PT97124A

PT97124A - Processo para a prparacao de composicoes inibidoras de interleucina - 6 (il-6)

Info

Publication number: PT97124A
Application number: PT97124A
Authority: PT
Inventors: Thomas Luger; Andreas Kock
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 1991-12-31
Also published as: IE910955A1; JPH0899996A; EP0448181A2; EP0448181A3

Description

DescriçSo referente â patente de invenção de GIST-BROCADES N«Y., holandesa, industrial e comercial , com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos, (inventores* Thomas Luger, residente na República Federal Alemã e Andreas Kock, residente na Áustria), para «PROCESSO PARA A PREPARAÇAO PE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO SOBRENADANTES CELULARES INIBIDORES DA ACTIVIDADE DA IN-TERLEUCINA - 6 (IL-6)".

Descrição Âmbito técnico A presente invenção refere-se a composiçSes terapêuticas que contrariam os efeitos da citoquina IL-6 e a métodos para a sua preparação·

Fundamento da invenção

As citoquinas são factores solúveis multifuncionais que ocorrem em mamíferos e que desempenham um papel importante na regulação de funçCes celulares tais como a mediação de reac-çOes inflamatórias e imunologicas· Veja-se, por exemplo, New England Journal of Medicine (198?) 3t7t 940-945· Estas citoquinas ou factores regulatórios são (glico) proteínas que se ligam a receptores específicos e influenciam a activaçáo, proliferação e diferenciação das células tanto imunologicas como não imunologicas· Estas substâncias de tipo hormona são libertadas pelos linféeitos, o que explica o nome inicial de linfoquinas, - 1 -

mas também por outras células imunológioas como fibroblastos, células endotelíais, células epiteliais incluindo os queratinó-eitos e células de estroma. Dma destas citoquinas é a interleu-cina - 6 (IL-6), que se revelou ser um importante mediador na iniciação e manutenção de reacçCes inflamatórias· Veja-se, por exemplo, J. Xmmunol. (1969) 142x1922-1928 e Immunology Today (1987) 84t p. 137. A IL-6 é também conhecida pelos nomes de factor-2, estimulante de células B, ínterferão )32, factor de crescimento de hibridoma, factor estimulante de hepatócito, in-dutor-2 de granulóeito maerofago e proteína 26 KDa* Acredita-se que a IL-6 está associada como doenças como psoríase, reacçOes alérgicas, estados reumáticos e doenças inflamatórias da pele, dos pulmdes ou do tracto gastrointestinal. A preparação e carac terização bioquímica da IL-6 encontram-se descritas em Sehgal, P.B. et al*, J« Interferon Bes» (1987)« 7j p.521 e Van Damme, J. et al·, J. Exp· Med. (1987) 165* p.914.

Sabe-se que a acção de várias citoquinas é contrabalançada por antagonistas, mas até agora não se encontrou qualquer antagonista natural da actividade da IL-6*

Embora as substâncias a seguir descritas se designem como inibidores, não se sabe se o efeito inibitório se baseia numa inactivação da proteína IL-6, no bloqueamento da posição do receptor ou num outro tipo de efeito. Por isso, o uso do ter mo *lnibidor” não implica que os efeitos descritos nesta invenção não sejam causados por antagonismo. A presente invenção refere-se a composiçdes farmacêuticas inibidores da IL-6, que se designam a seguir pela abrevia tura IL-61. Em particular, descobriram-se substâncias de origem natural inibidoras da IL-6. Um desses inibidores da interleuci-na-6 é uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 10 kilodalton (KDa) e não tem efeito inibitório sobre a IL-1, IL-2 ou IL-4» Um outro inibidor da interleucina-6 é uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 44 KDa. Ambos os IL-6i são produzidos por células de mamíferos. Estes inibidores de IL-6 são agentes anti-inflamatórios. 0 tratamento médico dos estados inflamatórios é ainda

%*Π!—.. '^^aas», #Γ-ί|,Λ pouco satisfatório· Os medicamentos mais largamente empregues são c0®P05iç5es contendo esteróides, particularmente corticos-teróides· Estes têm vários efeitos secundários indesejáveis, especialmente quando são administrados por um período prolongado, por exemplo, deterioração da pele e inibição do córtex a-drenai* Os inibidores de IL-6 mencionados nesta invenção não apresentam tais efeitos secundários*

Inovação da invenção A invenção refere-se a composiçOes farmacêuticas que inibem a actividade da IL-6 e que são por isso úteis como drogas anti-inflamatórias· Os inibidores da IL-6 desta invenção podem obter-se a partir de sobrenadantes celulares prevlamente estimulados para produzir as substâncias proteicas com actividade inibitória de IL-6, por vários processos, incluindo, por exemplo, estimulação por luz OY (ultravioleta) ou por acetato de miristato de forbol (PMA). Os sobrenadantes apresentam acti-vldade inibitória de IL-6 e os componentes responsáveis por esta actividade podem preparar-se numa forma purificada a partir destes sobrenadantes.

Estes componentes activos parecem ser proteínas, uma vez que após incubação de uma noite com uma protease a actividade inibitória da IL-6 (actividade 1L-61) desaparece. beste modo, num dos seus aspectos, a invenção refere--se a uma composição de substâncias com actividade Inibitória da IL-6, sendo a referida composição constituída por um sobre-nadante de cultura celular em que as células foram estimuladas para a produção da actividade inibitória da IL-6, a formas purificadas parcialmente dos componentes dos sobrenadantes com actividade IL-6i, ou aos seus componentes inibitórios individuais* A invenção refere-se também a derivados funcionais das referidas proteínas, que se podem obter, de acordo com métodos bem conhecidos, por eliminação, adição ou substituição de unidades de aminoácidos na respectiva sequêneia, mantendo a ac- - 3 - ‘«J5tj\· ‘«J5tj\· <**e«»»ni'.«'98Gia

N tividade funcional IL*6i. A alteração de aminoacidos pode envolver apenas uma ou várias unidades, em particular 1 a 50 unidade de aminoácidos.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a composiçCes farmacêuticas contendo um sobrenadante de cultura celular par-ticularmente purificado, com actividade IL-6i, obtido a partir de células de mamífero estimuladas para a produção de IL-6i, ou um seu componente com actividade IL~6i, a métodos de tratamento de inflamaçOes usando essas composiçCes e a métodos para a preparação das composiçCes farmacêuticas de acordo com a invenção.

