JPH09107994A

JPH09107994A - 細胞内ａｔｐの測定方法

Info

Publication number: JPH09107994A
Application number: JP29067095A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Haketa; 靖羽毛田
Original assignee: Toa Electronics Ltd
Current assignee: DKK TOA Corp
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1995-10-13
Publication date: 1997-04-28

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞を含む試料から界面活性剤を含んだＡＴ
Ｐ抽出試薬により細胞内ＡＴＰを抽出した抽出液に、ル
シフェリンとルシフェラーゼによる生物化学発光法を適
用して細胞内ＡＴＰを測定するに際し、抽出試薬による
生物化学発光の酵素反応の阻害を抑制することができ、
かつ細胞内ＡＴＰの抽出能力を低下することがない測定
方法を提供することである。【解決手段】酵素反応阻害抑制試薬としてシリコーン
を用い、細胞を含む試料に抽出試薬を添加した後、また
は細胞内ＡＴＰを抽出した抽出液に発光試薬を添加する
際に阻害抑制試薬を添加して、阻害抑制試薬の存在下に
生物化学発光を行なわせる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物化学発光法を
利用した細胞内ＡＴＰの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌、酵母菌、乳酸菌及びその他の生
細胞数の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、
超純水、環境などの分野において非常に重要である。一
般に、細胞数の測定は、成長培地中のコロニーの計測、
血球計算盤による顕微鏡下の計測、濁度測定などによっ
て行なわれている。

【０００３】成長培地中のコロニー計測による方法は、
高感度である、生細胞のみを測定できる、選択培地を用
いれば微生物細胞種が同定できる等の点で優れている。
しかし、細胞の培養を必要とするので、測定に通常１日
以上の時間を要し、迅速に結果を得たい場合には適さな
い。

【０００４】血球計算盤による方法は、顕微鏡を用いる
ために操作が煩雑である、自動化が困難である等の欠点
を有している。

【０００５】濁度測定による方法は、迅速で自動化が容
易である点で優れているが、感度が低い、生細胞と死細
胞の細胞数が区別ができない、発酵乳などベースの濁度
が高い試料には適用できない等の問題点を有している。

【０００６】ところで、上記分野における細胞数測定に
は、迅速かつ高感度の測定が要求される。たとえば食品
衛生の分野では、製品出荷のために製品の微生物汚染の
検査は必要不可欠である。従来、この検査はコロニー計
測法によって行なわれているが、検査に１日以上を要す
るために、結果が出るまで製品を倉庫に保管しておかね
ばならない。このため流通効率の点で問題があるだけで
なく、牛乳などの製品では保管時間が長くなるにつれて
微生物汚染の可能性が高くなる。また食品で汚染を問題
にする微生物濃度は総じて低濃度であるので、高感度な
検査が要求される。

【０００７】上記の要求を満たす微生物濃度測定法とし
て、生きた微生物中に必ず存在するアデノシン３リン酸
（ＡＴＰ）を生物化学発光法を用いて測定する方法が知
られている。この方法は微生物に含まれるＡＴＰ濃度が
微生物濃度に比例することを利用しており、測定時間が
短く、高感度であるために非常に有効な方法である。

【０００８】生物化学発光法による測定では、蛍発光の
基質であるルシフェリンとその酵素のルシフェラーゼが
用いられる。この方法を用いて微生物細胞のＡＴＰ濃度
を測定するには、細胞中に含まれるＡＴＰを抽出する必
要がある。

【０００９】細胞のＡＴＰ抽出法としては、トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）の水溶液を微生物に加えて抽出する方法
（ＴＣＡ法）、界面活性剤水溶液で抽出する方法（界面
活性剤法）、９０℃位に熱したトリス緩衝液で抽出する
方法（トリス緩衝液法）、エタノールを用いる方法（エ
タノール法）、リゾチームなどの溶菌酵素を用いる方法
（酵素法）等がある。

