JPH09110715A - 血液凝固疾患を治療するための医薬組成物とその製造法 - Google Patents
血液凝固疾患を治療するための医薬組成物とその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 凝固因子欠損および／または凝固因子インヒ
ビターに起因する血液凝固疾患患者を治療するための医
薬組成物を提供する。 【解決手段】 第ＶＩＩａ因子と少なくともさらに１種
類の活性成分を含み、少なくとも第ＶＩＩａ因子１０単
位／単位ＦＥＩＢＡの活性を有することを特徴とする、
ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物は上記目的に有用で
ある。
ビターに起因する血液凝固疾患患者を治療するための医
薬組成物を提供する。 【解決手段】 第ＶＩＩａ因子と少なくともさらに１種
類の活性成分を含み、少なくとも第ＶＩＩａ因子１０単
位／単位ＦＥＩＢＡの活性を有することを特徴とする、
ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物は上記目的に有用で
ある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液凝固障害、特
に第ＶＩＩＩ因子インヒビターによる障害を有する患者
を治療するための医薬組成物に関する。さらに、本発明
はこの種の組成物の製造法に関する。
に第ＶＩＩＩ因子インヒビターによる障害を有する患者
を治療するための医薬組成物に関する。さらに、本発明
はこの種の組成物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】血液
凝固は、種々の蛋白および／または酵素の一連の連続的
な反応によって引き起こされる。フィブリノーゲンから
のフィブリンの形成とそれによる傷の閉鎖は、血液凝固
因子の欠損によって妨げられ、その結果出血が起こる。
そのような例は血友病Ａにみられる。血友病Ａは、第Ｖ
ＩＩＩ因子の欠損に起因する、最も広範にみられる出血
性疾患である。第ＶＩＩＩ因子を含有する製剤は、血友
病Ａの置換療法に用いられる。この製剤を用いる治療に
よって、ほとんどの場合において速やかな止血が得られ
る。
凝固は、種々の蛋白および／または酵素の一連の連続的
な反応によって引き起こされる。フィブリノーゲンから
のフィブリンの形成とそれによる傷の閉鎖は、血液凝固
因子の欠損によって妨げられ、その結果出血が起こる。
そのような例は血友病Ａにみられる。血友病Ａは、第Ｖ
ＩＩＩ因子の欠損に起因する、最も広範にみられる出血
性疾患である。第ＶＩＩＩ因子を含有する製剤は、血友
病Ａの置換療法に用いられる。この製剤を用いる治療に
よって、ほとんどの場合において速やかな止血が得られ
る。
【０００３】しかしながら、患者のなかには第ＶＩＩＩ
因子が欠損しているだけでなく、第ＶＩＩＩ因子に対す
るインヒビターが発現している者もいる。さらに、血友
病Ａに罹患していないが第ＶＩＩＩインヒビターを有す
る患者もいる。存在するＡ因子インヒビターの量に応じ
て、投与した第ＶＩＩＩ因子が中和され、それによって
第ＶＩＩＩ因子の効果が阻害される。
因子が欠損しているだけでなく、第ＶＩＩＩ因子に対す
るインヒビターが発現している者もいる。さらに、血友
病Ａに罹患していないが第ＶＩＩＩインヒビターを有す
る患者もいる。存在するＡ因子インヒビターの量に応じ
て、投与した第ＶＩＩＩ因子が中和され、それによって
第ＶＩＩＩ因子の効果が阻害される。
【０００４】本発明は、第ＶＩＩＩ因子インヒビターを
有する患者を治療するための、凝固因子の混合物を含む
血漿分画を主体とする製剤を提供するものである。この
血漿分画は、例えば、プロトロンビンコンプレックス因
子（第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第
Ｘ因子）を含むことができる。第ＶＩＩＩ因子インヒビ
ターバイパス（回避）活性を有する血液凝固促進製剤
（ＦＥＩＢＡ（登録商標）ＴＩＭ４、Immuno AG）は、A
T-0368883の記載に従って、例えば寒冷上清の処理によ
って得られる。この製剤には第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因
子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子も含まれる。
有する患者を治療するための、凝固因子の混合物を含む
血漿分画を主体とする製剤を提供するものである。この
血漿分画は、例えば、プロトロンビンコンプレックス因
子（第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第
Ｘ因子）を含むことができる。第ＶＩＩＩ因子インヒビ
ターバイパス（回避）活性を有する血液凝固促進製剤
（ＦＥＩＢＡ（登録商標）ＴＩＭ４、Immuno AG）は、A
T-0368883の記載に従って、例えば寒冷上清の処理によ
って得られる。この製剤には第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因
子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子も含まれる。
【０００５】ＦＥＩＢＡ製剤の作用はその組成物が複雑
であるが故に複雑である。Marianiら（Thrombosis Res.
31,475-488(1983)）は、作用の原理として第ＶＩＩ因
子の活性型を挙げている。血漿中の第ＶＩＩａ因子の量
が多いとＦＥＩＢＡ製剤を注入した後に血友病が生じる
ことが明らかとなった。同様に、「第ＶＩＩＩ因子バイ
パス活性」を有するプロトロンビンコンプレックス濃縮
物中の第ＶＩＩａ因子の役割は、Teitelが記載している
（Thrombosis and Haemostasis 66(5)559-564(199
1)）。このタイプの製剤における第Ｘａ因子の作用原理
も併せて詳述している。試験したプロトロンビンコンプ
レックス濃縮物は第ＶＩＩ因子抗原に対する第ＶＩＩ因
子活性の比が２．１と２．５である第ＶＩＩａ因子を含
んでいた。
であるが故に複雑である。Marianiら（Thrombosis Res.
31,475-488(1983)）は、作用の原理として第ＶＩＩ因
子の活性型を挙げている。血漿中の第ＶＩＩａ因子の量
が多いとＦＥＩＢＡ製剤を注入した後に血友病が生じる
ことが明らかとなった。同様に、「第ＶＩＩＩ因子バイ
パス活性」を有するプロトロンビンコンプレックス濃縮
物中の第ＶＩＩａ因子の役割は、Teitelが記載している
（Thrombosis and Haemostasis 66(5)559-564(199
1)）。このタイプの製剤における第Ｘａ因子の作用原理
も併せて詳述している。試験したプロトロンビンコンプ
レックス濃縮物は第ＶＩＩ因子抗原に対する第ＶＩＩ因
子活性の比が２．１と２．５である第ＶＩＩａ因子を含
んでいた。
【０００６】EP-0044343-B1の記載に従って製造された
プロトロンビンを含む治療用組成物は、凝固因子インヒ
ビターを処理するのに適しており、該因子が部分的に活
性化されている活性化プロトロンビンコンプレックスを
含んでいる。第ＶＩＩａ因子量は８〜８０単位／ｍＬで
ある。第ＩＸ因子濃度は１５〜１１２単位／ｍＬの範囲
内である。これに対応して、第ＩＸ因子に対する第ＶＩ
Ｉａ因子の含有量は第ＶＩＩａ因子０．０７〜５．３Ｕ
／Ｕ第ＩＸ因子である。Vinazzer（ThrombosisRes. 26:
21-29(1982)）は、EP-44343の記載に従って製造された
製剤ＡＵＴＯＰＬＥＸとＦＥＩＢＡが異なることを明ら
かにしている。その中に示されている通り、ＡＵＴＯＰ
ＬＥＸは、ＦＥＩＢＡに比べてＮＩＨ単位で測定したト
ロンビン（第ＩＩａ因子）含有量が高い点で異なる（２
４頁、表１参照）。
プロトロンビンを含む治療用組成物は、凝固因子インヒ
ビターを処理するのに適しており、該因子が部分的に活
性化されている活性化プロトロンビンコンプレックスを
含んでいる。第ＶＩＩａ因子量は８〜８０単位／ｍＬで
ある。第ＩＸ因子濃度は１５〜１１２単位／ｍＬの範囲
内である。これに対応して、第ＩＸ因子に対する第ＶＩ
Ｉａ因子の含有量は第ＶＩＩａ因子０．０７〜５．３Ｕ
／Ｕ第ＩＸ因子である。Vinazzer（ThrombosisRes. 26:
21-29(1982)）は、EP-44343の記載に従って製造された
製剤ＡＵＴＯＰＬＥＸとＦＥＩＢＡが異なることを明ら
かにしている。その中に示されている通り、ＡＵＴＯＰ
ＬＥＸは、ＦＥＩＢＡに比べてＮＩＨ単位で測定したト
ロンビン（第ＩＩａ因子）含有量が高い点で異なる（２
４頁、表１参照）。
【０００７】しかしながら、高度に精製された第ＶＩＩ
ａ因子製剤を、凝固因子インヒビターの存在する病態を
治療するのに用いることも提案されている（例えば、EP
0082182-B1およびHednerらの、Haemostasis 19,335-343
(1989)）。高度に精製された第ＶＩＩａ因子を含有する
濃縮物の製造法もEP0547932-A1に開示されている。第Ｖ
ＩＩ因子は、寒冷沈降物の陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによって、第ＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ凝固因子か
ら分離される。次に、第ＶＩＩ因子をさらに精製して活
性化し、その際外因性蛋白が加わるのを避ける。次い
で、第ＶＩＩａ因子を有機溶媒／界面活性剤（ＴｎＢＰ
／Ｔｗｅｅｎ）で処理することによりウイルスを不活化
する。
ａ因子製剤を、凝固因子インヒビターの存在する病態を
治療するのに用いることも提案されている（例えば、EP
0082182-B1およびHednerらの、Haemostasis 19,335-343
(1989)）。高度に精製された第ＶＩＩａ因子を含有する
濃縮物の製造法もEP0547932-A1に開示されている。第Ｖ
ＩＩ因子は、寒冷沈降物の陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによって、第ＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ凝固因子か
ら分離される。次に、第ＶＩＩ因子をさらに精製して活
性化し、その際外因性蛋白が加わるのを避ける。次い
で、第ＶＩＩａ因子を有機溶媒／界面活性剤（ＴｎＢＰ
／Ｔｗｅｅｎ）で処理することによりウイルスを不活化
する。
【０００８】血漿や血漿分画を医薬製剤を製造するため
の出発物質として使用する場合、伝染性感染物質の危険
性がある。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎
ウイルスのような存在する可能性のあるウイルスに関し
て、ドナーを選択し、ドナーから得られた個々の血漿を
検査しているにも関わらず、血漿プールが感染性である
可能性がある。検査システムの感度に限界があること
と、測定可能な感染マーカー（診断手段）が出現するま
でのインキュベーション時間があるために、この残る感
染性は排除できない。
の出発物質として使用する場合、伝染性感染物質の危険
