JPH10165200A - 微生物ａｔｐの測定方法 - Google Patents
微生物ａｔｐの測定方法Info
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- JPH10165200A JPH10165200A JP34058196A JP34058196A JPH10165200A JP H10165200 A JPH10165200 A JP H10165200A JP 34058196 A JP34058196 A JP 34058196A JP 34058196 A JP34058196 A JP 34058196A JP H10165200 A JPH10165200 A JP H10165200A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 遊離ＡＴＰを多く含むサンプルの微生物測定
を効率よく、正確に、且つ短時間で行うことのできる微
生物ＡＴＰの測定方法を提供する。 【解決手段】 微生物に由来しない遊離ＡＴＰを多量に
含む試料（サンプル）にＡＴＰ分解試薬を添加してサン
プル中の遊離ＡＴＰを分解し、次いで、遊離ＡＴＰが分
解されたサンプル中にＡＴＰ抽出試薬を添加して微生物
からＡＴＰを抽出し、このとき、同時にＡＴＰ抽出試薬
は、先にサンプルに添加したＡＴＰ分解試薬を失活さ
せ、その後、サンプルに酵素反応阻害抑制試薬を含む発
光試薬を接触させ、生物化学発光反応によって生じた光
を生物化学発光測定装置にて測定する。
を効率よく、正確に、且つ短時間で行うことのできる微
生物ＡＴＰの測定方法を提供する。 【解決手段】 微生物に由来しない遊離ＡＴＰを多量に
含む試料（サンプル）にＡＴＰ分解試薬を添加してサン
プル中の遊離ＡＴＰを分解し、次いで、遊離ＡＴＰが分
解されたサンプル中にＡＴＰ抽出試薬を添加して微生物
からＡＴＰを抽出し、このとき、同時にＡＴＰ抽出試薬
は、先にサンプルに添加したＡＴＰ分解試薬を失活さ
せ、その後、サンプルに酵素反応阻害抑制試薬を含む発
光試薬を接触させ、生物化学発光反応によって生じた光
を生物化学発光測定装置にて測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を含む試料
の微生物細胞内のＡＴＰをルシフェラーゼとルシフェリ
ンによる生物化学発光法を用いて測定する微生物ＡＴＰ
の測定方法に関するものであり、食品衛生、バイオ、臨
床検査、医学、超純水、環境などの分野において大腸
菌、酵母、乳酸菌及びその他の微生物を測定するために
有効に利用される。
の微生物細胞内のＡＴＰをルシフェラーゼとルシフェリ
ンによる生物化学発光法を用いて測定する微生物ＡＴＰ
の測定方法に関するものであり、食品衛生、バイオ、臨
床検査、医学、超純水、環境などの分野において大腸
菌、酵母、乳酸菌及びその他の微生物を測定するために
有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌、酵母、乳酸菌及びその他の微生
物の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超純
水、環境などの分野において非常に重要である。一般
に、微生物の測定は、成長培地中のコロニーの計測、血
球計算盤による顕微鏡下での計測、濁度測定などによっ
て行われている。
物の測定は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超純
水、環境などの分野において非常に重要である。一般
に、微生物の測定は、成長培地中のコロニーの計測、血
球計算盤による顕微鏡下での計測、濁度測定などによっ
て行われている。
【０００３】成長培地中のコロニーの計測法は、高感
度である、生細胞のみを測定できる、選択培地を用
いれば微生物細胞が固定できるなどの点で優れている
が、培地を必要とするので測定に要する時間は通常１日
以上であり、迅速に結果を得たい場合には適さない。血
球計算盤による計測法は顕微鏡を用いるため、操作が
煩雑である、自動化が困難などの欠点を有している。
濁度測定法は、迅速で自動化が容易である点で優れてい
るが、感度が低い、生細胞と死細胞の区別ができな
い、発酵乳などベースの濁度が高いサンプルには適用
できないなどの問題点を有している。
度である、生細胞のみを測定できる、選択培地を用
いれば微生物細胞が固定できるなどの点で優れている
が、培地を必要とするので測定に要する時間は通常１日
以上であり、迅速に結果を得たい場合には適さない。血
球計算盤による計測法は顕微鏡を用いるため、操作が
煩雑である、自動化が困難などの欠点を有している。
濁度測定法は、迅速で自動化が容易である点で優れてい
るが、感度が低い、生細胞と死細胞の区別ができな
い、発酵乳などベースの濁度が高いサンプルには適用
できないなどの問題点を有している。
【０００４】上記分野における微生物測定には、迅速か
つ高感度の測定が要求される。例えば、食品衛生分野で
は、製品出荷のために製品の微生物汚染検査は必要不可
欠である。この検査は従来コロニー計測法で行われてい
るが、検査に１日以上要するため結果が出るまで製品を
倉庫に保管しておかなければならず、流通効率の点で問
題があるだけでなく、牛乳などの製品では保管時間が長
いほど微生物汚染の可能性が高くなる。又、食品で汚染
を問題にする微生物濃度は総じて低濃度であるので、高
感度な検査が要求される。
つ高感度の測定が要求される。例えば、食品衛生分野で
は、製品出荷のために製品の微生物汚染検査は必要不可
欠である。この検査は従来コロニー計測法で行われてい
るが、検査に１日以上要するため結果が出るまで製品を
倉庫に保管しておかなければならず、流通効率の点で問
題があるだけでなく、牛乳などの製品では保管時間が長
いほど微生物汚染の可能性が高くなる。又、食品で汚染
を問題にする微生物濃度は総じて低濃度であるので、高
感度な検査が要求される。
【０００５】このような要求を満たす微生物測定法とし
て、生きた微生物中には必ず存在するアデノシン３リン
酸（ＡＴＰ）を生物化学発光測定法を用いて測定する方
法が知られている。この方法は微生物細胞内に含まれる
ＡＴＰの濃度が微生物濃度に比例することを利用してお
り、測定時間が短く、高感度であるため非常に有効な方
法である。
て、生きた微生物中には必ず存在するアデノシン３リン
酸（ＡＴＰ）を生物化学発光測定法を用いて測定する方
法が知られている。この方法は微生物細胞内に含まれる
ＡＴＰの濃度が微生物濃度に比例することを利用してお