【００１０】しかしながら、ＴＣＡ法、エタノール法、
界面活性剤法は、生物化学発光の酵素反応を阻害する場
合が多い上に、稀釈やｐＨ調整などの前処理を必要と
し、操作が煩雑で感度を低下させる場合が多い。トリス
緩衝液法は抽出溶液を９０℃の高温に熱する必要があ
り、操作面での煩わしさがある。酵素法は抽出に時間が
かかり、試薬が高価で不安定という問題もある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】以上、いずれの方法も
一長一短があり、場合に応じて使い分けているのが現状
であるが、比較的多用されているのが界面活性剤法であ
る。一般に陽イオン性界面活性剤を用いる。

【００１２】この方法は、上述したように、生物化学発
光の酵素反応を阻害する場合が多く、その阻害度合は界
面活性剤の濃度が高いほど大きくなる。抽出能力は界面
活性剤濃度が高いほど大きくなるので、界面活性剤濃度
が低いと酵素反応の阻害を小さくできるが、抽出能力が
不十分となる。従って、界面活性剤法では酵素反応を阻
害せず、抽出能力が高い方法が望まれている。

【００１３】従って本発明の目的は、界面活性剤を含ん
だ抽出試薬により細胞を含む試料から細胞内ＡＴＰを抽
出し、これにルシフェラーゼとルシフェリンによる生物
化学発光法を適用して細胞内ＡＴＰを測定するに際し、
抽出試薬による生物化学発光の酵素反応の阻害を抑制す
ることができ、かつ細胞内ＡＴＰの抽出能力を低下する
ことがない細胞内ＡＴＰの測定方法を提供することであ
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記目的は、本発明にか
かる細胞内ＡＴＰの測定方法にて達成される。要約すれ
ば、本発明は、細胞を含む試料に界面活性剤を含むＡＴ
Ｐ抽出試薬を添加して細胞内のＡＴＰを抽出し、その抽
出液にルシェフェリンおよびルシェフェラーゼを含む発
光試薬を添加して酵素反応による生物化学発光を行なわ
せ、その発光によりＡＴＰを測定する細胞内ＡＴＰの測
定方法において、前記生物化学発光をシリコーンを含む
酵素反応阻害抑制試薬の存在下に行なうことを特徴とす
る細胞内ＡＴＰの測定方法である。

【００１５】以下、本発明について詳述する。

【００１６】本発明は、界面活性剤を含んだ抽出試薬に
よる細胞内ＡＴＰの抽出と、これへの生物化学発光法の
適用とによって細胞内ＡＴＰを測定する方法において、
抽出試薬の抽出能力を低下させず、かつ酵素反応の阻害
を抑制することが可能な酵素反応阻害抑制試薬（阻害抑
制試薬）を発見したことによって達成されたものであ
る。すなわち、界面活性剤は細胞からＡＴＰを抽出する
ために使用されるが、生物化学発光の酵素反応を阻害す
る場合が多く、本発明の特徴は、この阻害を抑制するた
めに、シリコーン、特に消泡剤として使用されるシリコ
ーンを含んだ阻害抑制試薬を接触させることにある。

【００１７】消泡剤として用いられる種類のシリコーン
は、界面活性剤の作用を抑えて、界面活性剤がルシェフ
ェラーゼを変性させたり、酵素反応を阻害したりするの
を防ぐ効果がある。さらに、シリコーンは化学的に不活
性であり、それ自体が酵素反応を阻害したり、ルシェフ
ェリン、ルシェフェラーゼを変性させる危険性がないこ
とも、抑制試薬として使用するのに適している。

【００１８】生物化学発光法を用いた細胞内ＡＴＰの測
定は、細胞を含んだ試料と界面活性剤を含んだ抽出試薬
とを接触させて、細胞内ＡＴＰを細胞外に抽出した後、
抽出したＡＴＰを蛍発光の基質であるルシフェリンと酵
素であるルシフェラーゼを含んだ発光試薬と接触し、ル
シフェリン、ルシフェラーゼおよびＡＴＰによる酵素反
応により生物化学発光させ、その生成した光を測定する
方法が一般的である。

【００１９】本発明では、この細胞を含む試料に抽出試
薬を添加した後にシリコーンを含んだ抑制試薬を添加す
るか、あるいは細胞内ＡＴＰを抽出した抽出液に発光試
薬を添加する際、発光試薬の添加と同時に抑制試薬を添
加するか、抑制試薬を添加してから発光試薬を添加し
て、阻害抑制試薬存在下に生物化学発光を行なわせるの
で、生物化学発光の酵素反応を抑制することが可能にな
る。