Breve descrição dos desenhos e gráficos

Gerais Nas figuras descritas, o eixo dos XX representa frequentemente a actividade de XL-6. Um valor baixo em relação a um padrão de IL-6 ou a uma amostra de referência indica um teor elevado em IL-6i da amostra testada. A Figura t mostra a actividade inibitória de IL-6 de fracçCes obtidas por HFLC de filtração de gel de um sobrenadante com XL-6i, preparado com PBNCs humanos sob estimulação por UV, como descrito no exemplo 1. A Figura 2 mostra a actividade inibitória de IL-6 de cinco sobrenadantes com IL-6i apos estimulação da cultura com várias intensidades de luz UV. A Figura 3 mostra o desenvolvimento da actividade inibitória de IL-6 numa cultura de células PMBC com irradiação (barras tracejadas) e sem irradiação (barras brancas). A Figura mostra a actividade inibitória de IL-6 de fracçóes obtidas por HPLC de filtração de gel de sobrenadantes com IL-6i preparados com células KB sob estimulação por PMA, como indicado no exemplo2. A Figura 5 mostra a actividade inibitória de IL-6 de um sobrenadante preparado de acordo com o exemplo 3, com células KRFM sob estimulação por PMA (barra quadriculada) e sem es-• timulação (barra tracejada)* A IL-6 nativa não foi removida das . amostras testadas. - 4 -

A Figura 6 mostra a aetividade inibitória de IL-6 de fraeçdes obtidas por cromatografia de permuta aniónica de um sobrenadante preparado de acordo com o exemplo 5 oom células A4$1 sob estimulação IL-1/IL-6. A IL-6 nativa não foi removida das amostras testadas» A Figura 7 mostra a densidade óptica (a 280 nm) de fracções eluídas de uma coluna HIC à qual se aplicou um sobrenadante tratado oom sulfato de amóniof preparado de acordo com o exemplo 6 oom células A431 sob estimulação por PMA.

As Figuras 8 e 9 mostram a aetividade inibitória de IL-6 e a aetividade inibitória de IL-1, respectivamente, de fraeções crescentemente diluídas, eluídas de uma coluna HIC, como descrito para a figura 7. A Figura tO mostra a aetividade inibitória de IL-6 de precipitados (barras do meio) obtidos por adição sucessiva de sulfato de amónio até 60% e 15% de saturação, respectivamente, a sobrenadante bruto obtido de uma cultura de células produtoras de lL-6i, comparada com as actividades do sobrenadante bruto (barra da esquerda) e do sobrenadante remanescente (barra da direita)· A Figura 11 mostra a aetividade inibitória de IL-6 de fracções obtidas por cromatografia de permuta aniónica da frac-ção 3 apresentada na figura 7. A IL-6 nativa não foi removida das amostras testadas* A figura 12 mostra a aetividade inibitória de IL-6 de fracções obtidas por HPLC de filtração de gel da mistura das fracções 4 e 5 obtidas pela cromatografia de permuta aniónica ilustrada na figura 11« Indicam-se os marcadores de peso molecular para 80 KDa e 8 KDa. A Figura 13 mostra a aetividade inibitória de um sobrenadante purificado quando testado num teste de IL-1, IL-2, IL-4 e IL-6, como descrito no exemplo 8. A Figura 14 mostra a aetividade de IL-61 de sobrena-dantes derivados de uma cultura celular epitelial de próstata, com diluições crescentes, preparado com PMA (barra da direita) - 5 -

e seis PMA (barra da esquerda), como descrito no exemplo 7. A Figura 15 mostra a actividade inibitória de IL-6 de fracçGes obtidas por cromatografia de permuta aniónica de um sobrenadante preparado de acordo com o exemplo 14 com células A431 sob estimulação por PMA, após precipitação com sulfato de amónio (75/*)* A IL-6 nativa nõo se removeu das mostras testadas. A Figura 16 mostra a actividade inibitória de IL-6 de fraeçdes obtidas por cromatografia em fase reversa das fraeçGes com actividade IL-6i obtidas na separação descrita na figura 15. A Figura 17 mostra a actividade inibitória de IL-6 de fraeçGes obtidas por cromatografia de permeaçSo de gel das frae, çGes com actividade IL-6i obtidas na separação descrita na Figura 16.

Modos de concretização da invenção

Abreviaturas utilizadast PBS e soro fisiológico tamponizado com fosfato PMA ss acetato de miristato de forbol KRFM = indicação de uma estirpe celular de melanoma nodular humano RPMI 1640 é um meio padrão (JAMA (1967), 199, p. 519) 2 2 ~ J/m s Joules/metro^ FCS » soro de vitela fetal EDTA s ácido etilenodiamlnotetraacético PMBC * células mononucleares de sangue periféricas MEPES s ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanosulfónico IL b interleucina hIL-1 = IL-1 humana hIL-6 = IL-6 humana IL-6i a inibidor ou antagonista de IL-6 rhIL-6 a IL-6 humana reeombinante FPLC = cromatografia líquida de proteína rápida*

As composiçGes inibitórias de IL-6 da presente invenção preparam-se pela estimulação de células humanas ou animais, em particular de células ou estirpes celulares de sangue de ma- - 6 - oansm

míferos, e, conforme o caso, por posterior purificação dos so-brenadantes de cultura. Entre as células adequadas ao objectivo da invençSo encontram-se as células mononucleares de sangue periféricas aderentes humanas (PBMC), as células de carcinoma epidermóide humano, as células de melanoma e as células epite-liais da próstata, mas podem usar-se também outras células humanas ou animais. Para a estimulação destas células pode usar--se, por exemplo, radiação ultravioleta (UV) ou acetato de mi-ristato de forboi (PMÂ) ou uma mistura de IL-1 e IL-6, ou uma combinação destes estimulantes. Outros estimulantes apropriados podem encontrar-se entre os estimulantes da proteinoquinase C e os activadores da concentração de cálcio intracelular. As quantidades adequadas de radiaçSo UV variam de 100-150 J/m2· As doses adequadas de PMÂ vão de 10 a 100 ng/ml.

