JPH1045620A - 血液凝固疾患処置用医薬製剤 - Google Patents

血液凝固疾患処置用医薬製剤

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JPH1045620A
JPH1045620A JP9108013A JP10801397A JPH1045620A JP H1045620 A JPH1045620 A JP H1045620A JP 9108013 A JP9108013 A JP 9108013A JP 10801397 A JP10801397 A JP 10801397A JP H1045620 A JPH1045620 A JP H1045620A
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prothrombin
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prothrombinase
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Teyureseku Peetaa
ペーター・テュレセク
Shiyubuarutsu Hansuupeetaa
ハンス−ペーター・シュヴァルツ
Aiburu Yohan
ヨハン・アイブル
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規血液凝固疾患処置用医薬製剤の開発。 【解決手段】 精製されたプロトロンビナーゼ因子、具
体的には精製プロトロンビンと任意に精製因子Ｘaを活
性成分として含有する血液凝固疾患処置用医薬製剤。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は医薬製剤、具体的にはプ
ロトロンビナーゼもしくはプロ−プロトロンビナーゼの
成分である凝固因子類を含有する血液凝固疾患処置用医
薬製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロトロンビナーゼはリン脂質表面上に
形成される酵素基質複合体であって、プロトロンビンの
活性化を可能にする。定義として、プロトロンビナーゼ
は因子ＩＩ（プロトロンビン）、活性化された因子Ｘ
（因子Ｘａ）、コファクターＶもしくはＶａ、リン脂質
およびカルシウムイオンからなる。生体内では、これら
の因子がプロトロンビンの活性化とトロンビンの形成に
際する遷移複合体として存在する。
【０００３】これに対応するプロ−プロトロンビナーゼ
は、プロトロンビナーゼを形成するために少なくとも部
分的には修飾もしくは活性化された状態で存在する因子
の複合体であると定義される。したがってプロ−プロト
ロンビナーゼは、プロトロンビナーゼの前駆体であると
理解されるべきであり、また、その中の1もしくは複数
の成分が酵素原や前駆体などの前段階で存在する複合体
であって、かつ、それら成分相互間の親和性に基づいて
形成される複合体であると理解されるべきである。
【０００４】血友病ＡはＸ−染色体劣性遺伝因子ＶＩＩ
Ｉ欠乏症に起因し、重篤な血液凝固疾患によって顕在化
する。急性の出血を制御するには、ほとんどの場合、凝
固活性血漿タンパク質濃縮物が使用されており、それは
主として因子ＶＩＩＩ濃縮物である。しかし、因子ＶＩ
ＩＩ製剤によるこの古典的な血友病Ａ患者処置において
は、約２０％の割合で、因子ＶＩＩＩに対する抗体が形
成され、その抗体がこれらの製剤によって投与された因
子ＶＩＩＩの阻害をもたらす。この場合、患者は因子Ｖ
ＩＩＩに対する機能的な阻害因子を形成し、いわゆる因
子ＶＩＩＩ阻害因子血友病または後天的血友病を発症し
たという。
【０００５】現在、因子ＶＩＩＩ阻害因子血友病を有す
る血友病Ａ患者の処置には、次に挙げるいくつかの方法
が用いられている。 （１）高投与量の因子ＶＩＩＩ製剤による処置：この場
合、因子ＶＩＩＩに対する抗体は生体内で中和され、過
剰分の因子ＶＩＩＩは止血凝固活性を発揮することがで
きる。長期間にわたる繰り返し投与によって、その患者
は因子ＶＩＩＩに対して脱感作され、次いで多くの場合
は通常の因子ＶＩＩＩ濃縮物療法に付されることになり
うる。この手法はきわめて大量の因子ＶＩＩＩを必要と
し、時間がかかり、処置の開始時に大規模なアナフィラ
キシー副作用が起こりうる。 （２）抗イディオタイプ因子ＶＩＩＩ抗体を含有する免
疫グロブリン製剤による因子ＶＩＩＩ阻害因子患者の処
置：この処置法は現在活発に研究されている。しかし、
このような処置法の効力に関する最終的な判定は現時点
では不可能である。 （３）免疫吸着：因子ＶＩＩＩ阻害因子を除去するため
のさらに複雑な方法は、免疫グロブリン（プロテイン
Ａ、プロテインＧ）を結合したレクチンもしくは固定化
因子ＶＩＩＩ（これに因子ＶＩＩＩに対して形成した抗
体が結合する）に対する体外での免疫吸着である。この
場合、患者はアフェレシス装置につながれるし、上述の
方法と同様に急性出血の停止にはつながらないあろう
し、さらには費用がかさむので、この方法は患者にとっ
ては厄介である。 （４）ＡＰＣＣとその誘導体：現在のところ選り抜きの
処置法は、活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣ
Ｃ）、ＦＥＩＢＡ、ＡＵＴＯＰＬＥＸの投与であり、こ
の処置法は阻害因子力価の高い患者でも急性出血を止め
るために使用することができる（ＤＥ−ＰＳ ３１ ２
７ ３１８（２）などを参照）。
【０００６】活性化プロトロンビン複合体因子濃縮物に
基づき、これにも含まれる成分、すなわち活性化した因
子ＶＩＩａが、この外因性凝固経路による因子ＶＩＩＩ
阻害因子患者の治療原理であると考えられている。対応
する製剤、すなわち組換え因子ＶＩＩａが現在臨床的に
試験されている（Hednerら，Transfusion MedicineRev
iews ７（２）：７８−８３（１９９３））。しかし例
えば血友病Ａにかかっている犬に対する前臨床試験で
は、組換え因子ＶＩＩａによる処置が効力を持たないこ
とが示されている。さらに、人への適用における成功率
も様々である。組換え因子ＶＩＩａのさらなる欠点は、
その極めて短い生体内半減期ゆえに、重篤な出血を制御
するには、仮にそれが可能であったとしても、これを高
い日用量で頻繁に投与しなければならないことにある。
このような場合、因子ＶＩＩａの効果を補助するために
抗繊維素溶解剤と共に因子ＶＩＩａを投与することが試
みられる。
【０００７】文献（例えばＤＥ ４４ １６ １８０ Ａ
ｌ）では、因子Ｘａとリン脂質を組み合わせて血友病Ａ
阻害因子患者の処置に治療的に用いることも提案されて
いる。阻害因子を伴う因子ＶＩＩＩ欠乏犬に対する生体
内試験は、このような組み合わせが適切な投与量では急
性出血を止めうることを示した。しかし有効投与量と凝
塊形成投与量は密接に近似している（このことは例えば
ヴェスラー（Ｗｅｓｓｌｅｒ）モデルのウサギで立証で
きる）ので、このような製剤の処置スペクトルは比較的
狭い。具体的にいうと、リン脂質は凝塊溶解原性を高め
る危険を伴うからである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、上述の方法の欠点を避け、血液凝固疾患を処置す
るため（具体的には因子ＶＩＩＩ阻害因子患者を処置す
るため）の治療原理であって、簡単な投与、作用の効果
的な開始、半減期の増大および凝塊形成副作用の防止を
可能にするものを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、この目
的は、プロトロンビナーゼまたはプロ−プロトロンビナ
ーゼの成分である少なくとも２つの凝固因子を活性成分
として含有する血液凝固疾患処置用医薬製剤、具体的に
は、活性成分として、精製されたプロトロンビンと精製
された因子Ｘａを溶解した状態で含有し、プロトロンビ
ン以外の因子の一つが好ましくは活性化されている製剤
によって達成される。これらの成分は、少なくとも内因
性の（すなわち出発物質に由来する）リン脂質、とりわ
けリン脂質小胞、を含まない程度に精製されていること
が好ましい。
【００１０】このようにして、一方では未成熟トロンビ
ンの生成を防止して医薬製剤の安定性を確保し、他方で
は血栓塞栓副作用の危険性を最小化する。本発明によれ
ば、プロトロンビナーゼの少なくとも２つの成分の混合
物もしくは複合体は「部分的プロトロンビナーゼ」であ
ると理解される。
【００１１】
【発明の実施の形態】プロトロンビナーゼもしくはプロ
−プロトロンビナーゼの成分以外に、緩和された効果
（具体的には止血の増加、減少、促進または減速）が得
られるように血液凝固および繊維素溶解の他の因子を含
有させることにも利点がある。したがって、さらに血液
凝固の活性化因子またはプロ活性化因子（とりわけ内因
性または外因性血液凝固の因子）を酵素原として、もし
くは活性化された因子として含有させることができる
し、それらのアゴニストまたはアンタゴニストまたは阻
害因子も同様である。さらに、このような組み合わせは
別個に投与される製剤としても考えられる。これらの中
には、局所的な適用にとりわけ好適なフィブリノーゲン
との組み合わせがある。
【００１２】しかし好ましい態様において、本医薬製剤
は実質的に、好ましくは一複合体としての「部分的プロ
トロンビナーゼ」、プロトロンビナーゼの成分もしくは
プロ−プロトロンビナーゼの成分からなる。この複合体
は簡単な方法で精製および処理することができる。具体
的には、化学的および／または物理的に処理して、分
子、微生物またはウイルス病原体を不活化することがで
きる。
【００１３】本発明の医薬製剤の因子は、少なくとも１
因子の活性化を可能にする形態で、もしくは少なくとも
1因子が既に活性化されている状態で含有される。因子
として、好ましくはヒト因子を使用する。本発明の医薬
製剤は、好ましくは因子ＩＩ、Ｖ、Ｖａ、ＸおよびＸａ
からなる群より選択される因子を含有する。
【００１４】部分的プロトロンビナーゼまたは部分的プ
ロ−プロトロンビナーゼの発明的製剤として、好ましく
は因子ＩＩとＶもしくはＶａの組み合わせ、あるいは因
子ＸとＶもしくはＶａの組み合わせが挙げられる。本発
明の製剤が実質上これらの組み合わせからなることがと
りわけ好ましい。同様に、因子ＩＩおよびＸ（これらは
因子ＶまたはＶａと組み合わせてもよい）からなるプロ
−プロトロンビナーゼも本発明の好ましい態様である。
【００１５】ここでは天然の因子、血漿や血漿画分から
回収されるタンパク質もしくはその等価体であって、例
えば組換え核酸によってコード化されたものを使用する
ことができる。また、修飾されたタンパク質や断片を含
むそれぞれの誘導体も、それらが活性化可能であるか、