【００２０】抑制試薬を発光試薬の添加と同時に添加す
る場合は、発光試薬に予め抑制試薬を添加しておくこと
ができる。好ましくは、抑制試薬を添加、接触させる工
程は、抽出したＡＴＰを発光試薬と接触させるのと同時
か、発光試薬と接触させる以前が、生物化学発光の酵素
反応の阻害を抑制する点で望ましい。

【００２１】これらの試薬の添加操作は、手操作による
方法、ポンプ等の装置による方法、フローインジェクシ
ョン分析法（ＦＩＡ法）又はこれらを組合せた方法等に
より行なうことができ、発光量の測定は、バッチ式又は
ＦＩＡ法などの流れを利用した分析法で行なうことがで
きる。ＦＩＡ法においては、キャリヤ液に抑制試薬を添
加することによっても本発明の目的を達成することが可
能である。

【００２２】抽出試薬に用いる界面活性剤には、アルキ
ルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（塩化ベン
ザルコニウム）、塩化ベンゼトニウム、セチルトリメチ
ルアンモニウムクロライド、ポリオキシエチレン−１０
−オクチルフェニルエーテル（商品名：ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００）等を好適に使用することができる。

【００２３】界面活性剤の添加量は、好ましくは、試料
および抽出試薬の合計量の０．００５〜０．０５ｗｔ％
である。界面活性剤の添加量が０．００５ｗｔ％未満で
あると、細胞内ＡＴＰの抽出が不十分となり、逆に０．
０５ｗｔ％を超えると抽出能力が飽和し、発光反応の阻
害性を増すだけである。

【００２４】抑制試薬に用いるシリコーンは、消泡剤と
して使用されているものならば採用することができ、シ
リコーン樹脂、シリコーンオイルあるいはそれらの変性
品であるかの形態を問わない。いずれか１または複数種
を選択して使用することができる。

【００２５】具体的には、シリコーン樹脂としては、た
とえばジメチルポリシロキサン等を使用することができ
る。シリコーンオイルとしては、たとえば直鎖状ジメチ
ルポリシロキサン等を使用することができる。シリコー
ン樹脂またはオイルの変性品としては、たとえばジメチ
ルポリシロキサン変性体（変性ジメチルポリシロキサ
ン）等を使用することができる。これらシリコーンは、
いずれか１種または複数種を選択して使用することがで
きる。

【００２６】シリコーンの添加量は、ＡＴＰを抽出した
抽出液および発光試薬の合計量の０．３〜７ｗｔ％程度
が好ましい。シリコーンの添加量が３ｗｔ％未満では、
界面活性剤による発光反応の阻害を抑制する効果が不十
分であり、７ｗｔ％を超えると、逆に発光反応を阻害す
る場合がある。

【００２７】発光試薬の添加量は、通常、抽出液の２５
〜５０Ｖｏｌ％程度が使用される。

【００２８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の具体例について説
明する。

【００２９】実施例１先ず、抽出試薬の化学発光反応阻害に対するシリコーン
の抑制効果を示す試験について述べる。発光の測定には
バッチ式の生物化学発光測定装置を使用した。抽出試薬
の界面活性剤にはドデシルジメチルベンジルアンモニウ
ムクロライド（塩化ベンザルコニウム）を使用し、又抑
制試薬のシリコーンにはＫＭ−７２（商品名。信越化学
工業（株）シリコーン樹脂３０％含有）を使用した。

【００３０】上記の塩化ベンザルコニウムは殺菌剤とし
て知られており、細胞の細胞壁に作用してＡＴＰなどの
比較的小さい分子を透過させる能力を有している。従っ
てＡＴＰを抽出する能力は非常に高く、抽出試薬として
優れている。ＡＴＰの抽出は、抽出試薬の一定量に細胞
を懸濁させた懸濁液を一定量加えて撹拌することにより
成し遂げられる。十分な抽出能力を発現させるために
は、懸濁液と抽出試薬を混合したときの混合液（抽出
液）に対し、塩化ベンザルコニウム濃度が０．０５％以
上になるようにすることが好ましい。しかしながら、塩
化ベンザルコニウムが０．０５％以上の濃度では、生物
化学発光によりＡＴＰ濃度を測定する工程で酵素反応を
著しく阻害するため、抽出後に緩衝液などにより稀釈す
ることが必要になる。