性がある。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎
ウイルスのような存在する可能性のあるウイルスに関し
て、ドナーを選択し、ドナーから得られた個々の血漿を
検査しているにも関わらず、血漿プールが感染性である
可能性がある。検査システムの感度に限界があること
と、測定可能な感染マーカー（診断手段）が出現するま
でのインキュベーション時間があるために、この残る感
染性は排除できない。
【０００９】したがって、血漿または血漿分画から製造
される医薬製剤には、存在する可能性のあるウイルスを
不活化するための種々の処理が施される。膜エンベロー
プを持つウイルスと膜エンベロープを持たないウイルス
を不活化するための確実な方法は、EP0159311-B1に記載
されている。この方法では、含水率の値を５〜７０％と
なるように調節した後、固体の状態で医薬製剤を加熱す
る。この処理はスチーム（蒸気）処理としても開示され
ている。水の代わりにメタノールやエタノールを用いる
こともできる。しかしながら、同時に、ウイルス不活化
法を組み合わせることが可能である。EP0519901の記載
によれば、高度に濃縮されたテンシドによる処理と加熱
処理が組み合わされる。
される医薬製剤には、存在する可能性のあるウイルスを
不活化するための種々の処理が施される。膜エンベロー
プを持つウイルスと膜エンベロープを持たないウイルス
を不活化するための確実な方法は、EP0159311-B1に記載
されている。この方法では、含水率の値を５〜７０％と
なるように調節した後、固体の状態で医薬製剤を加熱す
る。この処理はスチーム（蒸気）処理としても開示され
ている。水の代わりにメタノールやエタノールを用いる
こともできる。しかしながら、同時に、ウイルス不活化
法を組み合わせることが可能である。EP0519901の記載
によれば、高度に濃縮されたテンシドによる処理と加熱
処理が組み合わされる。
【００１０】本発明の目的は、血液凝固障害、特に第Ｖ
ＩＩＩ因子インヒビターを有する患者を治療するための
改良された医薬組成物とそれを製造するための簡単な方
法を提供することである。本発明の目的は、第ＶＩＩａ
因子と少なくともさらに１種類の活性成分を含有し、Ｆ
ＥＩＢＡ １単位当り第ＶＩＩａ因子１０単位の活性を
有する、ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物によって達
成される。本発明の組成物中の第ＶＩＩａ因子の含有量
は、少なくとも１０、好ましくは１０〜１００、最も好
ましくは１０〜２０、特に１０〜１５単位／単位ＦＥＩ
Ｂ活性である。ＦＥＩＢ−活性はAT-350726に記載の方
法によって決定される。
ＩＩＩ因子インヒビターを有する患者を治療するための
改良された医薬組成物とそれを製造するための簡単な方
法を提供することである。本発明の目的は、第ＶＩＩａ
因子と少なくともさらに１種類の活性成分を含有し、Ｆ
ＥＩＢＡ １単位当り第ＶＩＩａ因子１０単位の活性を
有する、ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物によって達
成される。本発明の組成物中の第ＶＩＩａ因子の含有量
は、少なくとも１０、好ましくは１０〜１００、最も好
ましくは１０〜２０、特に１０〜１５単位／単位ＦＥＩ
Ｂ活性である。ＦＥＩＢ−活性はAT-350726に記載の方
法によって決定される。
【００１１】高度に精製された第ＶＩＩａ因子を唯一の
有効物質として含有する製剤は、いかなるＦＥＩＢ活性
も持たないことが明らかになっている。したがって、活
性化プロトロンビンコンプレックスを含有する分画製剤
のようなＦＥＩＢ活性を有する製剤に第ＶＩＩａ因子を
加えることが、血液凝固疾患、特に第ＶＩＩＩ因子イン
ヒビターを有する患者を治療するための医薬製剤の有効
性を実質的に改善するのに貢献するということは驚くべ
きことである。以下の実施例において、第ＶＩＩａ因子
含有量は、ウシトロンボプラスチンを用いるEP0547932
およびVan Deijkの、Haemostasis 13:192-197,1983に記
載の方法を用いて決定された。さらに、第ＶＩＩａ因子
は、Morrisseyらの、Blood 81:734-744,1983およびWO92
/18870に記載の方法に従って組換え型の可溶性組織因子
を用いて決定することもできる。
有効物質として含有する製剤は、いかなるＦＥＩＢ活性
も持たないことが明らかになっている。したがって、活
性化プロトロンビンコンプレックスを含有する分画製剤
のようなＦＥＩＢ活性を有する製剤に第ＶＩＩａ因子を
加えることが、血液凝固疾患、特に第ＶＩＩＩ因子イン
ヒビターを有する患者を治療するための医薬製剤の有効
性を実質的に改善するのに貢献するということは驚くべ
きことである。以下の実施例において、第ＶＩＩａ因子
含有量は、ウシトロンボプラスチンを用いるEP0547932
およびVan Deijkの、Haemostasis 13:192-197,1983に記
載の方法を用いて決定された。さらに、第ＶＩＩａ因子
は、Morrisseyらの、Blood 81:734-744,1983およびWO92
/18870に記載の方法に従って組換え型の可溶性組織因子
を用いて決定することもできる。
【００１２】第ＩＩ、第ＩＸならびに第Ｘ凝固因子、お
よびさらに例えば、組織因子もしくはＸａならびにリン
脂質はＦＥＩＢ−活性を有する製剤の活性成分というべ
きものである。ＦＥＩＢ−活性を有する製剤中の物質は
上記に完全に列挙したわけではないので、これに限定さ
れると考えるべきではない。本発明の製剤は、好ましく
は各因子ごとの比が０．５〜２、特に好ましくは０．５
〜１．５Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡに相当する濃度の第ＩＩ、
第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子を含有するのが好ましい。測
定は、AT-350726に記載の試験法に従って行われる。
よびさらに例えば、組織因子もしくはＸａならびにリン
脂質はＦＥＩＢ−活性を有する製剤の活性成分というべ
きものである。ＦＥＩＢ−活性を有する製剤中の物質は
上記に完全に列挙したわけではないので、これに限定さ
れると考えるべきではない。本発明の製剤は、好ましく
は各因子ごとの比が０．５〜２、特に好ましくは０．５
〜１．５Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡに相当する濃度の第ＩＩ、
第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子を含有するのが好ましい。測
定は、AT-350726に記載の試験法に従って行われる。
【００１３】さらに、本発明の組成物は、第ＶＩＩａ因
子／ＦＥＩＢＡ比と第ＶＩＩａ因子／第ＩＸ因子比が異
常に高い点で既知の製剤とは異なる。例えば、後者はEP
-0044343に記載のものより明らかに高い。本発明の製剤
は、さらにプロテインＣおよび／またはプロテインＳを
含有すると一層好都合である。驚くべきことに、本発明
の製剤は簡単で経済的な方法で製造することができる。
したがって、本発明には、上記の分画を陰イオン交換体
と接触させることによって第ＶＩＩ凝固因子が少なくと
も部分的に活性化することを特徴とする製造法も含まれ
る。条件としては、例えば、低イオン強度の緩衝剤を用
いて、第ＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子で第ＶＩＩ因
子および／または第ＶＩＩａ因子を同時に吸収すること
ができるような条件が選ばれる。次いで、陰イオン交換
体を、例えば、沈澱法によって分け、第ＩＩ、第ＶＩＩ
ａ、第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子を含有する分画を分離す
る。ちなみに、この分画は接触前に既にＦＥＩＢＡを有
するかそして／またはＦＥＩＢＡはこの間に分画中に生
じる。
子／ＦＥＩＢＡ比と第ＶＩＩａ因子／第ＩＸ因子比が異
常に高い点で既知の製剤とは異なる。例えば、後者はEP
-0044343に記載のものより明らかに高い。本発明の製剤
は、さらにプロテインＣおよび／またはプロテインＳを
含有すると一層好都合である。驚くべきことに、本発明
の製剤は簡単で経済的な方法で製造することができる。
したがって、本発明には、上記の分画を陰イオン交換体
と接触させることによって第ＶＩＩ凝固因子が少なくと
も部分的に活性化することを特徴とする製造法も含まれ
る。条件としては、例えば、低イオン強度の緩衝剤を用
いて、第ＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子で第ＶＩＩ因
子および／または第ＶＩＩａ因子を同時に吸収すること
ができるような条件が選ばれる。次いで、陰イオン交換
体を、例えば、沈澱法によって分け、第ＩＩ、第ＶＩＩ
ａ、第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子を含有する分画を分離す
る。ちなみに、この分画は接触前に既にＦＥＩＢＡを有
するかそして／またはＦＥＩＢＡはこの間に分画中に生
じる。
【００１４】好ましくは、強陰イオン交換体、例えば、
ＱＡＥ、ＴＭＡＥおよびＱグループのような４級アンモ
ニウム基を有するマトリックスが、陰イオン交換物質と
して用いられる。陰イオン交換グループの支持体には、
セファデックス（登録商標）またはセファロース（登録
商標）のような架橋デキストランやフラクトゲル（登録
商標）のような合成物質が用いられる。この製造法は、
経済的な方法である点で他の製造とは異なる。この方法
は、第ＶＩＩ凝固因子を後で再び製剤に加えるために最
初に分離する必要がないという利点がある。さらに、凝
固因子含有分画は精製されるばかりでなく、第ＶＩＩ凝
固因子も一段階で活性化される。第ＩＩ因子を除く、第
ＩＸ因子および第Ｘ因子の部分活性化も同時に起きる。
ＱＡＥ、ＴＭＡＥおよびＱグループのような４級アンモ
ニウム基を有するマトリックスが、陰イオン交換物質と
して用いられる。陰イオン交換グループの支持体には、
セファデックス（登録商標）またはセファロース（登録
商標）のような架橋デキストランやフラクトゲル（登録
商標）のような合成物質が用いられる。この製造法は、
経済的な方法である点で他の製造とは異なる。この方法
は、第ＶＩＩ凝固因子を後で再び製剤に加えるために最
初に分離する必要がないという利点がある。さらに、凝
固因子含有分画は精製されるばかりでなく、第ＶＩＩ凝
固因子も一段階で活性化される。第ＩＩ因子を除く、第
ＩＸ因子および第Ｘ因子の部分活性化も同時に起きる。
【００１５】本発明の組成物は、精製プロトロンビンコ
ンプレックスを含有する分画と精製第ＶＩＩａ因子を含
有する分画を混合し、ウイルスを不活化する処理を行う
ことによっても得ることができる。しかしながら、本発
明の医薬組成物は、精製部分プロトロンビンコンプレッ
クス（第ＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子）を含有
する分画および精製第ＶＩＩａ因子を含有する分画から