もしくはトロンビンの生成を調節する活性を有する限
り、適当である。
【００１６】本発明の製剤は、インビトロで高い安定性
を有するばかりでなく、生体内においても、創傷または
出血の部位におけるプロトロンビンの活性化とトロンビ
ンの生成によってその効力を示すまで、安定であるとい
う利点を有する。血管系の細胞成分（例えば血液細胞や
管壁）、具体的にはリン脂質含有表面との接触によっ
て、トロンビンがその場で生成し、止血が促進される。
その局部的な効力ゆえに、例えば血栓塞栓合併症などの
全身的な副作用は防止される。
【００１７】止血に対する影響を制御するためには、邪
魔な混入物（とりわけトロンビン活性）から精製されて
いる高度な精製因子を使用することが好ましい。イオン
交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィーおよび／または分子
排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法で
精製された因子はとりわけ好適である。これにより、個
々の因子について少なくとも理論的純粋の５０％、とり
わけ少なくとも７０％、好ましくは９０％から理論的純
粋までの比活性を達成することができる。したがって実
質上変性産物を全く含まず、精製された活性因子、酵素
もしくは活性化可能な酵素原として存在する因子を使用
することも好ましい。
【００１８】さらに、例えば熱処理、照射またはろ過
（具体的にはナノろ過）などの化学的および／または物
理的処理によって感染性の病原体の不活化処理を行うこ
とが好ましい。好ましい変法として、本発明の医薬製剤
の因子を界面活性剤で処理することにより、一方ではウ
イルスの不活化を達成すると共に、他方では存在するか
もしれないあらゆるリン脂質を可溶化する。
【００１９】リン脂質は、例えば血漿や血漿画分もしく
は細胞培養から得られる血液凝固因子の製剤に含まれう
る。天然に存在するリン脂質を分離するための特別な因
子処理には、一つにはその可溶化があり、もう一つには
上述の精製法によるリン脂質の分離がある。
【００２０】ある態様の製剤は外性リン脂質と組み合わ
せて使用することができるが、本発明の製剤は加えられ
たリン脂質を含まず、その含有量が０．０１ｍｇ−リン
脂質／Ｕ−プロトロンビン未満であることが好ましい。
リン脂質には凝塊形成効果が考えられるので、凝塊形成
の危険性はさらに著しく減少する。とりわけ好ましい態
様では、本製剤が検出しうるリン脂質を含まない。
【００２１】さらなる態様として、本発明の製剤はさら
にマグネシウムイオンを含有する。これらのイオンはカ
ルシウムイオンに対して競争的に作用し、プロトロンビ
ナーゼまたはプロ−プロトロンビナーゼ中のカルシウム
イオンを置換することができる。したがて本発明製剤の
溶液中における未成熟なトロンビン形成が防止されるの
で、その製剤は溶液状態で何時間にもわたって安定なま
まである程度に安定化される。
【００２２】第一に遊離のカルシウムイオンを含有しな
いことが確かであれば、その医薬製剤を安定な注入溶液
として提供することさえ可能であることが示されてい
る。カルシウムイオンを錯化するには、医薬的に許容し
うるキレート剤（例えばＥＤＴＡやクエン酸などの類似
構造物）の含有も好適である。
【００２３】本発明の製剤は動物モデルにおいてＦＥＩ
ＢＡと同等な生物学的効力を有し、因子ＶＩＩＩ阻害因
子血漿の凝固時間を著しく減少させることができる。こ
れは、因子ＶＩＩＩ阻害因子ウサギおよびフォン・ヴィ
レブラント（von Willebrand）因子阻害因子ウサギの
長くなった出血時間と出血強度を完全に正常化すること
ができる。精製した血液凝固因子（例えば精製したプロ
トロンビンと精製した因子Ｘａ）を提供することによっ
て、本発明製剤の毒性はＦＥＩＢＡと比べて明らかに減
少している。つまり、例えば因子Ｘａとプロトロンビン
の効果的な組み合わせは、ヴェスラー血栓症モデル
（J．Appl．Phys．１４（１９５９），９４３−９４
６）において陰性であることが立証された。すなわちこ
の組み合わせについては、活性化されたプロトロンビン
複合体に比してより高い投与量であってもヴェスラーモ
デルにおける凝塊形成効果が検出されなかった。
【００２４】この凝塊形成性モデルでは、ウサギをペン
トバルビタールで麻酔し、その後さらなる局部麻酔下で
頸静脈を確保し、２ｃｍの位置に緩い結紮を施す。最後
に、頸静脈とは反対側の耳静脈中に試験すべき物質を15
秒以内に注射する。さらに25秒後、結紮を閉め、10分間
待った後、結紮した静脈区分を回収し、クエン酸緩衝液
で満たしたペトリ皿中で切開し、評価することができ
る。ヴェスラーに従って改良したその評価規準は次の通
りである：血栓の形成なし＝０、数個の小さな血栓＝
０．５〜１、数個の中ぐらいの血栓と多くの小さな血栓
＝２、多くの中ぐらいの血栓＝３、数個の大きな血栓＝
３．５、一つの密着した血栓＝４。
【００２５】本発明の医薬製剤の成分は、少なくとも１
５０Ｕ−プロトロンビン／ｋｇの投与量でも血栓塞栓副
作用を含まないような（これはヴェスラー血栓症モデル
においてせいぜい３まで、好ましくは最大２、とりわけ
て2未満の評点で表される）純度にまで精製されている
ことが好ましい。
【００２６】本発明の複合製剤には、プロトロンビンが
少なくとも５（より好ましくは少なくとも６、とりわけ
て少なくとも７）Ｕ／ｍｇ−タンパク質の比活性で含ま
れていることが好ましく、これらは理論的純粋の５０
％、６０％、７０％に相当する。使用する因子Ｘまたは
Ｘａ製剤は少なくとも１００Ｕ／ｍｇ−タンパク質の比
活性を持つことが好ましく、因子Ｘａは主として因子Ｘ
ａβとして含まれることが好ましい。因子ＶまたはＶａ
は、補因子として、それぞれ部分的プロトロンビナーゼ
もしくはプロ−プロトロンビナーゼの凝固因子に対して
ほぼ等モル比で使用する。好ましい比率は（０．０１〜
２）：１（モル／モル）であり、もっとも好ましくは
（０．５〜２）：１である。
【００２７】使用する製剤は可能な限りトロンビンを含
まないべきで、トロンビンを含まないということは適当
な（好ましくは発色）試験（例えばイムノ・エイジー製
の発色原基質ＴＨ−１）で検出することができるはずで
ある。
【００２８】例えばプロトロンビンと因子Ｘａのような
凝固因子が本発明製剤中に一複合体として存在するなら
ば、その製剤が従来の製剤に比して増大した安定性を有
し、精製および／またはウイルス不活化のため、その複
合体をさらなる処理にかけ得ることが明らかとなった。
本発明製剤の好ましい態様では、その製剤がさらに安定
化量の抗トロンビンＩＩＩを（任意にヘパリンと共に）
含有する。そのような製剤が血栓塞栓副作用を含まない
ということは、ヘパリンの非存在下で、あるいはヘパリ
ンの非遮蔽（すなわちヘパリンの中和および／または分
離）後に、ヴェスラー試験に従って、その評点が３に達
しないという意味で立証することができる。
【００２９】プロトロンビナーゼもしくはプロ−プロト
ロンビナーゼの成分である少なくとも２つの凝固因子
（なかでも高度に精製されたもの）からなる複合体は、
「部分的プロトロンビナーゼ複合体」として基本的に重
要である。塩化カルシウムなどのカルシウムイオンの存
在によって、この複合体に基づく製剤の活性は何倍にも
促進されうる。この複合体とさらにカルシウムイオンを
含む製剤を診断用の試薬の調製に使用できることも明ら
かになった。さらにトロンビン活性と任意にリン脂質を
含有する試薬は、例えば因子Ｖ補因子活性を決定するの
に適している。この試薬を、因子Ｖの蛋白加水分解的不
活化因子である活性化プロテインＣと共に、あるいは活
性化プロテインCなしで用いる診断法により、因子Ｖの
不活化の程度あるいは活性化プロテインＣに対する突然
変異由来の耐性の程度を見積もることが可能である。
【００３０】プロトロンビン単独ではインビトロで因子
ＶＩＩＩ阻害因子血漿の凝固時間を短縮することはでき
なかったにもかかわらず、驚くべきことに、精製された
プロトロンビンを唯一の活性成分として含む医薬製剤
が、凝固疾患の処置において本発明の複合製剤と同等の
生体内効果を有することも、本発明の範囲内で明らかと
なった。
【００３１】つまり、プロトロンビンを唯一の活性成分
として含む医薬製剤について遺伝的なプロトロンビン欠
乏症以外の医学的適応症が初めて示されたことになる。
したがって本発明は、精製されたプロトロンビンを唯一
の活性成分として含む（具体的には凝固疾患処置用の）
医薬製剤にも関係する。そのプロトロンビンは少なくと
も１５０Ｕ−プロトロンビン／ｋｇの投与量においても
血栓塞栓副作用を含まない（これはヴェスラー血栓症モ
デルにおいてせいぜい３、好ましくは最大２、とりわけ
2未満の評点で表される）程度に精製されていることが
好ましい。
【００３２】本発明の複合製剤とプロトロンビン製剤は
それぞれ、プロトロンビン１Ｕあたり０．１Ｕ未満の因
子ＶＩＩＩ：Ｃもしくは因子ＶＩＩＩ：Ａｇを含み、プ
ロトロンビン１Ｕあたり０．１Ｕ未満の因子ＩＸまたは
プロトロンビン１Ｕあたり０．１Ｕ未満の因子Ｘを含む
ことが好ましい。これによってこれらのタンパク質に対
する抗体の望ましくない生成や、その抗体との反応を効
率よく防ぐことができ、副作用の危険性を減少させるこ
とができる。
【００３３】このプロトロンビン製剤をリン脂質と組み
合わせて使用することもできるが、本発明製剤のさらな
る好ましい態様では、これらが添加されたリン脂質をふ
くまず、プロトロンビン１Ｕあたり０．０１ｍｇ未満の
リン脂質を含有する。とりわけ好ましい態様では、本発
明のプロトロンビン製剤が検出しうるリン脂質を含まな
い。
【００３４】本発明製剤の投与量はＦＥＩＢＡ中の等価
な成分の投与量に基づく。因子ＶＩＩＩ阻害因子迂回活
性（The Factor Eight Inhibitor Bypassing Acti
vity：ＦＥＩＢＡ）とは、ＡＴ ３５０７２６に記述さ
れている凝固試験において、因子ＶＩＩＩ阻害因子血漿
の凝固時間をブランク値の５０％まで減少させる製剤活
性であると定義される。その成分の高純度ゆえに、ＦＥ
ＩＢＡに対する本発明製剤の利点は、患者に対する血漿
タンパク質の負荷が減少することにある。とりわけ、因
子ＶＩＩＩ：Ａｇが存在しないことによってアナフィラ
キシー副作用が排除される。したがって、例えば少なく
とも５０Ｕ−プロトロンビン／ｋｇ−体重を含む投与量
に相当する濃度で本発明の製剤を投与することが可能で
ある。この投与量はこのような製剤に関して初めて、
（それが副作用を含まないので）ボーラス注射の形であ
っても投与可能であり、このように高い投与量を時間の
かかる他の投与法（点滴など）で投与することを避ける
ことができる。
【００３５】通常は本発明製剤を例えば５０〜１５０Ｕ