【００３１】本発明では、ＫＭ−７２を含んだ抑制試薬
を加えるので、抽出後に希釈等をすることなく、上記の
阻害を抑制することが可能である。

【００３２】測定操作は以下の通りである。１００ｎｍ
ｏｌ／ｌのＡＴＰ標準液をキュベットに１００μｌ入
れ、０．１％塩化ベンザルコニウムと１ｍＭのＥＤＴＡ
をｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬
（これを抽出試薬Ａとする）を１００μｌ加えて撹拌
し、ＡＴＰを抽出する。更に２０％のＫＭ−７２と１ｍ
ＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し
た抑制試薬（これを抑制試薬ａとする）を５０μｌ加え
て撹拌した後、蛍のルシフェリン、ルシフェラーゼを含
んだ発光試薬（東亜電波工業ＡＴＰＡ−１Ｌ１）を１
００μｌ加えて撹拌する。そしてキュベットを生物化学
発光測定装置にセットし、生物化学発光反応によって生
じた光を測定し発光量を求める。発光量はキュベットを
セットした後、１０秒後から始めて０．１秒間隔で発光
を１０秒間計測し、これを積算して求めた。

【００３３】抽出試薬Ａと抑制試薬ａに加えたＥＤＴＡ
は、細胞を抽出試薬に接触したときにＡＴＰを分解する
アルカリフォスフォターゼなどの酵素作用を抑制する目
的で使用している。ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液は、
生物化学発光法を用いてＡＴＰを測定する酵素を至適状
態に保つために必要である。

【００３４】表１にＡＴＰ測定における相対発光量を示
す。比較のために、上記の抑制試薬ａの組成からＫＭ−
７２を除いたもの（抑制試薬ｂ）と、１ｍＭのＥＤＴＡ
をｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した試薬（抽出
試薬Ｂ）を用いた場合を試した。

【００３５】

【表１】

【００３６】ブランクとして使用した抑制試薬ｂと抽出
試薬Ｂの組合せでは、ＫＭ−７２と塩化ベンザルコニウ
ムを含んでいないので、生物化学発光の酵素反応に対す
る阻害はないと考えられる。そこでこれを基準に選んで
相対発光量１００％とする。表１に示されるように、本
発明による抑制試薬ａと抽出試薬Ａの組合せでは、相対
発光量は抑制試薬ｂと抽出試薬Ｂの組合せのときの７０
％であり、発光反応の阻害が抑制されている。ＫＭ−７
２を含まない抑制試薬ｂと抽出試薬Ａの組合せの場合に
は、相対発光量は僅か９％であり、発光反応の阻害が極
めて大きいことが分かる。

【００３７】以上のように、ＫＭ−７２を含んだ抑制試
薬を添加することにより、生物化学発光の酵素反応に対
する阻害をほぼ抑制できることが確認された。

【００３８】次に、本発明法による微生物細胞内ＡＴＰ
の測定を、従来法による測定と比較して示す。従来法
は、ＡＴＰの抽出にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いる
ＴＣＡ抽出法に依った。ＴＣＡ抽出法は一般に微生物か
らＡＴＰを抽出する場合に用いられる方法で、ＡＴＰの
抽出能力に非常に優れている。測定試料には乳酸菌懸濁
液を用いた。

【００３９】ＴＣＡ抽出液による微生物中のＡＴＰの測
定操作は以下の通りである。乳酸菌懸濁液の試料１００
μｌに５％のトリクロロ酢酸溶液を１ｍｌ加えて６０秒
間撹拌し、乳酸菌からＡＴＰを抽出する。この試料を１
００μｌ分取し、ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液３．９
ｍｌを加えて良く撹拌する。この試料１００μｌをキュ
ベットに取り、発光試薬１００μｌを添加撹拌し、前述
の生物化学発光測定装置にセットし、発光量を求める。
そして既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌについて生物
化学発光測定装置で測定した発光量と比較して、ＡＴＰ
濃度を求めた。

