JPH0899996A - Ｉｌ−６抑制組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗炎症薬として有用なインターロイキン−６
抑制活性を有する組成物を提供することを目的とする。 【構成】 インターロイキン−６抑制活性の発生に関し
て刺激された哺乳類細胞からのインターロイキン−６抑
制活性を有する部分精製された細胞培養上澄液またはイ
ンターロイキン−６抑制活性を有するその成分であるこ
とを特徴とするインターロイキン−６抑制活性を有する
組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイトカインＩＬ−６
の作用に拮抗する治療組成物及びそれらの調製方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】サイト
カインは、炎症反応及び免疫反応の媒介の如き細胞機能
の制御に重要な役割を果たす哺乳類中に生じる多機能性
の可溶性因子である。例えば、New Eng-land Journal
of Medicine (1987) 317 : 940〜945 を参照のこと。こ
れらのサイトカインまたは制御因子は特異性なレセプタ
ーに結合し、免疫細胞及び非免疫細胞の両方の活性化、
増殖及び分化に影響する（グリコ）タンパク質である。
これらのホルモン様物質はリンパ球により放出される
（これは初期の名称のリホカインを説明する）が、また
繊維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイトを含む上皮細胞
及びストロマ細胞の如きその他の免疫細胞により放出さ
れる。これらのサイトカインの一つは、炎症反応の開始
及び持続に重要な媒介物質であることが示された。例え
ば、J Immunol (1989) 142 : 1922 〜 1928 及び Immun
ology Today (1987) 84: 137頁を参照のこと。また、Ｉ
Ｌ−６はＢ細胞刺激因子−２、インターフェロンβ２、
ハイブリドーマ増殖因子、肝細胞刺激因子、マクロファ
ージ顆粒細胞インデューサー２及び２６ｋDaタンパク質
の名称で知られている。ＩＬ−６は、乾癬、アレルギー
反応、リウマチ病並びに皮膚、肺または胃腸道の炎症疾
患に関連すると思われる。ＩＬ−６の調製及び生化学性
格付けは、P. B. ら著、J.Inter-feron Res. (1987) 7
: 521 頁及びバン・ダムメ（Van Damme)ら著、J.Exp.M
ed.(1987) 165 : 914頁に記載されている。

【０００３】幾つかのサイトカインの作用が拮抗薬によ
り相殺されることが知られているが、現在までＩＬ−６
活性の天然拮抗薬は見い出されていなかった。下記の物
質が抑制物質と称されるが、抑制効果がＩＬ−６タンパ
ク質、レセプター部位の遮断またはその他の干渉作用に
基くか否かは知られていない。それ故、“抑制物質”と
いう用語の使用は、本発明の効果が拮抗により生じられ
ないことを意味しない。

【０００４】本発明はＩＬ−６抑制物質（本明細書中、
略号ＩＬ−６ｉで表わされる）である組成物を提供す
る。特に、ＩＬ−６抑制物質は天然源のものであること
がわかった。一つのこのようなインターロイキン−６抑
制物質は約１０キロダルトン（ｋDa）の分子量を有する
タンパク質である。それはＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩ
Ｌ−４に関して抑制効果をもたない。別のこのようなイ
ンターロイキン−６抑制物質は約４４ｋDaの分子量を有
するタンパク質である。両方のＩＬ−６ｉは哺乳類細胞
により生産される。これらのＩＬ−６抑制物質は抗炎症
剤である。

【０００５】炎症病の内科療法は未だ不充分である。最
も広く使用される医薬はステロイド、特にコルチコステ
ロイドを含む組成物である。これらは、特にそれらが長
期間にわたって投与される場合に、多くの望ましくない
副作用、例えば皮膚の劣化及び副腎皮質の抑制を有す
る。本発明のＩＬ−６抑制物質は、このような副作用を
もたない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＩＬ−６の活
性を抑制し、こうして抗炎症薬剤として有益である組成
物を提供する。本発明のＩＬ−６抑制物質は、例えば、
紫外線またはフォルボールミリステートアセテート（Ｐ
ＭＡ）による刺激を含む種々の養生によりＩＬ−６ｉ活
性を有するタンパク質を含む物質を生産するように刺激
された細胞の上澄液から誘導し得る。上澄液はＩＬ−６
抑制活性を示し、この活性の原因となる成分はこれらの
上澄液から精製形態で調製し得る。

【０００７】これらの活性成分はタンパク質であるよう
である。何となれば、プロテアーゼと共に一夜保温した
後に、ＩＬ−６ｉ活性が消失するからである。それ故、
一つの特徴に於いて、本発明はＩＬ−６抑制活性を有す
る組成物に関するものであり、前記の組成物は細胞がＩ
Ｌ−６抑制活性の生成に関して刺激された細胞培養液上
澄液、上澄液のＩＬ−６ｉ成分の部分精製形態またはそ
の個々の抑制成分を含む。

【０００８】また、本発明は機能性ＩＬ−６ｉ活性を保
持しながら前記の配列中のアミノ酸の残基を欠失し、付
加し、または置換することにより公知の方法を用いて得
ることができる前記のタンパク質の機能性誘導体を含
む。アミノ酸の変化は唯一の残基または種々の残基、特
に１〜５０のアミノ酸残基を伴ない得る。別の特徴に於
いて、本発明はＩＬ−６ｉ生成に関して刺激された哺乳
類細胞からのＩＬ−６ｉ活性を有する部分精製された細
胞培養液上澄液またはＩＬ−６ｉ活性を有するその成分
を含む製薬組成物、これらの組成物を用いる炎症の治療
方法、及び本発明の組成物の調製方法に関する。

【０００９】本発明の実施方法 本明細書に使用される略号は、以下のものを含む。 ＰＢＳ ＝食塩加リン酸緩衝液； ＰＭＡ ＝フォルボールミリステートアセテート； ＫＲＦＭ ＝ヒト結節性メラノーマ細胞系の指標； ＲＰＭＩ１６４０は標準培地（ＪＡＭＡ（１９６７）、
１９９、５１９頁）である。