り、測定時間が短く、高感度であるため非常に有効な方
法である。
【０００６】しかしながら、食品などは微生物に由来し
ないＡＴＰ（遊離ＡＴＰ）を含むものが殆どであり、微
生物ＡＴＰだけを測定することは困難である。又、遊離
ＡＴＰは微生物ＡＴＰと比べると桁違いに高い場合が多
く、更に測定を難しいものとしている。そのために、こ
の生物化学発光測定法は、食品の測定にはあまり応用さ
れていない。
ないＡＴＰ（遊離ＡＴＰ）を含むものが殆どであり、微
生物ＡＴＰだけを測定することは困難である。又、遊離
ＡＴＰは微生物ＡＴＰと比べると桁違いに高い場合が多
く、更に測定を難しいものとしている。そのために、こ
の生物化学発光測定法は、食品の測定にはあまり応用さ
れていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで、これらの問題
を解決する手段として、ＡＴＰ分解酵素であるアピラー
ゼをＡＴＰ分解試薬としてサンプルに添加し、微生物に
由来しない遊離ＡＴＰを予め分解してから測定を行う方
法が開発されている。この測定方法は、アピラーゼをサ
ンプルに作用させ遊離ＡＴＰを分解する工程、微生物か
らＡＴＰを抽出する工程及びルシフェラーゼとルシフェ
リンを作用させてＡＴＰを測定する工程から構成され
る。
を解決する手段として、ＡＴＰ分解酵素であるアピラー
ゼをＡＴＰ分解試薬としてサンプルに添加し、微生物に
由来しない遊離ＡＴＰを予め分解してから測定を行う方
法が開発されている。この測定方法は、アピラーゼをサ
ンプルに作用させ遊離ＡＴＰを分解する工程、微生物か
らＡＴＰを抽出する工程及びルシフェラーゼとルシフェ
リンを作用させてＡＴＰを測定する工程から構成され
る。
【０００８】この測定方法では、遊離ＡＴＰを効率良く
短時間で分解するためには、アピラーゼの濃度を十分に
高くする必要がある。しかしながら、このアピラーゼ濃
度が高すぎると次の工程で微生物から抽出したＡＴＰも
同時に分解してしまい、全てのサンプルでＡＴＰ濃度が
ゼロになってしまうという問題を生じる。この問題を解
決するために、アピラーゼ濃度を低くしてＡＴＰの分解
速度を遅くすることが考えられるが、この方法では分解
に要する時間が長くなり、迅速性の点で問題がある。
又、アピラーゼを作用させてＡＴＰを分解し、次いで、
アピラーゼの阻害剤を添加した後ＡＴＰを抽出する方法
も開発されているが、この方法は、阻害剤を添加する工
程が増え効率が悪くなるだけでなく、希釈されることに
より測定感度が低下するという問題もあった。
短時間で分解するためには、アピラーゼの濃度を十分に
高くする必要がある。しかしながら、このアピラーゼ濃
度が高すぎると次の工程で微生物から抽出したＡＴＰも
同時に分解してしまい、全てのサンプルでＡＴＰ濃度が
ゼロになってしまうという問題を生じる。この問題を解
決するために、アピラーゼ濃度を低くしてＡＴＰの分解
速度を遅くすることが考えられるが、この方法では分解
に要する時間が長くなり、迅速性の点で問題がある。
又、アピラーゼを作用させてＡＴＰを分解し、次いで、
アピラーゼの阻害剤を添加した後ＡＴＰを抽出する方法
も開発されているが、この方法は、阻害剤を添加する工
程が増え効率が悪くなるだけでなく、希釈されることに
より測定感度が低下するという問題もあった。
【０００９】従って、本発明の目的は、遊離ＡＴＰを多
く含むサンプルの微生物測定を効率よく、正確に、且つ
短時間で行うことのできる微生物ＡＴＰの測定方法を提
供することである。
く含むサンプルの微生物測定を効率よく、正確に、且つ
短時間で行うことのできる微生物ＡＴＰの測定方法を提
供することである。
【００１０】本発明の他の目的は、遊離ＡＴＰを分解す
るためのＡＴＰ分解試薬の濃度を十分高くすることがで
き、そのために、余計な希釈を必要とせず、感度の向上
を図ることができると共に、微生物ＡＴＰの抽出能力を
低下することなく、操作の面でもより簡便な微生物ＡＴ
Ｐの測定方法を提供することである。
るためのＡＴＰ分解試薬の濃度を十分高くすることがで
き、そのために、余計な希釈を必要とせず、感度の向上
を図ることができると共に、微生物ＡＴＰの抽出能力を
低下することなく、操作の面でもより簡便な微生物ＡＴ
Ｐの測定方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記目的は本発明に係る
微生物ＡＴＰ測定方法にて達成される。要約すれば、本
発明は、微生物を含む試料の微生物細胞内のＡＴＰをル
シフェラーゼとルシフェリンによる生物化学発光法を用
いて測定する微生物ＡＴＰの測定方法であって、（ａ）
前記試料をＡＴＰ分解試薬と接触させて、微生物に由来
しない遊離ＡＴＰを分解し、次いで、（ｂ）前記試料を
ＡＴＰ抽出試薬と接触させて、微生物からＡＴＰを抽出
すると共にＡＴＰ分解試薬を失活させ、その後、（ｃ）
前記試料に酵素反応阻害抑制試薬と発光試薬とを接触さ
せてＡＴＰを測定する、ことを特徴とする微生物ＡＴＰ
の測定方法、である。
微生物ＡＴＰ測定方法にて達成される。要約すれば、本
発明は、微生物を含む試料の微生物細胞内のＡＴＰをル
シフェラーゼとルシフェリンによる生物化学発光法を用
いて測定する微生物ＡＴＰの測定方法であって、（ａ）
前記試料をＡＴＰ分解試薬と接触させて、微生物に由来
しない遊離ＡＴＰを分解し、次いで、（ｂ）前記試料を
ＡＴＰ抽出試薬と接触させて、微生物からＡＴＰを抽出
すると共にＡＴＰ分解試薬を失活させ、その後、（ｃ）
前記試料に酵素反応阻害抑制試薬と発光試薬とを接触さ
せてＡＴＰを測定する、ことを特徴とする微生物ＡＴＰ
の測定方法、である。
【００１２】
【発明の実施の形態】次に、更に詳しく本発明の微生物
ＡＴＰの測定方法について説明する。本発明によれば、
先ず、例えば食品などの、微生物に由来しない遊離ＡＴ
Ｐを多量に含む試料（サンプル）にＡＴＰ分解試薬を添
加し、サンプル中の遊離ＡＴＰを分解する。次いで、遊
離ＡＴＰが分解されたサンプル中にＡＴＰ抽出試薬を添
加し、微生物からＡＴＰを抽出する。このとき、ＡＴＰ
抽出試薬は、先にサンプルに添加したＡＴＰ分解試薬を
失活させる。その後、サンプルに酵素反応阻害抑制試薬
を含む発光試薬を接触させ、生物化学発光反応によって
生じた光を生物化学発光測定装置にて測定する。
ＡＴＰの測定方法について説明する。本発明によれば、
先ず、例えば食品などの、微生物に由来しない遊離ＡＴ
Ｐを多量に含む試料（サンプル）にＡＴＰ分解試薬を添
加し、サンプル中の遊離ＡＴＰを分解する。次いで、遊
離ＡＴＰが分解されたサンプル中にＡＴＰ抽出試薬を添
加し、微生物からＡＴＰを抽出する。このとき、ＡＴＰ