【００４０】上記のｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液を加
えて撹拌する操作は、トリクロロ酢酸が生物化学発光の
酵素反応を大きく阻害するので、これを防ぐために必要
である。しかし、試料溶液がトリクロロ酢酸と緩衝液に
より大きく稀釈（本例では８０倍に稀釈）されてしま
い、測定感度の低下が起こり、ＴＣＡ抽出法の問題点に
なっている。

【００４１】本発明による抑制試薬ａを用いた微生物細
胞内ＡＴＰの測定操作は以下の通りである。乳酸菌懸濁
液の試料１００μｌをキュベットに入れ、抽出試薬Ａを
１００μｌ加えて２０秒間撹拌し、乳酸菌からＡＴＰを
抽出する。更に抑制試薬ａを５０μｌ加えて撹拌した
後、発光試薬１００μｌを加えて撹拌し、生物化学発光
測定装置にキュベットをセットし、生物化学発光反応に
よって生じた光の発光量を測定する。発光量は、上述し
たように、キュベットをセットした後、１０秒後から始
めて０．１秒おきに発光を１０秒間計測し、これを積算
して求めた。抑制試薬ｂと抽出試薬Ａ、抑制試薬ｂと抽
出試薬Ｂの組合せについても同様な操作をして、発光量
を測定した。そして既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌ
について生物化学発光測定装置で測定した発光量と比較
して、ＡＴＰ濃度を求めた。これらの結果及びＴＣＡ抽
出法による結果を表２に示す。

【００４２】

【表２】

【００４３】表２に示されるように、本発明による抑制
試薬ａと抽出試薬Ａの組合せでは、ＴＣＡ法による測定
値とほぼ同等な結果が得られているが、ＫＭ−７２を加
えない抑制試薬ｂと抽出試薬Ａの組合せでは、発光の酵
素反応が阻害されるので、ＴＣＡ法に比べると低いＡＴ
Ｐ濃度しか得られない。又抑制試薬ｂと界面活性剤を含
まない抽出試薬Ｂの組合せでは、抽出が全く起こらない
ために、ＡＴＰ濃度の測定値がゼロとなっている。以上
のように、本発明に基づくシリコーンを含んだ抑制試薬
ａと抽出試薬Ａの組合せが優れた結果を示した。

【００４４】この本実施例よる測定では、試料溶液は抽
出試薬と抑制試薬の添加によりわずか３倍強にしか希釈
されない。抑制試薬を添加しない場合、従来の方法であ
ると試料溶液の１０倍以上の稀釈が必要であり、ＴＣＡ
法に至っては８０倍もの稀釈が必要であることを考慮す
ると、本発明の方法は感度の点で非常に有利となる。

【００４５】上記において、塩化ベンザルコニウムの濃
度は、抽出試薬１容に対し微生物を含んだ試料１容とい
う条件では０．１％が好ましいが、微生物濃度が低濃度
である場合には必ずしも０．１％である必要はなく、
０．０１〜０．１％の範囲であれば、塩化ベンザルコニ
ウムの濃度を適宜低くすることができる。塩化ベンザル
コニウムの濃度は、抽出を行なう細胞の種類によっても
使い分けることが好ましい。

【００４６】抑制試薬に添加するＫＭ−７２の濃度は、
抽出を行なった試料１容に対して、添加試薬０．５容積
という条件では２０％が好ましいが、塩化ベンザルコニ
ウム濃度が０．１％以下の場合には必ずしも２０％であ
る必要はない。ＫＭ−７２濃度はある程度高いほど発光
反応の阻害を抑制する効果が大きいが、必要以上に高い
と逆に酵素反応を阻害するので、１〜２０％の範囲で適
当な濃度を使用するのが好ましい。塩化ベンザルコニウ
ム、ＫＭ−７２の濃度は、上述の例に限られず、試料、
抑制試薬、抽出試薬、発光試薬の使用量や種類により適
切に設定する必要がある。

