JPH09107970A

JPH09107970A - Ｃ型肝炎ウイルス由来核酸、該核酸を用いたウイルスの検出方法

Info

Publication number: JPH09107970A
Application number: JP7268700A
Authority: JP
Inventors: Torahiko Tanaka; 寅彦田中; Noriyuki Kato; 宣之加藤; Kunitada Shimotoono; 邦忠下遠野
Original assignee: KOKURITSU GAN CENTER SOUCHIYOU; SOYAKU GIJUTSU KENKYUSHO KK
Current assignee: KOKURITSU GAN CENTER SOUCHIYOU; SOYAKU GIJUTSU KENKYUSHO KK
Priority date: 1995-10-17
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 1997-04-28
Also published as: US5837463A

Abstract

(57)【要約】【課題】ＨＣＶゲノムの３’末端部分の配列を明らか
にし、新規なＨＣＶの検出方法等を提供することを課題
とする。【解決手段】ＨＣＶゲノムの３’末端部分の高度に保
存されている新規な配列を見い出した。該配列を利用し
て、新規なＨＣＶの検出方法、ＨＣＶの増殖阻害方法等
が提供された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
（以下「ＨＣＶ」と略称する）の検出、治療等に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ＨＣＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスであ
り、ヒト肝臓内で増殖する。肝炎に占めるＣ型肝炎の割
合は高く、ＨＣＶは、肝炎の治療、予防等の観点から非
常に重要なウイルスである。しかし、患者血清中のウイ
ルス濃度が低いなどの理由で、ＨＣＶに関連する知見
は、他の主要なウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス等）
に比して乏しいと言わざるを得ない。

【０００３】特に、適当なin vitro実験系が存在しない
ため、阻害剤の開発等に有用であるＨＣＶゲノムやＨＣ
Ｖ粒子の複製メカニズムはほとんど明らかにされていな
い。また従来ＨＣＶゲノムに関しては、様々なサブタイ
プに関して様々な報告がなされている。（［I/1a型］J.
H.Han et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,1711-1715,1
991／G.Inchauspe et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,
10292-10296,1991／H.Okamoto et al.,Nucleic Acids R
es.20,6410,1992［II/1b型］N.Kato et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 87,9524-9528,1990／T.Tanaka et al.,Vi
rus Res.23,39-53,1992／A.Takamizawa et al.,J.Viro
l.65,1105-1113,1991／H.Okamoto et al.,Virology 19
0,894-899,1992／P.J.Chen et al.,Virology 188,102-1
13,1992／M.Honda et al.,Gene 120,317-318,1992／N.H
ayashi et al.,J.Hepatol.17(suppl3),S94-107,1993／
Y.Wang et al.,J.Med.Virol.40,254-260,1993［III/2a
型］H.Okamoto et al.,J.Gen.Virol.72,2697-2704,1991
［IV/2b型］H.Okamoto et al.,Virology 188,331-341,1
992［V/3a型］N.Yamada et al.,J.Gen.Virol.75,3279-3
284,1994／M.Sakamoto et al.,J.Gen.Virol.75,1761-17
68,1994［VI/3b型］K.Chayama et al.,J.Gen.Virol.75,
3623-3628,1994［1c型］H.Okamoto et al.,J.Gen.Viro
l.75,629-635,1994）しかし、ゲノムの複製の開始点に
あたると考えられているゲノム３’末端の配列に関して
は、複製に最も重要な働きを持っていると考えられる領
域であるにもかかわらず、確定した知見が得られていな
いのが現状である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＨＣＶゲノ
ムの３’末端部分の配列を明らかにし、新規なＨＣＶの
検出方法等を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まずＨＣ
Ｖゲノムの３’末端部分の配列を確定するため、ＨＣＶ
ゲノムRNAの３’末端を保護した状態で逆転写反応を行
い、ＨＣＶゲノム３’末端領域RNAに対応するcDNAのク
ローニングを行った。すると、従来はＨＣＶゲノムの
３’末端はＵクラスターで終わるとするのが定説であっ
たが、驚いたことに、該Ｕクラスターの下流にさらに別
な配列（以下「配列３'Ｘ」と称する）が存在すること
を新規に見いだし本発明を完成した。そして、臨床検体
の解析により、該「配列３'Ｘ」はＨＣＶに特異的なも
のであること、II/1b型（旧日本型）だけでなく他のＨ
ＣＶの型（III/2a型、世界中に分布するが、日本で２番
目に多く検出される型。現在知られているＨＣＶ型の中
でII/1b型と最も遺伝的に遠い位置にある。）にも存在
すること、各クローン間で高度に保存されていること等
を見い出し、「配列３'Ｘ」がＨＣＶの検出、増殖抑制
等に大いに有用な配列であるこを確認した。