抽出試薬は、先にサンプルに添加したＡＴＰ分解試薬を
失活させる。その後、サンプルに酵素反応阻害抑制試薬
を含む発光試薬を接触させ、生物化学発光反応によって
生じた光を生物化学発光測定装置にて測定する。
【００１３】ＡＴＰ分解試薬としては、ＡＴＰをＡＭＰ
（アデノシン１リン酸）に分解する酵素として知られて
いるアピラーゼを使用することができる。
（アデノシン１リン酸）に分解する酵素として知られて
いるアピラーゼを使用することができる。
【００１４】ＡＴＰ抽出試薬としては、陽イオン性界面
活性剤が用いられ、この陽イオン性界面活性剤にはアル
キルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベ
ンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セチルトリメチ
ルアンモニウムクロライドなどを使用し得る。
活性剤が用いられ、この陽イオン性界面活性剤にはアル
キルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベ
ンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セチルトリメチ
ルアンモニウムクロライドなどを使用し得る。
【００１５】又、酵素反応阻害抑制試薬としては、シリ
コーンを使用することができ、シリコーンは消泡剤とし
て使用されているものならば任意のものを採用すること
ができ、例えば、シリコーン樹脂、シリコーンオイル、
或は、シリコーン樹脂及びシリコーンオイルの変成品で
あっても良い。具体的には、シリコーン樹脂としては、
例えばジメチルポリキサンなどを使用することができ
る。シリコーンオイルとしては、例えば直鎖状ジメチル
ポリキサンなどを使用することができる。シリコーン樹
脂又はシリコーンオイルの変成品としては、例えばジメ
チルポリシロキサン変成体などを使用することができ
る。これらのシリコーンは、いずれか１種又は複数種を
選択して使用することができる。更には、酵素反応阻害
抑制試薬としては、特表平６−５０４２００号公報に記
載されるシクロデキストリンを使用することもできる。
シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリ
ン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン
又はそれらの変成体のいずれか１種又は複数種を選択し
て使用することができる。
コーンを使用することができ、シリコーンは消泡剤とし
て使用されているものならば任意のものを採用すること
ができ、例えば、シリコーン樹脂、シリコーンオイル、
或は、シリコーン樹脂及びシリコーンオイルの変成品で
あっても良い。具体的には、シリコーン樹脂としては、
例えばジメチルポリキサンなどを使用することができ
る。シリコーンオイルとしては、例えば直鎖状ジメチル
ポリキサンなどを使用することができる。シリコーン樹
脂又はシリコーンオイルの変成品としては、例えばジメ
チルポリシロキサン変成体などを使用することができ
る。これらのシリコーンは、いずれか１種又は複数種を
選択して使用することができる。更には、酵素反応阻害
抑制試薬としては、特表平６−５０４２００号公報に記
載されるシクロデキストリンを使用することもできる。
シクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリ
ン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン
又はそれらの変成体のいずれか１種又は複数種を選択し
て使用することができる。
【００１６】上述のように、本発明の微生物ＡＴＰの測
定方法は、サンプルの遊離ＡＴＰをアピラーゼを含むＡ
ＴＰ分解試薬で分解した後、陽イオン性界面活性剤を含
むＡＴＰ抽出試薬と接触させて微生物からＡＴＰを抽出
すると共にアピラーゼを失活させ、界面活性剤の酵素反
応阻害を抑制するためシリコーンを添加した発光試薬を
接触させることを特徴とするものであるが、本発明の方
法によれば遊離ＡＴＰを分解するためにアピラーゼ濃度
を十分高くできるだけでなく、アピラーゼを失活させる
工程と微生物からＡＴＰを抽出する工程が同時に行われ
るため、効率よく食品などの遊離ＡＴＰを多く含むサン
プルの微生物測定を行うことが可能になる。又、本発明
の方法ではアピラーゼを失活させるために陽イオン性界
面活性剤を使用しているが、界面活性剤の濃度が高いほ
どアピラーゼを失活させる能力は高くなる。しかし、陽
イオン性界面活性剤はルシフェラーゼの反応を阻害す
る。従って、本発明では、この問題を解決するべく、酵
素反応阻害抑制試薬としてシリコーンが用いられる。
定方法は、サンプルの遊離ＡＴＰをアピラーゼを含むＡ
ＴＰ分解試薬で分解した後、陽イオン性界面活性剤を含
むＡＴＰ抽出試薬と接触させて微生物からＡＴＰを抽出
すると共にアピラーゼを失活させ、界面活性剤の酵素反
応阻害を抑制するためシリコーンを添加した発光試薬を
接触させることを特徴とするものであるが、本発明の方
法によれば遊離ＡＴＰを分解するためにアピラーゼ濃度
を十分高くできるだけでなく、アピラーゼを失活させる
工程と微生物からＡＴＰを抽出する工程が同時に行われ
るため、効率よく食品などの遊離ＡＴＰを多く含むサン
プルの微生物測定を行うことが可能になる。又、本発明
の方法ではアピラーゼを失活させるために陽イオン性界
面活性剤を使用しているが、界面活性剤の濃度が高いほ
どアピラーゼを失活させる能力は高くなる。しかし、陽
イオン性界面活性剤はルシフェラーゼの反応を阻害す
る。従って、本発明では、この問題を解決するべく、酵
素反応阻害抑制試薬としてシリコーンが用いられる。
【００１７】次に、実施例に即して本発明の微生物ＡＴ
Ｐの測定方法を更に詳しく説明する。
Ｐの測定方法を更に詳しく説明する。
【００１８】実施例１ 本実施例では、バッチ式の生物化学発光測定装置を使用
して本発明の微生物ＡＴＰの測定方法を実施した。又、
本実施例では、アピラーゼを含んだＡＴＰ分解試薬、陽
イオン性界面活性剤としてドデシルジメチルベンジルア
ンモニウムクロライド（塩化ベンザルコニウム）を含ん
だＡＴＰ抽出試薬、シリコーンとしてＫＳ−５０２（商
品名、信越化学工業（株）変成シリコーンオイル１００
％含有）を含んだ酵素反応阻害抑制試薬を使用した。測
定操作は、以下の通りであった。
して本発明の微生物ＡＴＰの測定方法を実施した。又、
本実施例では、アピラーゼを含んだＡＴＰ分解試薬、陽