【００４７】抑制試薬、抽出試薬に添加するＥＤＴＡ及
びｐＨ緩衝液は必ずしも両試薬に入れる必要はなく、い
ずれか一方に添加すれば良い。抽出時間が短い場合には
必ずしもＥＤＴＡの添加は必要ではなく、ｐＨ緩衝液は
測定したい試料のｐＨが中性付近であれば使用する必要
はない。

【００４８】ＡＴＰの抽出に要する時間は微生物の種類
により異なるが、大腸菌、乳酸菌、一般細菌では１０秒
以上、酵母菌の場合には３０秒以上が好ましい。抽出を
行なってから試料を放置しておくとＡＴＰ濃度は少しず
つ低下するので、発光量の測定は抽出後５分以内に行な
うことが好ましく、特にＥＤＴＡを含んでいない抽出試
薬を使用する場合には、抽出が完了してからすぐに測定
するのが好ましい。又この例では試薬の添加を手操作に
より行なっているが、ポンプや自動シリンジを利用して
試薬を自動的に添加しても良く、これにより更に簡便に
細胞内ＡＴＰを測定することができる。

【００４９】実施例２本実施例では、発光試薬に抑制試薬を添加する場合につ
いて示す。抽出試薬の界面活性剤として塩化ベンゼトニ
ウムを、抑制試薬の高分子化合物としてＫＳ−５０２
（商品名。信越化学工業（株）変性シリコーンオイル
１００％含有）をそれぞれ使用した。測定装置はバッチ
式の生物化学発光測定装置を用いた。

【００５０】蛍のルシェフェリン、ルシフェラーゼを含
んだ発光試薬（東亜電波工業（株）ＡＴＰＡ−１Ｌ１）
に抑制試薬の１０％のＫＳ−５０２を添加した発光試薬
（発光試薬Ｘ）と、０．１％塩化ベンゼトニウムと１ｍ
ＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し
た抽出試薬（抽出試薬Ｃ）を使用した。

【００５１】測定操作は次の通りである。１００ｎｍｏ
ｌ／ｌのＡＴＰ標準液１００μｌをキュベットに入れ、
抽出試薬Ｃを１００μｌ加えて撹拌し、ＡＴＰを抽出す
る。次に本発明に基づく発光試薬Ｘを１００μｌ加えて
撹拌し、生物化学発光測定装置にキュベットをセット
し、生物化学発光反応によって生じた光の発光量を測定
する。発光量はキュベットをセットした後、１０秒後か
ら始めて０．１秒間隔で発光を１０秒間計測計測し、こ
れを積算して求めた。

【００５２】表３には、各発光試薬と抽出試薬のＡＴＰ
測定における相対発光量を示した。比較のために、上記
の発光試薬組成からＫＳ−５０２を除いたもの（発光試
薬Ｙ）と、１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ
緩衝液に溶解した抽出試薬（前述の抽出試薬Ｂ）を用い
た場合についても示した。

【００５３】

【表３】

【００５４】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｂの組合せでは、Ｋ
Ｓ−５０２と界面活性剤を含んでいないために発光反応
への阻害はなく、相対発光量は１００％と考えられる。
本発明による発光試薬Ｘと抽出試薬Ｃの組合せでは、表
３に示されるように、相対発光量は発光試薬Ｙと抽出試
薬Ｂの組合せの場合の８１％であり、大きな阻害はな
い。一方、ＫＳ−５０２を含まない従来法に基づく発光
試薬Ｙと抽出試薬Ｃの組合せでは、相対発光量は１５％
と低く阻害が大きいことが分かる。以上のように、発光
試薬にシリコーンを加えても、本発明の効果が得られる
ことが分かる。

【００５５】次に本発明による微生物細胞内ＡＴＰ測定
を、従来法による測定との比較において示す。試料は酵
母菌懸濁液を用いた。従来法は、実施例１と同様、ＡＴ
Ｐの抽出にＴＣＡ抽出法を用いる方法で、その微生物細
胞内ＡＴＰの測定操作は実施例１で説明した通りであ
る。

