JP2000279200A - Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）の効率的検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）の効率的検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびそれの使用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの効率的逆
転写のための新規オリゴヌクレオチドプライマーを開示
する。また生物学的試料中のＨＣＶ核酸配列を検出する
ための方法およびキットを提供する。 【解決手段】本発明の方法は生物学的試料より誘導した
ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行うことにより、ＨＣ
Ｖ特異的逆転写物を生成させ、これをＨＣＶ特異的プロ
ーブで検出する。
転写のための新規オリゴヌクレオチドプライマーを開示
する。また生物学的試料中のＨＣＶ核酸配列を検出する
ための方法およびキットを提供する。 【解決手段】本発明の方法は生物学的試料より誘導した
ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行うことにより、ＨＣ
Ｖ特異的逆転写物を生成させ、これをＨＣＶ特異的プロ
ーブで検出する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、生物学的試料中の
核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の改良検出
方法に関する。
核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の改良検出
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中
の大部分の輸血後肝炎の症例とかなりの割合の散在性
（または地域社会獲得性）肝炎の症例の原因である、非
経口的に伝染するウイルスである。世界人口の１％超が
ＨＣＶに感染していると見積もられている。ＨＣＶ感染
は急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌に関係が
ある。
の大部分の輸血後肝炎の症例とかなりの割合の散在性
（または地域社会獲得性）肝炎の症例の原因である、非
経口的に伝染するウイルスである。世界人口の１％超が
ＨＣＶに感染していると見積もられている。ＨＣＶ感染
は急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌に関係が
ある。
【０００３】ＨＣＶは現在フラビウイルス科（Flavivir
idae）の中の独自のヘパチウイルス属（Hepacivirus ）
として分類されている。そのゲノムは、約3,000 アミノ
酸のポリタンパク質前駆体をコードする単一の大きな転
写解読枠（ＯＲＦ）を有する約9,500 ヌクレオチドの正
鎖ＲＮＡ分子から成る。この大きなＯＲＦの上流には、
ゲノムの最も高度に保存された領域である約340 ヌクレ
オチドの５′非コード領域（ＮＣＲ）がある。このＯＲ
Ｆの５′領域は（５′→３′方向で）キャプシドタンパ
ク質、２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１とＥ２）
および未知の機能を有する小さなタンパク質（Ｐ７）を
コードする。このＯＲＦの３′領域は、プロテアーゼ、
プロテアーゼ／ヘリカーゼ二機能性タンパク質、ＲＮＡ
ポリメラーゼおよび調節タンパク質を包含する非構造タ
ンパク質をコードする。
idae）の中の独自のヘパチウイルス属（Hepacivirus ）
として分類されている。そのゲノムは、約3,000 アミノ
酸のポリタンパク質前駆体をコードする単一の大きな転
写解読枠（ＯＲＦ）を有する約9,500 ヌクレオチドの正
鎖ＲＮＡ分子から成る。この大きなＯＲＦの上流には、
ゲノムの最も高度に保存された領域である約340 ヌクレ
オチドの５′非コード領域（ＮＣＲ）がある。このＯＲ
Ｆの５′領域は（５′→３′方向で）キャプシドタンパ
ク質、２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１とＥ２）
および未知の機能を有する小さなタンパク質（Ｐ７）を
コードする。このＯＲＦの３′領域は、プロテアーゼ、
プロテアーゼ／ヘリカーゼ二機能性タンパク質、ＲＮＡ
ポリメラーゼおよび調節タンパク質を包含する非構造タ
ンパク質をコードする。
【０００４】世界中からのＨＣＶコード配列の分析によ
り、個々のウイルス分離株間で相当な配列変異が明らか
になった。更に、個々の患者からのＨＣＶ配列の分析に
より、関連するが同一でない配列を含むいわゆる「準種
"quasi-species"」としてウイルスが流布することが示
された。分離株間と個々の患者間に存在する変異は、ウ
イルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼが低い信頼度を有することの結果であると考えられ
る。ＨＣＶの遺伝的変異の程度は、感染の予防、診断お
よび制御にとって重要な意味を持つ。
り、個々のウイルス分離株間で相当な配列変異が明らか
になった。更に、個々の患者からのＨＣＶ配列の分析に
より、関連するが同一でない配列を含むいわゆる「準種
"quasi-species"」としてウイルスが流布することが示
された。分離株間と個々の患者間に存在する変異は、ウ
イルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼが低い信頼度を有することの結果であると考えられ
る。ＨＣＶの遺伝的変異の程度は、感染の予防、診断お
よび制御にとって重要な意味を持つ。
【０００５】ＨＣＶ感染の血清学的診断は、典型的には
組換えＨＣＶタンパク質またはペプチドを結合する抗体
を検出する市販のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
により測定される。陽性ＥＩＡ結果は組換え免疫ブロッ
トアッセイ（ＲＩＢＡ）により確かめることができる
が、ＥＩＡもＲＩＢＡ法も現在の感染と過去の感染を区
別することはできない。循環しているウイルスは典型的
には低いウイルス価であるために、ウイルスタンパク質
についての直接アッセイの開発は成功していない。更
に、抗体に依存するアッセイは一般に、暴露後２〜３カ
月間はＨＣＶ感染を検出することができない。
組換えＨＣＶタンパク質またはペプチドを結合する抗体
を検出する市販のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）
により測定される。陽性ＥＩＡ結果は組換え免疫ブロッ
トアッセイ（ＲＩＢＡ）により確かめることができる
が、ＥＩＡもＲＩＢＡ法も現在の感染と過去の感染を区
別することはできない。循環しているウイルスは典型的
には低いウイルス価であるために、ウイルスタンパク質
についての直接アッセイの開発は成功していない。更
に、抗体に依存するアッセイは一般に、暴露後２〜３カ
月間はＨＣＶ感染を検出することができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、ＨＣＶへの患
者の暴露後数日以内にＨＣＶウイルス血症を検出するの
に十分な位感受性であるＨＣＶについての改良アッセイ
が当該技術分野で必要とされている。
者の暴露後数日以内にＨＣＶウイルス血症を検出するの
に十分な位感受性であるＨＣＶについての改良アッセイ
が当該技術分野で必要とされている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、一面では、生
物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存
在の検出方法に向けられる。この方法は、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチ
ドプライマー対を使用して前記逆転写生成物を増幅せし
めることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
前記プライマー対は(a) 正プライマー 5'-CAGAAAGCGTC
TAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プ
ライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6)〔配列番号４〕；または(b) 正プライマー 5'-GGGAG
AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と
逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C29
4R25) 〔配列番号７〕；および(c) 正プライマー 5'-G
TGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号
３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282
R27)〔配列番号５〕および(ii) 5'-CACTCGCAAGCACCCTAT
CAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕から成る群より
選ばれた逆プライマーから成る群より選ばれ；そして (C) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮ
Ａの存在を示すことを特徴とする。
物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存
在の検出方法に向けられる。この方法は、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチ
ドプライマー対を使用して前記逆転写生成物を増幅せし
めることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、
前記プライマー対は(a) 正プライマー 5'-CAGAAAGCGTC
TAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プ
ライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6)〔配列番号４〕；または(b) 正プライマー 5'-GGGAG
AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と
逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C29
4R25) 〔配列番号７〕；および(c) 正プライマー 5'-G
TGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号
３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282
R27)〔配列番号５〕および(ii) 5'-CACTCGCAAGCACCCTAT
CAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕から成る群より
選ばれた逆プライマーから成る群より選ばれ；そして (C) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮ
Ａの存在を示すことを特徴とする。
【０００８】別の面では、本発明はＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法
は、(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料におい
て、ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチ
ドプライマー対を使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うこ
とにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させることを
含んで成り、ここで前記プライマー対は(a) (i) 5'-CA
GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号
１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F2
5)〔配列番号２〕および(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGA
GTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕から成る群より選
ばれた正プライマーと(b) (i) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTA
TGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，(ii) 5'-GCAA
GCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号
５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287
R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCAC
CCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕から成る群より選
ばれた逆プライマーとを含んで成る。
（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法
は、(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料におい
て、ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチ
ドプライマー対を使ってポリメラーゼ連鎖反応を行うこ
とにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させることを
含んで成り、ここで前記プライマー対は(a) (i) 5'-CA
GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号
１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F2
5)〔配列番号２〕および(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGA
GTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕から成る群より選
ばれた正プライマーと(b) (i) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTA
TGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，(ii) 5'-GCAA
GCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号
５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287
R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCAC
CCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕から成る群より選
ばれた逆プライマーとを含んで成る。
【０００９】第三の面では、本発明は生物学的試料中の
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に
向けられる。この方法は、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) 正プライマーと逆プライマーを使って前記逆転写生
成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物
を生成させ、前記正プライマーがオリゴヌクレオチド
5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) 〔配列番号
８〕から成り、そして前記逆プライマーがオリゴヌクレ
オチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)
〔配列番号９〕から成り；そして (C) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮ
Ａの存在を示すことを特徴とする。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に
向けられる。この方法は、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) 正プライマーと逆プライマーを使って前記逆転写生
成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物
を生成させ、前記正プライマーがオリゴヌクレオチド
5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) 〔配列番号
８〕から成り、そして前記逆プライマーがオリゴヌクレ
オチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)
〔配列番号９〕から成り；そして (C) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮ
Ａの存在を示すことを特徴とする。
【００１０】第四の面では、本発明はＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法
は、(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料におい
て、正プライマーと逆プライマーを使ってポリメラーゼ
連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を
生成させることを含んで成り、前記正プライマーがオリ
ゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'
(1F27) 〔配列番号８〕から成り、そして前記逆プライ
マーがオリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTG
CAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る。
（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法
は、(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料におい
て、正プライマーと逆プライマーを使ってポリメラーゼ
連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を
生成させることを含んで成り、前記正プライマーがオリ
ゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'
(1F27) 〔配列番号８〕から成り、そして前記逆プライ
マーがオリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTG
CAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る。
【００１１】第五の面では、本発明は生物学的試料中の
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に
向けられる。この方法は、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) ＨＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー対とを使って、前記逆転
写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生
成物を生成させ、前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマー対の各々が(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGG
CGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGA
GCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕およ
び(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)
〔配列番号３〕から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6) 〔配列番号４〕，(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTAC
CACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAA
GCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕およ
び(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)
〔配列番号７〕から成る群より選ばれた逆プライマーと
を含んで成り；そして前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド5'-GGTGGCT
CCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から
成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGT
ATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成
る逆プライマーとを含んで成り；そして (C) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮ
Ａの存在を示すことを特徴とする。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法に
向けられる。この方法は、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) ＨＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー対とを使って、前記逆転