もなり、この組成物にはウイルスを不活化する処理が施
される。本発明の組成物を製造するのに用いるプロトロ
ンビンコンプレックスは、好ましくは活性化プロトロン
ビンコンプレックスかまたはＦＥＩＢＡ製剤として存在
する。活性化プロトロンビンコンプレックスにおいて、
第ＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子は部分的に活性化さ
れる。しかしながら、そのような製剤においては、プロ
トロンビン形成活性を直接排除するために第ＩＩ因子の
活性化は避けるべきである。
ンプレックスを含有する分画と精製第ＶＩＩａ因子を含
有する分画を混合し、ウイルスを不活化する処理を行う
ことによっても得ることができる。しかしながら、本発
明の医薬組成物は、精製部分プロトロンビンコンプレッ
クス（第ＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子）を含有
する分画および精製第ＶＩＩａ因子を含有する分画から
もなり、この組成物にはウイルスを不活化する処理が施
される。本発明の組成物を製造するのに用いるプロトロ
ンビンコンプレックスは、好ましくは活性化プロトロン
ビンコンプレックスかまたはＦＥＩＢＡ製剤として存在
する。活性化プロトロンビンコンプレックスにおいて、
第ＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ凝固因子は部分的に活性化さ
れる。しかしながら、そのような製剤においては、プロ
トロンビン形成活性を直接排除するために第ＩＩ因子の
活性化は避けるべきである。
【００１６】出発溶液中および／または洗浄用緩衝液お
よび強陰イオン交換ゲル、例えばＱ−セファロース（登
録商標）Fast Flow（Pharmacia）中の高イオン強度のよ
うなある条件を用いることによって、寒冷沈降物を分離
した後に血漿または血漿上清から活性化プロトロンビン
コンプレックスをＦＥＩＢＡ製剤として高収量で分離す
ることができる。次に、このタイプのゲルは、第ＶＩＩ
因子または第ＶＩＩａ因子とは比較的あまり結合しな
い。したがって、さらなる工程において、同じ出発物質
から第ＶＩＩａ因子を高収量で分離することができる。
得られた分画は、例えば、医薬的に許容される担体およ
び／またはアジュバントを加え、濾過滅菌し、凍結乾燥
して保存可能な医薬製剤とする通常の方法で医薬製剤に
加工される。
よび強陰イオン交換ゲル、例えばＱ−セファロース（登
録商標）Fast Flow（Pharmacia）中の高イオン強度のよ
うなある条件を用いることによって、寒冷沈降物を分離
した後に血漿または血漿上清から活性化プロトロンビン
コンプレックスをＦＥＩＢＡ製剤として高収量で分離す
ることができる。次に、このタイプのゲルは、第ＶＩＩ
因子または第ＶＩＩａ因子とは比較的あまり結合しな
い。したがって、さらなる工程において、同じ出発物質
から第ＶＩＩａ因子を高収量で分離することができる。
得られた分画は、例えば、医薬的に許容される担体およ
び／またはアジュバントを加え、濾過滅菌し、凍結乾燥
して保存可能な医薬製剤とする通常の方法で医薬製剤に
加工される。
【００１７】本発明の組成物は、 ａ）第ＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ凝固因子の１つまたは
それ以上を含む１つまたはそれ以上の出発物質から個々
の因子としてかまたは混合物としてこれらの因子を分離
し、 ｂ）第ＶＩＩａ凝固因子および／または第ＶＩＩ凝固因
子を含有する出発物質から第ＶＩＩ／ＶＩＩａ凝固因子
を分離することによって第ＶＩＩ凝固因子を少なくとも
部分的に活性化し、 ｃ）出発物質または分離された凝固因子を前処理および
／または処理することによって感染性物質を不活化し、 ｄ）分離された凝固因子を医薬的に許容される担体と混
合する 工程を伴うさらなる方法によって製造することができ
る。
それ以上を含む１つまたはそれ以上の出発物質から個々
の因子としてかまたは混合物としてこれらの因子を分離
し、 ｂ）第ＶＩＩａ凝固因子および／または第ＶＩＩ凝固因
子を含有する出発物質から第ＶＩＩ／ＶＩＩａ凝固因子
を分離することによって第ＶＩＩ凝固因子を少なくとも
部分的に活性化し、 ｃ）出発物質または分離された凝固因子を前処理および
／または処理することによって感染性物質を不活化し、 ｄ）分離された凝固因子を医薬的に許容される担体と混
合する 工程を伴うさらなる方法によって製造することができ
る。
【００１８】好ましい態様において、第ＶＩＩａ因子は
成分の精製後に部分プロトロンビンコンプレックスとし
ても存在し得るプロトロンビンコンプレックスに加えら
れ、医薬的に許容される担体と混合され、次いで、ウイ
ルスを不活化する処理（例えば加熱処理）が施される。
高純度の第ＶＩＩａ因子の添加および／または含有は、
不純物として製剤中に混入する夾雑蛋白が少なくなるの
で特に好都合である。この製剤中の第ＶＩＩａ因子の比
活性は好ましくは、１０Ｕ／ｍｇ蛋白以上〜１０００Ｕ
／ｍｇ蛋白である。プロトロンビンコンプレックスは好
ましくは、活性化プロトロンビンコンプレックスかまた
はＦＥＩＢＡ製剤として存在する。
成分の精製後に部分プロトロンビンコンプレックスとし
ても存在し得るプロトロンビンコンプレックスに加えら
れ、医薬的に許容される担体と混合され、次いで、ウイ
ルスを不活化する処理（例えば加熱処理）が施される。
高純度の第ＶＩＩａ因子の添加および／または含有は、
不純物として製剤中に混入する夾雑蛋白が少なくなるの
で特に好都合である。この製剤中の第ＶＩＩａ因子の比
活性は好ましくは、１０Ｕ／ｍｇ蛋白以上〜１０００Ｕ
／ｍｇ蛋白である。プロトロンビンコンプレックスは好
ましくは、活性化プロトロンビンコンプレックスかまた
はＦＥＩＢＡ製剤として存在する。
【００１９】好ましくは、感染性物質（ウイルス）を不
活化するために加熱処理（例えば、スチーム処理）が施
される。固体状態の凝固因子の加熱処理は、アルブミン
のような安定化蛋白を加えることなく行うことができる
ことが解った。第ＶＩＩａ因子は、驚くべきことに、感
染性物質を不活化するために精製された状態で処理する
こともできるほどに安定である。ウイルスを不活化する
ための加熱処理は、脂質の被膜を持ったウイルスのみな
らず、脂質のエンペロープに被われていないウイルスに
対しても好都合である。
活化するために加熱処理（例えば、スチーム処理）が施
される。固体状態の凝固因子の加熱処理は、アルブミン
のような安定化蛋白を加えることなく行うことができる
ことが解った。第ＶＩＩａ因子は、驚くべきことに、感
染性物質を不活化するために精製された状態で処理する
こともできるほどに安定である。ウイルスを不活化する
ための加熱処理は、脂質の被膜を持ったウイルスのみな
らず、脂質のエンペロープに被われていないウイルスに
対しても好都合である。
【００２０】本発明の方法は、（部分）プロトロンビン
コンプレックスを含有する分画の製造において副産物と
して蓄積する分画から第ＶＩＩａ因子を分離することが
できることを特徴とする。したがって、この方法は、特
にその経済効率によっても特徴づけられる。本発明の方
法を用いることによって、単一の出発物質、好ましくは
血漿プールまたは血漿分画から本発明の組成物の全ての
成分を得ることができる。これにより、本発明において
得られる医薬製剤の安全性が増す。
コンプレックスを含有する分画の製造において副産物と
して蓄積する分画から第ＶＩＩａ因子を分離することが
できることを特徴とする。したがって、この方法は、特
にその経済効率によっても特徴づけられる。本発明の方
法を用いることによって、単一の出発物質、好ましくは
血漿プールまたは血漿分画から本発明の組成物の全ての
成分を得ることができる。これにより、本発明において
得られる医薬製剤の安全性が増す。
【００２１】好ましい態様において、本発明に記載の方
法は、好ましくは、ＤＥＡＥ−セファセル（登録商
標）、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース（登録商標）ＣＬ６Ｂ、ＤＥＡＥ−セ
ファロース（登録商標）Fast Flow、ＱＡＥ−セファデ
ックス（登録商標）、ＱＡＥ−セファロース（登録商
標）Fast Flow、Ｑ−セファロース（登録商標）High Pe
rformance、Ｑ−セファロース（登録商標）Big Beads
（Pharmaciaから入手可）、ＤＥＡＥ−トリスアクリ
ル、ＤＥＡＥ−セファロデックス（登録商標）、Ｑ−ハ
イパー−Ｄ（Sepracorから入手可）、マクロプレプ（登
録商標）ＤＥＡＥ、マクロプレプＱ（登録商標）（BioR
ad）、ＤＥＡＥ−トヨパール（登録商標）、ＱＡＥ−ト
ヨパール（登録商標）、ポヨパール（登録商標）スーパ
ー−Ｑ（Tosohaas）、プロテインＰＡＫ ＤＥＡＥ（Wat
ers）、フラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ−ＴＭＡＥ、
フラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ−ＤＥＡＥ、フラクト
ゲル（登録商標）ＥＭＤ−ＤＭＡＥ、リクロスフェア
（登録商標）１０００ＴＭＡＥ、リクロスフェア（登録
商標）１０００ＤＥＡＥ、およびリクロスフェア（登録
商標）４０００ＤＭＡＥ（Merck）のような陰イオン交
換体によるクロマトグラフィー法によって第ＶＩＩ凝固
因子を分離することを意図するものである。特に好まし
い態様において、本発明は、例えば、以下の物質を用い
る疎水性クロマトグラフィーによって第ＶＩＩａ因子を
分離することに関するものである：ブチル−セファロー
ス（登録商標）、オクチル−セファロース（登録商
標）、フェニル−セファロース（登録商標）、フェニル
−セファロース（登録商標）Fast Flow High Sub、フェ
ニル−セファロース（登録商標）Fast Flow Low Sub、
フェニル−セファロース（登録商標）High Performance
（すべてPharmaciaから入手可）、フラクトゲル（登録
商標）ＴＳＫ−ブチル（Merch）、マクロプレプ（登録
商標）−メチル−ＨＩＣ−Support、マクロプレプ（登
録商標）−ｔ−ブチル−ＨＩＣ−Support（BioRad）、
ＴＳＫ−ゲル・ブチル・トヨパール（登録商標）、ＴＳ
Ｋ−ゲル・フェニル・トヨパール（登録商標）、ＴＳＫ
−ゲル・エーテル・トヨパール（登録商標）（Tosohaa
s）。分離中に同時にみられる（少なくとも部分的な）
活性化は、第ＶＩＩ凝固因子の場合と同じく第ＩＸおよ
び第Ｘ凝固因子の精製においても好都合である。しかし
ながら、この製剤は血栓形成活性を持っておらず、した
がって、活性化第ＩＩ因子の含有を避けるべきであるこ
とに注意する必要がある。
法は、好ましくは、ＤＥＡＥ−セファセル（登録商
標）、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース（登録商標）ＣＬ６Ｂ、ＤＥＡＥ−セ
ファロース（登録商標）Fast Flow、ＱＡＥ−セファデ
ックス（登録商標）、ＱＡＥ−セファロース（登録商
標）Fast Flow、Ｑ−セファロース（登録商標）High Pe
rformance、Ｑ−セファロース（登録商標）Big Beads