【０００６】具体的には、本発明は、「配列番号：２」
の配列または該配列に相補的な配列の全部または一部分
に特異的にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ、更に該一
本鎖ＤＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＤＮＡに関す
る。また、本発明は、「配列番号：４」の配列または該
配列に相補的な配列の全部または一部分に特異的にハイ
ブリダイズする一本鎖ＤＮＡ、更に該一本鎖ＤＮＡとそ
の相補鎖とからなる二本鎖ＤＮＡに関する。また本発明
は、上記一本鎖ＤＮＡからなるプライマーまたは該プラ
イマーを含むＣ型肝炎ウイルスを検出するためのキッ
ト、更には、該プライマーを用いて検体に対してＰＣＲ
を行う工程を含むＣ型肝炎ウイルスの検出方法に関す
る。更に本発明は、上記一本鎖ＤＮＡからなるＣ型肝炎
増殖阻害剤に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】検体中の「配列３'Ｘ」を有する
核酸の存在の有無を検査することによって、検体中のＨ
ＣＶの存在の有無を確認することが可能である。特に
「配列３'Ｘ」は、変異が多いＨＣＶにおいては例外的
に高度に保存された配列であるので、「配列３'Ｘ」を
利用した検査は信頼性が高いと考えられる。

【０００８】検体中の「配列３'Ｘ」を有する核酸の有
無を検査する方法としては、検体中の「配列３'Ｘ」を
有する核酸と「配列３'Ｘ」に特異的にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドプローブとの結合を観察する方
法、「配列３'Ｘ」に特異的にハイブリダイズするプラ
イマーを用いてＰＣＲ法による「配列３'Ｘ」の増幅を
観察する方法等が挙げられるが、利便性、感度等を考慮
するとＰＣＲ法が好適であると考えられる。

【０００９】ＨＣＶウイルス遺伝子はＲＮＡであるの
で、ＰＣＲに先だってＲＮＡを逆転写反応によってＤＮ
Ａに変換する必要がある。従って、ＲＴ−ＰＣＲ法が用
いられる。プライマーは、「配列３'Ｘ」に特異的にハ
イブリダイズするものであればいかなるものでもよい
が、「配列３'Ｘ」と高度に相同であり、２０残基前後
の長さを有するものが好適に用いられる。また、各クロ
ーン間の変異（例えば図３または図４に示されている）
の存在しない領域を用いるのが好ましい。また、一般的
にＲＮＡウイルスゲノムの３’末端近傍は特異的な二次
構造を形成し、ウイルスの増殖開始に必須の領域と考え
られるため（Jacobson.S.J.,et.al.,J.Virol.67,2961,
(1993)）、ＨＣＶの「配列３'Ｘ」も同様にウイルスの
増殖開始に必須の領域であると考えられる。従って検体
中に「配列３'Ｘ」が存在すると検体中のＨＣＶが活発
な複製能を有する可能性が高いといえ、「配列３'Ｘ」
の存在が肝炎進行の指標となり、肝炎の悪化の早期診断
等に利用できる可能性がある。

【００１０】また、「配列３'Ｘ」がウイルスの増殖に
必須の領域と考えられることから、ＨＣＶの「配列３'
Ｘ」部分の機能を阻害することによって、ＨＣＶの増殖
を効果的に阻害することができると考えられる。具体的
には、「配列３'Ｘ」に対するアンチセンスオリゴマー
がＨＣＶの増殖抑制に効果的であると考えられる。該ア
ンチセンスオリゴマーは「配列３'Ｘ」に特異的にハイ
ブリダイズするものであればいかなるものでもよいが、
「配列３'Ｘ」と高度に相同であり、１５〜２０の長さ
を有するものが好適に用いられる。また、ＨＣＶの増殖
の抑制に用いられるアンチセンスオリゴマーは、生体内
での分解を防止するために化学修飾することもできる。
化学修飾の具体的な方法としては、ホスホジエステル結
合を形成するリン酸基をメチル基に置換する方法（Smit
h C., et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,2787(198
6)）等あるいは、リン酸基のＯ原子をＳ原子におきかえ
たもの（Matsukura M.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
84,7706(1987)）が挙げられる。更に、「配列３'Ｘ」を
特異的に切断するリボザイム、「配列３'Ｘ」とＨＣＶ
タンパクとの結合阻害剤なども、「配列３'Ｘ」の機能
を阻害するものとして有効と考えられる。該「配列３'
Ｘ」結合性のＨＣＶタンパクの候補としては、ＮＳ５Ｂ
（ＲＮＡ複製酵素）、ＮＳ３（ＲＮＡヘリカーゼ）など
が挙げられる。