Após estimulação desenvolvem-se as células durante 24 a 48 horas, de preferencia durante 36 horas em condições de oul^ tura padrão. Recolhem-se em seguida os sobrenadantes.

Antes ou depois da purificação que se segue efectua--se um teste para determinar a actividade de IL-61. Este teste baseia-se na redução do crescimento de células dependentes da IL-6 provocado pela 11,-6.

Numa das formas de efectuar o teste libertam-se as amostras a testar de toda a IL-6 nativa. Adiciona-se então uma quantidade pré-determinada de XL-6 às amostras que se pensa terem actividade de IL-6i e, após mistura com uma estirpe celular dependente de IL-6, determina-se o crescimento celular.

De acordo com um protocolo típico e prático liberta--se primeiro o sobrenadante de toda a IL-6 nativa. Um processo adequado consiste na adição de sulfato de amónio a 75$ de saturação. Como se pode ver na Figura 10 a IL-6 está no precipitado a 60$ de saturação, enquanto que a IL-6i está ainda presente no sobrenadante após 75$ de saturação. Em alternativa, pode remover-se a IL-6 passando a amostra por uma coluna de cromatogra-fla de afinidade contendo anticorpos para a IL-6. As colunas . para eromatografia de afinidade preparam-se fazendo a ligação • cruzada <"crosslink") da fraoçâo IgG de um anti-soro anti-hIL-6 - 7 -

de coelho a Sepharose 4B activada com brometo de eianogénio (Sigma Chemical Corp·, St, Louis, Mo).

Usa estirpe celular de hibridoma dependente da IL-6 é a B9, que se pode obter fornecida por L. Aarden, University of Amsterdam, Holanda* Outras estirpes dependentes da IL-6 adequadas encontram-se geralmente disponíveis ou podem preparar-se de acordo com métodos conhecidos na especialidade, por exemplo pelo método descrito em ttA growth-faetor dependent B-eell hybri-doman, Lansdorp, P.M. et al·, Current Toplcs in Mierobiology and Immunology (19Ô6) 132* p, 105-113* Um subclono obtido a partir da estirpe celular B13*29 dependente da IL-6 descrita, designa-se por BB9n.

Aplicam-se diluiç&es em série das amostras a testar (de preferência isentas de IL-6 nativa), em triplicado, a placas de microtitulação de fundo chato de 96 orifícios. Adicio-nam-se a cada orifício 5x10^ células B9 em 50 jil de meio de cultura.

Prepara-se uma linha de base de actividade IL-6 adicionando a cada orifício a solução de IL-6 até uma concentração calculada fixa na gama de 1-10 U/ml, de preferência 1 U/ml. Uma forma de XL-6 adequada para este fim é a IL-6 humana preparada com DHA reeombinante (rhIL-6) e comercializada por exemplo pela Brltish Biotechnology,

Após um período de incubação de 72 horas adiciona-se um impulso de 4h de 0.1 jiCi de timidina -t H], Colhem-se então as células e lavam-se no colector celular. Determina-se a quantidade de timidina-[^H] nas células num contador de cintilação líquidaj a incorporação de timidina-[%] nas células depende da actividade de IL-6. Comparam-se as actividades. dos orifícios da placa do teste com a actividade da linha de base. Os resultados exprimem-se como contagens por minuto (CPM) ou como U/ml, comparando-os com uma curva padrão de IL-6 relevante. Calculam-se em triplicado as médias e os desvios padrCes (SD).

Os sobrenadantes com actividade de IL-6i podem subme-ter-se a técnicas de purificação adequadas para o isolamento de componentes com IL-6i individuais ou para a purificação parcial - 8 -

destes. Técnicas adequadas são, p. ex„, cromatografia de permuta anióniea, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de interacção hidrofóbica. Estas técnicas podem usar -se separadamente se for conveniente, mas é mai3 vantajoso usá--las em combinação, de preferência sequencialmente.

De acordo com um protocolo de separação eficiente, os sobrenadantes obtidos a partir de uma cultura celular estimulada concentram-se primeiro por ultrafiltração e misturam-se a seguir com sulfato de amónio até 75% (p/v) de saturação. A ac-tividade de IL-6i permanece no sobrenadante (figura 10). Para remover o sulfato de amónio dializa-se o sobrenadante (contra 10 mM Tris/HCl, pH 7.9) e aplica-se a uma coluna para cromatografia de permuta anióniea* À coluna deve ser de preferência uma coluna DEAE monoQ (p. ex. a coluna 16/100 da firma Pharmacia).

As fracçCes eluem-se a pH 7.9 com um fluxo de 4 ml/ /min. com um tampão de Tris-HCl 10 mH, contendo um gradiente linear de NaCl. Após recolhe das fracçCes, testam-se estas para a IL-6i como indicado acima. Pode detectar-se uma fracçSo com actividade inibitória de IL-6 a 30-100 mM NaCl. Esta fracçâo contém um componente que, de acordo com a cromatografia de exclusão de tamanho, tem um PM (peso molecular) de cerca de 10 KDa.

Após dessalinização, as fracçCes seleccionadas concentram-se por ultrafiltração para obter componentes com propriedades inibitórias de IL-6 úteis para composiçCes farmacêuticas.

Outro método de separação adequado baseia-se na cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC). Uma coluna adequada para HIC é a coluna TSK Butil 650 (E. Merck). Mistura-se uma amostra com sulfato de amónio até uma concentração final de 1 M e aplica-se à coluna de HIC. Para a eluição utiliza-se um gra-diante em passos contendo sulfato de amónio nas concentr&çCes 1 M, 0.5 M, 0.1 Me OMe finalmente uma mistura de etilenogll-col/água (80?í p/v). - 9 -

Um outro mltodo de separação que se pode utilizar para a purificação de amostras brutas com IL-61 é a cromatografia em fase reversa (cromatografia RP). Uma coluna adequada é a coluna BIORAD HI-pore SP 304, utilizando-se água como fase móvel» Para a eluição pode utilizar-se um gradiante de acetonitrilo variando de 0 a 100% de acetonitrilo, com um caudal de 1.2 ml/ /rain. /

Os sobrenadantes ou as fraeçCes activas da eromatogra fia de permuta anióniea podem também purificar-se usando HPLC de filtração de gel (= permeação de gel) com base no peso molecular. 0 sistema de HPLC não tem requisitos especiais. Um sistema adequado é o fornecido pela firma LKB constituído por duas bombas LC 2150, um sistema controlador modelo 2152 e um injec-tor Rheodyne 7010, acoplado a um detector de comprimento de onda variável Uvicon 720 LC (Konfcron, Vósendorf, Áustria).