写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生
成物を生成させ、前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマー対の各々が(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGG
CGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGA
GCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕およ
び(iii)5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)
〔配列番号３〕から成る群より選ばれた正プライマーと
(b) (i) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6) 〔配列番号４〕，(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTAC
CACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAA
GCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕およ
び(iv) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)
〔配列番号７〕から成る群より選ばれた逆プライマーと
を含んで成り；そして前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド5'-GGTGGCT
CCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から
成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGT
ATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成
る逆プライマーとを含んで成り；そして (C) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮ
Ａの存在を示すことを特徴とする。
【００１２】第六の面では、本発明はＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法は
(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料において、Ｈ
ＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレ
オチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマー対とを使ってポリメラーゼ連鎖
反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成
させ、前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対
の各々が(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-
3' (C69F28)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTG
GTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および(iii)5'
-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番
号３〕から成る群より選ばれた正プライマーと(b) (i)
5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列
番号４〕，(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'
(C282R27)〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTA
TCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'
-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号
７〕から成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成
り；そして前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ー対の各々がオリゴヌクレオチド5'-GGTGGCTCCATCTTAGC
CCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プラ
イマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTC
TCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライ
マーとを含んで成ることを特徴とする。
（ＨＣＶ）ＤＮＡの増幅方法に向けられる。この方法は
(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料において、Ｈ
ＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレ
オチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマー対とを使ってポリメラーゼ連鎖
反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成
させ、前記５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対
の各々が(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-
3' (C69F28)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTG
GTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および(iii)5'
-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番
号３〕から成る群より選ばれた正プライマーと(b) (i)
5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列
番号４〕，(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'
(C282R27)〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTA
TCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'
-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号
７〕から成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成
り；そして前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ー対の各々がオリゴヌクレオチド5'-GGTGGCTCCATCTTAGC
CCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プラ
イマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTC
TCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライ
マーとを含んで成ることを特徴とする。
【００１３】逆転写反応を実施する本発明の方法の或る
態様では、逆転写反応はランダムオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使って行うか、あるいは１または複数のＨＣ
Ｖ特異的逆転写プライマー、即ち、ＨＣＶ ＲＮＡ中の
配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドを使っ
て行ってもよい。増幅の検出方法としては、非限定的
に、(a) 電気泳動および(b) ＨＣＶ特異的プローブが取
り付けられた固体支持体上への増幅生成物の捕捉に続く
比色アッセイによる結合生成物の定量が挙げられる。
態様では、逆転写反応はランダムオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使って行うか、あるいは１または複数のＨＣ
Ｖ特異的逆転写プライマー、即ち、ＨＣＶ ＲＮＡ中の
配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドを使っ
て行ってもよい。増幅の検出方法としては、非限定的
に、(a) 電気泳動および(b) ＨＣＶ特異的プローブが取
り付けられた固体支持体上への増幅生成物の捕捉に続く
比色アッセイによる結合生成物の定量が挙げられる。
【００１４】更なる面では、本発明はＨＣＶ ＲＮＡか
ら誘導されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅させるためのキット
に向けられる。このキットは１または複数の５′ＮＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前記
５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F2
8)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGA
A-3' (C131F25)〔配列番号２〕および(iii)5'-GTGGTCTG
CGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕から
成る群より選ばれた正プライマーと(b) (i) 5'-CGGTTC
CGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)
〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT
A-3' (C287R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'-CGGGGCAC
TCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕から成
る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成る。
ら誘導されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅させるためのキット
に向けられる。このキットは１または複数の５′ＮＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前記
５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々が
(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F2
8)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGA
A-3' (C131F25)〔配列番号２〕および(iii)5'-GTGGTCTG
CGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕から
成る群より選ばれた正プライマーと(b) (i) 5'-CGGTTC
CGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号４〕，
(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)
〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT
A-3' (C287R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'-CGGGGCAC
TCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕から成
る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成る。
【００１５】更に別の面では、本発明はＨＣＶ ＲＮＡ
から誘導されたＨＣＶ ｃＤＮＡを増幅させるためのキ
ットに向けられる。このキットは１または複数の３′Ｎ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前
記３′ＮＣＲプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド
5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番
号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番
号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る。
から誘導されたＨＣＶ ｃＤＮＡを増幅させるためのキ
ットに向けられる。このキットは１または複数の３′Ｎ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成り、前
記３′ＮＣＲプライマー対の各々がオリゴヌクレオチド
5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番
号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレオチド
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番
号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る。
【００１６】別の面では、本発明はＨＣＶ ＤＮＡの存
在を検出するためのキットに向けられる。このキットは
１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ー対を含んで成り、前記５′ＮＣＲプライマー対の各々
が(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69
F28)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCG
GAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および(iii)5'-GTGGTC
TGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕か
ら成る群より選ばれた正プライマーと(b) (i) 5'-CGGT
TCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号
４〕，(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282
R27)〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGG
CAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'-CGGG
GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕か
ら成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成る。
在を検出するためのキットに向けられる。このキットは
１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ー対を含んで成り、前記５′ＮＣＲプライマー対の各々
が(a) (i) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69
F28)〔配列番号１〕，(ii) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCG
GAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕および(iii)5'-GTGGTC
TGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26) 〔配列番号３〕か
ら成る群より選ばれた正プライマーと(b) (i) 5'-CGGT
TCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26) 〔配列番号
４〕，(ii) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282
R27)〔配列番号５〕，(iii)5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGG
CAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕および(iv) 5'-CGGG
GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25)〔配列番号７〕か
ら成る群より選ばれた逆プライマーとを含んで成る。
【００１７】更に別の面では、本発明はＨＣＶ ＲＮＡ
の存在を検出するためのキットに向けられる。このキッ
トは１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマー対を含んで成り、前記３′ＮＣＲプライマー対の
各々がオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAG
TCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマー
と、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCA
GTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーと
を含んで成る。
の存在を検出するためのキットに向けられる。このキッ
トは１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマー対を含んで成り、前記３′ＮＣＲプライマー対の
各々がオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAG
TCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマー
と、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCA
GTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーと
を含んで成る。
【００１８】
【発明の実施態様】本発明者らは、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして
用いると、生物学的試料中のＨＣＶ ＲＮＡの検出がよ
り効率的であることを発見した。従って、本発明は、低
コピーレベルのＨＣＶ ＲＮＡを検出する、改善され
た、１回の逆転写／増幅アッセイを提供する。オリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列保存、分子内または分子
間相互作用、およびアンプリコンと周囲配列の推定二次
構造に基づいて選択される。更に、プライマーとアッセ
イ方法は、ＨＣＶゲノムの多領域、多ウイルス種、およ
び内部陽性配列（ＩＰＣ）ＲＮＡ（またはＤＮＡ）の同
時増幅（または同時検出）を可能にするようにデザイン
される。ＨＣＶゲノムの多領域の同時増幅／検出はアッ
セイ感度を増加させ、そしてＩＰＣの同時増幅はＰＣＲ
の阻害により生じる偽陽性結果の可能性を減少させる。
（ＨＣＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして
用いると、生物学的試料中のＨＣＶ ＲＮＡの検出がよ
り効率的であることを発見した。従って、本発明は、低
コピーレベルのＨＣＶ ＲＮＡを検出する、改善され
た、１回の逆転写／増幅アッセイを提供する。オリゴヌ
クレオチドプライマーは、配列保存、分子内または分子
間相互作用、およびアンプリコンと周囲配列の推定二次
構造に基づいて選択される。更に、プライマーとアッセ
イ方法は、ＨＣＶゲノムの多領域、多ウイルス種、およ
び内部陽性配列（ＩＰＣ）ＲＮＡ（またはＤＮＡ）の同
時増幅（または同時検出）を可能にするようにデザイン
される。ＨＣＶゲノムの多領域の同時増幅／検出はアッ
セイ感度を増加させ、そしてＩＰＣの同時増幅はＰＣＲ
の阻害により生じる偽陽性結果の可能性を減少させる。
【００１９】分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよ
びタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Prot
ocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻,
1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第Ｉおよ
びII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Sy
nthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Tr
anslation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical
Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzym
ology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purificatio
n: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verla
g, N.Y.）中に説明された技術を、本発明を実施する際
に使用する。
びタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Prot
ocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻,
1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第Ｉおよ
びII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Sy
nthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Tr
anslation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical
Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzym
ology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purificatio
n: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verla
g, N.Y.）中に説明された技術を、本発明を実施する際
に使用する。
【００２０】本明細書中で用いる「核酸」または「ポリ
ヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドもしくはポ
リデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ／ポリ
デオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さの
プリンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには
一本鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮ
Ａ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びに
アミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された
「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修
飾塩基を含有する核酸も含まれる。
ヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドもしくはポ
リデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ／ポリ
デオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さの
プリンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには
一本鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮ
Ａ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びに
アミノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された
「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修
飾塩基を含有する核酸も含まれる。
【００２１】本明細書中で用いる核酸配列の「相補体」
とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参
加するアンチセンス配列を言う。
とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参
加するアンチセンス配列を言う。
【００２２】本明細書中で用いる「プライマー」は、着
目の一本鎖核酸配列と共に二重鎖を形成しそして例えば
逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の
重合を可能にする、長さ約10〜約50ヌクレオチド、好ま
しくは長さ約12〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約
12〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチド
である。
目の一本鎖核酸配列と共に二重鎖を形成しそして例えば
逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の
重合を可能にする、長さ約10〜約50ヌクレオチド、好ま
しくは長さ約12〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約
12〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチド
である。
【００２３】本明細書中で用いる「単離された」核酸と
は、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混
合物であるならそれの天然の環境、それが合成物である
なら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離
された核酸は、典型的には、最初にそれが関連していた
成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も
好ましくは約90％未満を含有する。
は、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混
合物であるならそれの天然の環境、それが合成物である
なら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離
された核酸は、典型的には、最初にそれが関連していた
成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も
好ましくは約90％未満を含有する。
【００２４】指摘した配列「から誘導された」核酸配列
とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言
う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的で
ある配列も含まれる。
とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言
う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的で
ある配列も含まれる。
【００２５】内部陽性対照（＝ＩＰＣ）標的核酸とは、
典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直
鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされ
た合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一
般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結
合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果
に対する包括的な対照として働く。
典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直
鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされ
た合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一
般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結
合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果
に対する包括的な対照として働く。
【００２６】好ましい内部陽性対照標的ＤＮＡの配列は
下記のものである：5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGA
ACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCG
GTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTC
AGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〔配列番号10〕。
下記のものである：5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGA
ACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCG
GTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTC
AGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〔配列番号10〕。
【００２７】本明細書中に開示するいずれかの配列また
はそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製
することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. A
m. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持
体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方
法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを合成する
ことができる。当該技術分野で既知である多数の手段に
より核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非
限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類似体
による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌク
レオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチルホス
ホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、
カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられ
る。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、例
えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、
シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤
（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤
（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）および
アルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語にはＰ
ＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホ
トリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の
形成により誘導体にすることができる。更に、本発明の
核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグナルを
提供することができる標識により修飾されてもよい。典
型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチ
ンなどが挙げられる。
はそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製
することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. A
m. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持
体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方
法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを合成する
ことができる。当該技術分野で既知である多数の手段に
より核酸を修飾することもできる。そのような修飾の非
限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類似体
による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌク
レオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチルホス
ホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、
カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられ
る。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、例
えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、
シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤
（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤
（例えば金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）および
アルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語にはＰ
ＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチルホスホ
トリエステルまたはアルキルホスホロアミデート結合の
形成により誘導体にすることができる。更に、本発明の
核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグナルを
提供することができる標識により修飾されてもよい。典
型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチ
ンなどが挙げられる。
【００２８】本明細書中で用いる「増幅」とは、非限定
的に、核酸がコピーされる相互作用工程を言う。適当な
増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連
鎖反応、鎖置換増幅、転写媒介増幅および核酸一塩基増
幅が挙げられる。
的に、核酸がコピーされる相互作用工程を言う。適当な
増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連
鎖反応、鎖置換増幅、転写媒介増幅および核酸一塩基増
幅が挙げられる。
【００２９】本発明は、生物学的試料中のＨＣＶの検出
方法を提供する。この方法は、 (i) 試料中に含まれるかまたは試料から誘導されたＲＮ
Ａを鋳型として使って逆転写反応を行い； (ii)ＨＣＶ ＲＮＡの５′または３′非コード領域内の
配列に相当する配列を有する増幅プライマー対を使って
逆転写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増
幅生成物を生成させ；そして (iii) 前記ＨＣＶ特異的増幅生成物を検出することによ
り実施される。ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が、試料
中のＨＣＶ ＲＮＡの存在を示す。
方法を提供する。この方法は、 (i) 試料中に含まれるかまたは試料から誘導されたＲＮ
Ａを鋳型として使って逆転写反応を行い； (ii)ＨＣＶ ＲＮＡの５′または３′非コード領域内の
配列に相当する配列を有する増幅プライマー対を使って
逆転写生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増
幅生成物を生成させ；そして (iii) 前記ＨＣＶ特異的増幅生成物を検出することによ
り実施される。ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出が、試料
中のＨＣＶ ＲＮＡの存在を示す。
【００３０】本発明によれば、任意の常法により患者か
ら生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料として
は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳および脳
脊髄液が挙げられる。好ましくは、血漿がＨＣＶ ＲＮ
Ａの入手源として使われる。
ら生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料として
は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳および脳
脊髄液が挙げられる。好ましくは、血漿がＨＣＶ ＲＮ
Ａの入手源として使われる。
【００３１】生物学的試料は、試料中に含まれるＲＮ
Ａ、特にＨＣＶ ＲＮＡへの逆転写試薬の接近を与える
ようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導され
た」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので且つ
試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が増大
された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術分野
で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを使用
する方法、またはGentraSystems, Inc. (Minneapolis M
N) からのPureScriptのような市販の試薬と方法を使用
する方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮア
ーゼからのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆転
写反応を妨害する可能性のある他の成分からの分離をも
たらすいずれの抽出方法を使ってもよい。
Ａ、特にＨＣＶ ＲＮＡへの逆転写試薬の接近を与える
ようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導され
た」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので且つ
試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が増大
された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術分野
で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを使用
する方法、またはGentraSystems, Inc. (Minneapolis M
N) からのPureScriptのような市販の試薬と方法を使用
する方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮア
ーゼからのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆転
写反応を妨害する可能性のある他の成分からの分離をも
たらすいずれの抽出方法を使ってもよい。
【００３２】次いで、試料を(a) ランダムプライマー、
例えばPharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey か
ら得られるランダムヘキサマー、および／または(b) Ｈ
ＣＶＲＮＡゲノム配列の５′もしくは３′ＮＣＲ領域由
来のプライマーを使った逆転写反応にかける。逆転写
は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,
第Ｉ, IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国
特許第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Micro
biol. 31(4):882 (1993) ; Myers他, Biochemistry 30
(3):7661 (1991)中に記載されたような、常用手段を使
って実施される。逆転写プライマーとしての使用に適し
た他のプライマーおよび本発明において使用することが
できる逆転写方法としては、同時係属米国特許出願第 0
9/ 号, 代理人書類番号2094/0E287に記載されたものが挙
げられる。
例えばPharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey か
ら得られるランダムヘキサマー、および／または(b) Ｈ
ＣＶＲＮＡゲノム配列の５′もしくは３′ＮＣＲ領域由
来のプライマーを使った逆転写反応にかける。逆転写
は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,
第Ｉ, IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国
特許第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Micro
biol. 31(4):882 (1993) ; Myers他, Biochemistry 30
(3):7661 (1991)中に記載されたような、常用手段を使
って実施される。逆転写プライマーとしての使用に適し
た他のプライマーおよび本発明において使用することが
できる逆転写方法としては、同時係属米国特許出願第 0
9/ 号, 代理人書類番号2094/0E287に記載されたものが挙
げられる。
【００３３】逆転写反応の後、生成物を増幅させる。任
意の増幅方法を使ってもよく、増幅方法の非限定例とし
ては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖
反応、鎖置換反応、核酸一塩基増幅および転写媒介増幅
が挙げられる。好ましくはＰＣＲが使われる。典型的に
は、ＰＣＲに必要な全ての成分を含む反応混合物が直接