【００１１】更に、ＨＣＶの阻害剤の開発等において
は、ウイルスのライフサイクルを明らかにすることが重
要である。この時、細胞（あるいは無細胞系）にＨＣＶ
ゲノムを投与してＨＣＶが複製されるような実験系が確
立されればＨＣＶの複製メカニズムの多くが明らかにさ
れると思われるが、現在のところ実験系を確立する試み
は成功していない。その大きな原因は、従来は複製に必
須であると考えられる「配列３'Ｘ」を欠くＨＣＶコン
ストラクトを全長ゲノムと信じて実験を行っていたこと
にあると考えられる。従って複製に重要な役割を果たす
と考えられる「配列３'Ｘ」を含む全長ゲノムは、複製
系の開発、確立に大いに有用であると考えられる。具体
的には「配列３'Ｘ」を含むＨＣＶゲノムの全配列を細
胞に導入しマイナス鎖の合成を検出する系、あるいは
「配列３'Ｘ」の上流に逆向きのレポーター遺伝子を接
続しマイナス鎖が合成されるとレポーター遺伝子の活性
が観察できるような系を構築することが考えられる。

【００１２】

【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明は、これらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００１３】［実施例１］肝細胞からのHCV RNAゲノ
ムを含むRNAの抽出肝癌手術摘出標品の非癌部（約0．5g）よりRNA抽出キッ
ト（RNAzolB／登録商標、BiotecxLaboratories社製）を
用いて全RNA画分を回収した。回収されたRNAをマイクロ
チューブに分注して、個々にエタノール沈殿を行った。
その後、その沈渣を75％エタノールに懸濁して、−70℃
において保存した。なお、用いたＨＣＶは日本で最も多
く観察されるII/1b型である。

【００１４】［実施例２］ RNAの3’末端修飾回収したＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する逆転写PC
R（以降、RT-PCRという）法では、本来鋳型であるＲＮ
Ａをプライマーとして合成が行われるセルフプライミン
グ反応等の非特異的反応が起こることがある。このよう
な反応を阻害するために、ＰＣＲ反応において鋳型RNA
にポリメラーゼが作用しないようその3'末端を修飾し
た。この3'末端修飾は、郡司ら（Arch. Virol.,1994.,1
34; 293-302）の方法に従い、次の方法により行った。

【００１５】「実施例１」のRNA（約20μg／180μl）
を、80℃、10分間加熱後、氷上にて冷やし変性させた。
次に、0．5M酢酸ナトリウム（pH5．0）を20μl、さらに
20mM NaI0₄を50μl加え、暗中、30℃、12時間インキュ
ベートした。この反応溶液に10％エチレングリコールを
60μl加えた後、RNAをエタノール沈殿させた。沈渣であ
るRNAを300μlの水に溶解させた。次いで、0.05N NaOH
に溶解した0．1M NaBH₄を100μl加え、暗中、0℃、1時
間反応させ、この反応溶液に2倍希釈酢酸を30μl加えた
後、RNAをエタノール沈殿させた。

【００１６】［実施例３］逆転写反応によるcDNAの合
成（逆転写反応）図１のに示すように、逆転写反応によりRNAからcDNA
を合成させた。この逆転写反応は次の通り行った。

【００１７】以下の組成の反応液を含む反応チューブを
5本準備した。「5倍濃度1st strand緩衝液」4.0μl、dN
TP（各2．5mM）4.0μl、0．1M DTT 1.0μl、「プライマ
ー１」（10μM）2.0μl、上記RNA（1μg／μl）1.5μl
及び水6.5μl。ここで、「5倍濃度1st strand 緩衝液」
（GIBCO BRL社）は、250mM Tris-HCl(pH8.3)、375mMKCl
及び15mM MgCl₂の組成である。また、上記「プライマー
１」は、HCV−JTの塩基（Tanaka et al., Virus.Res.,2
3,39-53(1994)）において9325-9344塩基に対応する配列
5'−TACTCCTACTCTCTGTAGGG−3'（配列番号：５）を有
している。

【００１８】上記の反応チューブを90℃3分間加熱し、
その後氷水中で急冷させて、RNAを変性させた。次い
で、逆転写酵素（SuperscriptII，GIBC0 BRL社）を各
チューブに1μl加え、６5℃において60分間、cDNAの合
成反応を行わせた。

【００１９】各チューブの反応液に6N NaOHを1.4μl加
え、65℃30分間加熱してRNAを加水分解し、その後、こ
れら５本の反応液を1本に回収し、6N酢酸を7．0μl加え
中和した。さらに6N酢酸を2.0μl追加してpHを5とした
後、エタノール沈殿した。沈渣のcDNAを25mM Tris-HCl
(pH7．4)に溶解し、DNA精製キット「GENOBIND（CL0NTEC
H社）」を用いて精製した。得られたcDNAをエタノール
沈殿後、その沈渣を8μlの水に溶解した。

【００２０】［実施例４］アンカーＰＣＲ法（dCテー
リング）図１のに示すように、上記において合成されたcDNAの
3'末端にポリＣテールを付加した。付加反応は以下の通
り行なった。