（Pharmaciaから入手可）、ＤＥＡＥ−トリスアクリ
ル、ＤＥＡＥ−セファロデックス（登録商標）、Ｑ−ハ
イパー−Ｄ（Sepracorから入手可）、マクロプレプ（登
録商標）ＤＥＡＥ、マクロプレプＱ（登録商標）（BioR
ad）、ＤＥＡＥ−トヨパール（登録商標）、ＱＡＥ−ト
ヨパール（登録商標）、ポヨパール（登録商標）スーパ
ー−Ｑ（Tosohaas）、プロテインＰＡＫ ＤＥＡＥ（Wat
ers）、フラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ−ＴＭＡＥ、
フラクトゲル（登録商標）ＥＭＤ−ＤＥＡＥ、フラクト
ゲル（登録商標）ＥＭＤ−ＤＭＡＥ、リクロスフェア
（登録商標）１０００ＴＭＡＥ、リクロスフェア（登録
商標）１０００ＤＥＡＥ、およびリクロスフェア（登録
商標）４０００ＤＭＡＥ（Merck）のような陰イオン交
換体によるクロマトグラフィー法によって第ＶＩＩ凝固
因子を分離することを意図するものである。特に好まし
い態様において、本発明は、例えば、以下の物質を用い
る疎水性クロマトグラフィーによって第ＶＩＩａ因子を
分離することに関するものである：ブチル−セファロー
ス（登録商標）、オクチル−セファロース（登録商
標）、フェニル−セファロース（登録商標）、フェニル
−セファロース（登録商標）Fast Flow High Sub、フェ
ニル−セファロース（登録商標）Fast Flow Low Sub、
フェニル−セファロース（登録商標）High Performance
（すべてPharmaciaから入手可）、フラクトゲル（登録
商標）ＴＳＫ−ブチル（Merch）、マクロプレプ（登録
商標）−メチル−ＨＩＣ−Support、マクロプレプ（登
録商標）−ｔ−ブチル−ＨＩＣ−Support（BioRad）、
ＴＳＫ−ゲル・ブチル・トヨパール（登録商標）、ＴＳ
Ｋ−ゲル・フェニル・トヨパール（登録商標）、ＴＳＫ
−ゲル・エーテル・トヨパール（登録商標）（Tosohaa
s）。分離中に同時にみられる（少なくとも部分的な）
活性化は、第ＶＩＩ凝固因子の場合と同じく第ＩＸおよ
び第Ｘ凝固因子の精製においても好都合である。しかし
ながら、この製剤は血栓形成活性を持っておらず、した
がって、活性化第ＩＩ因子の含有を避けるべきであるこ
とに注意する必要がある。
【００２２】本発明の組成物は、好都合にも、すぐに使
用できる溶液１ｍＬあたりＦＥＩＢＡ １〜１０００単
位の範囲のＦＥＩＢ−活性を有する。好ましくは、ＦＥ
ＩＢ−活性は５Ｕ／ｍＬより大きく、より好ましくはＦ
ＥＩＢＡは１０〜１００Ｕ／ｍＬの範囲である。本発明
には、凝固因子欠損患者の出血を速やかに止めるための
ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物を製造するために、
第ＶＩＩａ因子と少なくとも１種類の活性成分の混合物
を使用することも含まれる。この方法は、凝固因子イン
ヒビター依存性の出血を速やかに止めるのに特に有効で
ある。
用できる溶液１ｍＬあたりＦＥＩＢＡ １〜１０００単
位の範囲のＦＥＩＢ−活性を有する。好ましくは、ＦＥ
ＩＢ−活性は５Ｕ／ｍＬより大きく、より好ましくはＦ
ＥＩＢＡは１０〜１００Ｕ／ｍＬの範囲である。本発明
には、凝固因子欠損患者の出血を速やかに止めるための
ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物を製造するために、
第ＶＩＩａ因子と少なくとも１種類の活性成分の混合物
を使用することも含まれる。この方法は、凝固因子イン
ヒビター依存性の出血を速やかに止めるのに特に有効で
ある。
【００２３】本発明の医薬製剤のin vivoにおける効果
は、ウサギを第ＶＩＩＩ因子インヒビターを含む血漿で
処理することによって一過性に血友病Ａの状態を引き起
こす動物モデルにおいて証明することができる。該イン
ヒビターに起因する血友病の１つに相当する出血体質を
有するこのタイプの前処理動物にＦＥＩＢＡ ７５〜１
００単位／ｋｇを投与することによって、異常な出血挙
動を無処置のウサギのレベルまで改善することができ
る。定義された高い含有量の第ＶＩＩａ因子を含むＦＥ
ＩＢＡ製剤の改良された有効性を証明するために、ＦＥ
ＩＢＡ １単位あたり第ＶＩＩａ因子１０単位の割合の
第ＶＩＩａ因子とＦＥＩＢＡを含有する本発明の医薬製
剤を、用量ＦＥＩＢＡ ５Ｕ／ｋｇ（第ＶＩＩａ因子５
０Ｕ／ｋｇに相当）で出血しているウサギに投与した。
ＦＥＩＢＡ ７５Ｕ／ｋｇを投与するのと同程度に出血
強度は低下する。
は、ウサギを第ＶＩＩＩ因子インヒビターを含む血漿で
処理することによって一過性に血友病Ａの状態を引き起
こす動物モデルにおいて証明することができる。該イン
ヒビターに起因する血友病の１つに相当する出血体質を
有するこのタイプの前処理動物にＦＥＩＢＡ ７５〜１
００単位／ｋｇを投与することによって、異常な出血挙
動を無処置のウサギのレベルまで改善することができ
る。定義された高い含有量の第ＶＩＩａ因子を含むＦＥ
ＩＢＡ製剤の改良された有効性を証明するために、ＦＥ
ＩＢＡ １単位あたり第ＶＩＩａ因子１０単位の割合の
第ＶＩＩａ因子とＦＥＩＢＡを含有する本発明の医薬製
剤を、用量ＦＥＩＢＡ ５Ｕ／ｋｇ（第ＶＩＩａ因子５
０Ｕ／ｋｇに相当）で出血しているウサギに投与した。
ＦＥＩＢＡ ７５Ｕ／ｋｇを投与するのと同程度に出血
強度は低下する。
【００２４】コントロールとして、各例において無処理
の、血友病Ａインヒビターを有する動物において出血強
度の顕著な低下をもたらさない用量５Ｕ／ｋｇの通常の
ＦＥＩＢＡまたは用量５０Ｕ／ｋｇの第ＶＩＩａ因子を
投与する。これによって、本発明の医薬組成物の予期し
ない高い有効性が示される。この本質的な利点は、本発
明の医薬組成物が血栓を形成する可能性は、通常のＦＥ
ＩＢＡに比べて明らかに減少することである。
の、血友病Ａインヒビターを有する動物において出血強
度の顕著な低下をもたらさない用量５Ｕ／ｋｇの通常の
ＦＥＩＢＡまたは用量５０Ｕ／ｋｇの第ＶＩＩａ因子を
投与する。これによって、本発明の医薬組成物の予期し
ない高い有効性が示される。この本質的な利点は、本発
明の医薬組成物が血栓を形成する可能性は、通常のＦＥ
ＩＢＡに比べて明らかに減少することである。
【００２５】
【発明の実施の形態】以下の実施例において本発明をさ
らに詳しく説明する。 実施例１〜８：第ＶＩＩａ因子製剤の製造法
らに詳しく説明する。 実施例１〜８：第ＶＩＩａ因子製剤の製造法
【００２６】実施例１：血漿からの寒冷沈降物とＦＥＩ
ＢＡの分離 AT-350726およびAT-368883の記載に基づいて製造を行
う。新鮮な凍結ヒトクエン酸加血漿を０〜＋４℃で溶解
し、得られる寒冷沈降物を＋２℃で遠心して分離した。
本来のｐＨ値で、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商
標）Ａ−５０ ０．５ｇを、＋４℃で連続的に撹拌しな
がら、得られる凍結上清に加える。この懸濁液をさらに
１時間撹拌し、次いで放置することにより蛋白−ＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（登録商標）コンプレックスを沈澱
させる。これにより、ＦＥＩＢＡが生じ、プロトロンビ
ンコンプレックス（ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ）因
子および不活性蛋白と一緒にＤＥＡＥ−セファデックス
（登録商標）に吸着する。遠心または濾過による完全な
吸着工程の後、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）
−蛋白コンプレックスを上清から分ける。AT368883に記
載のごとく、洗浄し、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録
商標）−蛋白コンプレックスを溶離することによってＦ
ＥＩＢＡを分離する。さらに上清を加工して第ＶＩＩａ
因子製剤とする。
ＢＡの分離 AT-350726およびAT-368883の記載に基づいて製造を行
う。新鮮な凍結ヒトクエン酸加血漿を０〜＋４℃で溶解
し、得られる寒冷沈降物を＋２℃で遠心して分離した。
本来のｐＨ値で、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商
標）Ａ−５０ ０．５ｇを、＋４℃で連続的に撹拌しな
がら、得られる凍結上清に加える。この懸濁液をさらに
１時間撹拌し、次いで放置することにより蛋白−ＤＥＡ
Ｅ−セファデックス（登録商標）コンプレックスを沈澱
させる。これにより、ＦＥＩＢＡが生じ、プロトロンビ
ンコンプレックス（ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ）因
子および不活性蛋白と一緒にＤＥＡＥ−セファデックス
（登録商標）に吸着する。遠心または濾過による完全な
吸着工程の後、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）
−蛋白コンプレックスを上清から分ける。AT368883に記
載のごとく、洗浄し、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録
商標）−蛋白コンプレックスを溶離することによってＦ
ＥＩＢＡを分離する。さらに上清を加工して第ＶＩＩａ
因子製剤とする。
【００２７】実施例２：ＦＥＩＢＡ上清からの第ＶＩＩ
／ＶＩＩａ因子の分離 実施例１でＦＥＩＢＡを分離した後、水酸化アルミニウ
ムに吸着させることによって上清からプロトロンビンコ
ンプレックス因子、具体的には第ＶＩＩ因子と第ＶＩＩ
ａ因子を分離した。ＦＥＩＢＡ上清１Ｌあたり２％アル
ミニウムヒドロゲル懸濁液１０ｍＬを遠心した（SORVAL
L RC3B、ローターH6000A、5000rpm、１０分間、約４
℃）。得られる沈澱物を処理するＦＥＩＢＡ上清と均質
に混合した（Ultra Turrax）。次に、これを２０〜２２
℃で３０分間撹拌し、次いで遠心した（SORVALL RC3B、
ローターH6000A、5000rpm、１０分間、約４℃）。
／ＶＩＩａ因子の分離 実施例１でＦＥＩＢＡを分離した後、水酸化アルミニウ
ムに吸着させることによって上清からプロトロンビンコ
ンプレックス因子、具体的には第ＶＩＩ因子と第ＶＩＩ
ａ因子を分離した。ＦＥＩＢＡ上清１Ｌあたり２％アル
ミニウムヒドロゲル懸濁液１０ｍＬを遠心した（SORVAL
L RC3B、ローターH6000A、5000rpm、１０分間、約４
℃）。得られる沈澱物を処理するＦＥＩＢＡ上清と均質
に混合した（Ultra Turrax）。次に、これを２０〜２２
℃で３０分間撹拌し、次いで遠心した（SORVALL RC3B、
ローターH6000A、5000rpm、１０分間、約４℃）。
【００２８】遠心して得られた沈澱物を、クエン酸Ｎａ
3・２Ｈ2Ｏ ４ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ７ｇ／Ｌの溶液
（ｐＨ７．５）中の吸着に用いる３．５容量％ＦＥＩＢ
Ａ上清に懸濁し、３０分間撹拌して蛋白を除去した。次
に、遠心により沈澱を分離した（RC3B、ローターH6000
A、5000rpm、１０分間、約４℃）。上清を捨て、沈澱を