イオン性界面活性剤としてドデシルジメチルベンジルア
ンモニウムクロライド（塩化ベンザルコニウム）を含ん
だＡＴＰ抽出試薬、シリコーンとしてＫＳ−５０２（商
品名、信越化学工業（株）変成シリコーンオイル１００
％含有）を含んだ酵素反応阻害抑制試薬を使用した。測
定操作は、以下の通りであった。
【００１９】先ず、１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＴＰ水溶液
を測定用キュベットに１００μｌ入れ、更に、０．５Ｕ
／ｍｌアピラーゼと１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン４酢酸）をｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し
た試薬（分解試薬Ａ）１００μｌを添加して２分間反応
させた。
を測定用キュベットに１００μｌ入れ、更に、０．５Ｕ
／ｍｌアピラーゼと１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミ
ン４酢酸）をｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し
た試薬（分解試薬Ａ）１００μｌを添加して２分間反応
させた。
【００２０】その後、上記キュベットに、０．１％塩化
ベンザルコニウムと１ｍＭＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬（抽出試薬Ａ）を１０
０μｌ加えて撹拌した。
ベンザルコニウムと１ｍＭＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬（抽出試薬Ａ）を１０
０μｌ加えて撹拌した。
【００２１】更に、１ｍＭのＥＤＴＡ、蛍ルシフェラー
ゼ及びルシフェリンをｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液
に溶解した発光試薬に、抑制試薬として１０％ＫＳ−５
０２を加えた試薬（発光試薬Ａ）１００μｌを前記キュ
ベットに加えて撹拌した。
ゼ及びルシフェリンをｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液
に溶解した発光試薬に、抑制試薬として１０％ＫＳ−５
０２を加えた試薬（発光試薬Ａ）１００μｌを前記キュ
ベットに加えて撹拌した。
【００２２】次いで、上記キュベットを生物化学発光測
定装置にセットし、生物化学発光反応によって生じた光
を測定した。発光量はキュベットをセットした後、１０
秒後からの発光を０．１秒おきに１０秒間計測し積算し
求めた。
定装置にセットし、生物化学発光反応によって生じた光
を測定した。発光量はキュベットをセットした後、１０
秒後からの発光を０．１秒おきに１０秒間計測し積算し
求めた。
【００２３】抽出試薬Ａと発光試薬Ａに加えたＥＤＴＡ
は、細胞を抽出試薬に接触した時にＡＴＰを分解するア
ルカリフォスフォダーゼなどの酵素の作用を抑制する目
的で使用している。ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液は、
生物化学発光法を用いてＡＴＰを測定する酵素を至適状
態に保つために必要である。
は、細胞を抽出試薬に接触した時にＡＴＰを分解するア
ルカリフォスフォダーゼなどの酵素の作用を抑制する目
的で使用している。ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液は、
生物化学発光法を用いてＡＴＰを測定する酵素を至適状
態に保つために必要である。
【００２４】表１には、ＡＴＰ測定に対する発光量と相
対発光量を示す。本発明の効果を示すため、上記分解試
薬Ａからアピラーゼを除いた試薬（分解試薬Ｂ）、抽出
試薬Ａから塩化ベンザルコニウムを除いた試薬（抽出試
薬Ｂ）、発光試薬Ａの組成からＫＳ−５０２を除いた試
薬（発光試薬Ｂ）による組み合わせについて比較試料と
して示した。
対発光量を示す。本発明の効果を示すため、上記分解試
薬Ａからアピラーゼを除いた試薬（分解試薬Ｂ）、抽出
試薬Ａから塩化ベンザルコニウムを除いた試薬（抽出試
薬Ｂ）、発光試薬Ａの組成からＫＳ−５０２を除いた試
薬（発光試薬Ｂ）による組み合わせについて比較試料と
して示した。
【００２５】
【表１】
【００２６】ブランクとして使用した分解試薬Ｂ、抽出
試薬Ｂ、発光試薬Ｂの「組み合わせ１」では、アピラー
ゼ、塩化ベンザルコニウム、ＫＳ−５０２を含んでいな
いため発光反応に対する阻害はなく、ＡＴＰも分解され
ないため相対発光量は１００％と考えられる。本発明に
よる分解試薬Ａ、抽出試薬Ａ、発光試薬Ａの「組み合わ
せ２」では、アピラーゼによりＡＴＰが分解されるた
め、「組み合わせ１」と比較した相対発光量は０．００
３％であり、ＡＴＰは大略１００％分解されている。し
かしながら、アピラーゼを含まない分解試薬Ｂ、抽出試
薬Ａ、発光試薬Ａの「組み合わせ３」では相対発光量は
７５．７％であり、ＡＴＰは分解されておらず、大きな
妨害もないことが分かる。
試薬Ｂ、発光試薬Ｂの「組み合わせ１」では、アピラー
ゼ、塩化ベンザルコニウム、ＫＳ−５０２を含んでいな
いため発光反応に対する阻害はなく、ＡＴＰも分解され
ないため相対発光量は１００％と考えられる。本発明に
よる分解試薬Ａ、抽出試薬Ａ、発光試薬Ａの「組み合わ
せ２」では、アピラーゼによりＡＴＰが分解されるた
め、「組み合わせ１」と比較した相対発光量は０．００
３％であり、ＡＴＰは大略１００％分解されている。し
かしながら、アピラーゼを含まない分解試薬Ｂ、抽出試
薬Ａ、発光試薬Ａの「組み合わせ３」では相対発光量は
７５．７％であり、ＡＴＰは分解されておらず、大きな
妨害もないことが分かる。
【００２７】次に、測定の手順を変えて測定を行った。
即ち、０．５Ｕ／ｍｌアピラーゼと１ｍＭＥＤＴＡをｐ
Ｈ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した試薬（分解試薬
Ａ）１００μｌと、０．１％塩化ベンザルコニウムと１
ｍＭＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し
た抽出試薬（抽出試薬Ａ）１００μｌとを加えて撹拌し
た後に、１００ｎｍｏｌ／１のＡＴＰ水溶液を測定用キ
ュベットに１００μｌ入れ、２分間反応させた。次い
で、更に、１ｍＭＥＤＴＡ、蛍ルシフェラーゼ及びルシ
フェリンをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した発