−プロトロンビン／ｋｇ−体重の投与量で投与するが、
最大投与量は考えうる血栓塞栓副作用を伴うことなくこ
の１５０Ｕ／ｋｇ−体重をはるかに越えて、例えば３０
０や５００にまで及びうる。このように本発明は、少な
くとも５０Ｕ−プロトロンビン／ｋｇ−体重、好ましく
は５０〜５００Ｕ／ｋｇ−体重の投与量を含む本発明医
薬製剤の投与剤形にも関する。
【００３６】これらの投与剤形はすぐに使用できるよう
既に準備されているアンプルや注射器であってもよい
し、同様の直接または間接的に使用できる形態であって
もよい。注入、筋肉内または皮下投与に適した容器や、
活性剤を凍結乾燥物として含有する容器とその凍結乾燥
物の再構成に適した医薬的に許容される溶液を含有する
容器とからなるセットがこれらに含まれる。通常、医薬
的に許容される溶液または医薬製剤は水溶液中に塩、保
存料、緩衝剤などを含有する（Remington’s Pharmace
utical Sciences，第１５版，イーストン：Mack Pubi
shing Co．，１４０５〜１４１２および１４６１〜１
４８７頁（１９７５）とThe National Formulary Ｘ
ＩＶ．，第１４版，ワシントン：アメリカ薬学会（１９
７５）を参照のこと）。非水溶液の例はプロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、植物油と、オレイン
酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担
体は例えば水（アルコールと混合してもよい）、塩溶液
（ＮａＣｌ）、リンゲル・デキストロースなどである。
保存料として、抗微生物物質、抗酸化剤、キレート剤ま
たは不活性ガスを使用することができる。
【００３７】本発明による製剤は局部処置にも適してお
り、その投与剤形は出血の部位で活性になるものが選ば
れる。好ましくは粉末、粘着テープまたは創傷カバーの
形態の固体または液体、軟膏、座剤、カプセル（とりわ
け胃液耐性カプセル）あるいはドロップやスプレーがこ
れらに含まれる。
【００３８】使用する凝固因子は血漿由来のものでもよ
いし、組換えＤＮＡ技術によって調製されたタンパク質
であってもよい。どちらの場合においても重要なこと
は、それらが精製された形態（具体的には内因性および
外因性のリン脂質を含まない形態）で医薬製剤中に存在
することである。本発明の医薬製剤は輸送上、貯蔵上お
よび使用上の利点が知られている凍結乾燥型で提供され
ることが好ましい。再構成溶液としては、医薬的に許容
される溶液（ＡＴＩＩＩまたはヘパリンを含んでもよ
い）が適している。本発明製剤の成分は高純度であるか
ら、室温において短い再構成時間（好ましくは5分未
満、具体的には1分未満）内で光学的に透明な溶液に再
構成でき、例えば少なくとも１０Ｕ−プロトロンビン／
ｍｌから２００Ｕ−プロトロンビン／ｍｌ−溶液までも
の濃度が得られる。光学的に透明な溶液とは、６００ｎ
ｍにおける吸光度の最大値が純粋な（緩衝）溶液を対照
として（少なくとも５重量％のタンパク質含量を有する
溶液について厚さ１ｃｍで）０．１であると定義され
る。あるいは、３４０ｎｍの比濁計における厚さ１ｃｍ
の測定によって決定したときに７０光散乱単位（ＬＳ
Ｕ）未満である溶液も透明であると見なされる。
【００３９】今までに知られている血液凝固疾患処置用
製剤とは対照的に、本発明の製剤は極めて安定である。
つまり本発明製剤は投与前に、より長い期間放置してお
くことができる。例えば、製品情報によれば、投与準備
完了状態のＦＥＩＢＡは1時間以上放置すべきでない
が、本発明の製剤は使用準備完了溶液として、室温で3
時間以上にわたり凝固活性や凝塊形成性を何ら示さな
い。したがって数時間にわたって投与できる点滴溶液と
して本発明の製剤を提供することもできる。同じ理由か
ら、本発明の製剤を点滴溶液として長時間にわたって投
与することも可能である。しかし血栓塞栓副作用につい
ては、本発明の製剤の場合、ボーラス注射と遅い点滴と
の間で実質上の相違はないことがわかった。
【００４０】本発明の好ましい態様として、適当な投与
装置中で（好ましくは医薬的に許容される溶液によるイ
ンサイトゥー（in situ）再構成が可能な注射器中の凍
結乾燥物として）利用できるように本医薬製剤を製造す
る。本複合製剤については、図１に示す投与装置が好適
であるが、そこでは例えばプロトロンビンと因子Ｘａの
凍結乾燥物が好ましくは別個に保存されており、必要な
時に二室注射器によるインサイトゥー再構成の後、投与
することができる。
【００４１】純粋なプロトロンビン製剤の場合、単純な
注射器中のプロトロンビンを好ましくは凍結乾燥状態で
（任意に再構成用の医薬的に許容される溶液と共に）提
供するだけで十分である（図２を参照のこと）。しかし
プロトロンビン製剤を、液体製剤として、あるいは液体
急速冷凍冷蔵型で提供することもできる。
【００４２】とりわけそれらが血漿タンパク質から、も
しくは細胞培養から回収される場合、本発明の医薬製剤
を１または数回のウイルス不活化処理もしくはウイルス
消耗処理（例えば化学的または物理化学的処理、ＥＰ
０ １５９ ３１１、ＥＰ ０５１９ ９０１またはＥＰ
０ ６７４ ５３１による熱および／または界面活性剤処
理、あるいはナノろ過などの物理的処理）にかけてもよ
い。
【００４３】本発明の製剤は、極めて短時間のうちに作
用の効果的な開始を観測することのできる安全で簡単な
血液凝固疾患処置を可能にする。因子ＩＩと因子Ｘａの
複合体を投与すると、因子ＩＩのみを含有する製剤を投
与したときより迅速に作用の効果的な開始が起こりうる
ことが明らかになった。したがって阻害因子血友病にか
かっている患者における出血合併症を治療するには、ま
ず因子ＩＩ／Ｘａ複合体を投与して迅速な止血を達成
し、さらなる出血を避けるために因子ＩＩのみを含有す
る製剤の維持投与量で治療を続けることが有利である。
【００４４】さらに、本発明製剤は半減期が長く、凝塊
形成副作用を伴わず、あるいは阻害因子力価の増加を引
き起こすアナフィラキシー反応が起こらないので、既知
の方法に比して血液凝固疾患の危険にさらされている患
者の処置を本質的に改良することができる。本発明製剤
の高濃度または高投与量ゆえに、患者は活性物質のデポ
ー（貯留槽）を受けることができ、したがって頻繁な処
置の必要性が減少する。患者は数日間の長期間にわたっ
て処置を受けずにいることができ、あるいは自己注射
（皮下注射であってもよい）によって外来患者のように
自分自身を処置することも可能である。
【００４５】さらに本発明は、精製された医薬的プロト
ロンビン製剤を調製する方法であって、プロトロンビン
複合体濃縮物をクロマトグラフィー精製にかけ、そのプ
ロトロンビン含有画分を医薬製剤に加工することを特徴
とする方法にも関する。本発明の方法によれば、純度に
関して本発明の医薬製剤が必要とするすべての要請に
（とりわけヴェスラー試験によって決定される副作用を
伴わない点に関して）完全に合致するプロトロンビン製
剤が得られる。
【００４６】具体的に述べると、本発明の方法は次に挙
げる段階の組み合わせによって特徴づけられる： ・プロトロンビン複合体製剤を固体状態で、あるいはプ
ロトロンビン含有溶液として得る ・ウイルス不活化処理（好ましくは熱処理により、とり
わけ固体状態で行う） ・任意に、該プロトロンビン複合体製剤を溶解すること
により、プロトロンビン含有溶液を得る ・任意に、該プロトロンビン含有溶液を固形担体として
のアルカリ土類塩で処理する（プロトロンビンを吸着し
た後、脱着する） ・任意に、１または数回濃縮する（好ましくは該プロト
ロンビン含有溶液の沈殿または限外ろ過／ダイアフィル
トレーションとゲルろ過による） ・該プロトロンビン含有溶液を陰イオン交換剤で処理す
る（プロトロンビンを吸着した後、選択的に脱着する） ・プロトロンビン含有溶液を疎水性クロマトグラフィー
材料で処理する ・該プロトロンビン含有溶液を医薬製剤に仕上げる。
【００４７】好ましくは、リン酸カルシウム、硫酸バリ
ウムまたは水酸化アルミニウムを上記アルカリ土類塩と
して使用することができる。原則的に、プロトロンビン
に対して親和性を有するすべての陰イオン交換剤を使用
することができる。以下にその例を挙げる：ＤＥＡＥ−
セファセル、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ６Ｂ、ＤＥＡＥ−セファロース・ファス
ト・フロウ、ＱＡＥ−セファデックス、Ｑ−セファロー
ス・ファスト・フロウ、Ｑ−セファロース・ハイ・パフ
ォーマンス、Ｑ−セファロース・ビッグ・ビーズ（以上
ファルマシア製）、ＤＥＡＥ−トリス−アクリル、ＤＥ
ＡＥ−スフェロデックス、Ｑ−ハイパー−Ｄ（以上セプ
ラコル製）、マクロプレップＤＥＡＥ、マクロプレップ
Ｑ（以上バイオラッド製）、ＤＥＡＥ−トヨパール、Ｑ
ＡＥ−トヨパール、トヨパール・スーパー−Ｑ（以上ト
ーソーハース製）、プロテイン・パック・ＤＥＡＥ（ウ
ォータース製）、フラクトゲル・ＥＭＤ−ＴＭＡＥ、フ
ラクトゲル・ＥＭＤ−ＤＥＡＥ、フラクトゲル・ＥＭＤ
−ＤＭＡＥ、リクロスファー１０００ＴＭＡＥ、リクロ
スファー１０００ＤＥＡＥおよびリクロスファー４００
０ＤＭＡＥ（以上メルク製）。
【００４８】疎水相互作用クロマトグラフィー用のゲル
としてはフェニル−セファロース・ハイ・パフォーマン
ス（ファルマシア製）が好ましいが、以下に例示するそ
の他のクロマトグラフィーゲルも使用される：ブチル−
セファロース、オクチル−セファロース、フェニル−セ
ファロース、フェニル−セファロース・ファスト・フロ
ウ・ハイ・サブ、フェニル−セファロース・ファスト・
フロウ・ロウ・サブ（以上ファルマシア製）、フラクト
ゲルＴＳＫ−ブチル（メルク製）、マクロプレップ−メ
チル−ＨＩＣ−サポート、マクロプレップ・ｔ−ブチル
−ＨＩＣ−サポート（以上バイオラッド製）、ＴＳＫ−
ゲル・ブチル・トヨパール、ＴＳＫ−ゲル・フェニル・
トヨパールおよびＴＳＫ−ゲル・エーテル・トヨパール
（以上トーヨーハース製）。本発明方法の考えうる態様
を図３に例示する。
【００４９】本発明方法によって調製することができる
プロトロンビン製剤は、理論的に可能な純度１０Ｕ／ｍ
ｇに近い極めて高い純度によって特徴づけれるばかりで
なく、少なくとも１５０Ｕ−プロトロンビン／ｋｇの投
与量でさえ、血栓塞栓副作用を伴わないという事実（こ
のことはヴェスラー血栓症モデルにおける評点がせいざ
い３、好ましくは最大２、とりわけ好ましくは２未満で
あることによって表される）によっても特徴づけられ、
さらには凍結乾燥物として、せいぜい1分の再構成時間
で少なくとも１０Ｕ−プロトロンビン／ｍｌから２００
Ｕ−プロトロンビン／ｍｌまでの活性を有する透明な溶
液に再構成され得ることによっても特徴づけられる。プ