用いてさらに処理を行った。次に、AT-A1547/93の記載
に従って、存在するかも知れない病原物質を不活化する
ための工程を行った。吸着に用いる１．５容量％ＦＥＩ
ＢＡ上清にツイーン（登録商標）８０を加え、５５℃に
加熱した。最初の洗浄後に、Ultra Turraxミキサーを用
い、１〜２分間上清をツイーン（登録商標）８０溶液に
懸濁し、５５℃で１０分間撹拌した。次に、これを速や
かに９倍容量の水（＋４℃）で希釈した。
3・２Ｈ2Ｏ ４ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ７ｇ／Ｌの溶液
（ｐＨ７．５）中の吸着に用いる３．５容量％ＦＥＩＢ
Ａ上清に懸濁し、３０分間撹拌して蛋白を除去した。次
に、遠心により沈澱を分離した（RC3B、ローターH6000
A、5000rpm、１０分間、約４℃）。上清を捨て、沈澱を
用いてさらに処理を行った。次に、AT-A1547/93の記載
に従って、存在するかも知れない病原物質を不活化する
ための工程を行った。吸着に用いる１．５容量％ＦＥＩ
ＢＡ上清にツイーン（登録商標）８０を加え、５５℃に
加熱した。最初の洗浄後に、Ultra Turraxミキサーを用
い、１〜２分間上清をツイーン（登録商標）８０溶液に
懸濁し、５５℃で１０分間撹拌した。次に、これを速や
かに９倍容量の水（＋４℃）で希釈した。
【００２９】処理したＡｌ（ＯＨ）3−蛋白コンプレッ
クスを遠心して分離し、上清を捨て、沈澱物をさらに処
理した。次に、３．５容量％の使用したＦＥＩＢＡ上清
で各２回洗浄し、再懸濁し、クエン酸緩衝液（クエン酸
Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ ４ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ７ｇ／Ｌ（ｐ
Ｈ７．５））を用いて再度遠心した。
クスを遠心して分離し、上清を捨て、沈澱物をさらに処
理した。次に、３．５容量％の使用したＦＥＩＢＡ上清
で各２回洗浄し、再懸濁し、クエン酸緩衝液（クエン酸
Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ ４ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ７ｇ／Ｌ（ｐ
Ｈ７．５））を用いて再度遠心した。
【００３０】第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子含有分画を、水酸
化アルミニウムゲルからリン酸緩衝液で溶出して分離し
た。蛋白−水酸化アルミニウムコンプレックスを０．３
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．６：Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ
５３．４ｇ／ＬをＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ４１．４ｇ／
Ｌの溶液でｐＨ８．６に調整した）の吸着に用いる１容
量％のＦＥＩＢＡ上清と３０分間撹拌した。次に、２０
〜２２℃で１０分間５０００ｒｐｍで遠心して固相を分
けた。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子を含有する上清をさらに
処理してさらに精製した。
化アルミニウムゲルからリン酸緩衝液で溶出して分離し
た。蛋白−水酸化アルミニウムコンプレックスを０．３
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．６：Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ
５３．４ｇ／ＬをＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ４１．４ｇ／
Ｌの溶液でｐＨ８．６に調整した）の吸着に用いる１容
量％のＦＥＩＢＡ上清と３０分間撹拌した。次に、２０
〜２２℃で１０分間５０００ｒｐｍで遠心して固相を分
けた。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子を含有する上清をさらに
処理してさらに精製した。
【００３１】実施例３：第ＶＩＩ因子の活性化と第ＶＩ
Ｉａ因子のイオン交換精製 実施例２で分離した溶離物を蒸留水で１：１の割合で希
釈し、０．２５ｍＭＣａＣｌ2と混合し、ｐＨ値を８．
６に調整した。次に、この溶液を６５ｍＬ／ＬのＱ−セ
ファロース（登録商標）FFと混合し、緩衝液で予備洗浄
し、４℃で２時間撹拌した。次に、第ＶＩＩａ因子が結
合しているゲルを、濾過と遠心によって分けた。液を流
したゲルは、１５分間再懸濁し、次いで洗浄用緩衝液
（Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ９６．７ｇ／ＬおよびＣａＣ
ｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０３６８ｇ／ＬをＮａＨ2ＰＯ4・２
Ｈ2Ｏ ２０．７／Ｌの溶液でｐＨ８．６に調整した）か
ら分離することにより不活性蛋白を除去した。次に、第
ＶＩＩａ因子を、３０分間懸濁し、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １
０５．７ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５８．５ｇ／Ｌ、およびト
リスＨＣｌ ２．４２ｇ／Ｌの溶液（ｐＨ７．４）を用
いて溶出した。第ＶＩＩａ因子を含有するゲル上清を濾
過または遠心によって分けた。
Ｉａ因子のイオン交換精製 実施例２で分離した溶離物を蒸留水で１：１の割合で希
釈し、０．２５ｍＭＣａＣｌ2と混合し、ｐＨ値を８．
６に調整した。次に、この溶液を６５ｍＬ／ＬのＱ−セ
ファロース（登録商標）FFと混合し、緩衝液で予備洗浄
し、４℃で２時間撹拌した。次に、第ＶＩＩａ因子が結
合しているゲルを、濾過と遠心によって分けた。液を流
したゲルは、１５分間再懸濁し、次いで洗浄用緩衝液
（Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ９６．７ｇ／ＬおよびＣａＣ
ｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０３６８ｇ／ＬをＮａＨ2ＰＯ4・２
Ｈ2Ｏ ２０．７／Ｌの溶液でｐＨ８．６に調整した）か
ら分離することにより不活性蛋白を除去した。次に、第
ＶＩＩａ因子を、３０分間懸濁し、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １
０５．７ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５８．５ｇ／Ｌ、およびト
リスＨＣｌ ２．４２ｇ／Ｌの溶液（ｐＨ７．４）を用
いて溶出した。第ＶＩＩａ因子を含有するゲル上清を濾
過または遠心によって分けた。
【００３２】実施例４：疎水性クロマトグラフィーによ
る第ＶＩＩａ因子の精製 実施例３で得た第ＶＩＩａ因子含有溶液を、フェニルセ
ファロース（登録商標）LSを用いるクロマトグラフィー
により精製した。ＩＤ５０ｍｍおよびベッド高２４ｍｍ
のカラムにフェニルセファロース（登録商標）LSを満た
し、トリスＨＣｌ ２．４２ｇ／Ｌおよび（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4 １０５．７ｇ／Ｌを含有する緩衝液（ｐＨ７．４）
で平衡化した。実施例３で得た第ＶＩＩａ因子含有溶離
物１００ｍＬを２３ｍＬ／分の流速でゲルに流した。こ
れにより第ＶＩＩａ因子はゲルに結合し、不活性蛋白は
通過液にみいだされた。ゲルを平衡化に用いた緩衝液で
洗浄した。次に、第ＶＩＩａ因子をトリスＨＣｌ ２．
４２ｇ／Ｌ溶液（ｐＨ７．４）で溶離し、分画を回収し
た。第ＶＩＩａ因子活性を有する分画を混合し、セファ
デックス（登録商標）G-25を用いるクロマトグラフィー
によってトリスＨＣｌ ２．４２ｇ／Ｌ含有緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で緩衝液の交換を行った。
る第ＶＩＩａ因子の精製 実施例３で得た第ＶＩＩａ因子含有溶液を、フェニルセ
ファロース（登録商標）LSを用いるクロマトグラフィー
により精製した。ＩＤ５０ｍｍおよびベッド高２４ｍｍ
のカラムにフェニルセファロース（登録商標）LSを満た
し、トリスＨＣｌ ２．４２ｇ／Ｌおよび（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4 １０５．７ｇ／Ｌを含有する緩衝液（ｐＨ７．４）
で平衡化した。実施例３で得た第ＶＩＩａ因子含有溶離
物１００ｍＬを２３ｍＬ／分の流速でゲルに流した。こ
れにより第ＶＩＩａ因子はゲルに結合し、不活性蛋白は
通過液にみいだされた。ゲルを平衡化に用いた緩衝液で
洗浄した。次に、第ＶＩＩａ因子をトリスＨＣｌ ２．
４２ｇ／Ｌ溶液（ｐＨ７．４）で溶離し、分画を回収し
た。第ＶＩＩａ因子活性を有する分画を混合し、セファ
デックス（登録商標）G-25を用いるクロマトグラフィー
によってトリスＨＣｌ ２．４２ｇ／Ｌ含有緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で緩衝液の交換を行った。
【００３３】実施例５：Ｑ−セファロース（登録商標）
クロマトグラフィーによる第ＶＩＩａ因子の精製 ＩＤ２５ｍｍおよびベッド高５５ｍｍのカラムに充填し
たＱ−セファロース（登録商標）FFをトリスＨＣｌ ２
０ｍｍ／Ｌ（ｐＨ７．４）で平衡化し、実施例４で得た
第ＶＩＩａ因子含有溶液４３ｍＬを５．３ｍＬ／分の流
速でカラムに流した。これによって、第ＶＩＩａ因子は
ゲルに結合したが、不活性蛋白は通過液中に留まってい
た。次に、これを２５ｍＭクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2０およ
び８０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ６．０）で洗
浄した。これによって、さらに不活性蛋白が分かれた。
２５ｍＭクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2０および１６０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄することによって
第ＶＩＩａ因子を溶離した。この溶離工程の第ＶＩＩａ
因子活性を含む分画および蛋白をプールした。次に、カ
ラムを緩衝液（２５ｍＭクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2０および
１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で再生してさらに使用し
た。
クロマトグラフィーによる第ＶＩＩａ因子の精製 ＩＤ２５ｍｍおよびベッド高５５ｍｍのカラムに充填し
たＱ−セファロース（登録商標）FFをトリスＨＣｌ ２
０ｍｍ／Ｌ（ｐＨ７．４）で平衡化し、実施例４で得た
第ＶＩＩａ因子含有溶液４３ｍＬを５．３ｍＬ／分の流