光試薬に、抑制試薬として１０％ＫＳ−５０２を加えた
試薬（発光試薬Ａ）１００μｌを前記キュベットに加え
て撹拌した。このようにして得られたキュベットを生物
化学発光測定装置にセットし、生物化学発光反応によっ
て生じた光を測定した。発光量はキュベットをセットし
た後、１０秒後からの発光を０．１秒おきに１０秒間計
測し積算し求めた。
即ち、０．５Ｕ／ｍｌアピラーゼと１ｍＭＥＤＴＡをｐ
Ｈ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した試薬（分解試薬
Ａ）１００μｌと、０．１％塩化ベンザルコニウムと１
ｍＭＥＤＴＡをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し
た抽出試薬（抽出試薬Ａ）１００μｌとを加えて撹拌し
た後に、１００ｎｍｏｌ／１のＡＴＰ水溶液を測定用キ
ュベットに１００μｌ入れ、２分間反応させた。次い
で、更に、１ｍＭＥＤＴＡ、蛍ルシフェラーゼ及びルシ
フェリンをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した発
光試薬に、抑制試薬として１０％ＫＳ−５０２を加えた
試薬（発光試薬Ａ）１００μｌを前記キュベットに加え
て撹拌した。このようにして得られたキュベットを生物
化学発光測定装置にセットし、生物化学発光反応によっ
て生じた光を測定した。発光量はキュベットをセットし
た後、１０秒後からの発光を０．１秒おきに１０秒間計
測し積算し求めた。
【００２８】表２に、ＡＴＰ測定に対する発光量と相対
発光量を示す。本発明の効果を示すため、上記分解試薬
Ａからアピラーゼを除いた試薬（分解試薬Ｂ）、抽出試
薬Ａから塩化ベンザルコニウムを除いた試薬（抽出試薬
Ｂ）、発光試薬Ａの組成からＫＳ−５０２を除いた試薬
（発光試薬Ｂ）による組み合わせについて比較試料とし
て示した。
発光量を示す。本発明の効果を示すため、上記分解試薬
Ａからアピラーゼを除いた試薬（分解試薬Ｂ）、抽出試
薬Ａから塩化ベンザルコニウムを除いた試薬（抽出試薬
Ｂ）、発光試薬Ａの組成からＫＳ−５０２を除いた試薬
（発光試薬Ｂ）による組み合わせについて比較試料とし
て示した。
【００２９】
【表２】
【００３０】ブランクとして使用した分解試薬Ｂ、抽出
試薬Ｂ、発光試薬Ｂの「組み合わせ１」では、アピラー
ゼ、塩化ベンザルコニウム、ＫＳ−５０２を含んでいな
いため発光反応に対する阻害はなく、ＡＴＰも分解され
ないため相対発光量は１００％と考えられる。分解試薬
Ａ、抽出試薬Ａ、発光試薬Ａの「組み合わせ２」では、
アピラーゼが抽出試薬により阻害されることでＡＴＰが
分解されなくなり相対発光量は７０．２％であった。塩
化ベンザルコニウムを含まない抽出試薬Ｂを使用した
「組み合わせ３」では相対発光量は２．５％であり、抽
出試薬を添加した後もアピラーゼが作用し、ＡＴＰが分
解されてしまうことが分かる。又、ＫＳ−５０２を含ま
ない発光試薬Ｂの「組み合わせ４」では、相対発光量は
１９．８％であり、「組み合わせ２」と比較すると発光
量は１／４程度になってしまう。これは、塩化ベンザル
コニウムにより発光試薬が阻害されるために起こる現象
である。
試薬Ｂ、発光試薬Ｂの「組み合わせ１」では、アピラー
ゼ、塩化ベンザルコニウム、ＫＳ−５０２を含んでいな
いため発光反応に対する阻害はなく、ＡＴＰも分解され
ないため相対発光量は１００％と考えられる。分解試薬
Ａ、抽出試薬Ａ、発光試薬Ａの「組み合わせ２」では、
アピラーゼが抽出試薬により阻害されることでＡＴＰが
分解されなくなり相対発光量は７０．２％であった。塩
化ベンザルコニウムを含まない抽出試薬Ｂを使用した
「組み合わせ３」では相対発光量は２．５％であり、抽
出試薬を添加した後もアピラーゼが作用し、ＡＴＰが分
解されてしまうことが分かる。又、ＫＳ−５０２を含ま
ない発光試薬Ｂの「組み合わせ４」では、相対発光量は
１９．８％であり、「組み合わせ２」と比較すると発光
量は１／４程度になってしまう。これは、塩化ベンザル
コニウムにより発光試薬が阻害されるために起こる現象
である。
【００３１】これらのことから、０．５Ｕ／ｍｌのアピ
ラーゼは１００ｎｍｏｌ／１のＡＴＰを２分程度で分解
する能力があるが、アピラーゼを作用させた後にアピラ
ーゼの作用を阻害する物質を添加しないと、微生物のＡ
ＴＰを抽出した後もＡＴＰの分解が起こり、微生物のＡ
ＴＰを正確に測定できないことが分かる。又、抽出試薬
として使用した塩化ベンザルコニウムはアピラーゼを阻
害する能力があることが分かったが、塩化ベンザルコニ
ウムは次の工程で使用するルシフェラーゼ、ルシフェリ
ンによる生物化学発光反応を阻害してしまうため、これ
の阻害を抑制する必要がある。シリコーンは、この阻害
を抑制する効果を有していることが理解される。
ラーゼは１００ｎｍｏｌ／１のＡＴＰを２分程度で分解
する能力があるが、アピラーゼを作用させた後にアピラ
ーゼの作用を阻害する物質を添加しないと、微生物のＡ
ＴＰを抽出した後もＡＴＰの分解が起こり、微生物のＡ
ＴＰを正確に測定できないことが分かる。又、抽出試薬
として使用した塩化ベンザルコニウムはアピラーゼを阻
害する能力があることが分かったが、塩化ベンザルコニ
ウムは次の工程で使用するルシフェラーゼ、ルシフェリ
ンによる生物化学発光反応を阻害してしまうため、これ
の阻害を抑制する必要がある。シリコーンは、この阻害
を抑制する効果を有していることが理解される。
【００３２】本実施例にて、アピラーゼ濃度が高いほど
ＡＴＰを分解する速度は高くなるが、濃度が高すぎると
塩化ベンザルコニウムによりアピラーゼの効果を抑制す
ることができなくなる。ここで、塩化ベンザルコニウム
の濃度を高くすれば、アピラーゼの濃度が高くてもアピ
ラーゼを失活させることができるが、塩化ベンザルコニ
ウムの濃度が高すぎるとＫＳ−５０２により生物化学発
光反応の阻害を抑制することができなくなるため、アピ
ラーゼ、塩化ベンザルコニウム、ＫＳ−５０２は適切な
濃度を選択することが重要である。この組み合わせで
は、アピラーゼは０．１〜１Ｕ／ｍｌ、塩化ベンザルコ
ニウムは０．０４〜０．１ｗｔ％、ＫＳ−５０２は５〜
２０ｗｔ％が適当であるが、好ましくはアピラーゼは１
Ｕ／ｍｌ、塩化ベンザルコニウムは０．１ｗｔ％、ＫＳ
−５０２は２０ｗｔ％とするのが良い。
ＡＴＰを分解する速度は高くなるが、濃度が高すぎると
塩化ベンザルコニウムによりアピラーゼの効果を抑制す
ることができなくなる。ここで、塩化ベンザルコニウム
の濃度を高くすれば、アピラーゼの濃度が高くてもアピ
ラーゼを失活させることができるが、塩化ベンザルコニ