ロトロンビン製剤の生物学的活性はプロトロンビンの活
性化時に得られる酵素活性であると理解されるべきであ
る。
【００５０】本発明のさらなる側面は、精製されたプロ
トロンビナーゼ因子（とりわけ精製プロトロンビンおよ
び任意に精製因子Ｘａ）を使用して、患者の血液中に並
外れたプロトロンビン濃度を確立するため、あるいは低
下したプロトロンビンレベルを伴う症状の場合に正常な
プロトロンビン血中濃度を確立するための医薬製剤を製
造することに関する。
【００５１】本発明の製剤を用いて上述のような並外れ
た因子ＩＩレベルを永続的に（すなわち長期間にわたっ
て）維持することができることが明らかとなった。この
ことは、一つには血液凝固因子に関してプロトロンビン
が薬物として極めて長い半減期を有するという事実に起
因し、もう一つには本発明の製剤が例えばデポー投与に
よる皮下投与でさえ可能なほどに副作用を伴わないとい
う事実に帰する。精製プロトロンビンおよび任意に精製
因子Ｘａまたは他のプロトロンビナーゼ因子を投与する
ことによって血中に可能となる並外れたプロトロンビン
濃度は、少なくとも１５０％、好ましくは少なくとも２
００％にさえ達し、これは少なくとも１．５Ｕ−プロト
ロンビン／ｍｌ−血液、好ましくは少なくとも２．０〜
１０Ｕ／ｍｌの活性に相当する。
【００５２】最後に本発明は、精製されたプロトロンビ
ナーゼ因子（とりわけ精製プロトロンビンおよび任意に
精製因子Ｘａ）を使用して因子ＶＩＩＩ阻害因子状態、
血友病ＡまたはＢ、およびフォン・ヴィレブラント病の
処置用医薬製剤を製造することに関する。動物モデルに
おいて、本発明の製剤を用いれば、これらすべての適応
症について迅速で効率がよく副作用を伴わない処置が可
能であることが明らかとなった。
【００５３】好ましくは、本発明の製剤を生理学的ｐＨ
を有し、好ましくは遊離のカルシウムイオンを一切含有
しない溶液として提供する。しかし４．５〜６．５（好
ましくは５〜６）のｐＨ範囲にある酸性緩衝液を使用す
ることも可能である。この条件は因子Ｘａ活性最適条件
から離れており、したがってプロトロンビンの活性化が
防止され、それゆえに複合製剤の安定性がさらに増大し
うるのである。因子ＩＩ、Ｖ、Ｖａ、ＸおよびＸａに適
する医薬添加物および溶液のすべてを本発明製剤の使用
準備完了(ready−to−use）生産に使用できることは言
うまでもない。
【００５４】さらに、驚くべきことに非血友病患者の場
合でさえ、本発明の製剤を用いることによって、急性出
血、増大した出血強度または増大した出血危険性を効果
的に処置しうることが明らかとなった。さまざまなタイ
プの血友病の上述の適応症（すなわち血友病ＡおよびＢ
ならびに阻害因子血友病）に加えて、本発明の製剤は非
血友病患者にも適用できる。非血友病患者には、因子Ｖ
ＩＩＩまたは因子ＩＸでない血液因子に対する阻害因子
に基づく血液凝固疾患を持つ人々も含まれる。さらに、
トロンビン生成に欠陥を示す患者（これは外因性または
内因性凝固の１または数種の因子の不在または機能的欠
陥によってもたらされるか、もしくはこれらの因子の１
または数種に対する抗体の生成時に、もしくはこれらの
因子の１または数種に関する細胞受容体の欠損によって
もたらされる）を処置することもできる。本発明の医薬
製剤を投与すると凝固促進効果が生体内で起こりうるの
で、処置、すなわち予防的または治療的投与が可能にな
る。
【００５５】したがって本発明はさらなる側面として、
プロトロンビナーゼまたはプロ−プロトロンビナーゼの
成分である少なくとも２種類の凝固因子を使用して、あ
るいは本発明の製剤を使用して、非血友病患者における
急性出血、増大した出血強度または増大した出血危険性
を処置するための医薬製剤を製造することに関する。
【００５６】具体的には、血小板凝集作用の欠陥または
血小板障害（例えば貯蔵欠損）によって引き起こされる
症状、もしくは血小板関連タンパク質の欠乏症または機
能不全による症状、さらには血小板欠乏症（血小板減少
症）によって引き起こされる出血状態を処置することが
できる。抗凝血治療の副作用の一つは、ヘパリンによっ
て誘発される血小板減少症にあり、これもまた本発明製
剤の適応症の１つを構成する。
【００５７】つまり好ましい態様として、本発明はプロ
トロンビナーゼまたはプロ−プロトロンビナーゼの成分
である少なくとも2種類の凝固因子を使用して、血小板
減少症（具体的にはヘパリンによって誘発される血小板
減少症）によって引き起こされる出血を処置するための
医薬製剤を製造することに関する。
【００５８】これに関連して、本発明の方法によって製
造される医薬製剤は一次的止血活性を有しうる点が有利
である。一次的止血活性を有するタンパク質との組み合
わせによって、製造した医薬製剤の効力をさらに増大さ
せることができる。第一に適しているものは、明確なコ
ラーゲン結合活性を伴うフォン・ヴィレブラント因子タ
ンパク質またはフォン・ヴィレブラント因子の画分であ
る。
【００５９】血液凝固疾患にかかっている患者の処置に
関するさらなる適応症は、フォン・ヴィレブラント病に
関連して起こる出血の防止または処置である。この疾患
は凝固因子阻害因子の蔓延を伴って、あるいはこれを伴
わずに、出血傾向の増大または出血の危険性をはらみ、
多くの場合、制御が困難な出血につながる。本発明の製
剤を利用することにより、そのような出血を迅速に止め
ることができる。
【００６０】したがって本発明により、血液凝固疾患に
かかっている患者の処置用セットであって次の成分を含
むものが提供される： ａ）プロトロンビナーゼまたはプロ−プロトロンビナー
ゼの成分である少なくとも２種類の凝固因子を含み、リ
ン脂質を伴わない医薬製剤、および ｂ）一次的止血活性を有するタンパク質（とりわけｖＷ
Ｆ）。
【００６１】制御が困難な出血はいくつかの場合、合
成、半合成および生物学的凝固阻害因子または抗凝血薬
もしくは栓球機能阻害因子による治療の副作用として起
こる。これらの物質は凝固系を直接または間接的に干渉
し、自然な凝血または凝固過程を望ましくない方法で妨
害する。したがってこれらの物質の拮抗薬の需要があ
る。先行技術では、抗凝血薬療法によって引き起こされ
た出血の治療にプロトロンビン複合体またはＦＥＩＢＡ
製剤を使用することが知られている。この点について
は、Irani M．S．ら，The American Journal of C
ardiology，第７５巻，１９９５年２月１５日，４２２
頁；Fareed J．ら，Haemostasis １９９１，第２１巻
（増刊１），６４〜７２頁；およびFareed J．ら，Sem
inars in Thrombosis and Hemostasis １９９１，
第17巻，第2号，１３７頁を参照のこと。
【００６２】本発明のさらなる態様として、上述の凝固
因子を用いて、抗凝血薬療法の範囲内で起こる出血を処
置するための本発明医薬製剤を製造する。具体的には、
凝固阻害因子または栓球機能阻害因子の解毒剤として医
薬製剤を製造する。本質的なことは、リン脂質の存在に
伴う血栓症の危険性が回避されるということである。抗
凝血薬による治療を受けている患者の場合は特に、血栓
症の危険が増大している。しかし本発明によれば、リン
脂質の使用を回避することができ、それによって驚くべ
きことにその解毒効果がより特異的になる。
【００６３】本発明の使用は主として因子Ｘａまたはト
ロンビンを間接または直接的に阻害する凝固阻害因子ま
たは抗凝集薬の拮抗に関する。本発明によれば、好まし
くは、ＡＰＡＰ（（２Ｓ）−２−［４−［［（３Ｓ）−
１−アセチミジル−３−ピロリヂジニル］−オキシ］−
フェニル］−３−（７−アミジノ−２−ナフチル）−プ
ロピオン酸塩酸塩五水和物）、ベンズミジン誘導体、ヒ
ルジン、ヘパリン、ヘパリン類縁体（特に五糖類）、Ａ
Ｔ ＩＩＩヘパリン複合体、ＡＴ ＩＩＩ、アンチスタ
シン、「ダニ抗凝血ペプチド」、不活性凝固因子（特に
「活性部位」が阻害された凝固因子）、ＴＦＰＩ、栓球
膜表面受容体の拮抗配位子（特にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
に対する抗体）およびそれらの遺伝子操作によってもし
くは合成的に製造される類縁体（特にペプチド）、なら
びに経口抗凝血薬からなる群より選択される物質が拮抗
される。不活性凝固因子には、一次的に誘導体化され
た、突然変異した、断片化した、化学的または物理的に
不活化または阻害された、内因性および外因性血液凝固
因子が含まれ、これらは天然の因子と競争的に相互作用
しうる。
【００６４】栓球機能阻害因子の拮抗は主としてチクロ
ピジンまたはアセチルサリチル酸の場合について示され
る。急性出血は主として脳の領域において極めて重大で
ある。したがって頭蓋内出血（例えば脳室内出血（ＩＶ
Ｈ））の予防または処置が必要である。特に血管に損傷
を受けている患者やトロンビン生成に欠陥を有する患者
は頭蓋内出血の危険が増大している。本発明の製剤はこ
の適応症にも特に適しており、とりわけ未成熟な幼児の
処置の改良が可能になる。
【００６５】上述の適応症に本発明を使用する態様とし
て、本発明の医薬製剤を一成分として含有する各キット
を提供する。さらに止血効果を強化する物質、例えば一
次的止血活性を有するタンパク質（とりわけｖＷＦ）を
含有してもよい。この他、抗凝血薬治療用のキットは当
然、各抗凝血薬と解毒剤としての本発明医薬製剤を含有
するであろう。
【００６６】以下に実施例を挙げて添付の図面を参照し
ながら本発明をさらに詳しく説明する。ただし本発明は
これらに限定されるものではない。
【００６７】
【実施例】
実施例１：イオン交換クロマトグラフィーによるウイル
ス不活化血漿画分からの因子Ｘおよび因子ＩＩの調製 Brummelhuis，H．G．J．の方法（「プロトロンビン複合
体の調製」，Methodsof Plasma Protein Fractionat
ion，Curling，J．M．，１１７〜１２８，Academic Pr
ess，ニューヨーク（１９８９））とＥＰ １５９ ３
１１ のウイルス不活化用熱処理に従って、因子ＩＩ、
ＩＸ、Ｘ、プロテインＣおよびプロテインＳを含有する
凍結乾燥プロトロンビン複合体因子調製物を調製した。
上記凍結乾燥物（１０００Ｕ−因子Ｘ／ｇ、１２００Ｕ
−因子ＩＩ／ｇ）を５００００Ｕ−因子Ｘ／ｌとなるよ
うに蒸留水に溶解し、ｐＨ７．０に調節した。１２％
（ｖ／ｖ）TWEEN８０の添加後、室温で1時間攪拌した。
次いでそれを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．
０）で１：５に希釈し、室温で1時間攪拌することによ
って、そのプロトロンビン複合体タンパク質画分を、プ
ロトロンビン複合体溶液１ｌあたり３０ｇリン酸カルシ