【００１０】Ｊ／ｍ² ＝ジュール／ｍ² ； ＦＣＳ ＝胎児ウシ血清； ＥＤＴＡ ＝エチレンジアミンテトラ酢酸； ＰＢＭＣ ＝抹消血単核細胞； ＨＥＰＥＳ ＝〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−
ピペラジンエタンスルホン酸〕 ＩＬ ＝インターロイキン； ｈＩＬ−１ ＝ヒトＩＬ−１； ｈＩＬ−６ ＝ヒトＩＬ−６； ＩＬ−６ｉ ＝ＩＬ−６抑制物質または拮抗物質 ｒｈＩＬ−６＝組換えヒトＩＬ−６ ＦＰＬＣ ＝高速タンパク質液体クロマトグラフィー 本発明のＩＬ−６抑制組成物は、ヒトまたは動物の細
胞、特に哺乳類の血液細胞または細胞系の刺激、及び必
要により培養上澄液の更なる精製により調製される。本
発明を実施するのに適した細胞の中には、ヒト粘着性末
梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ヒト類表皮癌細胞、メラノ
ーマ細胞及び前立腺上皮細胞があるが、その他のヒトま
たは動物の細胞が同様に使用し得る。これらの細胞の刺
激に関して、例えば、紫外（ＵＶ）線またはフォルボー
ルミリステートアセテート（ＰＭＡ）またはＩＬ−１と
ＩＬ−６との混合物またはこれらの刺激要因の組合せが
使用し得る。その他の好適な刺激要因はプロテインキセ
ーゼＣ及び細胞内のカルシウム濃度のエンハンサーを含
む群に見られる。紫外線の好適な量は１００〜１５０Ｊ
／ｍ² である。ＰＭＡの好適な投与量は１０〜１００ｎ
ｇ／mlである。

【００１１】刺激後に、細胞は標準の培養条件下で２４
〜４８時間、好ましくは３６時間の間に増殖される。そ
の後、上澄液が回収される。更なる精製の前または後
に、ＩＬ−６活性を測定するための分析が行なわれる。
この分析はＩＬ−６依存性細胞のＩＬ−６で刺激された
増殖の減少に基く。その分析を行なう一つの方法におい
て、試験される試料から天然ＩＬ−６を取り除く。その
後、所定量のＩＬ−６がＩＬ−６ｉを含むと思われる試
料に添加され、ＩＬ−６依存性細胞系との混合後に、細
胞増殖が測定される。

【００１２】典型的な実施可能なプロトコルによれば、
上澄液から天然ＩＬ−６を最初に取り除く。好適な操作
は７５％の飽和までの硫酸アンモニウムの添加である。
図１０に見られるように、ＩＬ−６は６０％の飽和で沈
殿中にあり、一方、ＩＬ−６ｉは７５％の飽和後に上澄
液中に依然として存在する。また、ＩＬ−６はＩＬ−６
の抗体を有するアフィニティークロマトグラフィーカラ
ムに試料を通すことにより除去し得る。アフィニティー
クロマトグラフィー用のカラムは、ウサギ抗ｈＩＬ−６
抗血清のIgＧ画分を臭化シアンで活性化されたセファロ
ース４Ｂ（シグマ・ケミカル・コーポレーション、セン
トルイス、ＭＯ）に架橋することにより調製することが
できる。

【００１３】好適なＩＬ−６依存性ハイブリドーマ細胞
系はＢ９であり、これはオランダのアムステルダム大学
のＬ．アーデン（Aarden) から入手し得る。その他の好
適なＩＬ−６依存系は一般に入手でき、あるいは当業界
で公知の方法により調製し得る。例えば、その方法は
“増殖因子依存性Ｂ細胞ハイブリドーマ（A growth -fa
ctor dependent B-cell hybridoma ”、ランスドープ
（Lansdorp) ら著、Current Topics in Micro biology
and Immunology (1986) 132 : 105〜113 頁に記載され
ている。その記載されたＩＬ−６依存性Ｂ１3.２９細胞
系から得られるサブクローンが“Ｂ９”と称される。

【００１４】試験試料（好ましくは天然ＩＬ−６を取り
除いたもの）の連続希釈が９６−ウェル平底マイクロタ
イタプレートで三重で適用される。50μl の培地中の５
×１０³ 個のＢ９細胞が各ウェルに添加される。ＩＬ−
６活性基線は、ＩＬ−６溶液を１〜１０Ｕ／ml、好まし
くは１Ｕ／mlの範囲の固定の計算濃度まで添加すること
によりつくられる。添加される好適な形態のＩＬ−６は
rec−ＤＮＡで調製されたヒトＩＬ−６（ｒｈＩＬ−
６）であり、例えばブリティッシュ・バイオテクノロジ
ー（British Biotechnology)から市販される。

【００１５】７２時間の保温期間後に、0.１μCi[³Ｈ]-
チミジンの４ｈパルスが添加される。その後、細胞は細
胞回収装置を用いて回収され洗浄される。細胞中の
[³Ｈ]-チミジンの量は液体シンチレーションカウンター
中で測定される。細胞中の[³Ｈ]-チミジンの混入はＩＬ
−６活性に依存する。試験ウェル活性が基線活性と比較
される。結果は、カウント／分（ＣＰＭ）または適当な
ＩＬ−６標準との比較によるＵ／mlとして表わされる。
平均及び標準偏差(SD)が三重分析に関して計算される。

【００１６】ＩＬ−６ｉ活性を有する上澄液は、個々の
ＩＬ−６ｉ成分の単離またはその部分精製に適した精製
技術にかけることができる。好適な技術は、例えば陰イ
オン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣサイズ排除クロ
マトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー
である。これらの技術は別々に適当に使用し得るが、組
合せて特に連続して使用することが更に有利である。

【００１７】一つの成功した分離プロトコルによれば、
刺激された細胞培養液から得られた上澄液が最初に限外
濾過により濃縮され、続いて７５％（w/v)飽和まで硫酸
アンモニウムと混合される。ＩＬ−６ｉ活性は依然とし
て上澄液中にある（図１０を参照のこと）。硫酸アンモ
ニウムを除去するために、上澄液が透析され（１０mMの
トリス／ＨCl、pH7.９に対して）、陰イオン交換クロマ
トグラフィー用カラムに適用される。カラムはＤＥＡＥ
モノＱカラム（例えば、ファーマシア（Pharmacia)の１
６／１００カラム）であることが好ましい。画分は、線
形NaCl勾配を含む１０mMのトリス−Cl緩衝液でpH7.９、
４ml／分の流量で溶出される。回収された画分は上記の
ようにしてＩＬ−６ｉに関して分析される。ＩＬ−６抑
制活性を含む画分は３０〜１００mMのNaClで検出し得
る。この画分は、サイズ排除クロマトグラフィーによれ
ば約１０ｋDaの分子量を有する成分を含む。