【００２１】dCテーリング反応液は次の組成とした。
「5倍濃度TdT緩衝液」6.0μl、2．5mMdCTP 6.0μl、実
施例２で得たcDNA 4.0μl、0．1M DTT 0.3μl及び水11.
7μl。ここで「5倍濃度TdT緩衝液」とは、0．5M カコジ
ル酸ナトリウム（pH7．0）、10mM MnCl₂及び0.5mM DTT
の組成よりなる。この反応液をチューブに入れ、98℃3
分間加熱後氷上において冷やし、cDNAを変性させた後、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（東洋紡社製）2.0μlを加え、37℃1時間反応させて、
ポリＣテールを付加させた。

【００２２】反応液をフェノール／クロロホルム処理
し、次いでエタノール沈殿を2回（沈殿の補助塩として1
回目は酢酸アンモニウム、2回目は酢酸ナトリウムを用
いた）行い、その沈渣のポリＣテールが付加したcDNAを
水8μlに溶解した。

【００２３】［実施例５］アンカーＰＣＲ法（増幅反
応）アンカーＰＣＲ法は、図１のに模式的に示すように、
ＰＣＲプライマーに鋳型配列とは異なる適当な配列を持
たせてＰＣＲ反応を行なうものである。ここでは、上記
ＨＣＶcDNAの3'末端に付加されたポリＣテールよりも、
より3'末端にアンカーを付加させた。このアンカーは、
合成される相補鎖においてポリＣテールに相補的なポリ
Ｇよりも5'側に位置する、制限酵素の認識配列を含む配
列とした。

【００２４】１）第１段階ＰＣＲ次の反応液をマイクロチューブに調製した。「10倍濃度
緩衝液」 2.0μl、dNTP（各2．5mM）1.6μl、「プライ
マー２」（10μM）1.6μl、「プライマー３」（10μM）
1.6μl、dCテール付加cDNA 4.0μl及び水 8.9μl。なお
ここで、「プライマー２」は、HCV−JTの塩基9348-9367
／5'−GGCATCTACCTGCTCCCCAA−3'（配列番号：６）に対
応し、「プライマー３」は、ポリＣテールと相補するポ
リＧ配列とXhoIの認識配列（CTCGAG）を含む5'-TGCTGTC
GACTACTCGAGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3'（配列番号：７）
である。また、「10倍濃度緩衝液」の組成は、0.7M Tri
s‐HCl (pH8.8)、0.3M KCl、0.1M硫酸アンモニウム、20
mM MgCl₂、10mMDTT、1mg／ml牛血清アルブミン及び1．0
％トライトンＸ-100（Triton X-100）である。

【００２５】この反応液にミネラルオイルを１滴加えて
重層し、98℃2分間加熱後82℃に保持し、そこにTaqポリ
メラーゼ（Angewandte Gentechnologie Systeme GmbH
社）0.3μlを加えた。その後、93℃40秒、55℃45秒、72
℃2分のサイクルを34回操返すことでPCR反応を行った。

【００２６】２）第２段階ＰＣＲ次の反応液をマイクロチューブに調製した。「10倍濃度
緩衝液」5.0μl、dNTP（各2．5mM）4.0μl、「プライマ
ー４」（l0μM）4.0μl、「プライマー５」（10μM）4.
0μl、上記の第１ＰＣＲ反応液2.5μl及び水29.8μl。
ここで「プライマー４」は、HCV−JTの塩基9363-9382に
対応し、さらにXhoI認識配列を付加させ、5'-GCGTAATCT
CGAGCCCAACCGGTGAACCGGGAG-3’（配列番号：８）の配列
を有する。「プライマー５」は「プライマー３」の5'側
20残基と同ー配列であり、5'-TGCTGTCGACTACTCGAGCA‐
3'（配列番号：９）を有する。また「10倍濃度緩衝液」
は、上記第１段階ＰＣＲ反応と同一の組成である。

【００２７】この反応液にミネラルオイルを2滴加え重
層し、98℃2分間加熱後、82℃に保持して、Taqポリメラ
ーゼ（Angewandte Gentechnologie Systeme GmbH社製）
0．7μlを加えた。その後、上記第１段階ＰＣＲと同様
の反応サイクルによりPCR反応を行わせた。反応産物を
フェノール/クロロホルム処理後、エタノール沈殿を行
い、その沈渣を水10μlに溶解した。

【００２８】［実施例６］サブクローニング上記第２段階PCR反応に使用したプライマーは共に制限
酵素XhoIの認識配列を含んでいるため、上記第２段階Ｐ
ＣＲ反応による目的の産物には両側に２ヶ所のXhoIの認
識配列が合成されることになる。そのため、これらをXh
oIで消化した場合、両端にXhoIの切断末端を有した断片
が生じ、このうち一方の末端はＨＣＶの3'末端よりも外
側に切断末端が位置する。この断片を、同様にXhoIによ
り消化したベクターに組み込むことによって、ＨＣＶの
3'末端をクローニングした。