Os pesos moleculares podem determinar-se pela distribuição numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, usando marcadores de peso molecular padrão.

Um processo típico para a obtenção des factores IL-61 de acordo com a invenção, aplicado nos exemplos que se seguem, compreendem os passos seguintes*

Lavam-se em PBS as células apropriadas para a produção de inibidores de IL-6 (1x10** células/ml)«

Para a estimulação por UV tratam-se as oelulas com uma única exposição a UV de 100-150 J/m2. As células (1x10®) lavam-se duas vezes em RPMI 1640 (Flow Laboratories, McLean, VA), incubam-se em RPMI. 1640 isento de soro a 37°C, numa atmosfera humedecida contendo 5% de 00%. Colhem-se os sobrenadantes 24 horas após a irradiação e, conforme o caso, armazenam-se a -20°C.

Para a estimulação com PMA, desenvolvem-se as células como indicado para a estirpe celular utilizada. Após atingirem a confluência, muda-se o meio de cultura e adiciona-se PMA (10--100 ng/ml, de preferência 50 ng/ml) (Sigma Chem. Corp., St. Louis, Mo). Colhem-se os sobrenadantes 24 horas após a adição 10 -

de PMA e, conforme o caso, armazenam-se a -20°C.

Para a purificação do faetor IL-6i usando separação de tamanhos, submetem-se amostras de 100 jal de sobrenadanfce a cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando HPLC como indicado detalhadamente nos exemplos que se seguem e, conforme o caso, armazenam-se as fraeçCes obtidas a -20°C.

Em alternativa, pode efectuar-se a separação usando cromatografia de permuta iónica DEAE ou cromatografia de inte-racçâo hidrofobica. As fraeçCes concentram-se por ultrafiltra-çSo e, conforme o caso, dessalinizam-se, seguindo-se o teste de IL-6i das amostras como descrito acima. Recolhem-se as fracçCes com activldade IL-6i e, conforme o caso, liofilizam-se. Duzentos litros de líquido de cultura rendem aproximadamente 50 pg de inibidor de IL-6. Dessalinizaram-se as fracçCes por diálise contra PBS e testaram-se no ensaio B9.

Um dos objectivos desta invenção e um faetor com ac-tividade de IL-6i e u» PM de aproximadamente 1G KDa. Este fac-tor caracteriza-se ainda por não inibir a XL-1, a IL-2 ou a IL--4 (ver Figuras 9 e 13).

Um outro tipo de IL-6i é um faetor com aproximadamente 44 KDa.

Os produtos desta invenção podem também obter-se por técnicas de DNA recombinante de acordo com métodos conhecidos do especialista. Veja-se por exemplo: Maniatis et al., Molecular clonlng: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY (1982). 0 inibidor de IL-6 obtém-se cultivando células hospedeiras transformadas contendo o DNA que codifica o gene para o inibidor numa forma expressável. Para este fim o DNA que codifica o IL-6i deve clonar-se num sistema de expressão adequado. Selecciona-se o DNA usando sondas apropriadas para a fti-bridação. As células hospedeiras transformadas que segregam 0 faetor IL-61 identificam-se com anticorpos radioactivos marcados dirigidos contra as proteínas de IL-6i*

Organismos hospedeiros reeombinantes particularmente úteis para a produção em larga escala de uma proteína IL-6i são - 11

Baoillus licheniformis, gluyveromyces laetis e Aspergillus ni-ger. A invenção refere-se também a composições farmacêuticas contendo as composições IL-6i ou partes individuais destas» Podem utilizar-se os sobrenadantes brutos aqui descritos, componentes de IL-6i parcialmente purificados ou componentes de IL-6i puros* Se forem preparadas como sobrenadantes de culturas celulares ou a partir de sobrenadantes de culturas celulares, as composições de IL-6i isolam-se inicialmente como soluções aquosas do princípio aetivo. Após dessalinização e liofilizaçfio obtém-se um pó estável no qual se encontra preservada a acti-vidade inibitória de IL-6* 0 sobrenadante bruto ou uma composição parcialmente purificada pode processar-se posteriormente para remover impurezas associadas à cultura celular ou resultantes do processo de produção. As composições de IL-6i quer na forma de soluções quer de pós, brutos ou purificadas, podem processar-se segundo métodos conhecidos na especialidade farmacêutica, para se obterem composições farmacêuticas úteis para a tratamento de doenças associadas â IL-6, como peoríase, reac-ções alérgicas, estados reumáticos e doenças inflamatórias da pele, dos pulmões ou do tracto gastointestinal e para o tratamento de queimaduras e úlceras»

Preferem-se em particular as preparações adequadas para administração intravenosa, subcutânea, intralesional, oral ou tópica, tais como fluidos injectávels, comprimidos, cremes, unguentos ou loções» Podem também utilizar-se outras formas de dosagem» As técnicas para a formulação de composições de IL-6i encontram-se disponíveis por exemplo em Remingtonts Pharmaceu-tical Sciences (última edição), Mack Publishing Co», Easton, PA» Podem obter-se resultados satisfatórios com uma preparação farmacêutica feita a partir do isolado bruto, mas é preferível utilizar o inibidor de IL-6 purificado (IL-6i).

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção sem a limitarem. - 12

Preparação A

Isolamento de células mononucleares de sangue periférico humano

Cobriram-se cerca de 15 a 20 ml de meio de separação do linfócitos (Flow) com 30 ml de sangue humano e eentrifugou--se a mistura durante 20 minutos a 1800 rpm, A interface (que contem glóbulos brancos) removeu-se cuidadosamente e lavou-se com solução salina equilibrada de Hank* Ressuspendeu-se o pele-tizado celular em RPMI 1640 com 5 a 10% (v/v) de FCS, e ajustou -se a densidade celular a 5x10^ células/ml* Incubaram-se 10 ml de suspensão celular, numa caixa de Petri plástica de 9 cm, durante pelo menos 2 horas a 37°C de modo a permitir ao PBMC aderir. Removeu-se então o sobrenadante e lavaram-se cuidadosamente com RPMI. Colheram-se as células aderentes com um "polícia” de borracha.