速でカラムに流した。これによって、第ＶＩＩａ因子は
ゲルに結合したが、不活性蛋白は通過液中に留まってい
た。次に、これを２５ｍＭクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2０およ
び８０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ６．０）で洗
浄した。これによって、さらに不活性蛋白が分かれた。
２５ｍＭクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2０および１６０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄することによって
第ＶＩＩａ因子を溶離した。この溶離工程の第ＶＩＩａ
因子活性を含む分画および蛋白をプールした。次に、カ
ラムを緩衝液（２５ｍＭクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2０および
１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で再生してさらに使用し
た。
【００３４】実施例６：第ＶＩＩａ因子製剤の限外濾過
による濃縮 実施例５で得た第ＶＩＩａ因子を含むプールをｐＨ７．
０に調整し、０．１％ヒトアルブミンと混合した。次
に、これをアミコン８０／５０撹拌セル中、３．０ｂａ
ｒの圧で限外濾過膜（アミコンＹＭ１０、カットオフ１
００００Ｄ）によって出発容量の１／１０に濃縮した。
次いで、第ＶＩＩａ因子を含む濃縮溶液を凍結乾燥し
た。
による濃縮 実施例５で得た第ＶＩＩａ因子を含むプールをｐＨ７．
０に調整し、０．１％ヒトアルブミンと混合した。次
に、これをアミコン８０／５０撹拌セル中、３．０ｂａ
ｒの圧で限外濾過膜（アミコンＹＭ１０、カットオフ１
００００Ｄ）によって出発容量の１／１０に濃縮した。
次いで、第ＶＩＩａ因子を含む濃縮溶液を凍結乾燥し
た。
【００３５】実施例７：凍結乾燥第ＶＩＩａ因子の加熱
処理 含まれているかも知れない病原体を不活化するために、
実施例６で得た凍結乾燥第ＶＩＩａ因子製剤を、上昇し
た水分圧下で特許ＥＰ１５９３１１に記載の方法に従っ
て加熱し、および／または６０℃で処理した後に、さら
に１時間８０℃で処理した。第ＶＩＩａ因子の収率はそ
れぞれの場合で９０％以上であった。
処理 含まれているかも知れない病原体を不活化するために、
実施例６で得た凍結乾燥第ＶＩＩａ因子製剤を、上昇し
た水分圧下で特許ＥＰ１５９３１１に記載の方法に従っ
て加熱し、および／または６０℃で処理した後に、さら
に１時間８０℃で処理した。第ＶＩＩａ因子の収率はそ
れぞれの場合で９０％以上であった。
【００３６】実施例８：第ＶＩＩａ因子製剤の特徴づけ 第ＶＩＩ因子の活性化度の測定は、van Deijkの、Haemo
stasis 13:192-197（1983）に記載の方法に従って行っ
た。凝固試験は、第ＶＩＩ因子除去血漿と一方にウシト
ロンボプラスチンを、また他方にヒトトロンボプラスチ
ンを用いて行った。標準として、正常ヒト血漿を用いて
測定した。製品の個々の工程での第ＶＩＩａ因子の比活
性、純度と活性化度（ヒトトロンボプラスチンを用いて
測定した第ＶＩＩ因子対ウシトロンボプラスチンを用い
て測定した第ＶＩＩ因子）を表１に示す。蛋白測定はBr
adfordの、Anal.Biochem.72:248-254（1976）に記載の
方法に従って行った。
stasis 13:192-197（1983）に記載の方法に従って行っ
た。凝固試験は、第ＶＩＩ因子除去血漿と一方にウシト
ロンボプラスチンを、また他方にヒトトロンボプラスチ
ンを用いて行った。標準として、正常ヒト血漿を用いて
測定した。製品の個々の工程での第ＶＩＩａ因子の比活
性、純度と活性化度（ヒトトロンボプラスチンを用いて
測定した第ＶＩＩ因子対ウシトロンボプラスチンを用い
て測定した第ＶＩＩ因子）を表１に示す。蛋白測定はBr
adfordの、Anal.Biochem.72:248-254（1976）に記載の
方法に従って行った。
【００３７】実施例９：ＦＥＩＢＡと第ＶＩＩａ因子の
混合物 新鮮な凍結ヒトクエン酸加血漿を０〜＋４℃で溶解し、
得られる寒冷沈降物を＋２℃で遠心して分離した。本来
のｐＨ値で、ＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−５０
０．５ｇを、＋４℃で連続的に撹拌しながら、得られる
上清に加えた。この懸濁液をさらに１時間撹拌し、次い
で放置することにより蛋白−ＤＥＡＥ−セファデックス
コンプレックスを沈澱させた。これにより、ＦＥＩＢＡ
が生じ、プロトロンビンコンプレックスの因子および不
活性蛋白と一緒にＤＥＡＥ−セファデックス（登録商
標）に吸着させた。完全な吸着工程の後、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス（登録商標）−蛋白コンプレックスを濾過
して上清から分けた。AT368883に記載のごとく、緩衝液
で洗浄し、次いで塩化ナトリウム溶液で溶出することに
よって、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）からＦ
ＥＩＢＡを脱着させた。ＦＥＩＢＡを含む溶液を限外濾
過によって出発容量の１／５に濃縮し、次いで、プロト
ロンビンコンプレックス因子を自己活性化させるために
室温で２０時間インキュベーションした。次に、活性化
プロトロンビンコンプレックスを含む溶液を凍結乾燥し
た。次いで、この粉末をクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ ２ｇ
およびＮａＣｌ ４ｇの緩衝液（ｐＨ７．２）に、３０
ｍｇ蛋白／ｍＬの濃度に溶解した。この溶液をポアサイ
ズ１μｍのフィルターで濾過して再度凍結乾燥した。こ
のようにして分離した粉末を、実施例４の記載に従って
製造した第ＶＩＩａ因子を含む溶液に溶解した。AT3507
26の記載に従って試験したＦＥＩＢＡ １ＵあたりＦＶ
ＩＩａ １０Ｕを含むようにこの溶液を調節した。この
混合物をEP159311に記載の方法に従って再度凍結乾燥
し、６０℃で１０時間、次いで８０℃で１時間処理し
た。この粉末のＦＥＩＢ−活性とＶＦＩＩａ活性を加熱
処理の前後に測定した。加熱処理工程後、製剤中のＦＶ
ＩＩａ活性は出発物質の９６％と４％低下しており、Ｆ
ＥＩＢ−活性は９０％で１０％低下していた。これと比
較するために、実施例４で得たＦＶＩＩａ製剤を凍結乾
燥し、加熱処理も行ったところ、４８％の活性の低下が
見られた。
混合物 新鮮な凍結ヒトクエン酸加血漿を０〜＋４℃で溶解し、
得られる寒冷沈降物を＋２℃で遠心して分離した。本来
のｐＨ値で、ＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−５０
０．５ｇを、＋４℃で連続的に撹拌しながら、得られる
上清に加えた。この懸濁液をさらに１時間撹拌し、次い
で放置することにより蛋白−ＤＥＡＥ−セファデックス
コンプレックスを沈澱させた。これにより、ＦＥＩＢＡ
が生じ、プロトロンビンコンプレックスの因子および不
活性蛋白と一緒にＤＥＡＥ−セファデックス（登録商
標）に吸着させた。完全な吸着工程の後、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス（登録商標）−蛋白コンプレックスを濾過
して上清から分けた。AT368883に記載のごとく、緩衝液
で洗浄し、次いで塩化ナトリウム溶液で溶出することに
よって、ＤＥＡＥ−セファデックス（登録商標）からＦ
ＥＩＢＡを脱着させた。ＦＥＩＢＡを含む溶液を限外濾
過によって出発容量の１／５に濃縮し、次いで、プロト
ロンビンコンプレックス因子を自己活性化させるために
室温で２０時間インキュベーションした。次に、活性化
プロトロンビンコンプレックスを含む溶液を凍結乾燥し
た。次いで、この粉末をクエン酸Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ ２ｇ
およびＮａＣｌ ４ｇの緩衝液（ｐＨ７．２）に、３０
ｍｇ蛋白／ｍＬの濃度に溶解した。この溶液をポアサイ
ズ１μｍのフィルターで濾過して再度凍結乾燥した。こ
のようにして分離した粉末を、実施例４の記載に従って
製造した第ＶＩＩａ因子を含む溶液に溶解した。AT3507
26の記載に従って試験したＦＥＩＢＡ １ＵあたりＦＶ
ＩＩａ １０Ｕを含むようにこの溶液を調節した。この
混合物をEP159311に記載の方法に従って再度凍結乾燥
し、６０℃で１０時間、次いで８０℃で１時間処理し
た。この粉末のＦＥＩＢ−活性とＶＦＩＩａ活性を加熱
処理の前後に測定した。加熱処理工程後、製剤中のＦＶ
ＩＩａ活性は出発物質の９６％と４％低下しており、Ｆ
ＥＩＢ−活性は９０％で１０％低下していた。これと比
較するために、実施例４で得たＦＶＩＩａ製剤を凍結乾
燥し、加熱処理も行ったところ、４８％の活性の低下が
見られた。
【００３８】実施例１０：プロトロンビンコンプレック
スと第ＶＩＩａ因子の混合物 プロトロンビンコンプレックスを含む製剤は、H.G.J.Br
ummelhusの、Methodsof Plasma Protein Fractionatio
n, J.M. Curling （Hrsg.）、117-128頁、Academic Pre
ss（1980）に記載の方法に従って製造した。この製剤は
第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を同様の関係
で含んでいた。次に、この製剤を実施例４の記載に従っ
て生成した第ＶＩＩａ因子と混合した。この混合物をＦ
Ｘ １ＵあたりＦＶＩＩａ １０Ｕを含有するように調整
した。この混合物の凍結乾燥粉末はEpn159311に記載の
方法に従って６０℃で１０時間、次いで８０℃で１時間
処理した。第ＩＩ、第ＩＸ、ならびに第Ｘ凝固因子、お
よび第ＶＩＩａ因子の活性は、加熱処理の前後にそれぞ
れ測定された。活性の低下は第ＩＩ因子で７％、第ＩＸ
因子で１２％、第Ｘ因子で３％、および第ＶＩＩａ因子
で１％であった。これと比較するために、実施例４で得
た第ＶＩＩａ因子製剤を凍結乾燥し、加熱処理したとこ
ろ、活性の低下は４８％であった。
スと第ＶＩＩａ因子の混合物 プロトロンビンコンプレックスを含む製剤は、H.G.J.Br
ummelhusの、Methodsof Plasma Protein Fractionatio
n, J.M. Curling （Hrsg.）、117-128頁、Academic Pre
ss（1980）に記載の方法に従って製造した。この製剤は
第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を同様の関係
で含んでいた。次に、この製剤を実施例４の記載に従っ
て生成した第ＶＩＩａ因子と混合した。この混合物をＦ
Ｘ １ＵあたりＦＶＩＩａ １０Ｕを含有するように調整
した。この混合物の凍結乾燥粉末はEpn159311に記載の
方法に従って６０℃で１０時間、次いで８０℃で１時間
処理した。第ＩＩ、第ＩＸ、ならびに第Ｘ凝固因子、お
よび第ＶＩＩａ因子の活性は、加熱処理の前後にそれぞ
れ測定された。活性の低下は第ＩＩ因子で７％、第ＩＸ