【００２９】制限酵素XhoIによる消化は、上記第２段階
ＰＣＲ産物40μlを37℃2時間反応させて行なった。消化
後、反応液をフェノール/クロロホルム処理し、エタノ
ール沈殿を行った。その後、XhoI消化DNAをアガロース
電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色によりDNA
断片の大きさを確認して、約100塩基対以上の大きさを
持つDNAをDEAEセルロース紙に吸着させた。DNAが吸着し
たセルロース紙を溶出緩衝液［1M NaCl、0．lmM EDTA、
Tris-HCl(pH8．0)］中で、65℃20分加温して、溶出さ
せ、このDNA溶出液をフェノール/クロロホルム処理し、
エタノール沈殿した。沈渣を水10μlに溶解させ、XhoI
断片を回収した。

【００３０】アンピシリン耐性遺伝子を保持したベクタ
ーであるBluescriptKS+（東洋紡社製）をXhoI消化し、
アルカリフォスファターゼ（仔牛小腸由来）処理により
脱リン酸化し、XhoI消化ベクターを作成した。このXhoI
消化ベクターと上記XhoI断片回収溶液とを混合し、ライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて16℃1時間反
応させて、ＰＣＲ断片をベクターに挿入した。この反応
液を用いて大腸菌コンピテントセルJM109（宝酒造社
製）を形質転換し、この菌液をアンピシリンプレート上
に塗布した。

【００３１】［実施例７］スクリーニング先ず、コロニーハイブリダイゼーションによりHCV−JT
の断片が挿入されたクローンを選択した。アンピシリン
耐性コロニーをニトロセルロースフィルターに転写さ
せ、0.5N NaOH、1.5M NaCl溶液にてDNAを変性させ、1M
Tris-HCl(pH 7.4)にて中和した後、80℃3時間、減圧乾
燥させた。プローブとしてHCV−JTの塩基9381-9412に対
応するオリゴマーDNA（5'-AGCTAAACACTCCAGGCCAATAGGCC
ATCCCC-3'／配列番号：１０）を³²Pにて５’末端標識し
たものを用い、反応液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4)、0．9M NaCl、5mM EDTA、0．1％ウシ血清アル
ブミン、0．1％フィコール、0．1％ポリビニルピロリド
ン、0．1％SDS及び0．1mg／ml変性サケ精子DNA）中で、
40℃24時間ハイブリダイゼーション反応を行なわせた。
その後フィルターを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗
浄し（室温、１０分、２回）、更に１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで洗浄し（５５℃、３０分、２回）、オートラ
ジオグラフィーにより陽性（HCV−JTの断片の挿入を有
する）コロニーを検出した。

【００３２】コロニーハイブリダイゼーションの結果、
陽性と判定されたクローンのうちPCRにより、より長い
インサートを有するクローンを検出した。プライマーと
して、「プライマー５」及び5'-AAACACTCCAGGCCAATAGG-
3'（HCV−JTの塩基9385−9404と対応／配列番号：１
１）からなる「プライマー６」を用いた。反応液［10倍
濃度緩衝液（前出）1.0μl、dNTP（各2．5mM）0.8μl、
「プライマー５」（10μM） 0.8μl、「プライマー６」
（10μM）0.8μl及び水 6.3μl］をマイクロチューブに
調製し、そこに陽性コロニーの一部を懸濁させた。実施
例５のアンカーＰＣＲ（第１段階ＰＣＲ）と同様の条件
下、PCR反応を行わせた。反応産物を電気泳動して、イ
ンサートの長さを確認した。

【００３３】［実施例８］塩基配列の決定比較的長いインサートを持つクローンのプラスミドを調
製し、そのインサートの塩基配列をシークエンシングキ
ット（Sequenase Ver2、USB社）を用いてジデオキシ法
により決定した。その結果、HCV-JTの配列において従来
知られていなかった「配列３'Ｘ」（図２／配列番号：
１）が得られた。配列の長さは98bpであった。さらに、
Uストレッチと「配列３'Ｘ」との間に「移行領域」が新
たに見出された。「配列３'Ｘ」においては、RNAの2次
構造から予測された特有なステムアンドループ構造が存
在していた。

【００３４】［実施例９］臨床検体の解析ここで得られた「配列３'Ｘ」を基にして、RT-PCR及び
サザンブロット法により臨床検体中（II/1b型またはIII
/2a型）の配列の存在の有無を調ベた。用いたプライマ
ー及びプローブの位置は図３に示す。

【００３５】臨床検体（肝臓の非癌部または血清）より
RNAを調製した。肝臓由来のRNAについては、実施例１及
び２と同様の操作を行った。血清由来のRNAについて
は、血清を等量の水で希釈し、「IsogenLS試薬」（ニッ
ポンジーン社）によりRNAを回収後、RNAをエタノール沈
殿し、水に溶解することにより行った。これら肝臓また
は血清より調製されたRNA（1μg/μl）より、「プライ
マー７」（図３参照／5'-ACATGATCTGCAGAGAGGCC-3’／
配列番号：１２）を用いて、実施例３の操作と同様に逆
転写反応を行いcDNAを合成した。