Exemplo 1

Preparação de IL-6i usando células mononucleares de sangue pe-riféricas

Mantiveram-se em crescimento PBMC's humanas (células aderentes), preparadas como descrito na preparação A, numa cultura de monocamada usando RPMI 1640 suplementado com 5% (v/v) de FCS. Para subcultivar as células, lavaram-se primeiro estas com PBS (pH 7.4) e trataram-se então a 37°C com 0,05$ (p/v) de tripsina e 0.02$ (p/v) de EDTA em PBS. Colocaram-se alíquotas de 3 ml da suspensão celular (1x10^ células/ml) em caixas de Petri plásticas de 60 mm, seguindo-se uma única exposição UV de 100 J/m^. Otilizaram-se lâmpadas Osram Vitalux emitindo um espectro contínuo entre 300 e 600 nm. A energia emitida foi de 0.2 mJ/cm /seg. a 297 nm medida num radiómetro de Investigação International Light 700.

Em seguida, lavaram-se as células duas vezes em RPMI 1640 (Flow Laboratories, McLean, VA), ressuspenderam-se em 1 ml de RPMI 1640 isento de soro, e incubaram-se a 37°C numa atmos- - 13 -

fora humidificada com 5% de CO2* follieram-se os sobrenadantes 24 horas após irradiação e liofilizaram-se, Submeteram-se amostras (100 pl) a HPLC de filtração de gel usando uma coluna TSK--25 (E. Merck), Para esta separação (baseada no tamanho des produtos contidos nos sobrenadantes) utilizou-se a coluna de exclusão de tamanhos Bio-Sil TSK 125» 300 x 7.5 mm de Bio-RAD, Efectuou-se a eluição com PBS, pH 7*2, a um caudal de 1.0 ml/ /ain. Diluiram-se as fracçôes da coluna (0.5 ml) eom RPMI 1640 contendo 5% de FCS, e filtraram-se depois em condiçães estireis. Calibraram-se as colunas com um padrão de filtração de gel (BI0 -RAD, Richmond, CA) contendo tiroglobulina bovina (670 KDa), gamaglobulina bovina (158 KDa), ovalburaina de galinha (44 KDa), mioglobulina bovina (17 KDa) e cianocobalamina (1.3 KDa)*

Testaram-se as fracçães em relação â actividade de IL-6i, usando o teste descrito acima, após mistura de 1 U/ml de amostra padrão de rhIL-6. Estas actividades indicam-se na Figura 1 . 0 eixo dos XX da figura indica as fracçCes da coluna e o eixo dos ΪΪ a actividade de IL-61 (expressa em contagens por minuto). A linha horizontal mostra a actividade de uma amostra padrão de IL-6 (1 U/ml) antes da mistura eom a amostra a testar. 03 marcadores de peso molecular indicam-se na parte de cima da figura. Os mínimos da curva para as fracçCes 2-6 e 11-13 respec tivamente indicam a presença de inibidores de IL-6 de aproxima-damente 10 KDa e 44 KDa.

Para determinar o efeito de quantidades variáveis de estimulação UV, prepararam-se cinco sobrenadantes com actividade IL-6 i, como descrito acima, mas com quantidades de energia UV crescentes de 0-150 J/m2. Testaram-se estes sobrenadantes no que respeita à actividade de IL-6i, mas sem remoção prévia da IL-6 nativa, nem se adicionou â amostra a testar uma quantidade padrão de IL-6. Diluiram-se os sobrenadantes a 1s300. Veja-se a Figura 2. 0 eixos dos YY da figura mostra as actividades de IL--6 (expressas em contagens por minuto vezes 1000). 0 numero sob cada barra significa a quantidade total de luz UV administrada à amostra em causa, expressa em J/m2. Como se vê, as quantidades . crescentes de luz aumentaram inicialmente a produção da activi-] dade de IL-6, presumivelmente por indução de uma maior produção - 14 -

5e IL-6. Contudo, com um influxo do luz crescente acima de 50 J/m^ a produção de inibidor ou inibidores de IL-6 superou o aumento de IL-6, resultanto numa diminuição efectiva da aetivida-de de IL-6 no sobrenadante de células fortemente irradiadas,

Mas barras indicara-se também os desvides padrães. A figura 3 mostra a cinética da produçSo de IL-6 e do inibidor de IL-6 neste sistema. Trataram-se células PBMC humanas e cultivaram-se como descrito acima. Retiraram-se amostras após 0, 2, 4, 8, 16 e 32 horas. Mo se removeu a IL-6 nativa nem se adicionou uma quantidade padrão de IL-6 antes de se testarem os sobrenadantes em relação à actividade inibitória de IL-6. As actividades de IL-6 das células irradiadas com luz UV de 100 J/m^ indicam-se pelas barras tracejadas correspondentes aos tempos de amostragem? as barras brancas referem-se aos sobrenadantes de células nâo irradiadas recolhidos aos mesmos tempos. As actividades de IL-6 indicam-se em contagens por minuto (vezes 1000)? indicam-se também os desvios padrdes. Quando comparadas com as amostras não estimuladas (barras brancas), os sobrenadantes de células PBMC não tratadas cóm UV (barras tracejadas) demonstram uma actividade de IL-6 significativamente menor. Uma vez que as PBMC*s tratadas com UV produzem actividade de IL-6, conclui-se que a IL-6 indigena foi neutralizada pelo inibidor de IL-6 produzido concomitantemente.