因子で１２％、第Ｘ因子で３％、および第ＶＩＩａ因子
で１％であった。これと比較するために、実施例４で得
た第ＶＩＩａ因子製剤を凍結乾燥し、加熱処理したとこ
ろ、活性の低下は４８％であった。
【００３９】実施例１１：第ＶＩＩａ因子／ＦＥＩＢＡ
製剤の分離 第ＶＩＩａ因子とＦＥＩＢ−活性を含む製剤は以下のご
とく分離された。新鮮な凍結ヒトクエン酸加血漿を０〜
＋４℃で溶解し、得られる寒冷沈降物を＋２℃で遠心し
て分離した。本来のｐＨ値で、得られる寒冷沈降物をＱ
ＡＥ−セファデックス（登録商標）Ａ５０（Pharmaci
a）０．５ｇと混合し、＋４℃で１５時間撹拌した。次
に、ゲル−蛋白コンプレックスを沈澱と濾過によって上
清から分け、第ＶＩＩａ因子とＦＥＩＢＡを含む分画を
３％ＮａＣｌ溶液を用いる溶離により分離した。第ＶＩ
Ｉａ因子およびＦＥＩＢＡを定量的に測定した。この製
剤はＦＥＩＢＡ １単位あたりＦＶＩＩａ １２．７Ｕを
含有した。
製剤の分離 第ＶＩＩａ因子とＦＥＩＢ−活性を含む製剤は以下のご
とく分離された。新鮮な凍結ヒトクエン酸加血漿を０〜
＋４℃で溶解し、得られる寒冷沈降物を＋２℃で遠心し
て分離した。本来のｐＨ値で、得られる寒冷沈降物をＱ
ＡＥ−セファデックス（登録商標）Ａ５０（Pharmaci
a）０．５ｇと混合し、＋４℃で１５時間撹拌した。次
に、ゲル−蛋白コンプレックスを沈澱と濾過によって上
清から分け、第ＶＩＩａ因子とＦＥＩＢＡを含む分画を
３％ＮａＣｌ溶液を用いる溶離により分離した。第ＶＩ
Ｉａ因子およびＦＥＩＢＡを定量的に測定した。この製
剤はＦＥＩＢＡ １単位あたりＦＶＩＩａ １２．７Ｕを
含有した。
【００４０】実施例１２：第ＶＩＩａ因子／ＦＥＩＢＡ
製剤の分離 実施例１１の記載に従ってＦＥＩＢＡを分離した。しか
しながら、イオン交換体にフラクトゲル（登録商標）Ｅ
ＭＤ ＴＭＡＥ（Merch）を使用し、寒冷沈降物１Ｌあた
り湿潤ゲル５ｍＬの濃度で吸着を行った。３％ＮａＣｌ
溶液で活性化プロトロンビンコンプレックス因子を溶出
したところ、溶離物はＦＥＩＢＡ ５４Ｕ／ｍＬと第Ｖ
ＩＩａ因子０．６Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡを含んでいた。本
発明の製剤を製造するために、実施例２〜４の記載に従
って第ＶＩＩａ因子を寒冷上清から分離し、ＦＥＩＢＡ
を含む溶液を加えて、最終濃度が少なくとも第ＶＩＩａ
因子１０Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡとなるようにした。
製剤の分離 実施例１１の記載に従ってＦＥＩＢＡを分離した。しか
しながら、イオン交換体にフラクトゲル（登録商標）Ｅ
ＭＤ ＴＭＡＥ（Merch）を使用し、寒冷沈降物１Ｌあた
り湿潤ゲル５ｍＬの濃度で吸着を行った。３％ＮａＣｌ
溶液で活性化プロトロンビンコンプレックス因子を溶出
したところ、溶離物はＦＥＩＢＡ ５４Ｕ／ｍＬと第Ｖ
ＩＩａ因子０．６Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡを含んでいた。本
発明の製剤を製造するために、実施例２〜４の記載に従
って第ＶＩＩａ因子を寒冷上清から分離し、ＦＥＩＢＡ
を含む溶液を加えて、最終濃度が少なくとも第ＶＩＩａ
因子１０Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡとなるようにした。
【００４１】実施例１３：第ＶＩＩａ因子／ＦＥＩＢＡ
製剤の分離 実施例１２と同様に、再度ＦＥＩＢＡを製造した。イオ
ン交換体としてＱ−セファロース（登録商標）Fast Flo
w（Pharmacia）を寒冷上清１Ｌあたり５ｍＬの濃度で用
いた。得られた溶離液中のＦＥＩＢ−活性は１．２８Ｕ
／ｍＬおよび第ＶＩＩａ因子０．３Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡ
であった。第ＶＩＩａ因子２０Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡの製
剤を製造するために、実施例１１に記載のごとく、該寒
冷上清から第ＶＩＩａ因子を製造し、これからＦＥＩＢ
Ａ製剤を分離し、ＦＥＩＢＡ含有溶液と混合した。
製剤の分離 実施例１２と同様に、再度ＦＥＩＢＡを製造した。イオ
ン交換体としてＱ−セファロース（登録商標）Fast Flo
w（Pharmacia）を寒冷上清１Ｌあたり５ｍＬの濃度で用
いた。得られた溶離液中のＦＥＩＢ−活性は１．２８Ｕ
／ｍＬおよび第ＶＩＩａ因子０．３Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡ
であった。第ＶＩＩａ因子２０Ｕ／Ｕ ＦＥＩＢＡの製
剤を製造するために、実施例１１に記載のごとく、該寒
冷上清から第ＶＩＩａ因子を製造し、これからＦＥＩＢ
Ａ製剤を分離し、ＦＥＩＢＡ含有溶液と混合した。
【００４２】実施例１４：第ＶＩＩａ因子／ＦＥＩＢＡ
製剤のin vivoにおける有効性 実施例９の記載に従って製造したＦＥＩＢＡと第ＶＩＩ
ａ因子の混合物は、第ＶＩＩＩ因子インヒビターに起因
する血友病のウサギを用いて以下のごとく試験された。
約２ｋｇの白色New Zealandウサギを麻酔した。麻酔
後、各ウサギの右大腿静脈に永続的な静脈への接続口を
設けた。これを介して、ヒト第ＶＩＩＩ因子インヒビタ
ー血漿（１５００Bethesda単位／ｍＬ）０．５ｍＬ／ｋ
ｇ体重を１０分間かけて注入した。注入終了後３０分
に、Gilesらの、Blood 60:727-730(1982)に記載の改良
法を用いて出血特性を測定した。このために、後の出血
時において下毛に血液が吸着されるのを防ぐために、ウ
サギの後足の爪の周りの下毛を剃った。皮膚の頂部を有
鈎鉗子で傷つけた。その直後に、傷の下側の近くに濾紙
を置き、毛細管現象によって血液が流れ去ることなく濾
紙上に直接血液が滴下するようにした。このようにあら
かじめ注意を払うことによって、形成される血塊が壊れ
るのを防いだ。濾紙を２分ごとに交換し、存在する血液
フラクションを回収した。血液の回収は３０分間続け
た。出血特性の限定は、濾紙上に回収された血液フラク
ションを０．０４％水酸化アンモニウム溶液各５ｍＬで
５時間かけて抽出することによって行った。これによ
り、濾紙に血液と共に回収された赤血球を溶解させた。
１０分間の超音波処理を行って、ヘモグロビンを抽出
し、光度測定法によって４１６ｎｍで較正曲線に対して
定量した。なお、この較正曲線は濾紙上に容量１０μＬ
〜１ｍＬのウサギ血液をピペットで置き、上記のごとく
抽出し、ヘモグロビンを４１６ｎｍで光度測定すること
によって求めた。したがって、ヘモグロビン濃度を濾紙
あたりの血液量に直接変換するのを可能にする直線較正
曲線を作製することができよう。爪を切ったときの出血
特性は、時間に対する個々の血液フラクションをさらに
グラフ上にプロットすることによって血液の累積損失量
で表した。実験の１０〜２０分間の累積出血量の増大を
出血の関連基準として用い、出血強度の測定値とした。
この方法で処理した動物の平均出血強度を図（図１）に
示す。
製剤のin vivoにおける有効性 実施例９の記載に従って製造したＦＥＩＢＡと第ＶＩＩ
ａ因子の混合物は、第ＶＩＩＩ因子インヒビターに起因
する血友病のウサギを用いて以下のごとく試験された。
約２ｋｇの白色New Zealandウサギを麻酔した。麻酔
後、各ウサギの右大腿静脈に永続的な静脈への接続口を
設けた。これを介して、ヒト第ＶＩＩＩ因子インヒビタ
ー血漿（１５００Bethesda単位／ｍＬ）０．５ｍＬ／ｋ
ｇ体重を１０分間かけて注入した。注入終了後３０分
に、Gilesらの、Blood 60:727-730(1982)に記載の改良
法を用いて出血特性を測定した。このために、後の出血
時において下毛に血液が吸着されるのを防ぐために、ウ
サギの後足の爪の周りの下毛を剃った。皮膚の頂部を有
鈎鉗子で傷つけた。その直後に、傷の下側の近くに濾紙
を置き、毛細管現象によって血液が流れ去ることなく濾
紙上に直接血液が滴下するようにした。このようにあら
かじめ注意を払うことによって、形成される血塊が壊れ
るのを防いだ。濾紙を２分ごとに交換し、存在する血液
フラクションを回収した。血液の回収は３０分間続け
た。出血特性の限定は、濾紙上に回収された血液フラク
ションを０．０４％水酸化アンモニウム溶液各５ｍＬで
５時間かけて抽出することによって行った。これによ
り、濾紙に血液と共に回収された赤血球を溶解させた。
１０分間の超音波処理を行って、ヘモグロビンを抽出
し、光度測定法によって４１６ｎｍで較正曲線に対して
定量した。なお、この較正曲線は濾紙上に容量１０μＬ
〜１ｍＬのウサギ血液をピペットで置き、上記のごとく
抽出し、ヘモグロビンを４１６ｎｍで光度測定すること
によって求めた。したがって、ヘモグロビン濃度を濾紙
あたりの血液量に直接変換するのを可能にする直線較正
曲線を作製することができよう。爪を切ったときの出血
特性は、時間に対する個々の血液フラクションをさらに
グラフ上にプロットすることによって血液の累積損失量
で表した。実験の１０〜２０分間の累積出血量の増大を
出血の関連基準として用い、出血強度の測定値とした。
この方法で処理した動物の平均出血強度を図（図１）に
示す。
【００４３】活性物質を試験するために、各活性成分を
含有する医薬組成物の溶液３０ｍＬ容量を、ウサギにイ
ンヒビター誘発出血を生じさせた後に、注入速度１ｍＬ
／分で連続的に注入し、注入開始と同時に上記のごとく
出血強度を求めた。したがって、A350726またはA368883
の記載にしたがって製造したＦＥＩＢＡ製剤を、同様に
前処理したウサギに用量７５Ｕ／ＦＥＩＢＡ／ｋｇで投
与した。この用量は出血強度の劇的な減少をもたらした
（図１参照）。
含有する医薬組成物の溶液３０ｍＬ容量を、ウサギにイ
ンヒビター誘発出血を生じさせた後に、注入速度１ｍＬ
／分で連続的に注入し、注入開始と同時に上記のごとく
出血強度を求めた。したがって、A350726またはA368883
の記載にしたがって製造したＦＥＩＢＡ製剤を、同様に
前処理したウサギに用量７５Ｕ／ＦＥＩＢＡ／ｋｇで投
与した。この用量は出血強度の劇的な減少をもたらした
（図１参照）。
【００４４】コントロールとして、出血の減少をもたら
さない、活性成分を含まない緩衝液を注入した。同様
に、用量５Ｕ／ｋｇのＦＥＩＢＡを投与しても出血強度
の有意な低下はみられなかった。反対に、用量ＦＥＩＢ
Ａ ５Ｕ／ｋｇと第ＶＩＩａ因子５０Ｕ／ｋｇに相当す
る本発明の製剤をウサギに投与すると、有効なＦＥＩＢ
Ａの用量に匹敵する出血強度の低下が生じたが、第ＶＩ
Ｉａ因子５０Ｕ／ｋｇでは異常に増大した出血強度に対
する効果はみられなかった。
さない、活性成分を含まない緩衝液を注入した。同様
に、用量５Ｕ／ｋｇのＦＥＩＢＡを投与しても出血強度
の有意な低下はみられなかった。反対に、用量ＦＥＩＢ
Ａ ５Ｕ／ｋｇと第ＶＩＩａ因子５０Ｕ／ｋｇに相当す
る本発明の製剤をウサギに投与すると、有効なＦＥＩＢ
Ａの用量に匹敵する出血強度の低下が生じたが、第ＶＩ
Ｉａ因子５０Ｕ／ｋｇでは異常に増大した出血強度に対
する効果はみられなかった。
【００４５】
【表１】
【図１】 第ＶＩＩＩ因子インヒビター誘発血友病ウサ
ギにＦＥＩＢＡ ７５Ｕ／ｋｇ、またはＦＥＩＢＡ ５Ｕ