【００３６】次いで、以下の第１段階ＰＣＲ反応を行っ
た。前出の「10倍濃度緩衝液」 3.0μl、dNTP（各2．5m
M）2.4μl、「プライマー７」（10μM）2.4μl、「プラ
イマー８」（図３参照／5'−TTTCCTTCTTTGGTGGCTCC−
3’／配列番号：１３）（10μM）2.4μl、上記cDNA 1.5
μl及び水 17.9μlを混合した。この反応液にミネラル
オイルを１滴加えて重層し、98℃2分間加熱後82℃に保
持し、そこにTaqポリメラーゼ（Angewandte Gentechnol
ogie Systeme GmbH社製）0．45μlを加えた。その後、9
3℃40秒、55℃45秒、72℃2分のサイクルを34回操返し
た。

【００３７】次いで以下の第２段階ＰＣＲ反応を行っ
た。前出の「10倍濃度緩衝液」 5.0μl、dNTP（各2．5m
M）4.0μl、「プライマー９」（図３参照／5'-CCATCTTA
GCCCTAGTCACG-3'／配列番号：１４）（10μM）4.0μl、
「プライマー１０」（図３参照／5'-TCAGCACTCTCTGCAGT
CAT-3'／配列番号：１５）（10μM）4.0μl、上記第１
段階ＰＣＲ反応液 2.0μl及び水 30.3μlを混合した。
この反応液にミネラルオイルを2滴加えて重層し、98℃2
分間加熱後82℃に保持し、そこにTaqポリメラーゼ（Ang
ewandte Gentechnologie Systeme GmbH社製）0.7μlを
加えた。その後、93℃40秒、55℃45秒、72℃2分のサイ
クルを34回操返した。反応産物10μlを用いて、アガロ
ース電気泳動により、反応産物のサイズを確認し、目的
の67bpサイズを有するクローンを検出した。

【００３８】いくつかのクローンについては、最終産物
もしくは電気泳動のサイズ確認より検出されたクローン
をサザンブロットにより確認した。反応産物をアガロー
ス電気泳動により分画し、これを陽性荷電ナイロンメン
ブレン（HybondN+、Amersham社製）に0.4N NaOHを用い
てキャピラリートランスファー法によって転写した。次
いで、メンブレンを1M Tris-HCl（pH7.4）で中和した
後、反応液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4)、
0．9M NaCl、5mM EDTA、0．1％ウシ血清アルブミン、
0．1％フィコール、0．1％ポリビニルピロリドン、0．1
％SDS及び0．1mg／ml変性サケ精子DNA）中で、50℃1時
間インキュベーションした。更にプローブＲ３（5'ーCGG
CTCACGGACCTTTCACA-3'に相当するオリゴマーを³²Ｐにて
末端標識したもの／配列番号１６）を10⁶cpm/ml添加
し、50℃24時間ハイブリダイゼーション反応を行なわせ
た。その後、フイルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
で洗浄し（室温、１０分、２回）、更に１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳで洗浄し（５５℃、３０分、２回）、イ
メージアナライザ（BAS3000，富士フイルム社製）を用
いたオートラジオグラフィーにより「配列３'Ｘ」の有
無を解析した。

【００３９】その結果、「配列３'Ｘ」の存在が確認で
きた例は、HCV感染肝臓4検体中4例、HCV非感染肝臓3検
体中0例、HCV感染血清（II/1b型）24検体中19例、HCV感
染血清（III/2a型）3検体中2例、HBV感染血清11検体中0
例及び正常血清10検体中0例であった。

【００４０】以上のように、HCV感染検体において「配
列３'Ｘ」は高頻度で存在した。また、II/1b型及びIII/
2a型の血清を用いた解析において、共に「配列３'Ｘ」
が検出された。すなわち、これらタイプ間で「配列３'
Ｘ」が保存されていることが示された。肝臓及び血清を
用いた解析により、HCV感染に特異的に「配列３'Ｘ」が
検出できたことから、この配列がHCV感染を確認する検
査に有用な配列であることが示された。

【００４１】［実施例１０］ II/1b型HCVの「3'X配
列」の解析 HCV感染血清試料中のII/1b型HCVの「配列3'X」のクロー
ニング及び塩基配列の決定を前記実施例９と同様のRT-P
CR法により行った。この際、既知の3'末端領域よりポリ
Uテールを越え3'X配列に至る領域を互いにオーバーラッ
プする2つの領域に分けてRT-PCRを実施した。

【００４２】第一の領域（配列3'X内部）については逆
転写反応のプライマーとして前記プライマー7を用い、
第１段階PCRにおいては「プライマー7」及び「プライマ
ー11」（図３参照／5'-CTTTGGTGGCTCCATCTTAG-3'／配列
番号：17）を用い、第２段階PCRにおいては「プライマ
ー12」（図３参照／プライマー7にXhoI部位を付加した
配列／5'-CACGATCACTCGAGACATGATCTGCAGAGAGGCC-3'／配
列番号：18）「プライマー13」（図３参照／XhoI部位を
付加した配列／5'-AGTAATGCCTCGAGTGGCTCCATCTTAGCCCTA
-3'／配列番号：19）を用いて行った。