逆転写反応混合物に添加される。次いで、使用するプラ
イマー対により特定される条件を使って増幅反応を実施
する。
意の増幅方法を使ってもよく、増幅方法の非限定例とし
ては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖
反応、鎖置換反応、核酸一塩基増幅および転写媒介増幅
が挙げられる。好ましくはＰＣＲが使われる。典型的に
は、ＰＣＲに必要な全ての成分を含む反応混合物が直接
逆転写反応混合物に添加される。次いで、使用するプラ
イマー対により特定される条件を使って増幅反応を実施
する。
【００３４】本発明者らは、特定のＨＣＶ特異的増幅プ
ライマー対が患者試料中のＨＣＶＲＮＡを検出する際に
特に有利であることを発見した。ＨＣＶゲノムの５′Ｎ
ＣＲから誘導された有用なプライマーの非限定例とし
て、下の第１表に列挙されたプライマーが挙げられる。
ライマー対が患者試料中のＨＣＶＲＮＡを検出する際に
特に有利であることを発見した。ＨＣＶゲノムの５′Ｎ
ＣＲから誘導された有用なプライマーの非限定例とし
て、下の第１表に列挙されたプライマーが挙げられる。
【００３５】
【表１】
【００３６】センスオリゴヌクレオチドとアンチセンス
オリゴヌクレオチドの任意組合せをそれぞれ正プライマ
ーと逆プライマーとして使用することができる。増幅に
使われる好ましい５′ＮＣＲプライマー対としては(a)
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列
番号１〕と5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6)〔配列番号４〕；および(b) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCT
GCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と5'-CGGGGCACTCG
CAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕が挙げら
れる。
オリゴヌクレオチドの任意組合せをそれぞれ正プライマ
ーと逆プライマーとして使用することができる。増幅に
使われる好ましい５′ＮＣＲプライマー対としては(a)
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列
番号１〕と5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6)〔配列番号４〕；および(b) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCT
GCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と5'-CGGGGCACTCG
CAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕が挙げら
れる。
【００３７】好ましい態様では、増幅プライマー対が
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' 〔配列番号１〕
と 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' 〔配列番号４〕
から成る。別の好ましい態様では、増幅プライマー対が
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'〔配列番号２〕と
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'〔配列番号７〕から
成る。
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' 〔配列番号１〕
と 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' 〔配列番号４〕
から成る。別の好ましい態様では、増幅プライマー対が
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'〔配列番号２〕と
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'〔配列番号７〕から
成る。
【００３８】ＨＣＶゲノムの３′ＮＣＲから誘導された
有用なプライマーの非限定例としては、 5'-GGTGGCTCCA
TCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る
正プライマーと 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'
(57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーが挙げら
れる。
有用なプライマーの非限定例としては、 5'-GGTGGCTCCA
TCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る
正プライマーと 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'
(57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーが挙げら
れる。
【００３９】本発明は多重増幅、即ち同一反応混合物中
での複数の異なるプライマー対セットを使った異なる配
列の同時増幅も包含する。多重増幅反応において同時に
使うことができる好ましいプライマー対のセットは(a)
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' 〔配列番号２〕と5'
-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' 〔配列番号７〕（５′
対）および(b) 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'
〔配列番号８〕と5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'
〔配列番号９〕（３′対）である。
での複数の異なるプライマー対セットを使った異なる配
列の同時増幅も包含する。多重増幅反応において同時に
使うことができる好ましいプライマー対のセットは(a)
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' 〔配列番号２〕と5'
-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' 〔配列番号７〕（５′
対）および(b) 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'
〔配列番号８〕と5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'
〔配列番号９〕（３′対）である。
【００４０】増幅後、増幅生成物は、当該技術分野で周
知の任意方法、例えば非限定的に、アガロースまたはア
クリルアミドゲル中でのゲル電気泳動法；非同位体比色
検出法、例えばSureCell系（例えば下記の実施例１を参
照のこと）；ＥＣｉ検出法；蛍光検出法；および化学発
光法を使って検出することができる。そのような検出法
に有用な試薬は、例えばMolecular Probes, Eugene, Or
egonおよび Ortho Clinical Diagnostics, Inc., Roche
ster, NYから入手可能である。
知の任意方法、例えば非限定的に、アガロースまたはア
クリルアミドゲル中でのゲル電気泳動法；非同位体比色
検出法、例えばSureCell系（例えば下記の実施例１を参
照のこと）；ＥＣｉ検出法；蛍光検出法；および化学発
光法を使って検出することができる。そのような検出法
に有用な試薬は、例えばMolecular Probes, Eugene, Or
egonおよび Ortho Clinical Diagnostics, Inc., Roche
ster, NYから入手可能である。
【００４１】ＨＣＶ特異的増幅生成物の検出は、試料中
にＨＣＶ ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動
を用いた場合、ＨＣＶ特異的増幅生成物は、反応に用い
た増幅プライマーに相当する配列を有するＨＣＶ ＲＮ
Ａ中の位置により推定されるようなそれらのサイズによ
り確認される。比色検出用に有用なＨＣＶ特異的５′Ｎ
ＣＲ捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-GGGTCCTGG
AGGCTGCACGACACTCAT-3' 〔配列番号11〕、5'-CCTTTCGCG
ACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号12〕および5'-TTTCG
CGACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号13〕が挙げられ
る。ＨＣＶ特異的３′ＮＣＲ捕捉プローブとしては、非
限定的に、5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' 〔配列番
号14〕および5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' 〔配列
番号15〕が挙げられる。
にＨＣＶ ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動
を用いた場合、ＨＣＶ特異的増幅生成物は、反応に用い
た増幅プライマーに相当する配列を有するＨＣＶ ＲＮ
Ａ中の位置により推定されるようなそれらのサイズによ
り確認される。比色検出用に有用なＨＣＶ特異的５′Ｎ
ＣＲ捕捉プローブとしては、非限定的に、5'-GGGTCCTGG
AGGCTGCACGACACTCAT-3' 〔配列番号11〕、5'-CCTTTCGCG
ACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号12〕および5'-TTTCG
CGACCCAACACTACTCGGCT-3' 〔配列番号13〕が挙げられ
る。ＨＣＶ特異的３′ＮＣＲ捕捉プローブとしては、非
限定的に、5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' 〔配列番
号14〕および5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' 〔配列
番号15〕が挙げられる。
【００４２】１または複数の正および負５′ＮＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマー対を含有する、ＨＣＶ ＲＮ
Ａから誘導されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅するためのキッ
トを調製することができ、ここで前記正プライマーは5'
-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番
号１〕，5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)
〔配列番号２〕または5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-
3' (C143F26)〔配列番号３〕であることができ；そして
前記逆プライマーは5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'
(C133R26)〔配列番号４〕，5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGT
ACCACA-3' (C282R27) 〔配列番号５〕，5'-CACTCGCAAGC
ACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27) 〔配列番号６〕または
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番
号７〕であることができる。
ゴヌクレオチドプライマー対を含有する、ＨＣＶ ＲＮ
Ａから誘導されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅するためのキッ
トを調製することができ、ここで前記正プライマーは5'
-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番
号１〕，5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)
〔配列番号２〕または5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-
3' (C143F26)〔配列番号３〕であることができ；そして
前記逆プライマーは5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'
(C133R26)〔配列番号４〕，5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGT
ACCACA-3' (C282R27) 〔配列番号５〕，5'-CACTCGCAAGC
ACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27) 〔配列番号６〕または
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番
号７〕であることができる。
【００４３】１または複数の正および負３′ＮＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマー対を含有する、ＨＣＶ ＲＮ
Ａから誘導されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅するためのキッ
トも調製することができ、ここで前記正プライマーは5'
-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)〔配列番号
８〕であることができ；そして逆プライマーは5'-AGGCC
AGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番号９〕で
あることができる。
ゴヌクレオチドプライマー対を含有する、ＨＣＶ ＲＮ
Ａから誘導されたＨＣＶ ＤＮＡを増幅するためのキッ
トも調製することができ、ここで前記正プライマーは5'
-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)〔配列番号
８〕であることができ；そして逆プライマーは5'-AGGCC
AGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番号９〕で
あることができる。
【００４４】ＨＣＶ ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ Ｄ
ＮＡの増幅について上述した５′ＮＣＲおよび３′ＮＣ
Ｒプライマーを含んで成る、ＨＣＶ ＤＮＡの存在を検
出するためのキットも本発明の範囲内に含まれる。
ＮＡの増幅について上述した５′ＮＣＲおよび３′ＮＣ
Ｒプライマーを含んで成る、ＨＣＶ ＤＮＡの存在を検
出するためのキットも本発明の範囲内に含まれる。
【００４５】それらのキットは逆転写、増幅および生成
物検出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。
例えば、該キットは逆転写酵素、デオキシヌクレオチ
ド、ＤＮＡ増幅反応に適した耐熱性ポリメラーゼ、並び
に核酸の標識および検出用の試薬を含んで成ることがで
きる。
物検出のための試薬および説明書を更に含んでもよい。
例えば、該キットは逆転写酵素、デオキシヌクレオチ
ド、ＤＮＡ増幅反応に適した耐熱性ポリメラーゼ、並び
に核酸の標識および検出用の試薬を含んで成ることがで
きる。
【００４６】本発明は、ＨＣＶ感染の診断において；抗
ＨＣＶ療法処置の効能の試験において；およびＨＣＶ感
染試料についての輸血用血液製剤のスクリーニングにお
いて利用することができる。
ＨＣＶ療法処置の効能の試験において；およびＨＣＶ感
染試料についての輸血用血液製剤のスクリーニングにお
いて利用することができる。
【００４７】
【実施例】下記の実施例は非限定的に本発明を例証す
る。実施例１：生物学的試料中のＨＣＶの検出：５’ＨＣＶ
増幅プライマーと RocheAmplicor ＨＣＶアッセイの比
較 下記の実験は、本発明のＨＣＶアッセイとRoche Amplic
or系を比較するために行った。
る。実施例１：生物学的試料中のＨＣＶの検出：５’ＨＣＶ
増幅プライマーと RocheAmplicor ＨＣＶアッセイの比
較 下記の実験は、本発明のＨＣＶアッセイとRoche Amplic
or系を比較するために行った。
【００４８】Ａ．方法 １．試料調製：血漿試料から、 PureScript ＲＮＡ単離
試薬（Gentra Systems, MinneapolisMN）を使ってＲＮ
Ａを調製した。体液についての製造業者のプロトコルへ
の変更として、20 gではなく40 gのグリコーゲンをウイ
ルスＲＮＡの沈澱に役立つ担体として使用することを含
んだ。更に、大部分において、ＲＮＡのイソプロピルア
ルコール沈澱とエタノールによるＲＮＡペレットの洗浄
の後に、製造業者により提供されるＲＮＡハイブリダイ
ゼーション溶液ではなく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡ
ペレットを再懸濁した。
試薬（Gentra Systems, MinneapolisMN）を使ってＲＮ
Ａを調製した。体液についての製造業者のプロトコルへ
の変更として、20 gではなく40 gのグリコーゲンをウイ
ルスＲＮＡの沈澱に役立つ担体として使用することを含
んだ。更に、大部分において、ＲＮＡのイソプロピルア
ルコール沈澱とエタノールによるＲＮＡペレットの洗浄
の後に、製造業者により提供されるＲＮＡハイブリダイ
ゼーション溶液ではなく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡ
ペレットを再懸濁した。
【００４９】２．逆転写：ジエチルピロカルボネート
（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP
(Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー (Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ)または特異的逆転写
プライマーおよび20単位のRNasin（Promega, Madison,
Wisoconsin）を含有する溶液50 Ｌ中の100 Ｕの組換え
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵
素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland ）を
添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を触
媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、ＲＴ反
応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊した。各
反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間超遠心
した。
（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP
(Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー (Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ)または特異的逆転写
プライマーおよび20単位のRNasin（Promega, Madison,
Wisoconsin）を含有する溶液50 Ｌ中の100 Ｕの組換え
モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵
素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland ）を
添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を触
媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、ＲＴ反
応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊した。各
反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間超遠心
した。
【００５０】３．ＰＣＲ増幅：ＰＣＲは、25 mM Tris-H
Cl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM
NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5
％グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ
胸腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mMの各dNTP, 0.4 M の各プライ
マー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プ
ラスミドＤＮＡおよび16 ＵのTaq ポリメラーゼを含む
溶液 100 Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elm
er）中で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1
-12 とTP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号
明細書に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１の
モル比で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する
抗体のモル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の
変性の後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクル
の増幅を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の