【００１８】脱塩後に、選ばれた画分は限外濾過により
濃縮されて製薬組成物に有益なＩＬ−６抑制性を有する
成分を得る。別の好適な分離法は疎水性相互作用クロマ
トグラフィー（ＨＩＣ）に基く。ＨＩＣに適したカラム
はＴＳＫブチル６５０カラム（Ｅ．メルク（ＭＥＲＣ
Ｋ））である。試料は、１Ｍの最終濃度まで硫酸アンモ
ニウムと混合し、ＨＩＣカラムにかける。溶出のために
は、１、０．５、０．１及び０Ｍの濃度の硫酸アンモニ
ウムと、最終的には、エチレングリコール／水（８０％
v/v)のステップ勾配を用いる。

【００１９】粗ＩＬ−６ｉ含有試料を精製するために用
いることができる更なる分離方法は、逆相クロマトグラ
フィー（ＲＰクロマトグラフィー）である。好適なカラ
ムは、移動相として水を用いるバイオラッド ＨＩ−ポ
ア ＲＰ３０４カラムである。溶出のためには、アセト
ニトリル勾配を０〜１００％のアセトニトリルの範囲
で、流速１．２ml/ 分で用いてもよい。

【００２０】また、上澄液または陰イオン交換クロマト
グラフィーからの活性画分は、ゲル濾過（gel permeati
on )ＨＰＬＣを用いて分子量を基準として精製し得る。
ＨＰＬＣ系は、特別な要件をもたない。好適な系は、二
つのＬＣ２１５０ポンプ、システムコントローラー型式
２１５２、及びユビコン（Uvicon) ７２０ＬＣ可変波長
検出器（コントロン（Kontron)、ベェセンドルフ、オー
ストリア）に連結されたレオダイン（Rheodyne) ７０１
０インジェクターを含むＬＫＢにより供給される。

【００２１】分子量は標準分子量マーカーを使用してゲ
ル濾過サイズ排除カラム中の測定により確かめることが
できる。下記の実施例に適用されるように本発明のＩＬ
−６ｉ因子を得るための典型的な操作は以下の工程を含
む。ＩＬ−６抑制物質の生産に適した細胞（１×１０⁶
の細胞／ml）がＰＢＳ中で洗浄される。

【００２２】ＵＶ刺激に関して、細胞は１００〜１５０
Ｊ／ｍ² の単一ＵＶ暴露により処理される。細胞（１×
１０⁶)はＲＰＭＩ１６４０（フロー・ラボラトリィズ
（FlowLaboratories)、マックリーン、VA）中で２回洗
浄され、５％のCO₂ を含む保湿雰囲気中で血清を含まな
いＲＰＭＩ１６４０中で３７℃で保温される。上澄液は
照射２４時間後に回収され、必要により−２０℃で貯蔵
される。

【００２３】ＰＭＡ刺激に関して、細胞は使用される細
胞系について指示されるように増殖される。それらが集
密(confluency)に達した後、培地が交換され、ＰＭＡ
（10〜100 ng/ml 、好ましくは50 ng/ml) （シグマ・ケ
ミカル・コーポレーション（Sigma Chem. Corp.)、セン
トルイス、ＭＯ）が添加される。上澄液はＰＭＡの添加
の２４時間後に回収され、必要により−２０℃で貯蔵さ
れる。

【００２４】サイズ分離を用いるＩＬ−６ｉ因子の精製
に関して、上澄液の１００μl の試料は、特に下記の実
施例に記載されているようにＨＰＬＣを用いるサイズ排
除クロマトグラフィーにかけられ、得られた画分が必要
により−２０℃で貯蔵される。また、分離はＤＥＡＥイ
オン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロ
マトグラフィーを用いて行なわれる。画分は限外濾過に
より濃縮され、必要により脱塩され、続いて上記のよう
に試料のＩＬ−６ｉ分析が行なわれる。ＩＬ−６ｉ含有
画分は回収され、任意に凍結乾燥される。２ｌの培養液
から、約５０μｇのＩＬ−６抑制物質が得られる。画分
は、ＰＢＳで透析することにより脱塩され、Ｂ９−分析
により試験される。

【００２５】本発明の一つの実施態様はＩＬ−６ｉ活性
及び約１０ｋDaの分子量を有する因子である。この因子
は、それがＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩＬ−４のいずれ
も抑制しないことを更に特徴とする（図９及び図１３を
参照のこと）。別のＩＬ−６ｉ実施態様は約４４ｋDaの
因子である。また、本発明の生産物は、当業者に既知の
方法に従って組換えＤＮＡ技術により得ることができ
る。例えば、マニアチス（Maniatis) ら著、Molecular
clong-ing : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Laboratory, ＣＳＨ，ＮＹ（１９８２）を参照のこ
と。ＩＬ−６抑制物質は抑制物質に関する遺伝子を発現
可能な形態で暗号化するＤＮＡを含む形質転換された宿
主細胞を培養することにより得られる。これを行なうた
め、ＩＬ−６ｉを暗号化するＤＮＡは、好適な発現系中
でクローン化される必要がある。ＤＮＡはハイブリッド
形成に適したプローブを用いて選択される。ＩＬ−６ｉ
因子を分泌する形質変換された宿主細胞は、ＩＬ−６ｉ
タンパク質に対して発生されたラベルされた放射性抗体
により同定される。