ウムの濃度が高すぎるとＫＳ−５０２により生物化学発
光反応の阻害を抑制することができなくなるため、アピ
ラーゼ、塩化ベンザルコニウム、ＫＳ−５０２は適切な
濃度を選択することが重要である。この組み合わせで
は、アピラーゼは０．１〜１Ｕ／ｍｌ、塩化ベンザルコ
ニウムは０．０４〜０．１ｗｔ％、ＫＳ−５０２は５〜
２０ｗｔ％が適当であるが、好ましくはアピラーゼは１
Ｕ／ｍｌ、塩化ベンザルコニウムは０．１ｗｔ％、ＫＳ
−５０２は２０ｗｔ％とするのが良い。
【００３３】又、分解試薬、抽出試薬、発光試薬に添加
するＥＤＴＡ及びｐＨ緩衝液は必ずしも全ての試薬に入
れる必要はなく、どれかに添加すれば良い。抽出時間が
短い場合には必ずしもＥＤＴＡの添加は必要ではなく、
ｐＨ緩衝液は測定したい試料のｐＨが中性付近であれば
使用する必要はない。
するＥＤＴＡ及びｐＨ緩衝液は必ずしも全ての試薬に入
れる必要はなく、どれかに添加すれば良い。抽出時間が
短い場合には必ずしもＥＤＴＡの添加は必要ではなく、
ｐＨ緩衝液は測定したい試料のｐＨが中性付近であれば
使用する必要はない。
【００３４】実施例２ 本実施例では、本発明の方法に従って、乳酸菌培養液に
遊離ＡＴＰを添加したサンプルの測定を行なった。本実
施例でも、バッチ式の生物化学発光測定装置を使用し
た。又、本実施例では、アピラーゼを含んだＡＴＰ分解
試薬、陽イオン性界面活性剤としてセチルトリメチルア
ンモニウムクロライドを含んだＡＴＰ抽出試薬、シリコ
ーンとしてＫＭ−７２（商品名、信越化学工業（株）シ
リコーン樹脂３０％含有）を含んだ酵素反応阻害抑制試
薬を使用した。測定操作は、以下の通りであった。
遊離ＡＴＰを添加したサンプルの測定を行なった。本実
施例でも、バッチ式の生物化学発光測定装置を使用し
た。又、本実施例では、アピラーゼを含んだＡＴＰ分解
試薬、陽イオン性界面活性剤としてセチルトリメチルア
ンモニウムクロライドを含んだＡＴＰ抽出試薬、シリコ
ーンとしてＫＭ−７２（商品名、信越化学工業（株）シ
リコーン樹脂３０％含有）を含んだ酵素反応阻害抑制試
薬を使用した。測定操作は、以下の通りであった。
【００３５】先ず、１００ｎｍｏｌ／１のＡＴＰを遊離
ＡＴＰとして添加した１×１０4 、１×１０5 、１×１
０6 、１×１０7 個／ｍｌの乳酸菌培養液をそれぞれの
測定用キュベットに１００μｌずつ入れ、０．１Ｕ／ｍ
ｌアピラーゼと１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５のＨＥ
ＰＥＳ緩衝液に溶解した試薬（分解試薬Ｃ）１００μｌ
を添加して２分間反応させた。その後、０．１％セチル
トリメチルアンモニウムクロライドと１ｍＭＥＤＴＡを
ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬（抽
出試薬Ｃ）を１００μｌ加えて撹拌し、３０秒間ＡＴＰ
を抽出した。更に、１ｍＭＥＤＴＡ、蛍ルシフェラーゼ
及びルシフェリンをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶
解した発光試薬に、抑制試薬として２０％のＫＭ−７２
を添加した試薬（発光試薬Ｃ）１００μｌをキュベット
に加えて撹拌し、このキュベットを生物化学発光測定装
置にセットし、生物化学発光反応によって生じた光を測
定した。発光量はキュベットをセットした後、１０秒後
からの発光を０．１秒おきに１０秒間計測し積算し求め
た。又、予め１００ｎｍｏｌ／１ＡＴＰ標準試薬によ
り、発光量を求めておき、ＡＴＰ濃度を計算した。図１
に測定結果を示す。
ＡＴＰとして添加した１×１０4 、１×１０5 、１×１
０6 、１×１０7 個／ｍｌの乳酸菌培養液をそれぞれの
測定用キュベットに１００μｌずつ入れ、０．１Ｕ／ｍ
ｌアピラーゼと１ｍＭのＥＤＴＡをｐＨ７．７５のＨＥ
ＰＥＳ緩衝液に溶解した試薬（分解試薬Ｃ）１００μｌ
を添加して２分間反応させた。その後、０．１％セチル
トリメチルアンモニウムクロライドと１ｍＭＥＤＴＡを
ｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した抽出試薬（抽
出試薬Ｃ）を１００μｌ加えて撹拌し、３０秒間ＡＴＰ
を抽出した。更に、１ｍＭＥＤＴＡ、蛍ルシフェラーゼ
及びルシフェリンをｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶
解した発光試薬に、抑制試薬として２０％のＫＭ−７２
を添加した試薬（発光試薬Ｃ）１００μｌをキュベット
に加えて撹拌し、このキュベットを生物化学発光測定装
置にセットし、生物化学発光反応によって生じた光を測
定した。発光量はキュベットをセットした後、１０秒後
からの発光を０．１秒おきに１０秒間計測し積算し求め
た。又、予め１００ｎｍｏｌ／１ＡＴＰ標準試薬によ
り、発光量を求めておき、ＡＴＰ濃度を計算した。図１
に測定結果を示す。
【００３６】図１の「組み合わせ１」は本発明に基づく
分解試薬Ｃ、抽出試薬Ｃ、発光試薬Ｃを用いて測定した
乳酸菌数とＡＴＰ濃度をプロットしたものであり、「組
み合わせ２」は分解試薬Ｃからアピラーゼを除いた試薬
（分解試薬Ｂ）を用いて測定した結果をプロットしたも
のである。
分解試薬Ｃ、抽出試薬Ｃ、発光試薬Ｃを用いて測定した
乳酸菌数とＡＴＰ濃度をプロットしたものであり、「組
み合わせ２」は分解試薬Ｃからアピラーゼを除いた試薬
（分解試薬Ｂ）を用いて測定した結果をプロットしたも
のである。
【００３７】「組み合わせ１」では添加した遊離ＡＴＰ
が完全に分解されているため、菌数としてＡＴＰ濃度は
正比例関係になるが、アピラーゼを添加していない分解
試薬Ｂを用いた「組み合わせ２」では遊離ＡＴＰが分解
されないため、菌数に関わらずＡＴＰ濃度はほぼ一定の
値となり、正比例関係は得られないことが分かる。
が完全に分解されているため、菌数としてＡＴＰ濃度は
正比例関係になるが、アピラーゼを添加していない分解
試薬Ｂを用いた「組み合わせ２」では遊離ＡＴＰが分解
されないため、菌数に関わらずＡＴＰ濃度はほぼ一定の
値となり、正比例関係は得られないことが分かる。
【００３８】このように本発明によれば、遊離ＡＴＰを
大量に含む菌懸濁液中の菌数を正確に測定することが可
能になる。
大量に含む菌懸濁液中の菌数を正確に測定することが可
能になる。
【００３９】ＡＴＰの抽出に要する時間は微生物の種類
により異なるが、大腸菌や一般の細菌では１０秒以上、
酵母菌の場合には３０秒以上が好ましい。抽出を行って
から試料を放置しておくとＡＴＰ濃度は少しづつ低下す
るので、発光量の測定は抽出後５分以内に行うことが好