ウム［Ｃａ３（ＰＯ４）２］の濃度で、 Ｃａ３（ＰＯ
４）２に吸着させた。次いでその固相を５０００ｒｐｍ
２０分間の遠心分離によって分離し、再懸濁と再遠心分
離により、その沈殿を１０％硫酸アンモニウムを含有す
る２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回
洗浄した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、３度目の
洗浄を同様の方法で行った。プロトロンビン複合体画分
の溶出を１Ｍ リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）で
行った。ここではリン酸カルシウム１ｇあたり２５ｍｌ
の上記溶液を室温で1時間攪拌した後、残存する沈殿物
を上述のような遠心分離によって分離した。次いでその
上清を１ｌあたり３６６ｇの硫酸アンモニウムにより攪
拌下４℃で15時間の硫酸アンモニウム沈殿にかけた。プ
ロトロンビン複合体画分を含有する沈殿物を上述のよう
に遠心分離した。その沈殿物を１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭベンズアミジン塩酸塩を含有する２５ｍＭクエン
酸三ナトリウム二水和物緩衝液（ｐＨ６．０）に取り出
し、４℃のセファデックスＧ−２５を詰めたカラム上
で、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭベンズアミジン塩酸
塩を含有する２５ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物緩
衝液（ｐＨ６．０）に対して１ｃｍ／分の線流量で再度
緩衝化することにより硫酸アンモニウムを分離した。こ
こでは溶出流を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収と電気伝導
率を測定した。タンパク質含有画分を合わせた後、それ
をＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（ファルマシア製）に対
するイオン交換クロマトグラフィーにかけた。上記画分
を８．２ｌ（０．５５ｇ−タンパク質／ｌ−ゲル）のゲ
ル体積を持つカラム（内径：ゲルベッド高＝１：１．
３）に０．３６ｃｍ／分の線流量で添加した。クロマト
グラフィーは２２℃で行った。タンパク質の添加に先立
ち、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭベンズアミジン塩酸
塩を含有する２５ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物緩
衝液（ｐＨ６．０）でカラムを平衡化した。タンパク質
画分の溶出は、緩衝液１（２５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム二水和物、１ｍＭベンズアミジン塩酸塩、２４５ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）、緩衝液２（２５ｍＭクエン
酸三ナトリウム二水和物、１ｍＭベンズアミジン塩酸
塩、２７０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）および緩衝液
３（２５ｍＭクエン酸三ナトリウム二水和物、１ｍＭベ
ンズアミジン塩酸塩、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．
０）を用いる数段階によって達成した。緩衝液１による
溶出を２．４カラム体積実行した。これと共に不活性タ
ンパク質が分離された。緩衝液２による溶出を５．６カ
ラム体積行い、その画分を集めて因子ＩＩ、因子Ｘ、プ
ロテインＣおよび因子ＩＸの含量について分析した。因
子ＩＩ、ＩＸおよびプロテインＣを含まない因子Ｘ含有
画分を合わせた。緩衝液３による溶出（１．９カラム体
積）により因子ＩＩを脱着し、再びその画分を集め、因
子Ｘ、因子ＸＩおよび因子ＩＩの含量について検定し
た。因子ＩＩ含有画分を貯蔵した。因子ＩＩ含有画分と
因子Ｘ含有画分は共に、任意の工程として、１Ｍ ＫＳ
ＣＮの添加と２２℃で数時間のインキュベーションによ
る病原性不純物の不活化処理にかけることができる。
【００６８】実施例２：疎水相互作用クロマトグラフィ
ーによる因子ＩＩの精製 実施例１で回収した因子ＩＩ画分を塩化ナトリウムの添
加によって１．８ＭＮａＣｌに調節し、ｐＨを７．０に
補正し、この溶液を疎水相互作用によってゲル（フェニ
ルセファロース・ハイ・パフォーマンス（ファルマシア
製））に吸着させた。ここではゲル１ｌあたり３ｇのタ
ンパク質が結合した。内径：ゲルベッド高＝１：１．９
の比率を有するカラム中、０．２５ｃｍ／分の線流量で
タンパク質画分を吸着させた後、緩衝液（２５ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）での洗浄に
よって不活性タンパク質を除去した。同時に画分を集め
ながら、１１．５カラム体積の３Ｍ〜０．９Ｍ ＮａＣ
ｌによる勾配溶出で因子ＩＩをカラムから溶出させ、因
子ＩＩ活性を含有するが因子Ｘおよび因子ＩＸを含まな
い画分を貯蔵した。次いで、集めた因子ＩＩ画分を、３
０ｋＤのカットオフを有する限外ろ過膜を通す限外ろ過
／ダイアフィルトレーションによって１０倍に濃縮し、
４ｇ−クエン酸三ナトリウム二水和物／ｌ、８ｇ−Ｎａ
Ｃｌ／ｌを含む緩衝液（ｐＨ７．０）に対して再度緩衝
化した。このように調製した因子ＩＩ調製物は６．９Ｕ
／ｍｇ−タンパク質の比活性を有した。因子ＩＩ活性の
決定は、イムノ（ウィーン）製の試薬の組み合わせを用
いて、国際的因子ＩＩ標準に対し、因子ＩＩ欠乏血漿を
用いて、トロンボプラスチン時間に基づく1段階法で達
成した。凝固分析において、他の凝固因子は微量に検出
されるか、もしくは全く検出されたなかった（因子ＶＩ
Ｉ＜０．００００２Ｕ／Ｕ−因子ＩＩ、因子ＩＸ ０．
０００２Ｕ／Ｕ−因子ＩＩ、因子Ｘ ０．００４Ｕ／Ｕ
−因子ＩＩ、プロテインＣ ０．００３Ｕ／Ｕ−因子Ｉ
Ｉ、因子ＶＩＩＩ＜０．０００２Ｕ／Ｕ−因子ＩＩ）。
【００６９】実施例３：疎水相互作用クロマトグラフィ
ーおよびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを
用いる因子ＩＩの精製 高度に精製された因子ＩＩを調製する別法として、まず
疎水性クロマトグラフィーによって凍結乾燥プロトロン
ビン複合体因子調製物（実施例１を参照）から因子ＩＸ
を分離した後、因子ＩＩを単離し、次いでこれをヒドロ
キシルアパタイド上でのクロマトグラフィーにより高度
に精製するという方法をも使用した。プロトロンビン複
合体因子調製物を実施例１のように溶解し、界面活性剤
と共に室温で１時間インキュベートした。次いでＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦ（ファルマシア製）上でのイオン
交換クロマトグラフィーにより、因子ＩＩ、ＩＸおよび
Ｘ含有画分を実施例１のように単離した。次いでここか
ら、ブチル−トヨパール（トーソー・ハース製）との相
互作用によって因子ＩＸ含有画分を除去した。次いで、
その吸着上清をさらにフェニル−セファロース・ハイ・
パフォーマンス（ファルマシア製）上での疎水相互作用
クロマトグラフィーによって精製した。ここでは約４ｇ
−タンパク質／ｌ−ゲルが吸着可能であった。内径：ゲ
ルベッド高＝１：１．９の比率を有するカラム中、０．
２５ｃｍ／分の線流量でタンパク質画分を吸着させた
後、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．４による洗浄で不活性タンパク質を除去し、最後に
導電率を減少させる段階的溶出によって因子ＩＩ含有画
分を単離したところ、１．９Ｍ ＮａＣｌでゲルから脱
着した。次にその因子ＩＩ含有画分を直接、セラミック
−ヒドロキシルアパタイト（バイオラッド製）に吸着さ
せた。これは内径：ゲルベッド高＝１：４．８の比率を
有するカラム上で行った。溶出は３ｃｍ／分の線流量で
行った。塩勾配での溶出により、因子ＩＩをカラムから
脱着することができた。因子ＩＩ含有画分を集め、３０
ｋＤのカットオフを有するポリスルホン膜を通す限外ろ
過／ダイアフィルトレーションによって、因子ＩＩ濃度
が５０〜１００Ｕ／ｍｌになるまで濃縮した。このよう
に調製した因子ＩＩ調製物は少なくとも７Ｕ／ｍｇ−タ
ンパク質の比活性を有した。他の凝固因子、とりわけ因
子ＩＸと因子ＶＩＩＩは、実施例２で得られた調製物と
同様に痕跡量しか検出されないか、もしくは全く検出さ
れなかった。適当なダイアフィルトレーション緩衝液を
選択することにより、因子ＩＩ調製物を医薬的に許容さ
れる緩衝液（例えば４ｇ−クエン酸三ナトリウム二水和
物／ｌ、８ｇ−ＮａＣｌ／ｌ、ｐＨ７．０）中に移し
た。
【００７０】実施例４：因子Ｘａの回収 実施例１に記述の如く調製した因子Ｘ画分をさらにＤＥ
４３ ２５ ８７２に記載の如く因子Ｘａｂに加工し
た。ここではそのようにして得られる高度に精製された
因子Ｘａ調製物を１ｇ／１００ｍｌ−ヒト・アルブミン
の存在下で凍結乾燥した。このような調製物は他の凝固
因子を含まず、含有される因子Ｘａはアルブミンへの添
加前に１２０Ｕ／ｍｇ−タンパク質の比活性を有した。
【００７１】実施例５：因子ＩＩの凍結乾燥 実施例３に記載の高度に精製された因子ＩＩを含有する
調製物を安定化剤を添加することなく凍結乾燥したとこ
ろ、凍結乾燥後に最初の活性の８０％以上が残存してい
た。
【００７２】実施例６：因子ＩＩおよび因子Ｘａの同時
凍結乾燥 実施例３に従って調製した因子ＩＩ調製物を１００Ｕ／
ｍｌの濃度で５０ｍｌビン中に２０ｍｌ注入し、−８０
℃で瞬間冷凍した。次いでＤＥ ４３ ２５８５２に従
って調製した高度に精製された因子Ｘａの溶液で５００
Ｕ／ｍｌの濃度を持つものを、凍結した因子ＩＩ溶液上
に３０μｌ量加えた。その少量液を直ちに冷凍すること
により、因子ＩＩ相と因子Ｘａ相の混合を防いだ。次い
でこれを凍結乾燥した。点滴溶液を調製するには、その
凍結乾燥物を２０ｍｌのＡ．dest．で再構成し、混合
し、直ちに投与準備が完了した。
【００７３】実施例７：因子ＩＩ、因子Ｘａおよび抗ト
ロンビンＩＩＩおよび／または抗トロンビンＩＩＩ・ヘ
パリン複合体の医薬製剤 高度に精製した因子ＩＩを因子Ｘａおよび抗トロンビン
ＩＩＩまたは抗トロンビンＩＩＩ・ヘパリン複合体と組
み合わせて、４ｇ−クエン酸三ナトリウム二水和物／ｌ
と８ｇ−ＮａＣｌ／ｌを含有する緩衝液（ｐＨ７．０）
で適用濃度に希釈した。これらの溶液を凍結乾燥したと
ころ、各成分の少なくとも８０％の活性が残っていた。