【００２６】ＩＬ−６ｉタンパク質の大量生産に特に有
効な組換え宿主生物は、バチルス・リチニホルミス（Ba
cillus licheniformis) 、クルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis) 及びアスペルギルス・ニガー
（Aspergillus niger)である。また、本発明は、ＩＬ−
６ｉ組成物またはその個々の成分を含む製薬製剤を含
む。本明細書に記載された粗上澄液、部分精製されたＩ
Ｌ−６ｉ成分または純粋なＩＬ−６ｉ成分が使用し得
る。細胞培養液上澄液として調製される場合、または細
胞培養液上澄液として調製される場合、ＩＬ−６ｉ組成
物は活性成分の水溶液として最初に分離される。脱塩し
凍結乾燥した後、ＩＬ−６抑制活性が保存される安定な
粉末が生じる。粗上澄液または部分精製された組成物は
更に処理されて、細胞培養液と混在される不純物または
生産方法から生じる不純物を除去し得る。粗形態または
精製形態の、溶液または粉末としてのＩＬ−６ｉ組成物
は製薬業界に既知の方法により乾癬、アレルギー反応、
リウマチ病及び皮膚、肺または胃腸道の炎症疾患の如き
ＩＬ−６で媒介される疾患の治療並びに熱傷及び潰瘍の
治療に有益である製薬剤に加工し得る。

【００２７】注射液、錠剤、クリーム、軟膏またはロー
ション剤の如き、静脈内投与、皮下投与、病変内投与、
経口投与または局所投与に適する製剤が特に好ましい。
また、その他の投薬形態が使用し得る。ＩＬ−６ｉ組成
物の製剤化のための技術が当業界で利用可能であり、例
えば Remington's Pharmaceutical Science(最新編)マ
ック・パブリッシング・カンパニィ（Mack Publishing
Co.)、イーストマン、ＰＡに見られる。満足な結果が粗
分離物を用いてつくられた製薬製剤で得られるが、精製
ＩＬ−６抑制物質（ＩＬ−６ｉ）を使用することが好ま
しい。

【００２８】

【実施例】以下の実施例は本発明を説明することを目的
とするものであり、本発明を限定することを目的とする
ものではない。 調製Ａヒト末梢血単核細胞の分離 リンパ球分離培地（フロー（Flow))約１５〜２０mlをヒ
トの血液３０mlでオーバーレイし、混合物を１８００rp
m で２０分間遠心分離した。界面（白血球を含む）を注
意して除去し、ハンクス平衡塩溶液で洗浄した。細胞ペ
レットを、５〜１０％（v/v)のＦＣＳを含むＲＰＭＩ16
40中で再懸濁し、細胞密度を5 ×１０⁶細胞／mlに調節
した。細胞懸濁液１０mlを９cmのプラスチックペトリ皿
中で３７℃で少なくとも２時間保温して、ＰＢＭＣを粘
着させた。その後、上澄液を取り出して、細胞を注意し
てＲＰＭＩで洗浄した。付着細胞をゴム冠ポリスマンを
用いて回収できた。

【００２９】

【実施例１】末梢血単核細胞を用いたＩＬ−６ｉの調製 調製Ａに記載されたようにして調製したヒトＰＢＭＣ
（粘着細胞）を、5%(v/v)のＦＣＳで補足したＲＰＭＩ１
６４０を用いて単層培地中で保ち増殖させた。細胞を継
代培養するため、まず、それらをＰＢＳ（pH7.４）で洗
浄し、その後、ＰＢＳ中の0.０５％（w/v)のトリプシン
及び0.０２％（w/v)のＥＤＴＡで処理した。細胞懸濁液
（１×１０⁶ 細胞／ml）の３mlのアリコートを６０mmの
プラスチックペトリ皿中に入れ、続いて１００Ｊ／ｍ²
の単一ＵＶ暴露を行なった。３００〜６００nmの間で連
続スペクトルを放出するオスラム・ビタルックス（Osra
mVitalux)バルブを使用した。その出力はインターナシ
ョナルライト７００リサーチ・ラジオメーター（Intern
ational Light 700 Research Radiometer)で測定して２
９７nmで0.２mJ/cm²/ 分であった。

【００３０】続いて、細胞をＲＰＭＩ１６４０（フロー
・ラボラトリィズ、マックリーン、ＶＡ）中で２回洗浄
し、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０ １ml中で再懸濁
し、５％のCO₂ を含む保湿雰囲気中で３７℃で保温し
た。照射の２４時間後に、上澄液を回収し凍結乾燥し
た。試料（１００μl ) を、ＴＳＫ−２５カラム（Ｅ．
メルク）を用いてＨＰＬＣゲル濾過にかけた。この分離
（上澄液中に含まれる生産物のサイズに基く）のため、
サイズ排除カラム、バイオ−シル（Bio-Sil)ＴＳＫ１２
５、３００×7.５mmのバイオ−ラド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）
を使用した。溶出をＰＢＳ、pH7.２で1.０ml／分の流量
で行なった。カラム画分（0.５ml）を、５％のＦＣＳを
含むＲＰＭＩ１６４０で希釈し、その後、濾過滅菌し
た。カラムを、ウシチログロブリン（６７０ｋDa）、ウ
シγ−グロブリン（１５８ｋDa）、ニワトリ卵アルブミ
ン（４４ｋDa）、ウマミオグロブリン(17 kDa)及びシア
ノコバラミン(1.3ｋDa) を含むゲル濾過標準（バイオ−
ラド、リッチモンド、ＣＡ）で較正した。

【００３１】画分を、１Ｕ／mlのｒｈＩＬ−６標準試料
と混合した後、上記の分析を用いてＩＬ−６ｉ活性に関
して試験した。これらの活性を図１に示す。図のＸ軸は
カラム画分を示し、Ｙ軸はＩＬ−６活性（カウント／分
で表わす）を示す。水平線は、分析される試料と混合す
る前のＩＬ−６（１Ｕ／ml）標準試料の活性を示す。分
子量マーカーが図の上部に示される。画分２〜６及び１
１〜１３に関する曲線中の最小値は、夫々、約１０ｋDa
及び４４ｋDaのＩＬ−６抑制物質の存在を示す。

【００３２】ＵＶ刺激の量を変える効果を測定するため
に、５種のＩＬ−６ｉを含む上澄液を上記のようにして
調製したが、ＵＶエネルギーの量は０から１５０Ｊ／ｍ
² に増加した。これらの上澄液をＩＬ−６ｉ活性に関し
て分析し、天然ＩＬ−６の先だつ除去を行なわず、いず
れも標準量のＩＬ−６を分析試料に添加しなかった。上
澄液を１：３００に希釈した。図２を参照のこと。図の
Ｙ軸はＩＬ−６活性（カウント／分×１０００で表わ
す）を示す。夫々の縦線の下の数値は、相当する試料に
投与された紫外線の合計量（Ｊ／ｍ² で表わされる）を
意味する。示されるように、光の量の増加は、おそらく
ＩＬ−６の一層多い生産によりＩＬ−６活性の生成を最
初に増進した。しかしながら、５０Ｊ／ｍ² を超える光
の流入により、一種以上のＩＬ−６抑制物質の生産がＩ
Ｌ−６の増加に取って代わり、高度に照射された細胞の
上澄液中で次第に減少する正味のＩＬ−６活性を生じ
る。縦線は標準偏差の標示を備えている。