Exemplo 2

Preparação de IL-6i usando células KB

Podem obter-se células KB de carcinoma epidarmóide humano (ATCC CCL17) a partir da «American Type culture Collec-tion1'. Cultivaram-se estas células e estimularam-se com PMA (10 ng/ml) e liofilizaram-se os sobrenadantes e sujeitaram-se a HPLC de filtração de gel (TSK 125), como descrito no exemplo 1. Testaram-se as fracçOes pelo teste B9 na presença de 10 U/ml de rhIL-6, como descrito acima. As suas actividades indicam-se na Figura 4. 0 eixo dos XX da figura representa as fracçdes e o . eixo dos YY as actividades de IL-6 (expressas em contagens por — 15 —

minuto vezes 1000)* A linha horizontal mostra a actividade de imia amostra padrão de IL-6 (10 Ο/ml) antes da mistura com a a-mostra a testar. Os marcadores de peso molecular indicam-se na parte superior. Os mínimos da curva para as fraeçCes 3, 5-7 e 15-19 indicam a presença de inibidores de IL-6, mais uma vez eom pesos moleculares aproximados de 10 KDa e 44 KDa.

Exemplo 3

Preparação de IL-61 usando células KRFM

Desenvolveram-se células KRFM de melanoma humano fornecida pelo Prof* Th* Luger da Universidade de Munique, Alemanha, e, após terem atingido a confluência, substituiu-se o meio por um outro sem FCS. Incubaram-se as células durante 24 horas com PMA (10 ng/ml) e sem PMA. Recolheram-se os sobrena-dantes e submeteram-se a cromatografia de afinidade para IL-6, como descrito acima, de modo que não restasse actividade de IL--6 no eluído* A actividade de IL-6i do eluído testou-se então após mistura com uma amostra padrão de 10 U/ml de rhIL-6. Os resultados apresentam-se na figura 5.

As barras indicam as aetividades de IL-6 em contagens por minuto vezes 1000 e os desvios padrCes. A barra branca mostra a actividade de IL-6 de uma amostra padrão de rhIL-6 (10 U/ /ml)* 0 sobrenadante preparado com estimulação por PMA (barra quadriculada) mostra muito menor actividade de IL-6, aparentemente devido â produção de uma substância fortemente inibitória de IL-6. Nos sobrenadantes preparados sem estimulação por PMA (barra tracejada) o eluído não apresentou significativa inibição da actividade de IL-6 comparada com a da amostra padrão.

Exemplo 4

Preparação de IL-6i usando ovulas A431

As células A431 de carcinoma epidermoide humano . (ATCC CRL1555) são uma estirpe celular de rápido crescimento - 16 -

Fornecida pela American Type Cultur-s Colleotiontt. As células cultivarara-se era raeio de cultura padrão. Na confluência removeu -se o raeio de cultura e substituiu-se por um meio com estimulação contendos DMEM/F12 (1s1), 20 mM glutamina, antibióticos (p, ex. 100 U/ral de penicilina, 100 pg/ral de estreptomicina e 0.5 |ig/ml de fungizona), 10 mM MEPES e, como estimulantes, 200 nM inomioina e 50 ng/ml de PMA.

Após 36 horas de estimulação recolheram-se os sobre-nadantes. Adicionou-se ura inibidor de protease, tal como 100 mM PMSF (fluoreto de fenilraetilsulfonilo), e centrifugou-se o meio condicionado a 2000 g durante 15 a 20 minutos.

Concentrou-se o sobrenadante clarificado imediatamente, usando uma unidade de ultrafiltração com exclusão de 3 KDa. Efeetuou-se convenientemente a concentração por ultrafiltração usando uma célula com agitação "Amicon" equipada com um filtro YM5. Efectuou-se a purificação do retido por meio de precipitação com sulfato de amónio (ver fig. 10), cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração de gel e teste das frae çães pelo método B9, como descrito acima.

Exemplo 5

Preparação de IL-61 usando células A431

Incubaram-se células de carcinoma epidermoide humano (A431) com uma mistura de hIL-1 (1 U/ml) e rhIL-6 (100 U/ml) durante 36 horas. Dializarara-se os sobrenadantes contra água, Liofilizaram-se os dializados para futura concentração e subme-teram-se a cromatografia de permuta iónica DEAE como descrito acima. Dializaram-se as fracçCes contra água, reconstituiram-se usando 10 x RPMI 1640 e testaram-se a seguir pelo bioteste B9 em relação a IL-6i como descrito acima. Na figura 6 mostram-se as actividades das fracçães da coluna. 0 eixo dos XX da figura mostra os números das frae-çães e o eixo dos YY as actividades de IL-6 expressas em contagens por minuto. A linha ponteada indica o gradiente de NaCl - 17

variando de 0 a 500 mH IJaOl, A liníia tracejada representa a ac-tividade de uma amostra padrão de IL-6 (1 ϋ/ml) antes da mistura com a amostra a testar. Os dois mínimos da linha a cheio, correspondentes âs fracçCes 6-10 e 22-24, respeotivamente, referem- se às substâncias inibidoras de IL-6.

Exemplo 6

Preparação de IL-61 usando células A431

Cultivaram-se e estimularam-se células de carcinoma epidermoide humano (A431) como descrito no exemplo 4. Concen-trou-se o sobrenadante e dializou-se (contra 10 mM Tris/HCl, pH 7*0). Adicionou-se sulfato de amónio até uma concentração final de 1 M. Após centrifugação da suspensão aplicou-se o sobrenadante límpido a uma coluna para cromatografia de interac-çâo hidrofóbica (TSK Butil 650, E. Merck). Efectuou-se a elui-çâo usando primeiro um gradiente passo a passo de sulfato de amónio, seguido por Tris/HCl e etilenoglicol:

Fracção 1 : sulfato de amónio 1.0 M

fracção 2 * sulfato de amónio 0,5 M

fracção 3 t sulfato de amónio 0.1 M fracção 4 ϊ 10 mM Tris/HCl (pH 7.8) fracção 5 s etilenoglicol/água (80/20, v/v).

Os resultados apresentam-se na figura 7 em que o eixo dos YY da esquerda dá a densidade optica a 280 nm das fracçCes e o eixo dos YY da direita a concentração de sulfato de amório em M.

Após diálise contra RPMI 1640 testou-se a actividade de lL-6i usando o teste E9 acima descrito (Figura 6). Cada uma das fraeçCes 1 a 5 é representada por uma linha. 0 eixo dos YY dá a actividade de IL-6 em contagens por minuto. A linha de referência horizontal representa a actividade de uma amostra padrão de IL-6 (1 U/ml) antes da mistura com a amostra a testar. A fracção 3 continha claramente mais actividade de IL-6i, seguida pela fracção 4. Efectuou-se o teste para quatro diluiçOes - 18

diferentes das cinco fracções.