最終加熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。
使用したプライマーを下記の第２表に示す。
Cl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM
NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5
％グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ
胸腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mMの各dNTP, 0.4 M の各プライ
マー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プ
ラスミドＤＮＡおよび16 ＵのTaq ポリメラーゼを含む
溶液 100 Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elm
er）中で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1
-12 とTP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号
明細書に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１の
モル比で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する
抗体のモル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の
変性の後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクル
の増幅を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の
最終加熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。
使用したプライマーを下記の第２表に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】推定される生成物サイズを下記の第３表に
示す。
示す。
【表３】
【００５３】４．ＰＣＲ生成物の検出：増幅中に５′−
ビオチン標識プライマー（センス鎖）を使用してＰＣＲ
生成物をビオチン化した。フロースルー膜の表面上に付
着させたラテックス粒子に共有結合せしめたオリゴヌク
レオチドプローブへのハイブリダイセーションにより、
生成物を捕捉した（SureCell試験）。プローブは 5'-GG
GTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'（C96-27-PRBと称する）
〔配列番号11〕；5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
（C252-27-PRB と称する）〔配列番号12〕および5'-TTT
CGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' （C252-25-PRB と称する）
〔配列番号13〕であった。生じたプローブ／生成物複合
体を、色素前駆体から色素（青色）への酸化的変換を触
媒するストレプトアビジン（ＳＡ）−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）接合体と反応させた。色の強度を
色標準に比較することにより、青色の強度を目視により
採点した（０〜10）。目に見える色の得点＞３は、全て
陽性結果であると見なした。
ビオチン標識プライマー（センス鎖）を使用してＰＣＲ
生成物をビオチン化した。フロースルー膜の表面上に付
着させたラテックス粒子に共有結合せしめたオリゴヌク
レオチドプローブへのハイブリダイセーションにより、
生成物を捕捉した（SureCell試験）。プローブは 5'-GG
GTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'（C96-27-PRBと称する）
〔配列番号11〕；5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
（C252-27-PRB と称する）〔配列番号12〕および5'-TTT
CGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' （C252-25-PRB と称する）
〔配列番号13〕であった。生じたプローブ／生成物複合
体を、色素前駆体から色素（青色）への酸化的変換を触
媒するストレプトアビジン（ＳＡ）−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）接合体と反応させた。色の強度を
色標準に比較することにより、青色の強度を目視により
採点した（０〜10）。目に見える色の得点＞３は、全て
陽性結果であると見なした。
【００５４】５．Roche Amplicorアッセイ：Roche Ampl
icorアッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swit
hland ）は、製造業者の教示に従って実施した。
icorアッセイ（Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Swit
hland ）は、製造業者の教示に従って実施した。
【００５５】Ｂ．結果 ブラジル人とエジプト人患者からの42の試料のパネルを
上述した通りにＨＣＶについて試験した。それらの試料
の一部はChiron B-DNAアッセイを使っても試験した。ブ
ラジル人試料はアメリカ人試料に比較してより大きい比
率がＨＣＶ遺伝子型３を含むと予想され、そしてエジプ
ト人試料はアメリカでは稀にしか見られない遺伝子型で
あるＨＣＶ遺伝子型４から大部分成ると予想された。全
ての反応は二重反復試験において行った。プラスの表示
は二重反復試験の両方とも陽性であったことを示す。結
果を下の第４表に示す。
上述した通りにＨＣＶについて試験した。それらの試料
の一部はChiron B-DNAアッセイを使っても試験した。ブ
ラジル人試料はアメリカ人試料に比較してより大きい比
率がＨＣＶ遺伝子型３を含むと予想され、そしてエジプ
ト人試料はアメリカでは稀にしか見られない遺伝子型で
あるＨＣＶ遺伝子型４から大部分成ると予想された。全
ての反応は二重反復試験において行った。プラスの表示
は二重反復試験の両方とも陽性であったことを示す。結
果を下の第４表に示す。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【００５９】本発明の５′ＮＣＲプライマーを使って得
られた結果とRoche アッセイ系を使って得られた結果を
下記の第５表と第６表に要約する。
られた結果とRoche アッセイ系を使って得られた結果を
下記の第５表と第６表に要約する。
【００６０】
【表７】
【００６１】
【表８】
【００６２】本発明のプライマーはいずれもRoche Ampl
icorアッセイに比べて優れた感度を示した。プライマー
対69F/133Rの使用は最大感度を提供した。Roche Amplic
orアッセイを使った時に陰性であった５つの試料が、本
発明のC131/C294 プライマー対を使った場合に陽性であ
り、またRoche Amplicorアッセイを使った時に陰性であ
った11の試料が本発明の69F/133Rプライマー対を使った
場合に陽性であった。更に、Chiron bDNA アッセイによ
り検出可能であるウイルス負荷量を有する試料の全てが
本発明のプライマーを使って検出されたのに対し、それ
らのうちの３つの試料がRoche Amplicorアッセイを使う
と検出されなかった。陰性対照は本発明のアッセイにお
いて１つも陽性として記録されなかった。
icorアッセイに比べて優れた感度を示した。プライマー
対69F/133Rの使用は最大感度を提供した。Roche Amplic
orアッセイを使った時に陰性であった５つの試料が、本
発明のC131/C294 プライマー対を使った場合に陽性であ
り、またRoche Amplicorアッセイを使った時に陰性であ
った11の試料が本発明の69F/133Rプライマー対を使った
場合に陽性であった。更に、Chiron bDNA アッセイによ
り検出可能であるウイルス負荷量を有する試料の全てが
本発明のプライマーを使って検出されたのに対し、それ
らのうちの３つの試料がRoche Amplicorアッセイを使う
と検出されなかった。陰性対照は本発明のアッセイにお
いて１つも陽性として記録されなかった。
【００６３】第二系列の実験において、以前にＨＣＶ抗
体について陽性であると決定されたブラジル人からの15
0 の血漿試料を、Roche Amplicorアッセイと本発明のプ
ライマーを使って試験した。下記の第７表と第８表は、
SureCellカラースコアに基づいた結果を示す。各反応ご
とに、生成物をゲル上で調べて結果を確かめた。陰性の
血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から成る陰性対照
（臨床試料の所々に置いた）を各プライマーセットに含
めた。全ての陰性対照結果が陰性であった。
体について陽性であると決定されたブラジル人からの15
0 の血漿試料を、Roche Amplicorアッセイと本発明のプ
ライマーを使って試験した。下記の第７表と第８表は、
SureCellカラースコアに基づいた結果を示す。各反応ご
とに、生成物をゲル上で調べて結果を確かめた。陰性の
血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から成る陰性対照
（臨床試料の所々に置いた）を各プライマーセットに含
めた。全ての陰性対照結果が陰性であった。
【００６４】
【表９】
【００６５】
【表１０】
【００６６】本発明の５′ＮＣＲプライマー対は２つと
もRoche アッセイ系に比較して優れた感度を示した。最
大感度は69F/133Rプライマー対を使った場合に達成さ
れ、このプライマー対はC131/C294 プライマー対に比較
して更に３つの追加の試料中のＨＣＶ ＲＮＡの存在を
検出した。
もRoche アッセイ系に比較して優れた感度を示した。最
大感度は69F/133Rプライマー対を使った場合に達成さ
れ、このプライマー対はC131/C294 プライマー対に比較
して更に３つの追加の試料中のＨＣＶ ＲＮＡの存在を
検出した。
【００６７】実施例２：５′ＮＣＲ ＨＣＶアッセイ感
度の分析 次の実験は、本発明の５′ＮＣＲプライマー対を使った
ＨＣＶアッセイの感度を調べるために行った。 １．３つの患者試料をＨＣＶ ＲＮＡの理論的コピー数
に基づいて希釈し、そしてRoche Amplicor系および本発
明のプライマー対を使ってＨＣＶ ＲＮＡについてアッ
セイした。結果を下記の第９表に示す。
度の分析 次の実験は、本発明の５′ＮＣＲプライマー対を使った
ＨＣＶアッセイの感度を調べるために行った。 １．３つの患者試料をＨＣＶ ＲＮＡの理論的コピー数
に基づいて希釈し、そしてRoche Amplicor系および本発
明のプライマー対を使ってＨＣＶ ＲＮＡについてアッ
セイした。結果を下記の第９表に示す。
【００６８】
【表１１】
【００６９】３セットの希釈患者試料の全てにおいて、
本発明の５′ＮＣＲプライマー対を使ったアッセイがRo
che アッセイよりも大きい感度を示した。
本発明の５′ＮＣＲプライマー対を使ったアッセイがRo
che アッセイよりも大きい感度を示した。
【００７０】２．ＨＣＶ陽性であることが知られている
血漿をＨＣＶ陰性血漿で希釈し、そして上述した通りに
試験した。内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミドを反応あ
たり10コピー数で反応混合物中に含めた。結果（５つの
実験の編集）を下記の第10表に示す。
血漿をＨＣＶ陰性血漿で希釈し、そして上述した通りに
試験した。内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミドを反応あ
たり10コピー数で反応混合物中に含めた。結果（５つの
実験の編集）を下記の第10表に示す。
【００７１】
【表１２】
【００７２】C131F/C294R ５′ＮＣＲプライマー対は優
れた感度を示し、そしてポイゾン分布分析により推定す
るとＰＣＲ反応あたりウイルス粒子１個ほどの少数を検
出することができた。
れた感度を示し、そしてポイゾン分布分析により推定す
るとＰＣＲ反応あたりウイルス粒子１個ほどの少数を検
出することができた。
【００７３】３．低いＨＣＶウイルス価（範囲＝316 〜
8080コピー数／ml, これはＰＣＲ反応あたり16〜404 コ
ピー数に相当する）を有する患者からの18の患者試料。
試験した18個の試料のうちの17個が本発明のアッセイに
おいて陽性であった。
8080コピー数／ml, これはＰＣＲ反応あたり16〜404 コ
ピー数に相当する）を有する患者からの18の患者試料。
試験した18個の試料のうちの17個が本発明のアッセイに
おいて陽性であった。
【００７４】実施例３：生物学的試料中のＨＣＶの検
出：３′ＮＣＲ ＨＣＶ増幅プライマーと Roche Ampli
cor ＨＣＶアッセイとの比較 ＨＣＶ抗体について陽性であると以前に決定されたブラ
ジル人からの150 個の血漿試料を、Roche Amplicorアッ
セイと本発明の３′ＮＣＲプライマーを使って試験し
た。逆転写と増幅は上記実施例１に記載の通りに行っ
た。逆転写は配列 5'-GTATCAGCACTC-3' 〔配列番号16〕
を有するプライマーを使って行い、そして増幅はX1F27/
57R27 プライマー対を使って行った。各反応にはプラス
ミドＤＮＡの内部陽性対照（ＩＰＣ）を含めた。増幅生
成物の検出は捕捉プローブとして3X30PR25を使ってSure
Cell系を用いて行った。各反応ごとに、生成物をゲル上
で分析して結果を確かめた。陰性の血漿試料と水（ＲＮ
Ａ不含有）の両方から成る陰性対照（臨床試料の所々に
置いた）を各プライマーセットに含めた。ＲＴ−ＰＣＲ
において全てが陰性であった。本発明のプライマーを使
って得られた結果とRoche アッセイを使って得られた結
果との比較を下の第11表に要約する。
出：３′ＮＣＲ ＨＣＶ増幅プライマーと Roche Ampli
cor ＨＣＶアッセイとの比較 ＨＣＶ抗体について陽性であると以前に決定されたブラ
ジル人からの150 個の血漿試料を、Roche Amplicorアッ
セイと本発明の３′ＮＣＲプライマーを使って試験し
た。逆転写と増幅は上記実施例１に記載の通りに行っ
た。逆転写は配列 5'-GTATCAGCACTC-3' 〔配列番号16〕
を有するプライマーを使って行い、そして増幅はX1F27/
57R27 プライマー対を使って行った。各反応にはプラス
ミドＤＮＡの内部陽性対照（ＩＰＣ）を含めた。増幅生
成物の検出は捕捉プローブとして3X30PR25を使ってSure
Cell系を用いて行った。各反応ごとに、生成物をゲル上
で分析して結果を確かめた。陰性の血漿試料と水（ＲＮ
Ａ不含有）の両方から成る陰性対照（臨床試料の所々に
置いた）を各プライマーセットに含めた。ＲＴ−ＰＣＲ
において全てが陰性であった。本発明のプライマーを使
って得られた結果とRoche アッセイを使って得られた結
果との比較を下の第11表に要約する。
【００７５】
【表１３】
【００７６】実施例４：生物学的試料中のＨＣＶの検
出：本発明とRochester General Hospital（ＲＧＨ）
５′ＮＣＲ嵌め込みＰＣＲアッセイとの比較 次の実験は、本発明の３′ＮＣＲ ＨＣＶプライマーと
ＲＧＨ嵌め込みＰＣＲ検出法とを比較するために行っ
た。上記実施例１に記載した方法を用いて、57R27 プラ
イマーを使って83個の血漿試料を逆転写し、そして3X1F
27/57R27プライマー対を使って逆転写生成物を増幅させ
た。各反応ごとに、生成物をゲル上で分析して結果を確
かめた。陰性血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から
成る陰性対照（臨床試料の所々に置いた）を実験に含め
たが、このアッセイにおいて陰性対照は全て陰性であっ
た。
出：本発明とRochester General Hospital（ＲＧＨ）
５′ＮＣＲ嵌め込みＰＣＲアッセイとの比較 次の実験は、本発明の３′ＮＣＲ ＨＣＶプライマーと
ＲＧＨ嵌め込みＰＣＲ検出法とを比較するために行っ
た。上記実施例１に記載した方法を用いて、57R27 プラ
イマーを使って83個の血漿試料を逆転写し、そして3X1F
27/57R27プライマー対を使って逆転写生成物を増幅させ
た。各反応ごとに、生成物をゲル上で分析して結果を確
かめた。陰性血漿試料と水（ＲＮＡ不含有）の両方から
成る陰性対照（臨床試料の所々に置いた）を実験に含め
たが、このアッセイにおいて陰性対照は全て陰性であっ
た。
【００７７】本発明のプライマーを使って得られた結果
とRoche アッセイ系を使って得られた結果との比較を下
の第12表に要約する。
とRoche アッセイ系を使って得られた結果との比較を下
の第12表に要約する。
【００７８】
【表１４】
【００７９】これらの結果は、本発明の検出系がＲＧＨ
嵌め込みＰＣＲ系に比較して感受性であり且つ特異的で
あることを証明する。本発明のアッセイは、26個の陰性
試料のうちの25個に関してＲＧＨアッセイの結果と一致
した。嵌め込みＰＣＲでは、新しい試薬を添加するため
に反応中にチューブを開けなければならないのに対し、
本発明の利点は、嵌め込みＰＣＲを実施する時よりも、
後への持ち越し(carryover) の機会が少ない点である。
偽陽性結果を示す残りの１つの試料は、嵌め込みＰＣＲ
プロトコルにより引き起こされる持ち越しの実例である
のかもしれない。
嵌め込みＰＣＲ系に比較して感受性であり且つ特異的で
あることを証明する。本発明のアッセイは、26個の陰性
試料のうちの25個に関してＲＧＨアッセイの結果と一致
した。嵌め込みＰＣＲでは、新しい試薬を添加するため
に反応中にチューブを開けなければならないのに対し、
本発明の利点は、嵌め込みＰＣＲを実施する時よりも、
後への持ち越し(carryover) の機会が少ない点である。
偽陽性結果を示す残りの１つの試料は、嵌め込みＰＣＲ
プロトコルにより引き起こされる持ち越しの実例である
のかもしれない。
【００８０】実施例５：３′ＮＣＲ ＨＣＶアッセイの
コピー感度 次の実験は、本発明の３′ＮＣＲ ＨＣＶアッセイの検
出感度を調べるために行った。Roche Monitor とChiron
b-DNAアッセイを使ってＨＣＶについて既に試験されて
いる血漿試料をBoston Biomedica, Inc.より入手した。
ＲＮＡを調製し、１mlあたり20〜1000コピーのＨＣＶ
ＲＮＡを含むように希釈し、そして上記実施例１に記載
した方法を使って逆転写と増幅反応にかけた。逆転写は
66RT（12マー）プライマー（第13表参照）または57R27
（27マー）プライマー（第14表参照）を使って行い、そ
してＰＣＲは1F27正プライマーと57R27 逆プライマーを
それぞれ使って行った。内部陽性対照（ＩＰＣ）プライ
マーもこのアッセイに含め、これは各試料について陽性
結果を与えた。下記に示す結果は、捕捉プローブとして
3X-30PRB25を使ったSureCellとゲルバンド上で陽性であ
った試料の％を示す。
コピー感度 次の実験は、本発明の３′ＮＣＲ ＨＣＶアッセイの検
出感度を調べるために行った。Roche Monitor とChiron
b-DNAアッセイを使ってＨＣＶについて既に試験されて
いる血漿試料をBoston Biomedica, Inc.より入手した。
ＲＮＡを調製し、１mlあたり20〜1000コピーのＨＣＶ
ＲＮＡを含むように希釈し、そして上記実施例１に記載
した方法を使って逆転写と増幅反応にかけた。逆転写は
66RT（12マー）プライマー（第13表参照）または57R27
（27マー）プライマー（第14表参照）を使って行い、そ
してＰＣＲは1F27正プライマーと57R27 逆プライマーを
それぞれ使って行った。内部陽性対照（ＩＰＣ）プライ
マーもこのアッセイに含め、これは各試料について陽性
結果を与えた。下記に示す結果は、捕捉プローブとして
3X-30PRB25を使ったSureCellとゲルバンド上で陽性であ
った試料の％を示す。
【００８１】
【表１５】
【００８２】
【表１６】
【００８３】３′ＮＣＲ ＨＣＶアッセイは、アッセイ
時間の100 ％で1000ウイルスコピー数／mlを検出し、そ
してアッセイ時間の88〜100 ％で200 コピー数／mlを検
出した。100 コピー数／mlでは、試料のほぼ50％におい
てウイルスが検出された（12マーのＲＴプライマーを使
った時）。ポアソン分布は、反応あたり１コピーで（20
個のウイルス粒子／ml）、陽性結果の頻度が約60％であ
るだろうと推測する。このウイルスレベルでの20％検出
の結果は、ＨＣＶの３′非コード領域が全てのウイルス
粒子に存在するわけではないという可能性か、または短
鎖（12マー）の逆転写プライマーを使った場合にこのア
ッセイで本質的な感度低下があるという可能性のためか
もしれない。同じ試料において５′ＮＣＲプライマーを
使って逆転写／増幅アッセイを行うことにより、20コピ
ー数／mlにおいてより高い検出レベルが得られ、後者方
の解釈が裏付けられた。これらの結果は、より長鎖（27
マー）のプライマーを逆転写に用いることにより、３′
ＮＣアッセイの感度を増加することができることを示す
（12マーおよび27マーを使った10コピー数／反応の検出
を、それぞれ第13表と第14表に比較する）。
時間の100 ％で1000ウイルスコピー数／mlを検出し、そ
してアッセイ時間の88〜100 ％で200 コピー数／mlを検
出した。100 コピー数／mlでは、試料のほぼ50％におい
てウイルスが検出された（12マーのＲＴプライマーを使
った時）。ポアソン分布は、反応あたり１コピーで（20
個のウイルス粒子／ml）、陽性結果の頻度が約60％であ
るだろうと推測する。このウイルスレベルでの20％検出
の結果は、ＨＣＶの３′非コード領域が全てのウイルス
粒子に存在するわけではないという可能性か、または短
鎖（12マー）の逆転写プライマーを使った場合にこのア
ッセイで本質的な感度低下があるという可能性のためか
もしれない。同じ試料において５′ＮＣＲプライマーを
使って逆転写／増幅アッセイを行うことにより、20コピ
ー数／mlにおいてより高い検出レベルが得られ、後者方
の解釈が裏付けられた。これらの結果は、より長鎖（27
マー）のプライマーを逆転写に用いることにより、３′
ＮＣアッセイの感度を増加することができることを示す
（12マーおよび27マーを使った10コピー数／反応の検出
を、それぞれ第13表と第14表に比較する）。
【００８４】実施例６：異なるＨＣＶ遺伝子型を有する
患者試料の分析 次の実験は、異なる遺伝子型を有するＨＣＶの検出を評
価するために行った。 １．遺伝子型包括性：様々なＨＣＶ遺伝子型を表すチン