【００３３】図３は、この系におけるＩＬ−６及びＩＬ
−６抑制物質の生産の速度論を示す。ヒトＰＢＭＣ細胞
を、上記のようにして処理し培養した。試料を、０時
間、２時間、４時間、８時間、１６時間及び３２時間の
時点で採取した。いずれも、上澄液をＩＬ−６抑制活性
に関して分析する前に、天然ＩＬ−６を除去せず、また
標準量のＩＬ−６を添加しなかった。１００Ｊ／ｍ² の
紫外線で照射された細胞のＩＬ−６活性は、サンプリン
グ時間に相当する陰影線付きの棒により示される。陰影
線のない棒は、同じ時間に採取された照射しなかった細
胞の基準上澄液を表わす。ＩＬ−６活性はカウント／分
（１０００倍）で示される。標準偏差が示されている。
刺激しなかった試料（陰影線のない棒）と比較して、Ｕ
Ｖで処理したＰＢＭＣ上澄液（陰影線付き棒）は、かな
り少ないＩＬ−６活性を示す。ＵＶで処理したＰＢＭＣ
はＩＬ−６活性を生じるので、この固有のＩＬ−６は同
時に生産されるＩＬ−６抑制物質により中和されたもの
と結論される。

【００３４】

【実施例２】ＫＢ細胞を用いるＩＬ−６ｉの調製 ヒト類表皮癌ＫＢ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７）はアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ the Ame
rican Type Culture Collection)から入手し得る。これ
らの細胞を培養し、ＰＭＡ（１０ng/ml)で刺激し、実施
例１に記載したように、上澄液を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ
ゲル濾過（ＴＳＫ１２５）にかけた。これらの画分を、
上記のように、１０Ｕ／mlのｒｈＩＬ−６の存在下でＢ
９分析で試験した。それらの活性を図４に示す。図のＸ
軸は画分を示し、Ｙ軸はＩＬ−６活性（カウント／分×
１０００で表わされる）を示す。水平線は、分析される
試料との混合前のＩＬ−６（１０Ｕ／ml）標準試料の活
性を示す。分子量マーカーが上部に示されている。画分
３、５〜７及び１５〜１９に関する曲線中の最小値は、
再度、１０ｋDa及び４４ｋDaの概算分子量を有するＩＬ
−６抑制物質の存在を示す。

【００３５】

【実施例３】ＫＲＦＭ細胞を用いるＩＬ−６ｉの調製 ドイツのミュンスター大学の Th.ルガー（Lugar)教授か
ら入手したヒトメラノーマＫＲＦＭ細胞を増殖させ、そ
れらが集密に達した後、培地をＦＣＳを含まない培地に
より置換した。細胞をＰＭＡ（１０ng/ml)を用いて、ま
たＰＭＡを用いずに２４時間保温した。上澄液を回収
し、上記のように、ＩＬ−６アフィニティークロマトグ
ラフィーにかけ、その結果ＩＬ−６活性は溶出液中に残
存しなかった。その後、１０Ｕ／mlのｒｈＩＬ−６標準
試料と混合した後、溶出液のＩＬ−６ｉ活性を測定し、
結果を図５に示す。

【００３６】これらの棒はＩＬ−６活性（カウント／分
×１０００）及び標準偏差を示す。陰影線のない棒はｒ
ｈＩＬ−６標準試料のＩＬ−６活性（１０Ｕ／ml）を示
す。ＰＭＡ刺激により調製された上澄液（交差線付き
棒）は明らかにはるかに少ないＩＬ−６活性を示す。何
となれば、強力なＩＬ−６抑制物質が生産されるからで
ある。ＰＭＡで刺激しないで調製された上澄液（陰影線
付き棒）の溶出液は標準試料と比較して有意なＩＬ−６
活性の抑制を示さなかった。

【００３７】

【実施例４】Ａ４３１細胞を用いるＩＬ−６ｉの調製 ヒト類表皮癌Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５
５）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから得られる早生細胞系である。細胞を標準培地中で
培養した。集密時に培地を取り出し、刺激培地と置換し
た。これはＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、２０mMのグル
タミン、抗生物質（例えば、１００Ｕ／mlのペニシリ
ン、１００μg/mlのストレプトマイシン及び0.５μg/ml
のフンジゾン）、１０mlのＨＥＰＥＳ、及び刺激要因と
しての２００nMのイオノマイシン及び５０ng/ml のＰＭ
Ａを含んでいた。

【００３８】刺激の３６時間後に、上澄液を回収した。
１０mMのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド）の如きプロテアーゼ抑制物質を添加し、状態調節し
た培地を２０００ｇで１５〜２０分間遠心分離した。透
明にした上澄液を、３ｋDaのカットオフを有する限外濾
過単位装置を用いて、直ちに濃縮した。限外濾過による
濃縮は、ＹＭ５フィルターを備えたアミコン（Amicon)
攪拌セルを用いて適当に行なうことができた。硫酸アン
モニウム沈殿（図１０を参照のこと）、陰イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用
するレテンテート（retentate)の精製、及びＢ９バイオ
アッセイを用いる画分の分析は上記のようにして行なっ
た。