Testaram-se também as mesmas fracções (ver exemplo 8> em relação à inibição da actividade de IL-1, expressa pela inibição da proliferação do crescimento de timocitos dependentes da IL-1 (Figura 9) e em relação à inibição da actividade de IL--2 e IL-^i (ver Figura 13). Na figura 9 o eixo dos YY dá a actividade de IL-1 em contagens por minuto. 0 eixo dos YY da direita dá a concentração de NaCl. 0 eixo dos XX dá os números das fracções. A linha de referência horizontal representa a actividade teórica de uma amostra padrão de IL-1 adicionada contendo 1 U/ml. É claro que nenhuma das fracções apresentava qualquer actividade inibitória sobre a substância padrão IL-1 adicionada. Efectuou-se o teste para seis diluições diferentes das cinco fracções* Não se deteetou qualquer inibição da actividade de IL-1.

Dializou-se a fracção 3 contra Tris/HCl (10 mM, pH 7.8) e aplicou-se a uma coluna de permuta iónica para cromato-grafia de FPLC. Efectuou-se a eluição usando Tris/HCl (10 mM, pH 7.9), contendo um gradiante linear de cloreto de sódio (10--500 mM). 0 factor IL-6i eluiu nas fracções contendo 30-60 mM cloreto de sódio (Figura 11). 0 eixo dos YY da esquerda dá a actividade de IL-6 em contagens por minuto* A linha de referência horizontal I a actividade de uma amostra padrão de IL-6 (1 U/ml) antes da mistura com a amostra a testar.

Misturaram-se as fracções da permuta iónica que apresentavam actividade de IL-6i, concentraram-se por diálise contra polietilenoglicol 8000 e aplicaram-se a uma coluna TSK 2000 de 60 cm (LKB) para cromatografla de HPLC de filtração de gel usando PBS como eluente. A actividade de IL-6i estava associada às fracções correspondentes a cerca de 10 KDa e 80 KDa respec-tivamente (Figura 12), de acordo com os marcadores de peso molecular A e B* 0 eixos dos YY dá a actividade de IL-6 em contagens por minuto* A linha de referencia h.vizontal representa a actividade de uma amostra padrão de IL-6 (1 U/ml) antes da mistura com a amostra a testar. A referida actividade de IL-6i en-. controu-se não apenas a cerca de 10 KDa mas também a 80 KDa. *» 1Ç a» iveimente pela formaçSo de H-ste fenómeno pode explicar-se po, m agregado do faotor IL-6i mais leve.

Exemplo 7

PreparapSo de IL-6i usando células epiteliais da próstata

Obtiveram-se células epiteliais da próstata PC3 fornecidas pela "American Type Culture Collection" (ATCC CRL 1435)· Cultivaram-se e estimularam-se as células e recolheram-se os sobrenadantes e testaram-se como descrito no exemplo 4 para as células A431. A Figura 14 mostra a actividade de IL-6i destes sobrenadantes, preparados com PMA (barra da direita) e sem PMA (barra da esquerda). Quatro pares de barras representam quatro diluiçCes (1:4, 1:8, 1s16» 1:32) dos sobrenadantes* As células estimuladas com PMA produziram claramente IL-6i.

Exemplo 8

Teste de inibição de IL-t, IL-2 e IL-4

Geral

Dilulram-se as amostras a testar a 1:1 com RPMI 1640 suplementado. Em alternativa, podem dializar-se as amostras contra água e reconstituir-se com 10 x RPMI 1640. Após filtra-çSo em condiçCes estéreis podem armazenar-se opcionalmente as amostras a -20°C.

Inibiqgo da interleucina 1

Suspenderam-se timocitos de ratos C3H HeJ de 6-8 semanas (fornecidos por IFA CREDO) em 15 ml de RPMI 1640, suplementado com 5J5 de FCS inactivado térmica ^nte, 20 mM glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 jig/ml de estreptomicina, 10 mM HEPES, 10 mM piruvato de sódio e 0,05 mH 2-mercaptoetanol, até permanecer apenas tecido conjuntivo. Filtrou-se a suspensão de - 20 -

or-jitrifugou-se a 1200 rpm (36 cn de diâmetro do rotor) durante 8 minutos. Repetiu-se a lavagem por duas vezes e ajustou-se a concentração de timóeitos a 3.10^/ml.

Traçou-se uma curva padrão, usando várias diluiçOes 3 um padrão de IL-t (3 U/ml, fornecido pela firma FLOW) prepara do como descrito acima. Ineluiram-se amostras de controle. Adicionaram-se a cada orifício (exeepto aos orifícios de controle) 50 pl de uma solução de concanavalina A (2.2 pg/mlt fornecida pela firma Pharmacia). Adicionou-se a todos os orifícios IL-1 humana até â concentração de 0.05 U/orifício.

Adicionaram-se depois 50 pl da suspensSo de timóeitos acima descrita a cada orifício. Após 67 horas adicionou-se 0.1 pCi de timidina tritiada em 50 pl de meio RPMI 16*10. Determi-nou-se a radioactividade incorporada num contador de cintilação líquida. Exprimiram-se os resultados como a média das experiências em triplicado.

Inibição de IL-2 e IL-4

Jl „

Cultivou-se uma suspensSo de 100 pl de 1 x 10 células CTLL·, obtidas a partir da ''American Type Culture Collection* (ATCC TIB214), em meio RPMI 1640 com 5$ de FCS, 20 mM glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de esterptomicina, 10 mM HEPES, 10 mM piruvato de sódio e 0,05 mM 2-mercaptoetanol. Adicionou-se a cada orifício 100 pl da amostra a testar. Após 2 dias determinou-se a proliferação das células CTLL medindo a incorporação de %-timidina, como descrito para o teste da IL-1·

Para a determinação da actividade inibitória de IL-2 adicionou-se a eada orifício 0.05 U de IL-2 humana.