パンジーの血漿を米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入
手した。血漿を調製しそして上記実施例１に記載した通
りに処理した。５′ＮＣＲプライマーはC131F とC294R
（それぞれ正プライマーと逆プライマー）であり、３′
ＮＣＲプライマーは1F27と57R27 （それぞれ正プライマ
ーと逆プライマー）であった。臭化エチジウム染色した
４％アガロースゲル上でのＰＣＲ生成物の分析により結
果を得た。陽性結果は複製試料に基づいて得られた。下
記の第15表（５′ＮＣＲプライマーを使った場合）およ
び第16表（３′ＮＣＲプライマーを使った場合）に結果
を示す。
患者試料の分析 次の実験は、異なる遺伝子型を有するＨＣＶの検出を評
価するために行った。 １．遺伝子型包括性：様々なＨＣＶ遺伝子型を表すチン
パンジーの血漿を米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入
手した。血漿を調製しそして上記実施例１に記載した通
りに処理した。５′ＮＣＲプライマーはC131F とC294R
（それぞれ正プライマーと逆プライマー）であり、３′
ＮＣＲプライマーは1F27と57R27 （それぞれ正プライマ
ーと逆プライマー）であった。臭化エチジウム染色した
４％アガロースゲル上でのＰＣＲ生成物の分析により結
果を得た。陽性結果は複製試料に基づいて得られた。下
記の第15表（５′ＮＣＲプライマーを使った場合）およ
び第16表（３′ＮＣＲプライマーを使った場合）に結果
を示す。
【００８５】
【表１７】
【００８６】
【表１８】
【００８７】２．患者試料：既知遺伝子型を有する27の
未希釈患者試料を、上述した通りにC131F およびC294R
プライマーを使ってアッセイした。SureCell検出法を使
って結果を確認した（ＨＣＶ生成物およびＩＰＣ生成物
の捕捉プローブとしてそれぞれ C252-PRB25とIPC-1Pを
使って）。パネルは、ＨＣＶ遺伝子型１〜４と６に感染
した代表的な血漿試料を含んだ。患者試料は様々な地理
的領域（スコットランド、チュニジア、サウジアラビア
および香港）からものであった。各試料は二重反復試験
した（例えば６つの遺伝子型１試料を試験した）。
未希釈患者試料を、上述した通りにC131F およびC294R
プライマーを使ってアッセイした。SureCell検出法を使
って結果を確認した（ＨＣＶ生成物およびＩＰＣ生成物
の捕捉プローブとしてそれぞれ C252-PRB25とIPC-1Pを
使って）。パネルは、ＨＣＶ遺伝子型１〜４と６に感染
した代表的な血漿試料を含んだ。患者試料は様々な地理
的領域（スコットランド、チュニジア、サウジアラビア
および香港）からものであった。各試料は二重反復試験
した（例えば６つの遺伝子型１試料を試験した）。
【００８８】本発明のプライマー系は、このパネルに含
まれる全ての遺伝子型試料を増幅することができた。C1
31F25/C294R25 プライマーは、今までに可能な全てのＨ
ＣＶ遺伝子型（遺伝子型１〜６）を同定した。
まれる全ての遺伝子型試料を増幅することができた。C1
31F25/C294R25 プライマーは、今までに可能な全てのＨ
ＣＶ遺伝子型（遺伝子型１〜６）を同定した。
【００８９】３．低コピー数試料：異なる遺伝子型（１
〜６，アメリカ合衆国、スコットランド、チュニジア、
サウジアラビアおよび香港から得られた）のＨＣＶを含
む試料を、Roche MonitorAssay を使って定量し、ＰＣ
Ｒ反応あたり50ウイルスコピー数（1000コピー数／ml）
に希釈し、そして上述した通りにC131F およびC294R プ
ライマーを使ってアッセイした。全ての試料が本発明の
プライマーを使って検出された。
〜６，アメリカ合衆国、スコットランド、チュニジア、
サウジアラビアおよび香港から得られた）のＨＣＶを含
む試料を、Roche MonitorAssay を使って定量し、ＰＣ
Ｒ反応あたり50ウイルスコピー数（1000コピー数／ml）
に希釈し、そして上述した通りにC131F およびC294R プ
ライマーを使ってアッセイした。全ての試料が本発明の
プライマーを使って検出された。
【００９０】実施例７：５′および３′増幅プライマー
対の両方を使った多重アッセイ 次の実験は、単一の反応混合物における５′ＮＣＲと
３′ＮＣＲの同時増幅の効果を分析するために行った。
対の両方を使った多重アッセイ 次の実験は、単一の反応混合物における５′ＮＣＲと
３′ＮＣＲの同時増幅の効果を分析するために行った。
【００９１】Ａ．Roche Monitor Assay との比較 反応あたり45〜17,000ウイルスコピー数当量を含む73個
の患者試料を試験した。試料は、インターフェロンで治
療していた、ＨＣＶに感染していることが知られている
患者からのものであった。結果として、数人の患者はほ
とんどまたは全く循環しているウイルスを持たなかっ
た。５′ＮＣＲプライマー対 131F/294Rと３′ＮＣＲプ
ライマー対 1F27/57R27 並びにＩＰＣプライマーを使っ
て多重方式でこのパネルを試験した。陰性の臨床試料を
試験試料の所々に置いた。全ての陰性試料が陰性ＲＴ−
ＰＣＲを与えた。その結果を、定量的Roche Monitor As
say(Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Switzerland）
を使って得られた結果と比較した。その結果を下記の第
17表に要約する。
の患者試料を試験した。試料は、インターフェロンで治
療していた、ＨＣＶに感染していることが知られている
患者からのものであった。結果として、数人の患者はほ
とんどまたは全く循環しているウイルスを持たなかっ
た。５′ＮＣＲプライマー対 131F/294Rと３′ＮＣＲプ
ライマー対 1F27/57R27 並びにＩＰＣプライマーを使っ
て多重方式でこのパネルを試験した。陰性の臨床試料を
試験試料の所々に置いた。全ての陰性試料が陰性ＲＴ−
ＰＣＲを与えた。その結果を、定量的Roche Monitor As
say(Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Switzerland）
を使って得られた結果と比較した。その結果を下記の第
17表に要約する。
【００９２】
【表１９】
【００９３】本発明の５′および３′プライマー対を使
った場合、５′ＮＣＲおよび３′ＮＣＲアッセイにおい
て、Roche Monitor 結果によると未検出であった追加の
試料を検出することができた。このことは本発明のプラ
イマーを使用するアッセイは、低ウイルス負荷量を有す
る患者をアッセイする場合は Rocheアッセイよりも高い
感度を示す。Roche アッセイによって未検出であったこ
の陽性試料を、別の５′ＮＣＲプライマー 69F/133R を
使って確かめた。
った場合、５′ＮＣＲおよび３′ＮＣＲアッセイにおい
て、Roche Monitor 結果によると未検出であった追加の
試料を検出することができた。このことは本発明のプラ
イマーを使用するアッセイは、低ウイルス負荷量を有す
る患者をアッセイする場合は Rocheアッセイよりも高い
感度を示す。Roche アッセイによって未検出であったこ
の陽性試料を、別の５′ＮＣＲプライマー 69F/133R を
使って確かめた。
【００９４】Ｂ．Roche Amplicor Assayとの比較 組換え免疫ブロットアッセイ（ＲＩＢＡ）を使って中間
物として試験した16個の患者試料を、５′プライマー対
131F/294Rと３′プライマー対 1F27/57R27 を使って多
重方式で試験した。その結果を定量的Roche Amplicorア
ッセイを使ったものと比較した。結果を下記の第18表に
要約する。
物として試験した16個の患者試料を、５′プライマー対
131F/294Rと３′プライマー対 1F27/57R27 を使って多
重方式で試験した。その結果を定量的Roche Amplicorア
ッセイを使ったものと比較した。結果を下記の第18表に
要約する。
【００９５】
【表２０】
【００９６】本発明のアッセイとRoche アッセイとは10
0 ％の一致が見られた。全てのＰＣＲ反応は、単一のＲ
ＮＡ抽出物から二重反復試験として行った。陰性試料
は、別の５′ＮＣＲプライマー対（69F/133R）を使った
増幅により確認した。再試験した全ての陰性試料が「真
の」陰性試料として確認された。
0 ％の一致が見られた。全てのＰＣＲ反応は、単一のＲ
ＮＡ抽出物から二重反復試験として行った。陰性試料
は、別の５′ＮＣＲプライマー対（69F/133R）を使った
増幅により確認した。再試験した全ての陰性試料が「真
の」陰性試料として確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケビン エム．ゴーマン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ロチェスター，コンラッド ドライブ 204
Claims (64)
- 【請求項１】 生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法であって、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌクレオチ
ドプライマー対を使用して前記逆転写生成物を増幅せし
めることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させ、 ここで前記プライマー対は(a) 正プライマー 5'-CAGAA
AGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕
と逆プライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'
(C133R26)〔配列番号４〕；または(b) 正プライマー
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番
号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA
-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；および(c) 正プライマ
ー 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配
列番号３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'
(C282R27)〔配列番号５〕および(ii) 5'-CACTCGCAAGCA
CCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕から成る
群より選ばれた逆プライマーから成る群より選ばれ；そ
して (C) 前記増幅生成物を検出し、 ここで前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ Ｒ
ＮＡの存在を示すことを含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記逆転写反応がランダムオリゴヌクレ
オチドプライマーを使って行われる、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 前記逆転写反応が、ＨＣＶ ＲＮＡ中の
配列に相当する配列を有する１または複数のオリゴヌク
レオチドプライマーを使って行われる、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項４】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リ
ガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基置換および転
写媒介増幅から成る群より選ばれた方法により行われ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記検出が、ゲル電気泳動により前記増
幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項６】 前記検出が、１または複数のＨＣＶ特異
的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体上
で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使っ
て前記捕捉された生成物を定量することを含んで成る、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記正プライマーが(C131F25) または(C
143F26) である場合には、前記プローブが(a) 5'-TTTCG
CGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB) 〔配列番号1
3〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C2
52-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より選ばれたメ
ンバーを含んで成り；そして前記正プライマーが(C69F2
8)である場合には、前記プローブが(c) 5'-GGGTCCTGGAG
GCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配列番号11〕を含
んで成る、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾液
および脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項９】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの増
幅方法であって、(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含むＤＮＡ試料
において、ＨＣＶに特異的な１または複数のオリゴヌク
レオチドプライマー対を使ってポリメラーゼ連鎖反応を
行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物を生成させる
ことを含んで成り、 前記プライマー対が(a) 正プライマー 5'-CAGAAAGCGTC
TAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プ
ライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R2
6)〔配列番号４〕；または(b) 正プライマー 5'-GGGAG
AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕と
逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C29
4R25) 〔配列番号７〕；および(c) 正プライマー 5'-G
TGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号
３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282
R27)〔配列番号５〕および(ii) 5'-CACTCGCAAGCACCCTAT
CAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕から成る群より
選ばれた逆プライマーから成る群より選ばれることを特
徴とする方法。 - 【請求項１０】 (B) 前記増幅生成物を検出することを
更に含んで成り、 前記増幅生成物の検出が前記試料中にＨＣＶ ＤＮＡの
存在を示す、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記検出が、ゲル電気泳動により前記
増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記検出が、１または複数のＨＣＶ特
異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体
上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使
って捕捉された生成物を定量することを含んで成る、請
求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記正プライマーが(C131F25) または
(C143F26) である場合には、前記プローブが(a) 5'-TTT
CGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB) 〔配列番号
13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C
252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より選ばれたメ
ンバーを含んで成り；そして前記正プライマーが(C69F2
8)である場合には、前記プローブが(c) 5'-GGGTCCTGGAG
GCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配列番号11〕を含
んで成る、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１４】 生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法であって、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) 正プライマーと逆プライマーを使って前記逆転写生
成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成物
を生成させ、 ここで前記正プライマーはオリゴヌクレオチド 5'-GGTG
GCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕か
ら成り、そして前記逆プライマーはオリゴヌクレオチド
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番
号９〕から成り；そして (C) 前記増幅生成物を検出し、 ここで前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ Ｒ
ＮＡの存在を示すことを含んで成る方法。 - 【請求項１５】 前記逆転写反応が、ランダムオリゴヌ
クレオチドプライマーを使って行われる、請求項１４に
記載の方法。 - 【請求項１６】 前記逆転写反応が、ＨＣＶ ＲＮＡ中
の配列に相当する配列を有する１または複数のオリゴヌ
クレオチドプライマーを使って行われる、請求項１４に
記載の方法。 - 【請求項１７】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、
リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基置換および
転写媒介増幅から成る群より選ばれた方法により行われ
る、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記検出が、ゲル電気泳動により前記
増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記検出が、１または複数のＨＣＶ特
異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体
上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使
って前記捕捉された生成物を定量することを含んで成
る、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記プローブが 5'-GCGGCTCACGGACCTT
TCACAGCTA-3' (30PRB25)〔配列番号14〕および5'-ATGCG
GCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32PRB25) 〔配列番号15〕か
ら成る群より選ばれる、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾
液および脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項２２】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの
増幅方法であって、(A) ＨＣＶ ＤＮＡを含むＤＮＡ試
料において、正プライマーと逆プライマーを使ってポリ
メラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅
生成物を生成させることを含んで成り、 前記正プライマーがオリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCA
TCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) 〔配列番号８〕から成
り、そして前記逆プライマーがオリゴヌクレオチド 5'-
AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号
９〕から成る方法。 - 【請求項２３】 (B) 前記増幅生成物を検出することを
更に含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中に
ＨＣＶ ＤＮＡの存在を示す、請求項２２に記載の方
法。 - 【請求項２４】 前記検出が、ゲル電気泳動により前記
増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項２３
に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記検出が、１または複数のＨＣＶ特
異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体
上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使
って前記捕捉された生成物を定量することを含んで成
る、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記プローブが、5'-GCGGCTCACGGACCT
TTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号14〕および 5'-AT
GCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32PRB25)〔配列番号15〕
から成る群より選ばれる、請求項２５に記載の方法。 - 【請求項２７】 生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）ＲＮＡの存在の検出方法であって、 (A) 鋳型として前記試料から誘導したＲＮＡを使って逆