【００３９】

【実施例５】Ａ４３１細胞を用いるＩＬ−６ｉの調製 ヒト類表皮癌細胞（Ａ431 ）を、ｈＩＬ（１Ｕ／ml）と
ｒｈＩＬ−６（１００Ｕ／ml）の混合物と共に３６時間
保温した。上澄液を水に対して透析した。さらに濃縮す
るために透析物を凍結乾燥し、上記のようにしてＤＥＡ
Ｅイオン交換クロマトグラフィーにかけた。画分を水に
対して透析し、１０×ＲＰＭＩ１６４０を用いて再構成
し、続いて上記のＩＬ−６ｉに関してＢ９バイオアッセ
イで試験した。カラム画分の活性を図６に示す。 図の
Ｘ軸は画分番号を示し、Ｙ軸はカウント／分で表わされ
るＩＬ−６活性を示す。点線は０〜５００mMのNaClの範
囲のNaCl勾配を表わす。一点鎖線は分析される試料と混
合される前のＩＬ−６（１Ｕ／ml）標準試料の活性を表
わす。画分６〜１０及び２２〜２４に夫々相当する実線
中の二つの最小値は、ＩＬ−６抑制物質を表わす。

【００４０】

【実施例６】Ａ４３１細胞を用いるＩＬ−６ｉの調製 ヒト類表皮癌細胞（Ａ４３１）を培養し、実施例４に記
載したようにして刺激した。上澄液を濃縮し、透析した
（１０mMのトリス／ＨCl、pH7.０に対して）。硫酸アン
モニウムを１Ｍの最終濃度まで添加した。懸濁液の遠心
分離後に、透明な上澄液を疎水性相互作用クロマトグラ
フィー用カラム（Ｅ．メルクのＴＳＫブチル６５０）に
適用した。溶出は、最初に段階硫酸アンモニウム勾配を
用い、続いてトリス／ＨCl次いでエチレングリコールを
用いて行なった。

【００４１】画分１： 1.０Ｍの硫酸アンモニウム 画分２： 0.５Ｍの硫酸アンモニウム 画分３： 0.１Ｍの硫酸アンモニウム 画分４： １０mMのトリス／ＨCl（pH7.８） 画分５： エチレングリコール／水（８０／２０、v/v) 結果を図７に示す。図中、左側のＹ軸は画分の２８０nm
に於ける光学密度を示し、右側のＹ軸は硫酸アンモニウ
ム濃度（Ｍ）を示す。

【００４２】ＲＰＭＩ１６４０に対して透析した後、Ｉ
Ｌ−６ｉ活性を上記のＢ９分析を用いて分析した（図
８）。画分１〜５の夫々は線により表わされる。Ｙ軸は
ＩＬ−６活性（カウント／分）を示す。水平の基準線
は、分析される試料と混合する前のＩＬ−６（１Ｕ／m
l）の活性を示す。画分３は殆どのＩＬ−６ｉ活性を明
らかに含んでおり、画分４がそれに続く。分析は、５つ
の画分の４つの異なる希釈液に関して行なった。

【００４３】また、同じ画分をＩＬ−１依存性胸腺細胞
生殖の増殖抑制（図９）で表わされるようなＩＬ−１活
性の抑制並びにＩＬ−２及びＩＬ−４活性の抑制（図１
３を参照のこと）に関して分析した（実施例８を参照の
こと）。図９のＹ軸はＩＬ−１活性（カウント／分）を
示す。右側のＹ軸はNaCl濃度を示す。Ｘ軸は画分番号を
示す。水平の基準線は、１Ｕ／mlを含む添加したＩＬ−
１標準試料の理論活性である。画分のいずれもが添加し
たＩＬ−１標準物質に対して抑制活性を示さなかったこ
とが明らかである。分析を５つの画分の６つの異なる希
釈液に関して行なった。ＩＬ−１活性の抑制が存在しな
いことが明らかであった。

【００４４】画分３をトリス／ＨCl（１０mM、pH7.８）
に対して透析し、ＦＰＬＣクロマトグラフィー用陰イオ
ン交換カラムに適用した。溶出は線形塩化ナトリウム勾
配ナトリウム画分（０〜５００mM) を含むトリス/HCl(1
0mM 、pH7.9)を用いて行ったＩＬ−６因子は、３０〜６
０mMの塩化ナトリウムを含む画分中で溶出した（図１
１）。左側のＹ軸はＩＬ−６活性（カウント／ml）を示
す。水平の基準線は分析される試料との混合する前のＩ
Ｌ−６（１Ｕ／ml）標準試料の活性である。

【００４５】ＩＬ−６ｉ活性を示す陰イオン交換からの
画分を溜め、ポリエチレングリコール８０００に対する
透析により濃縮し、ＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィ
ー用の６０cmのＴＳＫ２０００カラム（ＬＫＢ）に溶離
剤としてＰＢＳを使用して適用した。ＩＬ−６ｉ活性は
分子量マーカーＡ及びＢにより約１０ｋDa及び80ｋDaに
夫々相当する画分と関連していた。Ｙ軸はＩＬ−６活性
（カウント／分）を示す。水平の基準線は、分析される
試料と混合する前のＩＬ−６（１Ｕ／ml）標準試料の活
性である。そのＩＬ−６ｉ活性は約１０ｋDaで見られた
だけでなく、また８０ｋDaでも見られた。この現象は、
おそらく一層軽質のＩＬ−６ｉ因子の凝集物の形成によ
り説明し得る。

【００４６】

【実施例７】前立腺上皮細胞を用いるＩＬ−６ｉの調製 前立腺上皮細胞ＰＣ３は、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４３５）から
入手できる。上記細胞を培養し、刺激し、その上澄液を
回収し、Ａ４３１細胞に対する実施例４に記載したよう
に試験した。

【００４７】図１４はＰＭＡを使用して（右側の棒）、
またＰＭＡを使用しないで（左側の棒）調製した上記の
上澄液のＩＬ−６ｉ活性を示す。４対の棒は上澄液の４
つの希釈液（１：４、１：８、１：１６、１：３２）を
表わす。ＰＭＡで刺激した細胞は、明らかにＩＬ−６ｉ
を産生した。

【００４８】

【実施例８】ＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−４の抑制に関する分析 一般 試験試料を補足ＲＰＭＩ １６４０で１：１に希釈し
た。あるいはまた、被検体は、水で透析し、１０ＸＲＰ
ＭＩ １６４０で再構成することもできる。濾過殺菌
後、試料を任意に−２０℃で保存することができる。