【００５６】本発明による発光試薬Ｘを用いた微生物細
胞内のＡＴＰの測定操作は以下の通りである。酵母菌懸
濁液の試料１００μｌをキュベットに入れ、抽出試薬Ｃ
を１００μｌ加えて３０秒間撹拌し、酵母菌からＡＴＰ
を抽出する。更に発光試薬を１００μｌ加えて撹拌し、
生物化学発光測定装置にキュベットをセットし、生物化
学発光反応によって生じた光の発光量を測定する。発光
量はキュベットをセットした後、１０秒後から始めて
０．１秒おきに発光を１０秒間計測し、積算して求め
た。

【００５７】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｃ、発光試薬Ｙと抽
出試薬Ｂの組合せについても同様な操作により発光量を
測定した。そして既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌに
ついて生物化学発光測定装置で測定した発光量と比較し
て、ＡＴＰ濃度を求めた。これら及びＴＣＡ法による結
果を表４に示す。

【００５８】

【表４】

【００５９】表４に示されるように、本発明に基づく発
光試薬Ｘと抽出試薬Ｃの組合せでは、ＴＣＡ法による測
定値と同等な結果が得られている。これに対し、ＫＳ−
５０２を加えない発光試薬Ｙと抽出試薬Ｃの組合せで
は、発光の酵素反応の阻害を防止できないために、ＴＣ
Ａ法に比べ低いＡＴＰ濃度しか得られない。又界面活性
剤を含まない抽出試薬Ｂを使用した場合には、ほとんど
抽出が起こらないために、ＡＴＰの測定値がほぼゼロと
なっている。従って本発明に基づく発光試薬Ｘと抽出試
薬Ｃの組合せが優れていることは明らかである。

【００６０】界面活性剤の濃度とシリコーンの濃度及び
抽出時間については、実施例１と同様な注意が必要であ
る。

【００６１】実施例３本実施例においても、発光試薬に抑制試薬を添加して使
用した。界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商
品名。和光純薬（株）ポリオキシエチレン−１０−オ
クチルフェニルエーテル）、抑制試薬のシリコーンとし
てＫＳ−５０６（商品名。信越化学工業（株）変性シ
リコーンオイル１００％含有）を使用した。測定装置は
これまでと同様、バッチ式の生物化学発光測定装置であ
る。

【００６２】ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、ほとんどの微
生物細胞に対しＡＴＰ抽出能力を示さず、動物の体細胞
のみからＡＴＰを抽出する能力があることが知られてい
る。そのために動物細胞と微生物細胞のＡＴＰを別々に
測定したい場合に使用されることがあるが、塩化ベンザ
ルコニウムなどの陽イオン性界面活性剤と同様に生物化
学発光反応を阻害するため、同様にＡＴＰ測定感度の低
下などの問題を有している。

【００６３】本実施例では、蛍のルシフェラーゼ、ルシ
フェリンを含んだ発光試薬（東亜電波工業製ＡＴＰＡ−
１Ｌ１）に抑制試薬の５％のＫＳ−５０６を添加した発
光試薬（発光試薬Ｚ）と、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００と１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝
液に溶解した抽出試薬（抽出試薬Ｄ）を使用した。比較
のために、上記の発光試薬組成からＫＳ−５０６を除い
た発光試薬（前述の発光試薬Ｙ）と、１ｍＭのＥＤＴＡ
をｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬Ｂ
を用いた場合についても試験した。

【００６４】阻害抑制の測定は実施例２と同様な方法で
行なった。表５には各発光試薬と抽出試薬のＡＴＰ測定
における相対発光量を示した。

【００６５】

【表５】

【００６６】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｂの組合せでは、Ｋ
Ｓ−５０６とＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいないた
め発光反応への阻害がなく、相対発光量は１００％と考
えられる。本発明による発光試薬Ｚと抽出試薬Ｃの組合
せの場合の相対発光量は、表５に示されるように、発光
試薬Ｙと抽出試薬Ｂの組合せの場合の９１％であり、ほ
とんど阻害はない。ＫＳ−５０６を含まない従来法に基
づく発光試薬Ｙと抽出試薬Ｄの組合せでは、相対発光量
は３５％と低く、阻害が大きいことが分かる。以上のよ
うに、発光試薬にＫＳ−５０６を加えることによって
も、本発明の効果が得られることが分かる。