Para a determinação da actividade de IL-4 adicionou--se a cada orifício 0.05 0 de IL-4 de rato recombinante. A figura 13 mostra a actividade inibitória de um so-brenadante purificado quando testado num teste de IL-6, IL-2, IL-4 e IL-1. Apenas a actividade exógena de IL-6 foi reduzida pelas amostras. As actividades exógenas de IL-1, IL-2 e IL-4 não foram afectadas. - 21

Purificação de um sobrenadante contendo IL-6i

Cultivaram-se e estimularam-se células de carcinoma epidermoide humano (A4B1), como descrito no exemplo 4» Concentrou-se o sobrenadante e dialisou-se (contra 10 mM Tris/HCl, pH 8.9).

Aplicou-se este material a uma coluna MonoQ AEX e eluiu-se usando um gradiante linear de NaCl variando de 0 a 100 mM durante os primeiros 30 minutos. Aumentou-se a concentração de NaCl durante o minuto 33 ao minuto 38 até atingir uma concentração final de 1000 mM, manteve-se essa concentração durante 10 minutos e finalmente diminuiu-se até 0 mM durante os últimos 5 minutos. A actividade inibitória de IL-6 eluiu como um único pico a uma concentração de NaCl de 80-90 mM (Figura 15)*

Misturaram-se as fracçdes activas 30 e 31 e separa-ram-se posteriormente por cromatografia de fase reversa (RP18), usando água como fase móvel. Usou-se um gradiante linear de acetonitrilo variando de 0 a 1005(. 0 inibidor de IL-6 eluiu como um único pico de actividade na concentração de acetonitrilo de 50 a 6056. (Figura 16).

Misturaram-se as fraeçdes de RP18 22, 23 e 24, contendo cerca de 150 pg de IL-6i, e separaram-se posteriormente por cromatografia de permeaçãc* de gel (GPC). A actividade inibitória de IL-6 eluiu em dois picos distintos de actividade inibitória, demonstrando actividade a pesos moleculares de cerca de 44 e 10 KDa (Figura 17). - 22 -

Claims

REIVINDICAÇÕES - ta - Processo para a preparação de uma composição inibidora da interleucina-6, oaracterizado por se executarem sucessivamente os seguintes passoss - tratamento de uma cultura de células PBMC aderentes humanas, de células de carcinoma epidermoide, de células de melanoma ou de células epiteliais da próstata, cora luz ultravioleta (UV) e/ou com acetato miristato de forbol e/ou com uma mistura de IL-1 e IL-6, - recolha da camada sobrenadante da cultura celular, - separação dos componentes da camada sobrenadante em frac-çCes. - 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-raeterizado por a separação referida se efectuar por permuta iónica ou por cromatografia de interaeçâo hidrofóbiea. - 3« - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por a separação referida se basear no tamanho molecular. - Afi - Processo para a preparação de uma composição com actividade inibidora de interleucina-6 (IL-61), de acordo com a reivindicação 1, oaracterizado por a referida composição ser uma camada sobrenadante de cultura celular parcialmente purificada, com actividade IL-6i, de células de mamíferos, esti-j muladas para a produção de IL-6i, ou um componente dela com ac— • tividade IL-61· 23 -

- 53 - Processo de acordo com a reivindicação 4, ea-racterizado por a referida actividade IL-6i estar associada com uma proteína que* - tenha um peso molecular, determinado numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, de aproximadamente 10 KDa, e - não tenha actividade inibidora interleucina-1, tnterleuci-na-2 ou interleucina-4, e - não precipite numa solução de sulfato de amónio saturado a 75%. _ - 6i - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a actividade IL-6i referida estar associada com uma proteína que tenha um peso molecular, determinado numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, de aproximadamente 44 KDa* - 7a - Processo para a preparação de um factor IL-6i, caracterizado por se efeetuarem os seguintes passos sucessivos* - tratamento de uma cultura de células PBMC aderentes humanas, de células de carcinoma epidermoide, de células de melanoma ou de células epiteliais da próstata, com luz UV e/ou com acetato miristato de forbol e/ou com uma mistura de IL-1 e IL-6, - separação da camada sobrenadante de cultura celular em fraeçOes - teste das fracçCes em relação â actividade IL-6i, - recolha de pelo menos uma fracçãc corn actividade IL-61, e opcionalmente, - 24 -

- concentração e/ou posterior purificaçSo dessa fracçâo. - 8* - Processo de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizado por a separação referida se efectuar por cromato-grafia de permuta iónica, por cromatografia era fase reversa, ou por cromatografia de interaoçâo hidrofóbica. - 9ã - Processo de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizado por a referida separação se basear no tamanho molecular. - 10* - Processo de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizado por o faetor IL-6i purificado ter um peso molecular de aproximadamente 10 KDa* - 11* -

Processo de acordo com a reivindicação 7f ca-racterizado por o faetor IL-6i purificado ter um peso molecular de aproximadamente 44 KDa. - 12* - Processo para a preparação de um faetor numa forma purificada e isolada, com actividade inibidora de inter-leueina-6, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser uma proteína, ter um peso molecular, determinado numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, de aproximadamente 10 KDa, e por não ter actividade inibidora de IL-1, IL-2 ou IL-4. 25 -

- 13« - Processo para a preparação de um factor numa forma purificada e isolada, com actividade inibidora de inter-leucina-6, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser uma proteína e ter um peso molecular, determinado numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, de aproximada-mente 44 KDa. - 14a - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para o controle ou tratamento da psoriase, reae-ções alérgicas, estados reumáticos ou doenças inflamatórias da pele ou dos pulmões, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade efectiva de uma composição com actividade inibidora de interleueina-6 (IL-6i), quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, com um ou mais exoipientes farmacologicamente assimiláveis, diluentes e/ou adjuvantes. - 15« - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a composição de IL-6i ser uma proteína com um peso molecular, determinado numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, de aproximadamente 10 KDa* - 16« - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a composição de IL-6i ser uma proteína com um peso molecular, determinado numa coluna de filtração de gel de exclusão de tamanho, de aproximadamente 44 KDa. A requerente reivindica as prioridades dos - 26 - pedidos de patente europeia apresentados em 23 de Março de 1990 e em 8 de Outubro de 1990, sob os NSs. 90200696.4 e 90202674.9, respectivamente * Lisboa, 22 de Março de 1991

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