【００４９】インターロイキン１の抑制 ６〜８週令のＣ３Ｈ ＨｅＪ マウス（ＩＦＡ ＣＲＥ
ＤＯから入手可能）の胸腺細胞を１５ml RPMI 1640 に
懸濁し、5 ％加熱不活性化FCS 、２０mM グルタミン、
１００Ｕ／ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプト
マイシン、１０mM HEPES、１０mM ピルビン酸ナトリウ
ム及び０．０５mM 2- メルカプトエタノールを補足して
結合組織のみ残した。胸腺懸濁液を円錐形に屈曲したス
チール格子を用いて、１５mlファルコン チューブ中に
濾過し、1200rpm(36 cm ローター直径) で８分間遠心分
離した。洗浄を２回繰り返して、胸腺細胞濃度を３．１
０ ⁷/mlに調整した。

【００５０】いくつかの希釈及び上記のように調製した
ＩＬ−１標準（３Ｕ／ml、ＦＬＯＷから入手可能）を用
いて、標準曲線を作製する。対照試料を入れた。全ウェ
ル（対照ウェル以外の）に５０μｌのコンカナバリンＡ
溶液（2.2 μg/ml、ファルマシアから入手可能) を添加
した。全ウェルに、天然ヒトＩＬ−１を添加し、0.05Ｕ
／ウェルとした。

【００５１】その後、５０μｌの上記した胸腺細胞懸濁
液を各ウェルに添加した。６７時間後、５０μｌ ＲＰ
ＭＩ １６４０培地中の0.1 μCi トリチウム化したチ
ミジンを添加した。含有放射能を液体シンチレーション
カウンターで測定した。結果を三重実験法で表した。ＩＬ−２及びＩＬ−４抑制 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ ＴＩＢ２１４）から入手できる１×１０⁴ ＣＴＬ
Ｌ細胞の１００μｌ中の懸濁液を、５％ FCS、２０mM
グルタミン、１００Ｕ／ml ペニシリン、１００μg/ml
ストレプトマイシン、１０mM HEPES、１０mM ピルビ
ン酸ナトリウム及び０．０５mM 2- メルカプトエタノー
ルを有するＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。各ウ
ェルに、１００μl 試験試料を添加した。２日後、ＣＴ
ＬＬ細胞の増殖をＩＬ−１試験で記載したように³ Ｈ-
チミジン取込み測定法を用いて測定した。

【００５２】ＩＬ−２抑制活性の測定に対しては、０．
０５ＵヒトＩＬ−２を各ウェルに添加した。ＩＬ−４抑
制活性の測定に対しては、０．０５Ｕ組み換え型マウス
ＩＬ−４を各ウェルに添加した。図１３は、ＩＬ−６、
ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１試験で分析された場合
の精製上澄液の抑制活性を示す。外因性のＩＬ−６活性
のみが試料により減少した。外因性のＩＬ−１、ＩＬ−
２、ＩＬ−４活性は影響されなかった。

【００５３】

【実施例９】ＩＬ−６ｉ含有上澄液の精製 ヒト類表皮癌細胞（Ａ４３１）を培養し、実施例４に記
載したように刺激した。上澄液を濃縮し、（１０mM ト
リス/HCl、pH 8.9で) 透析した。上記の物質をMonoQ AE
X カラムにかけ、最初の30分間０〜１００mMの範囲の線
形NaCl勾配を用いて溶出した。NaCl濃度を33〜38分間増
加し最終濃度を１０００mMとし、10分間その濃度に維持
し、最後の５分間で最終的に０mMに減少させた。このＩ
Ｌ−６抑制活性は、80〜90mMのNaCl濃度で単一ピークと
して溶出した（図１５）。

【００５４】活性画分３０及び３１を溜め、更に水を移
動相として用いる逆相（ＲＰ１８）クロマトグラフィー
で分離した。０〜１００％の範囲のアセトニトリルの線
形勾配を用いた。ＩＬ−６抑制物質は、５０〜６０％の
アセトニトリル範囲内の活性の単一ピークとして溶出し
た（図１６）。約１５０μｇＩＬ−６ｉを含有するＲＰ
１８画分２２、２３及び２４を溜め、更にゲル濾過クロ
マトグラフィー（ＧＰＣ）で分離した。このＩＬ−６ｉ
抑制活性は、約４４及び１０KDa の分子量での活性を示
す抑制活性の２つの異なるピークとして溶出した( 図１
７）。

【図面の簡単な説明】

全般：記載された図に於いて、Ｙ軸はしばしばＩＬ−６
活性を示す。ＩＬ−６標準物質または基準試料に関する
低い値は、相当する高いＩＬ−６ｉ含量を示す。

【図１】図１は、実施例１に記載されたＵＶ刺激のもと
でヒトＰＢＭＣで調製されたＩＬ−６ｉを含む上澄液の
ＨＰＬＣゲル濾過により得られた画分のＩＬ−６抑制活
性を示す。

【図２】異なる量の紫外線による培養液刺激後の５つの
ＩＬ−６ｉを含む上澄液のＩＬ−６抑制活性を示す。

【図３】照射による（陰影線付き棒）、また照射によら
ない（ブランクの棒）ＰＢＭＣ細胞の培養に於けるＩＬ
−６抑制活性の発生を示す。

【図４】実施例２に記載されたようなＰＭＡ刺激のもと
にＫＢ細胞で調製されたＩＬ−６ｉを含む上澄液のＨＰ
ＬＣゲル濾過により得られた画分のＩＬ−６抑制活性を
示す。

【図５】ＰＭＡ刺激のもとに（交差線付き棒）、また刺
激しないで（陰影線付き棒）ＫＲＦＭ細胞を用いて実施
例３に従って調製された上澄液のＩＬ−６抑制活性を示
す。天然ＩＬ−６は分析試料から除去されなかった。

【図６】ＩＬ−１／ＩＬ−６刺激のもとにＡ４３１細胞
を用いて実施例５に従って調製された上澄液の陰イオン
交換クロマトグラフィーにより得られた画分のＩＬ−６
抑制活性を示す。

【図７】ＰＭＡ刺激の下にＡ４３１細胞を用いて実施例
６に従って調製された硫酸アンモニウム処理上澄液を適
用したＨＩＣカラムから溶出された画分の光学密度（２
８０nm）を示す。