ましく、特にＥＤＴＡを含んでいない抽出試薬を使用す
る場合には抽出が完了してからすぐに測定するのが好ま
しい。
により異なるが、大腸菌や一般の細菌では１０秒以上、
酵母菌の場合には３０秒以上が好ましい。抽出を行って
から試料を放置しておくとＡＴＰ濃度は少しづつ低下す
るので、発光量の測定は抽出後５分以内に行うことが好
ましく、特にＥＤＴＡを含んでいない抽出試薬を使用す
る場合には抽出が完了してからすぐに測定するのが好ま
しい。
【００４０】又、上記実施例では試薬の添加を手操作に
より行っているが、ポンプや自動シリングを利用して試
薬を自動的に添加すれば、更に簡単に細胞内ＡＴＰを測
定できる。
より行っているが、ポンプや自動シリングを利用して試
薬を自動的に添加すれば、更に簡単に細胞内ＡＴＰを測
定できる。
【００４１】この実施例においても、アピラーゼ濃度が
高いほど、ＡＴＰを分解する速度が高くなるが、濃度が
高すぎるとセチルトリメチルアンモニウムクロライドに
よりアピラーゼの効果を抑制することができなくなる。
ここで、セチルトリメチルアンモニウムクロライドを高
くすれば、アピラーゼの濃度が高くてもアピラーゼを失
活させることができるが、セチルトリメチルアンモニウ
ムクロライドの濃度が高すぎるとＫＭ−７２により生物
化学発光反応の阻害を抑制することができなくなる。従
って、アピラーゼ、セチルトリメチルアンモニウムクロ
ライド、ＫＭ−７２は適切な濃度を選択することが重要
である。この組み合わせでは、アピラーゼは０．１〜
０．２Ｕ／ｍｌ、セチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドは０．０５〜０．１ｗｔ％、ＫＭ−７２は２０〜３
０ｗｔ％が適当である。更に好ましくはアピラーゼは
０．１Ｕ／ｍｌ、セチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドは０．１ｗｔ％、ＫＳ−７２は２０ｗｔ％が良い。
高いほど、ＡＴＰを分解する速度が高くなるが、濃度が
高すぎるとセチルトリメチルアンモニウムクロライドに
よりアピラーゼの効果を抑制することができなくなる。
ここで、セチルトリメチルアンモニウムクロライドを高
くすれば、アピラーゼの濃度が高くてもアピラーゼを失
活させることができるが、セチルトリメチルアンモニウ
ムクロライドの濃度が高すぎるとＫＭ−７２により生物
化学発光反応の阻害を抑制することができなくなる。従
って、アピラーゼ、セチルトリメチルアンモニウムクロ
ライド、ＫＭ−７２は適切な濃度を選択することが重要
である。この組み合わせでは、アピラーゼは０．１〜
０．２Ｕ／ｍｌ、セチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドは０．０５〜０．１ｗｔ％、ＫＭ−７２は２０〜３
０ｗｔ％が適当である。更に好ましくはアピラーゼは
０．１Ｕ／ｍｌ、セチルトリメチルアンモニウムクロラ
イドは０．１ｗｔ％、ＫＳ−７２は２０ｗｔ％が良い。
【００４２】
【発明の効果】以上詳しく説明したように、本発明の微
生物ＡＴＰの測定方法は、微生物に由来しない遊離ＡＴ
Ｐを多量に含む試料（サンプル）にＡＴＰ分解試薬を添
加してサンプル中の遊離ＡＴＰを分解し、次いで、遊離
ＡＴＰが分解されたサンプル中にＡＴＰ抽出試薬を添加
して微生物からＡＴＰを抽出し、このとき、同時にＡＴ
Ｐ抽出試薬は、先にサンプルに添加したＡＴＰ分解試薬
を失活させ、その後、サンプルに酵素反応阻害抑制試薬
を含む発光試薬を接触させ、生物化学発光反応によって
生じた光を生物化学発光測定装置にて測定する構成とさ
れるので、食品などの遊離ＡＴＰを大量に含有したサン
プルの微生物数を効率よく正確に測定することが可能で
あり、更に、本発明では、余計な希釈を必要としないた
め感度の向上を図ることができるばかりでなく、抽出能
力を低下させることなく、操作の面でもより簡便なＡＴ
Ｐ測定方法を構築することができる。従って、本発明
は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超純水、環境
などの分野における微生物検査に大きく貢献することが
できる。
生物ＡＴＰの測定方法は、微生物に由来しない遊離ＡＴ
Ｐを多量に含む試料（サンプル）にＡＴＰ分解試薬を添
加してサンプル中の遊離ＡＴＰを分解し、次いで、遊離
ＡＴＰが分解されたサンプル中にＡＴＰ抽出試薬を添加
して微生物からＡＴＰを抽出し、このとき、同時にＡＴ
Ｐ抽出試薬は、先にサンプルに添加したＡＴＰ分解試薬
を失活させ、その後、サンプルに酵素反応阻害抑制試薬
を含む発光試薬を接触させ、生物化学発光反応によって
生じた光を生物化学発光測定装置にて測定する構成とさ
れるので、食品などの遊離ＡＴＰを大量に含有したサン
プルの微生物数を効率よく正確に測定することが可能で
あり、更に、本発明では、余計な希釈を必要としないた
め感度の向上を図ることができるばかりでなく、抽出能
力を低下させることなく、操作の面でもより簡便なＡＴ
Ｐ測定方法を構築することができる。従って、本発明
は、食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超純水、環境
などの分野における微生物検査に大きく貢献することが
できる。
【図１】乳酸菌数とＡＴＰ濃度の関係を示すグラフであ
る。
る。
Claims (13)
- 【請求項１】 微生物を含む試料の微生物細胞内のＡＴ
Ｐをルシフェラーゼとルシフェリンによる生物化学発光
法を用いて測定する微生物ＡＴＰの測定方法であって、
（ａ）前記試料をＡＴＰ分解試薬と接触させて、微生物
に由来しない遊離ＡＴＰを分解し、次いで、（ｂ）前記
試料をＡＴＰ抽出試薬と接触させて、微生物からＡＴＰ
を抽出すると共にＡＴＰ分解試薬を失活させ、その後、
（ｃ）前記試料に酵素反応阻害抑制試薬と発光試薬とを
接触させてＡＴＰを測定する、ことを特徴とする微生物
ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項２】 前記ＡＴＰ分解試薬はアピラーゼを含む
試薬である請求項１の微生物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項３】 前記ＡＴＰ抽出試薬は陽イオン性界面活
性剤を含む試薬である請求項１の微生物ＡＴＰの測定方
法。 - 【請求項４】 前記酵素反応阻害抑制試薬はシリコーン
或はシクロデキストリンを含む試薬である請求項１の微
生物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項５】 前記発光試薬はルシフェラーゼ及びルシ