【００７４】実施例８：部分的プロトロンビナーゼの検
出 因子ＩＩと因子Ｘａの複合体が「部分的プロトロンビナ
ーゼ」を形成することを次の実験で立証した。実施例３
で得た５７Ｕの因子ＩＩと実施例４で得た１．２Ｕの因
子Ｘａを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、複合体形成
のため、室温で15分間インキュベートした。次にこの溶
液の一部をスーパーロース１２（ＨＲ１０／３０）（フ
ァルマシア製）によるゲル透過クロマトグラフィー（流
速０．２５ｍｌ／分）で分画した。適用体積は２００μ
Ｌであった。カラムを通過する処理量をUV分光測光法的
に２８０ｎｍで測定し、０．５ｍｌづつ集めた。次にＤ
Ｅ ４３ ２５ ８７２に記載の方法を利用する測光法
試験で発色原性基質を用いて決定される因子Ｘａを各画
分内で定量的に測定した。同様に、因子ＩＩ活性を実施
例２のように個々の画分で決定した。その結果を図４に
示す。因子Ｘａ［図４：−■− Ａｃｔ．Ｘａ（ＦＩＩ
／Ｘａ）］と因子ＩＩ［図４：−●− Ａｃｔ．ＩＩ×
１０（ＦＩＩ／Ｘａ）］はタンパク質画分［図４：――
Ａ２８０ｎｍ（ＦＩＩ／Ｘａ）］と一緒に溶出した。同
一の条件下で、因子Ｘａを単独でカラムに適用し、その
溶出特性図をゲル通過後に２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定
することによって決定し［図４：・・・・Ａ２８０ｎＭ
（ＦＸａ）］、各画分の因子Ｘａ活性［図４：−▲−
Ａｃｔ．Ｘａ×１０（ＦＸａ）］を決定した。因子Ｘａ
に対応するタンパク質ピークは因子ＩＩとの複合体中の
因子Ｘａから明らかに外れている。複合体内の因子Ｘａ
のカラム上での保持時間が減少し、明らかにより高い分
子量へ転移することから、因子ＩＩと因子Ｘａの複合体
形成（部分的プロトロンビナーゼ）が立証できた。
【００７５】実施例９：調製物の二室式注射器系への製
剤 例えば因子ＩＩと因子Ｘａの混合物または因子ＩＩ、因
子Ｘａおよび抗トロンビンＩＩＩの混合物などの複数成
分系の適用を簡単にするため、ＡＴ ３８２７８３に記
載の二重二室式注射器を適用装置として使用することが
できる。このような方法を用いない場合、凍結乾燥複数
成分系の臨床的適用では、患者へ投与する前にこれらを
個別に再構成し、規定の比率で互いに混合する必要があ
ろう。対応する凍結乾燥物を二室式注射器系に充填する
ことにより、阻害因子血友病処置用製剤の予定の活性
（例えばＡＴ ３５０ ７２６に従って決定できる従来
のＦＥＩＢＡ単位）を正確に投与することが可能にな
る。このような系を用いれば、効果的な混合物が注射時
にその場で調製される。一つの態様では、活性物質（因
子ＩＩおよび因子Ｘａ）の凍結乾燥物のそれぞれが２つ
の二室式注射器内に存在し、高度に精製されたタンパク
質の容易な溶解性ゆえに、それらが一度に可溶化し、混
合ヘッド内での混合後に注射器ピストンをさらに押し下
げることによって直ちに患者に注入される（図１参
照）。
【００７６】因子ＩＩの溶液への高い安定性ゆえに、こ
れは二室式注射器適用剤形における因子Ｘａ用の溶媒と
しても好適である。例えば実施例２に従って調製される
高度に精製された因子ＩＩの生理学的に許容されるクエ
ン酸緩衝液（４ｇクエン酸三ナトリウム二水和物／ｌ、
８ｇ ＮａＣｌ／ｌ、ｐＨ７．０）溶液（濃度１００Ｕ
因子ＩＩ／ｍｌ）を抗トロンビンＩＩＩ（イムノ製，ウ
ィーン）（１ｍＵ抗トロンビンＩＩＩ／Ｕ−因子ＩＩ）
と混合する。この溶液を二室式注射器における高度に精
製された因子Ｘａの凍結乾燥粉末用の溶媒として使用す
る（図２参照）。
【００７７】実施例１０：高度に精製された因子ＩＩの
安定性 因子ＩＩを実施例２のように精製し、４ｇ／ｌクエン酸
三ナトリウム二水和物、８ｇ／ｌ ＮａＣｌを含有する
緩衝液（ｐＨ７．０）中に６０Ｕ／ｍｌ濃度の溶液とし
て、５℃、２２℃、３７℃および５０℃で保存した。５
℃と２２℃の保存温度では、試料を２４時間毎に採取
し、３７℃と５０℃の保存温度では、試料を２４時間に
わたって１時間、２時間、４時間、８時間および２４時
間で採取した。各試料内の因子ＩＩ活性を決定した。
【００７８】５℃では最初の活性の８０％以上が保存開
始の８６日後でさえ検出できた。２２℃では最初の活性
の８０％以上が１４日間認められ、３７℃では最初の活
性の９５％が保存開始の２４時間後に認められた。５０
℃でさえ、最初の活性の９４％が保存開始の８時間後に
認められた。
【００７９】実施例１１：本発明製剤の自己活性化と安
定性 実施例５（因子ＩＩ）と実施例６（因子ＩＩ／Ｘａ複合
体）の本発明製剤をその（とりわけ外因性凝固系の）プ
ロトロンビン特性について試験管内試験で調べ、２つの
市販のプロトロンビン複合体濃縮物と比較した。試験で
使用する前に、ヘパリンで遮蔽される凝塊形成物質を発
揮するように、プロトロンビン複合体濃縮物中に存在す
るヘパリンをヘパリンの濃度に対応する硫酸プロタミン
で中和した。
【００８０】分析物質は、ウシ脳と吸着されたウシ血漿
由来のトロンボプラスチンを含有する調製物である２５
０μＬトロンボテスト（ニコメド・ファルマ・エイエス
製，ノルウェイ国オスロ）からなり、これを３７℃で３
分間予備インキュベートした。次に５０μｌの試料を加
え、球面凝固測定器（ＫＣ４，アメルング製）を用いて
凝固時間を決定した。ウシトロンボプラスチンは活性化
された凝固因子に対してとりわけ感受性であると考えら
れる。したがってこの試験系は検定される製剤の試験管
内凝塊形成性について情報を提供することができる。こ
の試験では、希釈しない正常なヒト血漿を対照として用
いた。これは７４秒の凝固時間を持った。希釈せずに用
いた場合、考えうる適用濃度３０Ｕ−因子ＩＩ／ｍｌに
相当する濃度で、検定した２つの本発明製剤は１００秒
以上の凝固時間を持った。同様に３０Ｕ／ｍｌの適用濃
度に希釈溶解した市販のプロトロンビン複合体濃縮物
は、正常な血漿の凝固時間（７４秒）を達成するにはさ
らに緩衝液で１：３２に希釈する必要があった。もう1
つの市販活性化プロトロンビン複合体濃縮物も正常な血
漿の凝固時間（すなわち７４秒）を達成するには緩衝液
で１：２１６に希釈する必要があった。次に、本発明製
剤を溶解した状態で室温に4時間まで保存し、１時間に
１回試料を採取して、再びトロンボテストを用いて凝固
時間を決定した。変化は起こらなかった。すなわち４時
間後でさえ、希釈しない状態で使用した試料が１００秒
以上の凝固時間を持った。これらの試験から、本発明製
剤が市販のプロトロンビン複合体濃縮物と比較して著し
く低い凝塊形成能を持つことがわかった。
【００８１】実施例１２：本発明製剤の溶解特性 高度に精製した因子ＩＩを含有する製剤を実施例５のよ
うに調製し、凍結乾燥した。その凍結乾燥物を蒸留水で
再構成した後に体積活性が５０Ｕ／ｍｌになるように調
節した。これは典型的な適用濃度である。しかしこの調
製物の高純度ゆえに、１ｍｌあたり１００単位以上の因
子ＩＩ体積濃度も達成できた。溶媒（蒸留水）の添加か
らその粉末の完全な溶解までに経過する時間と定義され
る製剤の溶解時間を決定した。それと比較するため、２
つの市販製剤（すなわちプロトロンビン複合体と活性化
プロトロンビン複合体）の凍結乾燥物をそれぞれ蒸留水
の添加によって供給者の指示に従って再構成し、その溶
解時間をも決定した。試験した製剤の溶解時間を次の表
に示す。
【００８２】☆
【表１】 （１）ＡＰＣＣ＝活性化プロトロンビン複合体濃縮物 （２）ＰＣＣ＝プロトロンビン複合体濃縮物 各製剤を溶解したとき、それぞれのＵＶ／ＶＩＳスペク
トルをクエン酸化食塩緩衝液に対して２８０〜７５０ｎ
ｍで測定した。そのスペクトルを図５ａ、ｂおよびｃに
示す（ａ：本発明製剤；ｂ：活性化プロトロンビン複合
体；ｃ：プロトロンビン複合体）。これらのスペクトル
を比較すると、本発明製剤が７００ｎｍまでの可視領域
で比較製剤より著しく低い光吸収を持つことがわかっ
た。このように本発明の調製物には優れた溶解性が認め
られ、溶解した状態では透明で無色の溶液として存在し
た。これは改善された医薬製剤の特徴である。
【００８３】実施例１３：因子ＶＩＩＩ阻害因子血漿に
おける本製剤の効果 高力価因子ＶＩＩＩ阻害因子血漿（５５ＢＵ／ｍｌ）を
氷槽中で予備冷却し、ＰＴＴ試薬（イムノ製，ウィー
ン）および試験すべき試料（いずれも氷槽中で予備冷却
したもの）と共に１＋１＋１の比率で３７℃で１分間イ
ンキュベートした。次に１体積の０．０５Ｍ ＣａＣｌ
２溶液を加え、試験混合物の凝固時間を球面凝固測定器
（アメルング製）モデルＫＣ−４を用いて決定した。試
験する製剤を７ｇ ＮａＣｌ／ｌおよび６ｇ クエン酸
三ナトリウム二水和物／ｌからなる緩衝液で１：１０に
さらに希釈し、この濃度での試験に使用した。これらの
条件下で、高度に精製された因子ＩＩを単独で、あるい
は高度に精製された因子Ｘａと組み合わせて、あるいは
抗トロンビンＩＩＩおよびヘパリンと組み合わせて、試
験した。凝固時間を次の表に示す。
【００８４】☆
【表２】 対照として、試験試料の凝固時間を純粋な塩化ナトリウ
ムクエン酸三ナトリウム緩衝液で決定した。これは１４
８秒であった。このように阻害因子血漿の凝固時間は単
に因子ＩＩ／Ｘａを添加するだけで、抗トロンビンＩＩ
Ｉまたはヘパリンが存在してもしなくても、著しく減少
した。因子ＶＩＩＩ阻害因子患者を処置するための従来
の製剤であるＦＥＩＢＡ標準製剤（ＦＥＩＢＡ ＳＴＩ
Ｍ ４，イムノ製）を様々な濃度で同じ試験試料中で測
定することにより、１０Ｕ／ｍｌ−因子ＩＩと０．１Ｕ
−因子Ｘａ／ｍｌを含有する製剤のＦＥＩＢ活性が約２
５Ｕ−ＦＥＩＢＡ／ｍｌに相当することがわかった。
【００８５】実施例１４：因子ＶＩＩＩ阻害因子血友病
の生体内効果 本発明製剤の生体内効力を試験するため、因子ＶＩＩＩ
阻害因子血友病ウサギモデルを使用した。体重約２ｋｇ
の白ニュージーランドウサギを麻酔した。麻酔の発効
後、各右大腿部静脈を用意し、永続的静脈進入路を確保
した。これを通して体重１ｋｇあたり０．５ｍｌのヒト
因子ＶＩＩＩ阻害因子血漿（１５００ＢＵ／ｍｌ）を10
分間かけて注入した。注入終了時点の３０分後に、Ｇｉ
ｌｅｓら，Ｂｌｏｏｄ ６０：７２７−７３０（１９８
２）の改良法を用いて出血特性を決定した。このため
に、ウサギの後足の爪の周りの毛を剃ることにより、後
の出血時に出てきた血液が毛に吸収されるのを防止し
た。爪切りを用いて爪の角皮を損傷し、その後ただち
に、血液が毛細管現象によってフィルターに吸い上げら
れることなくフィルター上に直接滴るようにフィルター
をその下に置き、形成する血液凝固が破壊されることを
防止した。そのフィルターユニットを２分毎に交換し、
出てきた血液を一部づつ集めた。血液を３０分間集め続
けた後、出血が止まっていない場合は創傷を焼灼した。