【図８】図７に関して記載されたＨＩＣカラムから溶出
された次第に希釈された画分のＩＬ−６抑制活性を示
す。

【図９】図７に関して記載されたＨＩＣカラムから溶出
された次第に希釈された画分のＩＬ−１に抑制活性を示
す。

【図１０】粗上澄液（最左の棒）及び残存上澄液（最右
の棒）の活性と比較して、ＩＬ−６ｉを生じる細胞の培
養から得られた粗上澄液に硫酸アンモニウムを夫々６０
％及び７５％の飽和まで逐次添加することにより得られ
た沈殿（中央の棒）のＩＬ−６抑制活性を示す。

【図１１】図７に示された画分３の陰イオン交換クロマ
トグラフィーにより得られた画分のＩＬ−６抑制活性を
示す。

【図１２】図１１により示された陰イオン交換クロマト
グラフィーの溜められたＩＬ−６ｉ画分４及び５のＨＰ
ＬＣゲル濾過により得られた画分のＩＬ−６抑制活性を
示す。８０KDa と８KDa に対する分子量マーカーを示
す。

【図１３】実施例８に記載されたようにしてＩＬ−１、
ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６試験で分析した場合の
精製上澄液の抑制活性を示す。

【図１４】実施例７に記載されたように、ＰＭＡを用い
て（右側の棒）、またＰＭＡを用いないで（左側の棒）
調製された、次第に希釈された前立腺上皮細胞培養誘導
上澄液のＩＬ−６ｉ活性を示す。

【図１５】Ａ４３１細胞をＰＭＡ刺激し、硫酸アンモニ
ウム（７５％）沈澱の後、実施例４に記載したように調
製した上澄液の陰イオン交換クロマトグラフィーから得
られた画分のＩＬ−６抑制活性を示す。天然ＩＬ−６は
試験試料から取り除いた。

【図１６】図１５に記載の分離物のＩＬ−６ｉ活性含有
画分の逆相クロマトグラフィーから得られた画分のＩＬ
−６抑制活性を示す。

【図１７】図１６に記載の分離物のＩＬ−６ｉ活性含有
画分のゲル濾過クロマトグラフィーから得られた画分の
ＩＬ−６抑制活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン−６抑制活性（ＩＬ−
   ６ｉ）を有する組成物であって、前記の組成物がＩＬ−
   ６ｉ生成に関して刺激された哺乳類細胞からのＩＬ−６
   ｉ活性を有する部分精製された細胞培養上澄液、または
   ＩＬ−６ｉ活性を有するその成分であることを特徴とす
   る前記の組成物。
2. 【請求項２】 前記のＩＬ−６ｉ活性が − ゲル濾過サイズ排除カラムで測定して約１０ｋDaの
   分子量を有し − インターロイキン−１、インターロイキン−２また
   はインターロイキン−４を抑制する活性をもたず、かつ − ７５％の飽和硫酸アンモニウム溶液中で沈殿しない
   タンパク質と関連する請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記のＩＬ−６ｉ活性がゲル濾過サイズ
   排除カラムで測定して約４４ｋDaの分子量を有するタン
   パク質と関連する請求項１に記載の組成物。
4. 【請求項４】 ヒト粘着ＰＢＭＣ細胞、類表皮癌細胞、
   メラノーマ細胞または前立腺上皮細胞の培養液を紫外線
   及び／またはフォルボールミリステートアセテート及び
   ／またはＩＬ−１とＩＬ−６との混合物で処理し、 細胞培養液上澄液を画分に分離し、 画分をＩＬ−６ｉ活性に関して分析し、 ＩＬ−６ｉ活性を有する少なくとも一つの画分を回収
   し、次いで必要により前記の画分を濃縮し、かつまたは
   更に精製することを含む方法により得られる精製ＩＬ−
   ６ｉ因子。
5. 【請求項５】 前記の分離がイオン交換クロマトグラフ
   ィー、逆相クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用ク
   ロマトグラフィーによる請求項４に記載の精製ＩＬ−６
   ｉ因子。
6. 【請求項６】 前記の分離が分子のサイズに基く請求項
   ４に記載の精製ＩＬ−６ｉ因子。
7. 【請求項７】 約１０ｋDaの分子量を有する請求項４記
   載の因子。
8. 【請求項８】 約４４ｋDaの分子量を有する請求項４に
   記載の因子。
9. 【請求項９】 インターロイキン−６抑制活性を有し、
   タンパク質であり、かつゲル濾過サイズ排除カラムで測
   定して約１０ｋDaの分子量及びＩＬ−１、ＩＬ−２また
   はＩＬ−４を抑制する活性の不在により性格付けされる
   ことを特徴とする精製され単離された形態の因子。
10. 【請求項１０】 インターロイキン−６抑制活性を有
    し、タンパク質であり、かつゲル濾過サイズ排除カラム
    で測定して約４４ｋDaの分子量に性格付けされることを
    特徴とする精製され単離された形態の因子。
11. 【請求項１１】 下記の工程：ヒト粘着ＰＢＭＣ細胞、
    類表皮癌細胞、メラノーマ細胞または前立腺上皮細胞の
    培養液を紫外線及び／またはフォルボールミリステート
    アセテート及び／またはＩＬ−１とＩＬ−６との混合物
    で処理する工程、 細胞培養液上澄液を回収する工程、 上澄液の成分を画分に分離する工程を特徴とするインタ
    ーロイキン−６抑制因子の調製方法。
12. 【請求項１２】 前記の分離がイオン交換クロマトグラ
    フィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーによる
    請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記の分離が分子のサイズに基く請求
    項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 有効量のインターロイキン−６抑制
    （ＩＬ−６ｉ）活性を有する組成物及び一種以上の製薬
    上許される賦形剤、希釈剤及び／またはアジュバントを
    含むことを特徴とする乾癬、アレルギー反応、リウマチ
    病並びに皮膚及び肺の炎症疾患を防除または回復するた
    めの製薬製剤。
15. 【請求項１５】 ＩＬ−６ｉ組成物がゲル濾過サイズ排
    除カラムで測定して約１０ｋDaの分子量を有するタンパ
    ク質である請求項１４に記載の製剤。
16. 【請求項１６】 ＩＬ−６ｉ組成物がゲル濾過サイズ排
    除カラムで測定して約４４ｋDaの分子量を有するタンパ
    ク質である請求項１４に記載の製剤。
17. 【請求項１７】 有効量のＩＬ−６ｉ因子を含む製薬組
    成物を投与することを特徴とする炎症疾患の治療。