【００６７】次に本発明による動物体細胞内ＡＴＰの測
定を従来法との比較において示す。試料はマウスの肺細
胞懸濁液を用いた。従来法は、これまでと同様、ＴＣＡ
抽出法によるＡＴＰの抽出を行なう方法である。ＴＣＡ
抽出法及び本発明による発光試薬Ｚと抽出試薬Ｄを用い
た細胞内ＡＴＰの測定操作は、実施例２で説明した通り
である。

【００６８】発光試薬Ｙと抽出試薬Ｄ、発光試薬Ｙと抽
出試薬Ｂの組合せについても同様な操作により発光量を
測定し、既知濃度のＡＴＰ標準液１００μｌについて生
物化学発光測定装置で測定した発光量と比較して、ＡＴ
Ｐ濃度を求めた。これらの結果を表６に示す。

【００６９】

【表６】

【００７０】表６に示されるように、本発明に基づく発
光試薬Ｚと抽出試薬Ｄの組合せでは、ＴＣＡ法による測
定値と同等な結果が得られているが、ＫＳ−５０６を加
えない発光試薬Ｙと抽出試薬Ｄの組合せでは、発光の酵
素反応を阻害するためにＴＣＡ法に比べると低いＡＴＰ
濃度しか得られない。又ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含ま
ない抽出試薬Ｂでは全く抽出が起こらないために、ＡＴ
Ｐ濃度の測定値はほぼゼロとなっている。本発明に基づ
く発光試薬Ｚと抽出試薬Ｄの組合せが優れていることは
明らかである。

【００７１】界面活性剤の濃度とシリコーンの濃度及び
抽出時間については、実施例１と同様な注意が必要であ
る。

【００７２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明では、ＡＴ
Ｐ抽出試薬の界面活性剤による生物化学発光の酵素反応
の阻害に対し、シリコーンを含む抑制試薬を用いたの
で、酵素反応の阻害を抑制して発光させることができ、
その発光を検出することによりＡＴＰ濃度を正確に測定
することができる。又測定試料の稀釈を必要としないた
めに、測定感度の向上を図ることができ、抽出能力を低
下させることなもなく、操作面でも一層簡単なＡＴＰ測
定方法を構築することができる。従って食品衛生、バイ
オなどの微生物検査に際し多大な威力を発揮する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を含む試料に界面活性剤を含むＡＴ
Ｐ抽出試薬を添加して細胞内のＡＴＰを抽出し、その抽
出液にルシェフェリンおよびルシェフェラーゼを含む発
光試薬を添加して酵素反応による生物化学発光を行なわ
せ、その発光によりＡＴＰを測定する細胞内ＡＴＰの測
定方法において、前記生物化学発光をシリコーンを含む
酵素反応阻害抑制試薬の存在下に行なうことを特徴とす
る細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項２】シリコーンが、シリコーン樹脂、シリコ
ーンオイルおよびこれらの変性品からなる群から選択さ
れる請求項１の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項３】シリコーン樹脂がジメチルポリシロキサ
ンである請求項２の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項４】シリコーンオイルが直鎖状ジメチルポリ
シロキサンである請求項２の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項５】変性品がジメチルポリシロキサンの変性
体である請求項２の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項６】シリコーンの添加量が、抽出液および発
光試薬の合計量の０．３〜７ｗｔ％である請求項１、
２、３、４または５の細胞内ＡＴＰの測定方法。
【請求項７】抽出試薬を試料に添加した後に抑制試薬
を添加する請求項１、２、３、４、５または６の細胞内
ＡＴＰの測定方法。
【請求項８】発光試薬を抽出液に添加する際に抑制試
薬を添加する請求項１、２、３、４、５または６の細胞
内ＡＴＰの測定方法。
【請求項９】界面活性剤が、塩化ベンザルコニウム、
塩化ベンゼトニウム、セチルトリメチルアンモニウムク
ロライドおよびポリオキシエチレン−１０−オクチルフ
ェニルエーテルからなる群から選択される請求項１、
２、３、４、５、６、７または８の細胞内ＡＴＰの測定
方法。
【請求項１０】界面活性剤の添加量が、試料及び抽出
試薬の合計量の０．００５〜０．０５ｗｔ％である請求
項１、２、３、４、５、６、７、８または９の細胞内Ａ
ＴＰの測定方法。