【００４３】次に第二の領域（ポリUテールをはさむ領
域）については、逆転写用のプライマーには実施例９記
載の「プライマー10」を用い、第1段階PCRにおいては実
施例５記載の「プライマー2」及び「プライマー14」
（図３参照／5'-CTGCAGTCATGCGGCTCACG-3'／配列番
号：20）、第２段階PCRにおいては、実施例５記載の
「プライマー4」及び「プライマー15」（図３参照／Xho
I部位を付加した配列／5'-CGCGATAACTCGAGCACGGACCTTTC
ACAGCTAG-3'／配列番号：21）を用いて行った。

【００４４】第一、第二の領域の第2段階PCR産物（各々
約120塩基対、及び約200塩基対）を実施例６と同様の方
法でサブクローニングを行った。実施例８で得た肝臓由
来II/1b型クローン（4検体由来21クローン）及び本実施
例で得た血清由来II/1b型クローン（4検体由来22クロー
ン）を、実施例８と同様の方法で塩基配列を決定したと
ころ、図４の配列において下に塩基が記載してある塩基
において、変異を持つクローンが存在していた。具体的
には２５位のＡがＧに、２８位のＧがＡに、５４位のＣ
がＴに、６０位のＴがＣに、６３位のＡがＧに、６５位
のＡがＧに、７１位のＣがＴに変異していた。該変異を
含んだ「配列番号：１」の配列を「配列番号：２」とし
て記載する。他の領域に比較して、「配列３'Ｘ」はII/
1b型の各クローン間で変異の少ない領域であることが判
明した。

【００４５】［実施例１１］ III/2a型HCVの「配列3'
X」の塩基配列の決定血清HCVIII/2a型の3'X領域の配列を前記実施例10と同様
の2領域のRT-PCR法により決定した。各プライマーの
「配列3'X」における位置と向きを図３に示す。全体の
配列は2つのオーバーラップする領域の配列を合成して
決定した。第一の領域（配列3'X内部）については、全
ての操作を実施例１０と同一の方法で行った。第２の領
域（ポリＵテールをはさむ領域）については、逆転写反
応のプライマーには「プライマー10」を用い、第一段階
PCRにおいては、「プライマー14」及び「プライマー1
6」（III/2a型HCVであるHC-J6（岡本ら、J.Gen.Virol.7
2,2697-2704.1991)の塩基9356-9375に相当する配列／5'
-GTGTCGCGTGCCCGACCCCG-3'／配列番号：22）、第2段階P
CRにおいては「プライマー15」及び「プライマー17」
（HC-J6の塩基9380-9399の位置に相当する配列にXhoI部
位を付加した配列／5'-GTAATGTCTCGAGTTACTCCTTGGCCTAC
TCCT-3'／配列番号：23）を用いた。

【００４６】第１領域は約１２０ｂｐ、第２領域は２０
０ないし３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを実施例６と
同様の方法でサブクローニングを行い、実施例８と同様
の方法で塩基配列を決定した。その結果、HCVII/1bとほ
ぼ同じ「配列３'Ｘ」（図５／配列番号：３）が得られ
た。配列の長さは98bpであり、HCVII/1bと比較すると、
７２位が異なるのみであった。（II/1b型がＵであると
ころがIII/2aがＣであった。）また、HCVII/1b型と同
様、Uストレッチと「配列３'Ｘ」との間に「移行領域」
が観察された。この移行領域は、III/2a型に特有な配列
を有していた。なお、図５または配列番号:３におい
て、3'末端から２０ｂｐの配列「5'-GGCCUCUCUGCAGAUCA
UGU-3'」はクローニングに用いた「プライマー７」由来
の配列であるが、III/2a型ゲノムに「プライマー７」が
特異的にハイブリダイズしＰＣＲ反応が進行したことか
らすると、III/2a型ゲノムも同じ配列を有している可能
性が非常に高いと考えられる。（少なくともこの配列を
用いて、III/2a型の検出等の本発明の課題が達成される
ことは明らかである。）

【００４７】血清2検体より、III/2a型クローンの「配
列３'Ｘ」の部分を配列決定したところ、図５の配列に
おいて下に塩基が記載してある塩基において、変異が生
じていた。「配列３’Ｘ」内においては、具体的には４
３位のＵがＣに、６６位のＧがＣに変異していた。また
６１位のＧが欠失している変異株が存在した。該変異を
含んだ「配列番号：３」の配列を、「配列番号：４」と
して記載する。なお、血清由来のIII/2a型HCVについ
て、領域１は１５クローン（３検体より各５クロー
ン）、領域２は１０クローン（２検体より各５クロー
ン）を解析して図５の結果を得た。上記結果から「配列
３'Ｘ」はII/1b型とIII/2a型とで非常に保存された配列
を有し、またIII/2a型の各クローン間においても変異が
少ない領域であることが判明した。

