰ１遺伝子のプロモーター領域 配列 CACGGACTAA AGCCCAAAAA AAAGGGGCGG TGACGTGTGG GTGGCGCCCG GCGGTAGCGA 60 TGACGACTTG TTGACGGCCC TTGGCTCTTT GCGTAAGGGA CAAAACCAGA ACTTGAGGGT 120 GGTAAAAATA GCAATTTGGA TTTGGTAACG GATGCCAGCT ATGCTATTCT TTAAGGGGCG 180 CGGTGTAGGT TGTAGGGGGC TACTAGTAGA AAGTAAAAAA CAACCCGGAG AGGGTGAAAG 240 TGGTGATGTG GCAACTAGAA GAAGAAGAAG AAAGAAAAAA AAAAAGACAC AAACACAAAC 300 AAGACGTATT GCTAGGTGGT GGGCGGTAAA GTGATCTACA GCCCCTGGGA ATTGCTTTCG 360 GGCGAAGAAC AGTTCCCTTC GTCCCTCTCT CTTCTCCTTC TTCCCCCCTC TTAATCTGGA 420 ATCTAGTCCT TGAATCCTGG ATTCAAACGT ATAAATACCA CCCTAAGTTG CTTTCTTCTC 480 TCTCACTTGT ATTCTTTCCT CTTGTTTATG TTCTCTCTCA TATAATAAAA AAAAACCATC 540 TGATTATTTC ATAATCTCAA ACAACAACTA AAACAAACAA AAAACAAAC 589

【００５４】配列番号：３ 配列の長さ：１５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源： 生物名：サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae） 配列の特徴 Ｌｇ−ＣＳＰ１遺伝子のプロモーター領域の一部 配列 CCTGGATTCA AACGTATAAA TACCACCCTA AGTTGCTTTC TTCTCTCTCA CTTGTATTCT 60 TTCCTCTTGT TTATGTTCTC TCTCATATAA TAAAAAAAAA CCATCTGATT ATTTCATAAT 120 CTCAAACAAC AACTAAAACA AACAAAAAAC AAAC 154

【００５５】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 他の情報：ｐ１２タンパク質の部分アミノ酸配列 配列 Asn Ala Asp Ser Gln Gly Glu Ser Phe Ala Asp Gln Ala Arg Asp Tyr Met Gly 1 5 10 15 Ala Ala Lys 20

【００５６】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 他の情報：ｐ１２タンパク質の部分アミノ酸配列 配列 Asp Ala Val Glu Tyr Val Ser Gly Arg Ala His Glu Glu Asp Pro Thr Lys 1 5 10 15

【００５７】配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 他の情報：ｐ１２タンパク質の部分アミノ酸配列 配列 Asp Ala Val Glu Tyr Val Ser Gly Arg Val His Gly Glu 1 5 10

【００５８】配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 他の情報：ｐ１２タンパク質の部分アミノ酸配列

【００５９】配列番号：８ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 他の情報：ｐ１２タンパク質の部分アミノ酸配列

【００６０】配列番号：９ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 他の情報：ｐ１２タンパク質の部分アミノ酸配列

【００６１】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：プローブとして用いる 配列 AATGATGCTG TTGAATA 17

【００６２】配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：プローブとして用いる 配列 CATGAAGAAG ATCCTAC 17

【００６３】配列番号：１２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：プローブとして用いる 配列 GATTATATGG GTGCTGC 17

【００６４】配列番号：１３ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＰＣＲプライマー５′ 配列 CAGGTCGACG GATCTCGATG GGGTCGCCCC TAT 33

【００６５】配列番号：１４ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：ＰＣＲプライマー３′ 配列 CCAAGCTTGT TTGTTTTTTG TTTGTTTTAG TTGTTGTTTG A 41

【００６６】配列番号：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：塩基配列確認用プライマー 配列 CCGCGCCCCT TAAAGAATAG C 21

【００６７】配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：塩基配列確認用プライマー 配列 CTTAGGGTGG TATTTATACG T 21

【００６８】配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：塩基配列確認用プライマー 配列 ACCGCCCACC ACCTAGCAAT A 21

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐφ３ＨＳにサブクローニングされたＬｇ−Ｃ
ＳＰ１遺伝子ＤＮＡ断片の制限地図を示した図である。

【図２】ｐφ３Ｐ１９のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片におけ
るＬｇ−ＣＳＰ１プロモーター領域を調製するためのＰ
ＣＲプライマーの位置を示した図である。

【図３】Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーター領域を調製する工
程を示した図である。

【図４】Ｌｇ−ＣＳＰ１プロモーターとレポーター（Ａ
ＬＤＣ）遺伝子との連結工程を示した図である。

【図５】Ｌｇ−ＣＳＰ１短縮プロモーターを調製する工
程を示した図である。

【図６】ビール酵母に導入するプラスミドを調製する工
程を示した図である。形質転換されたビール酵母はプロ
モーター活性試験に用いられる。

【図７】実験酵母ＴＤ４における短縮されたＬｇ−ＣＳ
Ｐ１プロモーターのＡＬＤＣ活性による評価を示した図
である。

【図８】ビール酵母における短縮されたＬｇ−ＣＳＰ１
プロモーターのＡＬＤＣ活性による評価を示した図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 岩 松 明 彦 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒 麟麦酒株式会社基盤技術研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号２に記載されるＤＮＡ配列、また
   は配列番号２に記載されるＤＮＡ配列と相同性を有しか
   つプロモーター活性を保持する配列を有する、ＤＮＡ断
   片。
2. 【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡ断片と、その下流
   に位置する外来遺伝子とを含んでなる、発現ベクター。
3. 【請求項３】請求項１に記載のＤＮＡ断片と、その下流
   に位置する外来遺伝子とを含んでなる、ＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】請求項２に記載の発現ベクターまたは請求
   項３に記載のＤＮＡ断片によって形質転換された、宿
   主。
5. 【請求項５】宿主が酵母である、請求項４に記載の宿
   主。
6. 【請求項６】請求項４または５に記載の宿主を培養する
   ことを含んでなる、タンパク質の製造法。
7. 【請求項７】培養温度が１０℃以下である、請求項６に
   記載のタンパク質の製造法。
8. 【請求項８】配列番号１に記載されるＤＮＡ配列を有す
   る、ＤＮＡ断片。