転写反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的逆転写生成物
を生成させ； (B) ＨＣＶに特異的な１または複数の５′ＮＣＲオリゴ
ヌクレオチドプライマー対と１または複数の３′ＮＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー対を使って、前記逆転写
生成物を増幅させることにより、ＨＣＶ特異的増幅生成
物を生成させ、 ここで前記５′ＮＣＲプライマー対が(a) 正プライマー
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配
列番号１〕と逆プライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGG
CTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕；または(b) 正プラ
イマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)
〔配列番号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCA
CCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；および(c) 正
プライマー 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143
F26)〔配列番号３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTA
CCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕および(ii) 5'-CACT
CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕
から成る群より選ばれた逆プライマーから成る群より選
ばれ、前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対
の各々がオリゴヌクレオチド5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTA
GTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマ
ーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTG
CAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマー
とを含んで成り；そして (C) 前記増幅生成物を検出することを含んで成り、 前記増幅生成物の検出が前記試料中のＨＣＶ ＲＮＡの
存在を示すことを特徴とする方法。 - 【請求項２８】 前記逆転写反応がランダムオリゴヌク
レオチドプライマーを使って行われる、請求項２７に記
載の方法。 - 【請求項２９】 前記逆転写反応が、ＨＣＶ ＲＮＡ中
の配列に相当する配列を有する１または複数のオリゴヌ
クレオチドプライマーを使って行われる、請求項２７に
記載の方法。 - 【請求項３０】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、
リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基置換および
転写媒介増幅から成る群より選ばれた方法により行われ
る、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記検出が、ゲル電気泳動により前記
増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項２７
に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記検出が、１または複数のＨＣＶ特
異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体
上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使
って捕捉された生成物を定量することを含んで成る、請
求項２７に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記５′ＮＣＲ正プライマーが(C131F
25) または(C143F26) である場合には、前記プローブが
(a) 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB)
〔配列番号13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTC
GGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より
選ばれたメンバーを含んで成り；前記５′ＮＣＲ正プラ
イマーが(C69F28)である場合には、前記プローブが(c)
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配
列番号11〕を含んで成り；そして前記プローブが(d) 5'
-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号
14〕および(e) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32P
RB25) 〔配列番号15〕から成る群より選ばれたメンバー
を含んで成る、請求項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾
液および脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項２７
に記載の方法。 - 【請求項３５】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡの
増幅方法であって、(A) ＨＣＶに特異的な１または複数
の５′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対と１また
は複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を
使って、ＨＣＶ ＤＮＡを含むＤＮＡ試料に対してポリ
メラーゼ連鎖反応を行うことにより、ＨＣＶ特異的増幅
生成物を生成させ、 前記５′ＮＣＲプライマー対が(a) 正プライマー 5'-C
AGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28) 〔配列番号
１〕と逆プライマー 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-
3' (C133R26)〔配列番号４〕；または(b) 正プライマー
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列
番号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTAT
CA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；および(c) 正プライ
マー 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)
〔配列番号３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCAC
A-3' (C282R27)〔配列番号５〕および(ii) 5'-CACTCGCA
AGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列番号６〕から
成る群より選ばれた逆プライマーから成る群より選ば
れ、 前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対の各々
がオリゴヌクレオチド5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG
-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正プライマーと、
オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-
3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含
んで成る方法。 - 【請求項３６】 (B) 前記増幅生成物を検出することを
更に含んで成り、前記増幅生成物の検出が前記試料中の
ＨＣＶ ＤＮＡの存在を示す、請求項３５に記載の方
法。 - 【請求項３７】 前記検出が、ゲル電気泳動により前記
増幅生成物を視覚化することを含んで成る、請求項３６
に記載の方法。 - 【請求項３８】 前記検出が、１または複数のＨＣＶ特
異的オリゴヌクレオチドプローブを含有する固体支持体
上で前記増幅生成物を捕捉し、そして比色アッセイを使
って前記捕捉された生成物を定量することを含んで成
る、請求項３６に記載の方法。 - 【請求項３９】 前記５′ＮＣＲ正プライマーが(C131F
25) または(C143F26) である場合には、前記プローブが
(a) 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB)
〔配列番号13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTC
GGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より
選ばれたメンバーを含んで成り；前記５′ＮＣＲ正プラ
イマーが(C69F28)である場合には、前記プローブが(c)
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配
列番号11〕を含んで成り；そして前記プローブが(d) 5'
-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号
14〕および(e) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32P
RB25) 〔配列番号15〕から成る群より選ばれたメンバー
を含んで成る、請求項３８に記載の方法。 - 【請求項４０】 下記：5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
GTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕，5'-GGGAGAGCCATAGTG
GTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕，5'-GTGGTCT
GCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号３〕，5'
-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号
４〕，5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)
〔配列番号５〕，5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'
(C287R27) 〔配列番号６〕，5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCT
ATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕，5'-GGTGGCTCCATCT
TAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)〔配列番号８〕，5'-AGGCCAG
TATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番号９〕，5'
-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配列
番号11〕，5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-
27-PRB) 〔配列番号12〕，5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGG
CT-3' (C252-25-PRB) 〔配列番号13〕，5'-GCGGCTCACGG
ACCTTTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号14〕および5'
-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32PRB25) 〔配列番号
15〕から成る群より選ばれたオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４１】 下記：5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
GTA-3' (C69F28) 〔配列番号１〕，5'-GGGAGAGCCATAGTG
GTCTGCGGAA-3' (C131F25) 〔配列番号２〕，5'-GTGGTCT
GCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (C143F26)〔配列番号３〕，5'
-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号
４〕，5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27)
〔配列番号５〕，5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'
(C287R27) 〔配列番号６〕，5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCT
ATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕，5'-GGTGGCTCCATCT
TAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)〔配列番号８〕および5'-AGG
CCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27) 〔配列番号９〕
から成る群より選ばれた、ＨＣＶ特異的増幅プライマー
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項４２】 下記：5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTC
AT-3' (C96-22-PRB)〔配列番号11〕，5'-CCTTTCGCGACCC
AACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕，5'
-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB) 〔配列
番号13〕，5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' (30PRB2
5) 〔配列番号14〕および5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAG
C-3' (32PRB25) 〔配列番号15〕から成る群より選ばれ
たオリゴヌクレオチドを含んで成るプローブ。 - 【請求項４３】 ＨＣＶ ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ
ＤＮＡを増幅するためのキットであって、１または複
数の5'NCR オリゴヌクレオチドプライマー対を含んで成
り、前記5'NCR プライマー対が (a) 正プライマー 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-
3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プライマー 5'-CGGTT
CCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕； (b) 正プライマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) 〔配列番号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCA
CTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；お
よび (c) 正プライマー 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'
(C143F26)〔配列番号３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAG
GCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕および(ii)
5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列
番号６〕から成る群より選ばれた逆プライマーを含んで
成るキット。 - 【請求項４４】 １または複数の３′ＮＣＲオリゴヌク
レオチドプライマー対を更に含んで成り、前記３′ＮＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマー対の各々がオリゴヌク
レオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)
〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレ
オチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)
〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る、
請求項４３に記載のキット。 - 【請求項４５】 １または複数のプローブを更に含んで
成る、請求項４３に記載のキット。 - 【請求項４６】 １または複数のプローブを更に含んで
成る、請求項４４に記載のキット。 - 【請求項４７】 ５′ＮＣＲ正プライマーが(C131F25)
または(C143F26) である場合には、前記プローブが(a)
5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB) 〔配
列番号13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT
-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より選ば
れたメンバーを含んで成り；そして前記５′ＮＣＲ正プ
ライマーが(C69F28)である場合には、前記プローブが
(c) 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)
〔配列番号11〕を含んで成る、請求項４５に記載のキッ
ト。 - 【請求項４８】 前記５′ＮＣＲ正プライマーが(C131F
25) または(C143F26) である場合には、前記プローブが
(a) 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB)
〔配列番号13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTC
GGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より
選ばれたメンバーを含んで成り；前記５′ＮＣＲ正プラ
イマーが(C69F28)である場合には、前記プローブが(c)
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配
列番号11〕を含んで成り；そして前記プローブが(d) 5'
-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号
14〕および(e) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32P
RB25) 〔配列番号15〕から成る群より選ばれたメンバー
を含んで成る、請求項４６に記載のキット。 - 【請求項４９】 前記５′ＮＣＲプライマー対が 5'-CA
GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号
１〕および 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R
26) 〔配列番号４〕から成る、請求項４３に記載のキッ
ト。 - 【請求項５０】 前記５′ＮＣＲプライマー対が 5'-GG
GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕
および 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)
〔配列番号７〕から成る、請求項４３に記載のキット。 - 【請求項５１】 ＨＣＶ ＲＮＡから誘導されたＨＣＶ
ｃＤＮＡを増幅させるためのキットであって、１また
は複数の３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライマー対を
含んで成り、前記３′ＮＣＲオリゴヌクレオチドプライ
マー対の各々が、オリゴヌクレオチド 5'-GGTGGCTCCATC
TTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) 〔配列番号８〕から成る正
プライマーと、オリゴヌクレオチド 5'-AGGCCAGTATCAGC
ACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)〔配列番号９〕から成る逆プ
ライマーとを含んで成るキット。 - 【請求項５２】 １または複数のプローブを更に含んで
成る、請求項５１に記載のキット。 - 【請求項５３】 前記プローブが(a) 5'-GCGGCTCACGGAC
CTTTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号14〕および(b)
5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32PRB25) 〔配列番
号15〕から成る群より選ばれる、請求項５２に記載のキ
ット。 - 【請求項５４】 ＨＣＶ ＤＮＡの存在を検出するため
のキットであって、１または複数の５′ＮＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマー対を含んで成り、前記５′ＮＣＲ