出血特性を定量するため、各フィルターを０．０４％水
酸化アンモニウム溶液で5時間抽出し、それによって血
液の付いたフィルター上に集められた赤血球を溶解し
た。１０分間の超音波処理によってヘモグロビンを抽出
し、４１６ｎｍで測光法的に較正曲線に対して定量し
た。較正曲線は１０μｌ〜１ｍｌのウサギ血液をフィル
ター上にのせ、そのフィルターを上述のように抽出し、
４１６ｎｍでヘモグロビンを測光法的に決定することに
よって確立した。２分毎の血液量を時間に対してグラフ
的にプロットすることによって爪切断の出血特性を決定
した。評価のため、個々の血液画分の体積を時間に対し
てグラフ的にプロットすることによって、蓄積した血液
損失を決定した。１０〜２０分の累積出血の傾斜を関連
する出血規準とした。この値は爪切断に依存してウサギ
間で変動する初期出血量には依存しない。１０〜２０分
の観測期間における出血特性の増大を出血強度の尺度と
した。ゼロに等しい増加は出血が停止していることを意
味し、相関係数＞０．８を伴う＞０の増加は一定の出血
があることを意味した。この試験条件下で、健康なウサ
ギは＜２μｌ血液／分の出血強度を持った。因子ＶＩＩ
Ｉ阻害因子ウサギは約５０μｌ血液／分の出血強度を示
した（図６参照）。実施例３の因子ＩＩ製剤を３０分か
けて７５Ｕ／ｋｇ体重の投与量で注入した因子ＶＩＩＩ
阻害因子ウサギは９．３μｌ／分の平均（ｎ＝６）出血
強度（つまり処置していない阻害因子動物と比較して有
意な減少）を示した。
【００８６】実施例１５：フォン・ウィレブラント因子
／因子ＶＩＩＩ阻害因子の場合の生体内効果 実施例１４と同様に、１ｍｌ／ｋｇ体重の投与量の精製
因子ＶＩＩＩ／フォン・ウィレブラント因子製剤でヤギ
を免疫感作することによって回収したヤギ由来の抗フォ
ン・ウィレブラント因子／因子ＶＩＩＩ抗血漿をウサギ
に注入することにより、フォン・ウィレブラント因子／
因子ＶＩＩＩ阻害因子モデルを確立した。このような予
備処置動物は増大した出血強度を示す（図７参照）。試
験物質の注入と同時、もしくは試験物質注入終了の30分
後に、これらの動物に爪切断を施すことによって出血特
性を測定した。因子ＩＩを投与量７５Ｕ／ｋｇのボーラ
ス２．５ｍｌとして投与することにより、最初に増大し
た出血強度を７７μｌ／分から３１μｌ／分（第１回爪
切断）および１２μｌ／分（第２回爪切断）へ減少させ
ることができた。因子ＩＩ（７５Ｕ／ｋｇ）を投与量
０．５５Ｕ／ｋｇの因子Ｘａｂ（実施例４に従って調
製）と注射体積２．５ｍｌのボーラスとして組み合わせ
ることにより、出血の傾向を初期値から第１回爪切断時
の１８μｌ／分および第2回爪切断時の５μｌ／分へ減
少させることができた。このように阻害因子動物の異常
に増大した出血特性が健康な対照動物のレベル（４μｌ
／分）にまで正常化した。
【００８７】さらに因子ＩＩ（７５Ｕ／ｋｇ）、因子Ｘ
ａ（０．５５Ｕ／ｋｇ）および抗トロンビンＩＩＩ（イ
ムノ製，ウィーン）（７５ｍＵ／ｋｇ）の組み合わせを
も同じモデルで試験した。第１回の爪切断時には３５μ
ｌ／分への減少が、第２回の爪切断時には７μｌ／分へ
の減少が達成された（図８参照）。抗トロンビンＩＩＩ
の添加は、投与された溶液中の酵素因子Ｘａゆえにプロ
トロンビンからトロンビンが生成するのを防止するはず
である。
【００８８】実施例１６：本発明製剤の凝塊形成性 ヴェスラー，Ｊ．Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． １４：９４
３−９４６（１９５９）に記載の方法を用い、鬱血状態
にあるウサギの静脈血で、本発明製剤の個々の成分およ
びそれらの混合物を、その凝塊形成活性について試験し
た。ウサギをペントバルビタールで麻酔し、その動物の
頸静脈を切開し、１〜２ｃｍの距離に緩い結紮を施し
た。試験する物質を切開した頸静脈とは反対側の耳静脈
中に注射した。注射を15秒以内に行った。１０〜１５秒
の待機時間の後、上記静脈区分をクランプで圧迫した。
さらに１０分後、クランプで圧迫した静脈区分を取り出
し、ペトリ皿内のクエン酸化緩衝液中で切り開き、得ら
れた血栓を評点で０から４に評価した（表参照）。
【００８９】☆
【表３】 ７５Ｕ−因子ＩＩ／ｋｇ、０．５５Ｕ−因子Ｘａ／ｋｇ
および７５ｍＵ−抗トロンビンＩＩＩ／ｋｇをそれぞれ
単独で、あるいは組み合わせて投与した動物６匹で各物
質を試験した。次の表は試験した各６匹の動物のヴェス
ラー評点の平均値を表す。希釈緩衝液としても使用した
純粋なクエン酸化緩衝液を対照として用いた。
【００９０】☆
【表４】 使用した成分はいずれも、単独でも組み合わせても、ウ
サギ内で凝塊形成活性を持たないことが立証された。
【００９１】実施例１７：投与形態による本発明製剤の
作用 因子ＩＩと因子Ｘａを含有する実施例６の製剤を、誘発
された因子ＶＩＩＩ阻害因子血友病（実施例１４参照）
を持つ６匹のウサギにおけるその効力について試験し
た。試験した投与量は実施例１５に記載の通りであっ
た。対照として、動物に純粋な緩衝液を注入した。第１
回の試験では、自動注入ポンプを用い、１ｍｌ／分の注
入速度で、試験物質の注入を３０分かけて行った。これ
は約１５分／ｋｇ体重に相当する。第２回の試験では、
同じ投与量を小さい注射体積２．５ｍｌ／ｋｇで３０秒
以内にボーラスとして動物に投与した。実施例１４のご
とく、物質投与の間もしくはその後に出血強度を測定し
た。大注入体積の遅い注入でも、あるいは小体積投与の
迅速な注射でも、体重あたりの投与量が同一である場
合、病理学的に拡大した出血傾向６７μｌ／分を健康な
対照動物の出血特性に対応する５μｌ／分にまで正常化
できることが立証された。緩衝液の投与では２つの注入
形態のいずれでも出血強度の変化は認められなかった。
ボーラスとしての迅速な注射にもかかわらず、注射中に
不耐性反応は観測できず、遅い注入中にもそうであっ
た。同様の適応症の市販製剤（活性化プロトロンビン複
合体製剤）については、急性の血栓塞栓副作用と不耐性
反応を避けるため、＜０．０５ｍｌ／分／ｋｇ体重の範
囲の注入速度が推奨されている。この試験が示すよう
に、本発明の製剤は、その高純度ゆえに何らの副作用を
も伴うことなく、５ｍｌ／分／ｋｇ体重（すなわち１０
０倍の注射速度）で投与することができた。
【００９２】実施例１８:血小板欠損を示すラットにお
ける部分的プロトロンビナーゼの作用 Ｔ．Ｂ．ＴｓｃｈｏｐｐおよびＭ．Ｂ．Ｚｕｃｋｅｒ
（「ラットにおける血小板機能の遺伝性欠損」，Ｂｌｏ
ｏｄ １９７２；４０：２１７−２２６）に記載のファ
ウン−フーデット（Ｆａｗｎ−Ｈｏｏｄｅｄ）ラットを
血栓血小板症モデルとして使用する。Ｓ．Ｌ．Ｒａｙｍ
ｏｎｄおよびＷ．Ｊ．Ｄｏｄｄｓ（「止血研究用モデル
としてのファウン−フーデット・ラットの特徴づけ」，
Ｔｈｒｏｍｂｏｓ Ｄｉａｔｈｅｓ．ｈａｅｍｏｒｒ
ｈ．１９７５；３３：３６１−３６９）によってさらに
特徴づけられているこのラット株は、異常に増大した出
血時間と減少した血小板凝集によって特徴づけられ、一
方、プロトロンビン時間、部分的トロンボプラスチン時
間、血漿因子ＶＩＩＩおよびフィブリノーゲンレベルな
らびに血小板数は健康なラットと同じ範囲にある。ファ
ウン−フーデットラットに生じる血小板症は減少したト
ロンビン誘発性ＡＴＰおよびＡＤＰ放出ならびに減少し
たセロトニン放出を伴うので、ヒトにおける「貯蔵欠乏
症」を反映して「貯蔵欠乏症」と特徴づけられる。
【００９３】ファウン−フーデットラットをケタミン−
キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉
内注射で麻酔する。頸静脈内にカテーテルを挿入し、そ
れを通して試験物質を注入する。次いでシンプレートＲ
使い捨て血液ランセット（オルガノン・テクニカ製）を
用いて出血時間を決定する。尾の付け根から約１．５ｃ
ｍの位置に１つの背面縦切開とそれに続く1つの腹面縦
切開を施し、出血時間を測定する。２つの個別の測定の
平均値を出血時間とする。次に試験物質（緩衝液、実施
例２の因子ＩＩ、実施例４の因子Ｘａ、実施例６の部分
的プロトロンビナーゼ）を適用する。３０分後に出血時
間を再び決定する。健康なスプラグ−ドーリー・ラット
（チャールス・リバー社）を対照として使用する。
【００９４】試験は各１０匹の動物からなる群で行い、
部分的プロトロンビナーゼの複合体は２つの投与量（７
５Ｕ／ｋｇ体重（ＢＷ）プロトロンビンおよび０．５５
Ｕ／ｋｇＢＷ因子Ｘａならびに１５０Ｕ／ｋｇＢＷプロ
トロンビンおよび１．１Ｕ／ｋｇＢＷ因子Ｘａ）で投与
する。対照として、個々の成分と緩衝液を投与する。個
々の試験群で測定した平均出血時間を次の表に示す。健
康なラットは同じ試験条件下で１６８±5秒の出血時間
を持ち、血小板障害にかかっているラットは３３５±１
０秒の増大した出血時間を持つ。部分的プロトロンビナ
ーゼの投与によって、この異常に増大した出血時間を約
２７０秒に減少させることができる。
【００９５】☆
【表５】 統計学的評価：データは平均値±標準偏差として記して
ある。群平均値をスチューデントＴ検定を用いて比較し
た。 ｎ．ｄ．＝決定しなかった ｎｓ＝対照群（０Ｕ／ｋｇ ＦＩＩおよび０Ｕ／ｋｇ
ＦＸａ）に対して有意でない相違。 ※＝対照群（０Ｕ／ｋｇ ＦＩＩおよび０Ｕ／ｋｇ Ｆ
Ｘａ）に対してｐ≧９５％で有意な相違。 ※※※＝対照群（０Ｕ／ｋｇ ＦＩＩおよび０Ｕ／ｋｇ
ＦＸａ）に対してｐ≧９９．９％で有意な相違。
【００９６】実施例１９：フォン・ウィレブラント因子
欠乏イヌにおける部分的プトロンビナーゼの作用 測定できないフォン・ウィレブラント因子活性および抗
原血漿レベルならびに５０％減少した因子ＶＩＩＩ血漿
濃度を持つ先天的フォン・ウィレブラント因子欠乏症を
示すイヌを投与量１００Ｕ／ｋｇＢＷの部分的プロトロ
ンビナーゼで処置する。このためにイヌを麻酔した後、
実施例６に従って製造した部分的プロトロンビナーゼを
静脈内にボーラスとして与える。試験物質投与の直前
と、注入の１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、
２４時間および４８時間後に、血液試料を採取し、それ
から血漿を調製し、その血漿試料中のプロトロンビン、
トロンビンおよび因子ＶＩＩＩ濃度を決定する。
【００９７】部分的プロトロンビンの投与前と、注射の
３および２４時間後に、角皮出血特性を決定する。この
ためにＡ．Ｒ．Ｇｉｌｅｓ，Ｓ．Ｔｉｎｌｉｎおよび
Ｒ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，「血友病（因子ＶＩＩＩ：Ｃ
欠乏症）出血のイヌモデル」，Ｂｌｏｏｄ １９８２：
６０の方法を改良して使用する。後の出血時に出てくる
血液が毛に吸収されるのを防止するために爪の周囲の毛