フェリンを含む試薬である請求項１の微生物ＡＴＰの測
定方法。 - 【請求項６】 前記陽イオン性界面活性剤はアルキルジ
メチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベンザル
コニウム、塩化ベンゼトニウム或はセチルトリメチルア
ンモニウムクロライドである請求項３の微生物ＡＴＰの
測定方法。 - 【請求項７】 前記シリコーンは、シリコーン樹脂、シ
リコーンオイル、又は、シリコーン樹脂及びシリコーン
オイルの変成品であり、いずれか１種又は複数種を選択
して使用する請求項４の微生物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項８】 前記シリコーン樹脂はジメチルポリキサ
ンであり、前記シリコーンオイルは直鎖状ジメチルポリ
キサンであり、前記シリコーン樹脂又はシリコーンオイ
ルの変成品はジメチルポリシロキサン変成体である請求
項８の微生物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項９】 前記シクロデキストリンは、α−シクロ
デキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデ
キストリン又はそれらの変成体であり、いずれか１種又
は複数種を選択して使用する請求項４の微生物ＡＴＰの
測定方法。 - 【請求項１０】 前記ＡＴＰ分解試薬はアピラーゼを含
む試薬であり、前記ＡＴＰ抽出試薬は塩化ベンザルコニ
ウムを含む試薬であり、前記酵素反応阻害抑制試薬は変
成シリコーンオイルである請求項１の微生物ＡＴＰの測
定方法。 - 【請求項１１】 前記アピラーゼは０．１〜１Ｕ／ｍ
ｌ、前記塩化ベンザルコニウムは０．０４〜０．１ｗｔ
％、前記変成シリコーンオイル（１００％含有）は５〜
２０ｗｔ％である請求項１０の微生物ＡＴＰの測定方
法。 - 【請求項１２】 前記ＡＴＰ分解試薬はアピラーゼを含
む試薬であり、前記ＡＴＰ抽出試薬はセチルトリメチル
アンモニウムクロライドを含む試薬であり、前記酵素反
応阻害抑制試薬はシリコーン樹脂である請求項１の微生
物ＡＴＰの測定方法。 - 【請求項１３】 前記アピラーゼは０．１〜０．２Ｕ／
ｍｌ、前記セチルトリメチルアンモニウムクロライドは
０．０５〜０．１ｗｔ％、前記シリコーン樹脂（３０％
含有）は２０〜３０ｗｔ％である請求項１２の微生物Ａ
ＴＰの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34058196A JPH10165200A (ja) | 1996-12-05 | 1996-12-05 | 微生物ａｔｐの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34058196A JPH10165200A (ja) | 1996-12-05 | 1996-12-05 | 微生物ａｔｐの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10165200A true JPH10165200A (ja) | 1998-06-23 |
Family
ID=18338375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34058196A Pending JPH10165200A (ja) | 1996-12-05 | 1996-12-05 | 微生物ａｔｐの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10165200A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008504841A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-21 | プロメガ コーポレイション | 微生物ａｔｐの抽出及び検出システム |
| US8361739B2 (en) | 2002-12-23 | 2013-01-29 | Promega Corporation | Luciferase-based assays |
| JP2013070640A (ja) * | 2011-09-27 | 2013-04-22 | Toyama Prefecture | アミノ酸の定量方法 |
| JP2021052675A (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 高砂熱学工業株式会社 | 除染効果の判定方法 |
-
1996
- 1996-12-05 JP JP34058196A patent/JPH10165200A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8361739B2 (en) | 2002-12-23 | 2013-01-29 | Promega Corporation | Luciferase-based assays |
| US8603767B2 (en) | 2002-12-23 | 2013-12-10 | Promega Corporation | Luciferase-based assays |
| US8859220B2 (en) | 2002-12-23 | 2014-10-14 | Promega Corporation | Luciferase-based assays |
| US9631225B2 (en) | 2002-12-23 | 2017-04-25 | Promega Corporation | Luciferase-based assays |
| JP2008504841A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-21 | プロメガ コーポレイション | 微生物ａｔｐの抽出及び検出システム |
| JP2013070640A (ja) * | 2011-09-27 | 2013-04-22 | Toyama Prefecture | アミノ酸の定量方法 |
| JP2021052675A (ja) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | 高砂熱学工業株式会社 | 除染効果の判定方法 |
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