【００４８】

【発明の効果】本発明によって、ＨＣＶにおいて高度に
保存されまた複製に重要であると考えられる３’末端の
塩基配列が明らかにされたことによって、信頼性の高い
ＨＣＶの検出、効果的なＨＣＶ阻害剤の開発等が可能と
なった。

【００４９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：98 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic RNA 起源生物名：C型肝炎ウイルス配列 GGUGGCUCCA UCUUAGCCCU AGUCACGGCU AGCUGUGAAA GGUCCGUGAG CCGCAUGACU 60 GCAGAGAGUG CUGAUACUGG CCUCUCUGCA GAUCAUGU 98 配列番号：2 配列の長さ：98 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic RNA 起源生物名：C型肝炎ウイルス配列 GGUGGCUCCA UCUUAGCCCU AGUCRCGRCU AGCUGUGAAA GGUCCGUGAG CCGYAUGACY 60 GCRGRGAGUG YUGAUACUGG CCUCUCUGCA GAUCAUGU 98 配列番号：3 配列の長さ：98 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic RNA 起源生物名：C型肝炎ウイルス配列 GGUGGCUCCA UCUUAGCCCU AGUCACGGCU AGCUGUGAAA GGUCCGUGAG CCGCAUGACU 60 GCAGAGAGUG CCGAUACUGG CCUCUCUGCA GAUCAUGU 98 配列番号：4 配列の長さ：98 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic RNA 起源生物名：C型肝炎ウイルス配列の特徴存在位置：61 特徴を決定した方法：E 他の情報：この部位（Ｇ）が欠失してもよい配列 GGUGGCUCCA UCUUAGCCCU AGUCACGGCU AGCUGUGAAA GGYCCGUGAG CCGCAUGACU 60 GCAGASAGUG CCGAUACUGG CCUCUCUGCA GAUCAUGU 98 配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TACTCCTACT CTCTGTAGGG 20 配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GGCATCTACC TGCTCCCCAA 20 配列番号：7 配列の長さ：38 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TGCTGTCGAC TACTCGAGCA GGGGGGGGGG GGGGGGGG 38 配列番号：8 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GCGTAATCTC GAGCCCAACC GGTGAACCGG GAG 33 配列番号：9 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TGCTGTCGAC TACTCGAGCA 20 配列番号：10 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AGCTAAACAC TCCAGGCCAA TAGGCCATCC CC 32 配列番号:11 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AAACACTCCA GGCCAATAGG 20 配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 ACATGATCTG CAGAGAGGCC 20 配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TTTCCTTCTT TGGTGGCTCC 20 配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CCATCTTAGC CCTAGTCACG 20 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 TCAGCACTCT CTGCAGTCAT 20 配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CGGCTCACGG ACCTTTCACA 20 配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CTTTGGTGGC TCCATCTTAG 20 配列番号：18 配列の長さ：34 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CACGATCACT CGAGACATGA TCTGCAGAGA GGCC 34 配列番号：19 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 AGTAATGCCT CGAGTGGCTC CATCTTAGCC CTA 33 配列番号：20 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CTGCAGTCAT GCGGCTCACG 20 配列番号：21 配列の長さ：34 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 CGCGATAACT CGAGCACGGA CCTTTCACAG CTAG 34 配列番号：22 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GTGTCGCGTG CCCGACCCCG 20 配列番号：23 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成DNA）配列 GTAATGTCTC GAGTTACTCC TTGGCCTACT CCT 33

【図面の簡単な説明】

【図１】 HCV3'末端付近のクローニングの手順を示す
図である。

【図２】 HCVII/1bの3'末端付近の塩基配列を示す図で
ある。

【図３】 HCVの検出クローニング及び検出に用いるプ
ライマーの位置と方向を示す図である。

【図４】 HCVII/1bの3'末端付近の塩基配列の変異を示
す図である。

【図５】 HCVIII/2aの3'末端付近の塩基配列とその変
異を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/29 Ａ６１Ｋ 39/29 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２の配列または該配列に相補的
な配列の全部または一部分に特異的にハイブリダイズす
る一本鎖核酸。
【請求項２】請求項１記載の核酸とその相補鎖とから
なる二本鎖核酸。
【請求項３】配列番号４の配列または該配列に相補的
な配列の全部または一部分に特異的にハイブリダイズす
る一本鎖核酸。
【請求項４】請求項３記載の核酸とその相補鎖とから
なる二本鎖核酸。
【請求項５】請求項１または３のＤＮＡからなるプラ
イマー。
【請求項６】請求項５記載のプライマーを含むＣ型肝
炎ウイルスを検出するためのキット。
【請求項７】請求項５記載のプライマーを用いて検体
に対してＰＣＲを行う工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスの
検出方法。
【請求項８】請求項１または３の核酸からなるＣ型肝
炎増殖阻害剤。