／ｋｇと第ＶＩＩａ因子５０Ｕ／ｋｇの混合物を投与す
ることにより出血強度の低下がみられた。
ギにＦＥＩＢＡ ７５Ｕ／ｋｇ、またはＦＥＩＢＡ ５Ｕ
／ｋｇと第ＶＩＩａ因子５０Ｕ／ｋｇの混合物を投与す
ることにより出血強度の低下がみられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス・ペーター・シュヴァルツ オーストリア、アー−1180ヴィーン、シン ドラーガッセ32番 (72)発明者 ゲルダ・レドル オーストリア、アー−2301ルッチェンドル フ、オルツシュトラーセ５番
Claims (23)
- 【請求項１】 凝固因子欠損および／または凝固因子イ
ンヒビターに起因する血液凝固障害患者を治療するため
のＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物であって、第ＶＩ
Ｉａ因子と少なくともさらに１種類の活性成分を含み、
ＦＥＩＢＡ１単位当り少なくとも第ＶＩＩａ因子１０単
位の活性を有することを特徴とする該医薬組成物。 - 【請求項２】 ＦＥＩＢＡ １単位当り第ＶＩＩａ因子
１０〜１００単位の範囲の活性を有することを特徴とす
る請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項３】 ＦＥＩＢＡ １単位当り第ＶＩＩａ因子
１０〜２０単位の範囲の活性を有することを特徴とする
請求項２に記載の医薬組成物。 - 【請求項４】 ＦＥＩＢＡ １単位当り第ＶＩＩａ因子
１０〜１５単位の範囲の活性を有することを特徴とする
請求項２に記載の医薬組成物。 - 【請求項５】 第ＶＩＩａ因子に加えて、さらに活性成
分として第ＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ凝固因子を、好ま
しくはＦＥＩＢＡ １単位当りそれぞれ０．５〜２単位
の割合で含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか
１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項６】 第ＶＩＩａ因子に加えて、さらに活性成
分として第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を、
好ましくはＦＥＩＢＡ １単位当りそれぞれ０．５〜
１．５単位の割合で含むことを特徴とする請求項１〜４
のいずれか１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項７】 さらにプロテインＣおよび／またはプロ
テインＳを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれ
か１項に記載の医薬組成物。 - 【請求項８】 精製プロトロンビンコンプレックスを含
む分画と精製第ＶＩＩａ因子を含む分画とを含有し、第
ＶＩＩａ因子の比活性が＞１０Ｕ／ｍｇ蛋白である、ウ
イルスの不活化処理が施されている請求項１に記載の医
薬組成物。 - 【請求項９】 精製部分プロトロンビンコンプレックス
を含む分画と精製第ＶＩＩａ因子を含む分画とを含有
し、第ＶＩＩａ因子の比活性が＞１０Ｕ／ｍｇ蛋白であ
る、ウイルスの不活化処理が施されている請求項１に記
載の医薬組成物。 - 【請求項１０】 プロトロンビンコンプレックスが活性
化プロトロンビンコンプレックスまたはＦＥＩＢＡ製剤
として存在することを特徴とする請求項８または９に記
載の医薬組成物。 - 【請求項１１】 第ＶＩＩａ因子およびプロトロンビン
コンプレックスを含む因子が同じ血漿プールに由来する
ことを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成
物。 - 【請求項１２】 第ＶＩＩ凝固因子を含む分画と陰イオ
ン交換体を接触させることによって第ＶＩＩ凝固因子を
少なくとも部分的に活性化し、陰イオン交換体を分離し
て第ＶＩＩａ凝固因子を含む分画を単離することによっ
て、この分画が接触前のＦＥＩＢＡを含み、そして／ま
たはＦＥＩＢＡがこの分画中に生じることを特徴とする
請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物の製造
法。 - 【請求項１３】 ４級アンモニウム基を含む陰イオン交
換体、例えば、ＱＡＥ、ＴＡＥ、およびＱ型を用いるこ
とを特徴とする請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 ＦＥＩＢ−活性を有する医薬組成物の
製造法であって、 ａ）第ＩＩ、第ＩＸ、および第Ｘ凝固因子を含む１つま
たはそれ以上の出発物質から個々の因子としてかまたは
混合物としてこれらの因子を分離し、 ｂ）第ＶＩＩ凝固因子を含有する出発物質から第ＶＩＩ
／ＶＩＩａ凝固因子を単離し、第ＶＩＩ凝固因子が少な
くとも部分的に活性化されてＶＩＩａとなり、 ｃ）出発物質または個々の凝固因子を前処理および／ま
たは処理することによって感染性物質を不活化し、 ｄ）単離された凝固因子を医薬的に許容される担体と混
合する 工程を含む請求項８〜１０のいずれか１項に記載の製造
法。 - 【請求項１５】 凝固因子が単一出発物質、好ましくは
血漿プールまたは血漿分画から分離されることを特徴と
する請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 感染性物質を不活化するために加熱処
理が行われることを特徴とする請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項１７】 凝固因子の加熱処理が固体の状態で行
われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 加熱処理がアルブミンの非存在下で行
われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１９】 凝固因子を医薬的に許容される担体と
混合した後に感染性物質の不活化処理が行われることを
特徴とする請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２０】 疎水性クロマトグラフィーによって第
ＶＩＩａ凝固因子が単離されることを特徴とする請求項
１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２１】 単離中に、第ＩＸ、第Ｘ、および第Ｖ
ＩＩ凝固因子が少なくとも部分的に活性化されることを
特徴とする請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項２２】 凝固因子欠損患者の出血を速やかに止
めるための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＦ
ＥＩＢ−活性を有する医薬組成物を製造するための第Ｖ
ＩＩａ因子とさらに少なくとも１種類の活性成分との混
合物の使用。 - 【請求項２３】 製剤が凝固因子インヒビターに起因す
る出血を速やかに止めるのに適している請求項２２に記
載の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19531637-1 | 1995-08-28 | ||
| DE19531637A DE19531637A1 (de) | 1995-08-28 | 1995-08-28 | Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Blutgerinnungsstörugnen, Verfahren zur Herstellung derselben und deren Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09110715A true JPH09110715A (ja) | 1997-04-28 |
Family
ID=7770599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8226561A Pending JPH09110715A (ja) | 1995-08-28 | 1996-08-28 | 血液凝固疾患を治療するための医薬組成物とその製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5891843A (ja) |
| EP (1) | EP0765669A1 (ja) |
| JP (1) | JPH09110715A (ja) |
| CA (1) | CA2184226A1 (ja) |
| DE (1) | DE19531637A1 (ja) |
| NO (1) | NO963568L (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007217415A (ja) * | 2006-02-17 | 2007-08-30 | Grifols Sa | 超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤および治療製剤を得るための方法 |
| JP2017526669A (ja) * | 2014-08-12 | 2017-09-14 | バクスアルタ インコーポレイテッド | 第ｘ因子の活性化 |
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|---|---|---|---|---|
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| AT405608B (de) * | 1997-04-08 | 1999-10-25 | Immuno Ag | Verfahren zur inaktivierung von pathogenen, insbesondere von viren, in einem biologischen material |
| BR9807936A (pt) * | 1997-04-08 | 2000-02-22 | Baxter Ag | Preparação farmacêutica imuno-tolerante de complexo de pró-trombina, processo para a produção de uma preparação, e, utilização de uma preparação |
| US20050032690A1 (en) * | 1997-09-10 | 2005-02-10 | Rojkjaer Lisa Payne | Factor VII polypeptides for preventing formation of inhibitors in subjects with haemophilia |
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| US7247708B2 (en) | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
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