プライマー対が (a) 正プライマー 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-
3' (C69F28) 〔配列番号１〕と逆プライマー 5'-CGGTT
CCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26)〔配列番号４〕； (b) 正プライマー 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) 〔配列番号２〕と逆プライマー 5'-CGGGGCA
CTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) 〔配列番号７〕；お
よび (c) 正プライマー 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'
(C143F26)〔配列番号３〕と(i) 5'-GCAAGCACCCTATCAG
GCAGTACCACA-3' (C282R27)〔配列番号５〕および(ii)
5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27)〔配列
番号６〕から成る群より選ばれた逆プライマーから成る
群より選ばれることを特徴とするキット。 - 【請求項５５】 １または複数の３′ＮＣＲオリゴヌク
レオチドプライマー対を更に含んで成り、前記３′ＮＣ
Ｒオリゴヌクレオチドプライマー対の各々がオリゴヌク
レオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)
〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレ
オチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)
〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成る、
請求項５４に記載のキット。 - 【請求項５６】 １または複数のプローブを更に含んで
成る、請求項５４に記載のキット。 - 【請求項５７】 １または複数のプローブを更に含んで
成る、請求項５５に記載のキット。 - 【請求項５８】 前記５′ＮＣＲ正プライマーが(C131F
25) または(C143F26) である場合には、前記プローブが
(a) 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB)
〔配列番号13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTC
GGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より
選ばれたメンバーを含んで成り；そして前記５′ＮＣＲ
正プライマーが(C69F28)である場合には、前記プローブ
が(c) 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PR
B)〔配列番号11〕を含んで成る、請求項５６に記載のキ
ット。 - 【請求項５９】 前記５′ＮＣＲ正プライマーが(C131F
25) または(C143F26) である場合には、前記プローブが
(a) 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-25-PRB)
〔配列番号13〕および(b) 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTC
GGCT-3' (C252-27-PRB) 〔配列番号12〕から成る群より
選ばれたメンバーを含んで成り；前記５′ＮＣＲ正プラ
イマーが(C69F28)である場合には、前記プローブが(c)
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' (C96-22-PRB)〔配
列番号11〕を含んで成り；そして前記プローブが(d) 5'
-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号
14〕および(e) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32P
RB25) 〔配列番号15〕から成る群より選ばれたメンバー
を含んで成る、請求項５７に記載のキット。 - 【請求項６０】 前記５′ＮＣＲプライマー対が 5'-CA
GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28)〔配列番号
１〕および 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R
26) 〔配列番号４〕から成る、請求項５４に記載のキッ
ト。 - 【請求項６１】 前記５′ＮＣＲプライマー対が 5'-GG
GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25)〔配列番号２〕
および 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)
〔配列番号７〕から成る、請求項５４に記載のキット。 - 【請求項６２】 ＨＣＶ ＲＮＡの存在を検出するため
のキットであって、１または複数の３′ＮＣＲオリゴヌ
クレオチドプライマー対を含んで成り、前記３′ＮＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー対の各々が、オリゴヌク
レオチド 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27)
〔配列番号８〕から成る正プライマーと、オリゴヌクレ
オチド 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27)
〔配列番号９〕から成る逆プライマーとを含んで成るキ
ット。 - 【請求項６３】 １または複数のプローブを更に含んで
成る、請求項６２に記載のキット。 - 【請求項６４】 前記プローブが5'-GCGGCTCACGGACCTTT
CACAGCTA-3' (30PRB25) 〔配列番号14〕および5'-ATGCG
GCTCACGGACCTTTCACAGC-3' (32PRB25) 〔配列番号15〕か
ら成る群より選ばれる、請求項６３に記載のキット。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MD3300G2 (ro) * | 2006-09-28 | 2007-11-30 | Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы | Primer oligonucleotidic pentru depistarea ARN-ului virusului hepatitei C |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
| WO2004060278A2 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US20040121309A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues |
| US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| EP1379690A4 (en) * | 2001-04-12 | 2004-08-18 | Biocore Co Ltd | OLIGONUCLEOTIDE CHIP COMPOSITION FOR THE ANALYSIS OF THE HEPATITIS C VIRUS GENOTYPE (HCV), AND DETECTION METHOD THEREOF |
| US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
| US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US8242254B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-08-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US7364854B2 (en) | 2004-01-23 | 2008-04-29 | Biomerieux, Inc | Nucleotide mixture for improved nucleic acid amplification performance |
| US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
| ES2641832T3 (es) | 2004-05-24 | 2017-11-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Espectrometría de masas con filtración de iones selectiva por establecimiento de umbrales digitales |
| US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
| US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
| WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
| GB0423552D0 (en) * | 2004-10-22 | 2004-11-24 | Hepcgen Ltd | Methods |
| US20060205040A1 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| JP2009502137A (ja) | 2005-07-21 | 2009-01-29 | アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法 |
| US9149473B2 (en) | 2006-09-14 | 2015-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| EP2126132B1 (en) | 2007-02-23 | 2013-03-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid foresnsic dna analysis |
| WO2008125119A1 (en) | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Hvidovre Hospital | Adaptive mutations allow establishment of jfh1-based cell culture systems for hepatitis c virus genotype 4a |
| US8945584B2 (en) * | 2007-04-13 | 2015-02-03 | Hvidovre Hospital | Cell culture system of a hepatitis C genotype 3a and 2a chimera |
| EP2147118A4 (en) * | 2007-04-27 | 2010-09-01 | Eragen Biosciences Inc | MATERIALS AND METHOD FOR DETECTING HEPATITIS C VIRUS |
| US8618275B2 (en) | 2007-05-18 | 2013-12-31 | Hvidovre Hospital | Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 5A |
| WO2009023358A2 (en) * | 2007-05-25 | 2009-02-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of strains of hepatitis c virus |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| WO2009080052A1 (en) * | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Hvidovre Hospital | Efficient cell culture system for hepatitis c virus genotype 6a |
| WO2009087685A2 (en) * | 2008-01-04 | 2009-07-16 | Premas Biotech Pvt.Ltd | Method for detection of hepatitis nucleic acid and uses thereof |
| US8506969B2 (en) | 2008-08-15 | 2013-08-13 | Hvidovre Hospital | Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 7a |
| US8663653B2 (en) | 2008-08-15 | 2014-03-04 | Hvidovre Hospital | Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 2B |
| US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| WO2010033625A1 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
| US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
| WO2010037403A1 (en) | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Hvidovre Hospital | Hepatitis c virus expressing reporter tagged ns5a protein |
| EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
| EP2454000A4 (en) | 2009-07-17 | 2016-08-10 | Ibis Biosciences Inc | SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES |
| US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| EP2488656B1 (en) | 2009-10-15 | 2015-06-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| KR101503039B1 (ko) * | 2010-07-01 | 2015-04-29 | (주)바이오니아 | Ｃ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｃ형 간염 바이러스 진단 방법 |
| WO2012019260A2 (pt) * | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Universidade Federal Do Rio De Janeiro | Molécula de rna sintética do vírus da hepatite c, processo de obtenção e uso como controle interno para quantificação e/ou identificação do vírus da hepatite c |
| CN103443293B (zh) * | 2011-04-06 | 2015-04-08 | 瑞基海洋生物科技股份有限公司 | 聚合酶链式反应用的混合液 |
| AU2013205064B2 (en) * | 2012-06-04 | 2015-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid |
| CN106929603A (zh) * | 2017-01-10 | 2017-07-07 | 上海纽思格生物科技有限公司 | 一种改良型hcv rna检测试剂盒 |
| CN110892082A (zh) * | 2017-10-03 | 2020-03-17 | 雅培分子公司 | 丙型肝炎病毒(hcv)的测定 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06153961A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Imuno Japan:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
| JPH07184695A (ja) | 1993-12-27 | 1995-07-25 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | Ｃ型肝炎ウイルスの簡易検出法 |
| JPH09107970A (ja) * | 1995-10-17 | 1997-04-28 | Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス由来核酸、該核酸を用いたウイルスの検出方法 |
| JPH09163991A (ja) * | 1995-11-29 | 1997-06-24 | F Hoffmann La Roche Ag | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー |
| WO1997046716A1 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Wabco B.V. | Method to detect hcv specific nucleic acids |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5747244A (en) | 1991-12-23 | 1998-05-05 | Chiron Corporation | Nucleic acid probes immobilized on polystyrene surfaces |
| DE69324678T2 (de) * | 1992-11-27 | 1999-12-09 | Naamloze Vennootschap Innogenetics S.A., Gent | Verfahren zur typisierung von hcv-isolaten |
-
2000
- 2000-01-28 US US09/493,353 patent/US6638714B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-01 PT PT00300763T patent/PT1026262E/pt unknown
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06153961A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Imuno Japan:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
| JPH07184695A (ja) | 1993-12-27 | 1995-07-25 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | Ｃ型肝炎ウイルスの簡易検出法 |
| JPH09107970A (ja) * | 1995-10-17 | 1997-04-28 | Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス由来核酸、該核酸を用いたウイルスの検出方法 |
| JPH09163991A (ja) * | 1995-11-29 | 1997-06-24 | F Hoffmann La Roche Ag | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー |
| WO1997046716A1 (en) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Wabco B.V. | Method to detect hcv specific nucleic acids |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JPN6010008135; Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．３４, 1996, ｐｐ．２６１-２６４ * |
| JPN6010008136; Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１６, 1992, ｐｐ．２９３-２９９ * |
| JPN6010008139; Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． Ｖｏｌ．８９, 1992, ｐｐ．１８７-１９１ * |
| JPN6010008140; Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．４２, 1995, ｐｐ．３６７-３７１ * |
| JPN6010008142; Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２２４, 1995, ｐｐ．５９７-６００ * |
| JPN6010008145; Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．４６, 1998, ｐｐ．６５３-６６０ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MD3300G2 (ro) * | 2006-09-28 | 2007-11-30 | Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы | Primer oligonucleotidic pentru depistarea ARN-ului virusului hepatitei C |
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