を剃る。爪切りで爪を損傷する。その後ただちに、血液
が毛細管効果によってフィルターに吸い上げられること
なくフィルター上に直接滴るようにフィルター（ピペッ
トマンＰ５０００保護フィルター，ギルソン製）を創傷
の下に置き、形成する血液凝固が破壊されることを防止
する。そのフィルターユニットを２分毎に交換し、出て
きた血液を一部づつ集めた。血液を３０分間集め続けた
後、出血が止まっていない場合は創傷を焼灼した。同じ
動物の異なる爪を使用することができる。
【００９８】出血特性を定量するため、各フィルター上
に分けて集められた血液を０．０４％水酸化アンモニウ
ム溶液５ｍｌで5時間抽出し、それによって血液の付い
たフィルター上に集められた赤血球を溶解する。１０分
間の超音波処理（ソノレックスＲＫ１００，バンデリン
・エレクトロニック製，ベルリン）によってヘモグロビ
ンを抽出し、４１６ｎｍで測光法的に較正曲線に対して
定量した。較正曲線は１０μｌ〜１ｍｌのイヌ血液をフ
ィルター上にのせ、そのフィルターを上述のように抽出
し、４１６ｎｍでヘモグロビンを測光法的に決定するこ
とによって確立できる。そのようにして直線的較正曲線
を確立することができ、それによってヘモグロビン濃度
をフィルターあたりの血液量について直接的に計算でき
る。２分毎の血液量を時間に対してグラフ的にプロット
することによって爪切断の出血特性を決定する。出血特
性の評価のため、個々の血液画分を時間に対して相加的
にグラフ化することによって、蓄積した血液損失を決定
する。１０〜２０分の累積出血の増大を関連する出血規
準とした。この値は標準化しにくい爪切断技術ゆえに変
化に富む初期血液量には依存しない。１０〜２０分の観
測期間における出血特性の増大は出血強度の尺度とな
り、これをｍｌ血液／分で表す。ゼロに等しい増加（０
ｍｌ／分に対応する）は出血が停止していることを意味
し、相関係数＞０．８を伴う＞０の増加は一定の出血が
あることを意味する。これらの条件下で試験した正常な
イヌは観測期間中に出血を示さない。すなわち出血は既
に停止している（出血強度：０．０１ｍｌ／分）。
【００９９】部分的プロトロンビナーゼの投与前には出
血強度が１．０５ｍｌ／分であり、３時間後ではそれが
０．３５ｍｌ／分に減少し、２４時間後ではさらに０．
４７ｍｌ／分に減少した。因子ＶＩＩＩ血漿レベルは観
測期間中ずっと一定のままであり、フォン・ウィレブラ
ント抗原は検出限界未満のままであった。プロトロンビ
ンは物質投与前に０．７Ｕ／ｍｌで、部分的プロトロン
ビナーゼの注射後は２．４Ｕ／ｍｌに上昇し、約２４時
間の半減期で循環から除去された。試験物質投与の1時
間後に、トロンビンＴｈ１の発色原試薬（イムノ製）で
有意な血栓生成が決定できた。イヌは部分的プロトロン
ビナーゼの注射に耐性であり、何らの副作用をも伴わな
かった。
【０１００】実施例２０：フォン・ウィレブラント因子
欠乏症イヌにおける部分的プロトロンビナーゼおよびフ
ォン・ウィレブラント因子の作用 実施例１９と同様に、イヌを投与量１００Ｕ／ｋｇＢＷ
の部分的プロトロンビナーゼと投与量６０ＲＣｏＦ Ｕ
／ｋｇＢＷの精製フォン・ウィレブラント因子で処置し
た。この組み合わせの投与はフォン・ウィレブラント因
子欠乏症イヌにおける異常に増大した出血特性を２４時
間後に完全に正常化する（その血漿パラメーターはプロ
トロンビンおよびトロンビンに関して実施例１９と同等
である）。そのうえ内因性因子ＶＩＩＩは初期値の約２
００％に増大し、それは４８時間以上にわたって一定を
保った後、約１２０時間かけて初期値に戻った。フォン
・ウィレブラント因子は２０時間の半減期で除去され
た。文献（Ｌ．Ｄｒｏｕｅｔ、Ｊ．Ｒｏｕｓｓｉ、Ｍ．
Ｂｏｎｎｅａｕ、Ｇ．Ａ．Ｐｉｇｎａｕｄ、Ｐ．Ｌ．Ｔ
ｕｒｅｃｅｋ、Ｆ．Ｄｏｒｎｅｒ、Ｕ．Ｓｃｈｌｏｋａ
ｔ、Ｆ．Ｇ．Ｆａｌｋｎｅｒ、Ｂ．Ｆｉｓｃｈｅｒ、
Ａ．ＭｉｔｔｅｒｅｒおよびＨ．Ｐ．Ｓｃｈｗａｒｚ，
「重篤なフォン・ウィレブラント病を持つブタにおける
組換えヒトフォン・ウィレブラント因子の効果」，Ｂｌ
ｏｏｄ １９９５；８６：６１２ａ−ＡｂｓＮｏ．２４
３５（ａｂｓ））によれば、フォン・ウィレブラント因
子単独の投与は出血特性の部分的な正常化しかもたらさ
ないことが知られている。
【０１０１】実施例２１：ペプチド抗凝固剤のアンタゴ
ニストとしての部分的プロトロンビナーゼの作用 ５７Ｕの因子ＩＩおよび１．２Ｕの因子Ｘａの組成から
なる部分的プロトロンビナーゼを１５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に
溶解し、複合体形成のため室温で１５分間インキュベー
トした。次にその５０μｌを取り、５０μｌのトリス−
イミダゾール緩衝液（ｐＨ８．４）と共に３７℃で９０
秒間インキュベートした。次にそれを発色原基質アラニ
ル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドヒ
ドロ酢酸メトキシ−カルボニル−Ｄ−シクロヘキシルの
溶液１００μｌと発色原基質の濃度が１ｍｍｏｌ／ｌに
なるように混合した。次に発色原基質の切断速度を３７
℃で３分間、４０５ｎｍで測光法的に決定した。トロン
ビンと因子Ｘａの両方によって加水分解される発色原基
質は、部分的プロトロンビナーゼと共にインキュベート
した場合に、０．０８４のΔＯＤ／分を持った。対照と
して同じ濃度の因子Ｘａをプロトロンビンなしでこの試
験に用いると、発色原基質の変換速度が０．０６４ΔＯ
Ｄ／分になった。濃度０．００２５Ｕ／ｍｌの組換えヒ
ルジン（レイン−バイオテック製）を部分的プロトロン
ビナーゼに加えて、発色原基質の変換速度を調べた。純
粋な因子Ｘａの基質変換速度（０．０６４ΔＯＤ／分）
を差し引くと基質変換はもはや測定されないことがわか
った。これはヒルジンの完全な中和による。
【０１０２】効果的で特異的な血栓阻害因子ヒルジンの
他に、選択的な因子Ｘａ阻害因子である組換えダニ抗凝
固ペプチド（オルニトドロス・モウバタ（南アフリカ産
のヒメダニ）のセリンプロテアーゼ阻害因子の組換え等
価物であり、その生体内抗凝固効力はＧ．Ｐ．Ｖｌａｓ
ｕｋ，Ｄ．Ｒａｍｊｉｔ，Ｔ．Ｆｕｊｉｔａら，「静脈
血栓症のウサギモデルにおける標準ヘパリンと高度に選
択的な因子Ｘａ阻害因子アンチスタシンおよびダニ抗凝
固ペプチド（ＴＡＰ）の生体内抗凝固特性の比較」，Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ １９９１；６
５：２５Ｗ−２６２）に記述されている）を５０μｇ／
ｍｌの濃度で加えた。組換えダニ抗凝固ペプチド添加の
３０分後には、上記発色原基質で酵素活性はもはや測定
できなかった。この試験は部分的プロトロンビナーゼが
ペプチド抗凝固剤ヒルジンおよびダニ抗凝固ペプチドの
効果的なアンタゴニストであることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明製剤の考えうる投与形態を表す図であ
る。
【図２】 本発明製剤の考えうる投与形態を表す図であ
る。
【図３】 本製造法の一態様のフローチャートである。
【図４】 部分的プロトロンビナーゼ複合体を立証する
図である。
【図５】 標準的製剤である活性化プロトロンビン複合
体（Ｂ）、プロトロンビン複合体（Ｃ）と比較した本発
明製剤の一例（Ａ）の分光測光法的分析結果を示す図で
ある。
【図６】 因子ＶＩＩＩ阻害因子ウサギに対する因子Ｉ
Ｉ製剤の生体内効果を示す図である。
【図７】 フォン・ウィレブラント因子／因子ＶＩＩＩ
阻害因子モデルにおける本発明製剤の生体内効果を示す
図である。
【図８】 フォン・ウィレブラント因子／因子ＶＩＩＩ
阻害因子モデルにおける本発明製剤の生体内効果を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＣＡ Ｇ０１Ｎ 33/86 47/48 Ａ６１Ｋ 37/475 ＡＤＱ Ｇ０１Ｎ 33/86 37/64 (72)発明者 ハンス−ペーター・シュヴァルツ オーストリア、アー−1180ヴィーン、シン ドラーガッセ32番 (72)発明者 ヨハン・アイブル オーストリア、アー−1180ヴィーン、グス タフ−チェルマークガッセ２番

Claims (55)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロトロンビナーゼまたはプロ−プロト
    ロンビナーゼの成分である少なくとも２つの凝固因子を
    含有し、リン脂質を含まない血液凝固疾患処置用医薬製
    剤。
  2. 【請求項２】 該因子の少なくとも１つが活性化されて
    いることを特徴とする請求項１の製剤。
  3. 【請求項３】 因子ＩＩ、Ｖ、Ｖａ、ＸおよびＸａから
    なる群より選択される少なくとも２つの凝固因子を含有
    することを特徴とする請求項１または２の製剤。
  4. 【請求項４】 実質上因子ＩＩおよびＶまたはＶａから
    なることを特徴とする請求項１から３のいずれかの製
    剤。
  5. 【請求項５】 実質上因子ＸおよびＶまたはＶａからな
    ることを特徴とする請求項１から３のいずれかの製剤。
  6. 【請求項６】 実質上因子ＩＩおよびＸまたはＸａ（任
    意に因子ＶまたはＶaを伴ってもよい)からなることを特
    徴とする請求項１から３のいずれかの製剤。
  7. 【請求項７】 凝固因子類が複合体として存在すること
    を特徴とする請求項１から６のいずれかの製剤。
  8. 【請求項８】 マグネシウムイオンを含有することを特
    徴とする請求項１から７のいずれかの製剤。
  9. 【請求項９】 遊離のカルシウムイオンを一切含まない
    ことを特徴とする請求項１から８のいずれかの製剤。
  10. 【請求項１０】 遊離カルシウムイオン錯化用キレート
    剤を含有することを特徴とする請求項９の製剤。
  11. 【請求項１１】 精製されたプロトロンビンと精製され
    た因子Ｘａを活性成分として含有し、リン脂質を含まな
    いことを特徴とする請求項１から３および６から１０の
    いずれかの製剤。
  12. 【請求項１２】 本質的にプロトロンビンおよび因子Ｘ
    ａからなることを特徴とする請求項１１の製剤。
  13. 【請求項１３】 少なくとも１５０Ｕ−プロトロンビン
    ／kgの投与量で、血栓塞栓副作用を伴わないこと（これ
    はヴェスラー血栓症モデルにおいて評点が最大３である
    ことによって表される）を特徴とする請求項１１または
    １２の製剤。
  14. 【請求項１４】 プロトロンビンを少なくとも５Ｕ／ｍ
    ｇ−タンパク質の比活性で含有することを特徴とする請
    求項１１から１３のいずれかの製剤。
  15. 【請求項１５】 因子Ｘａを少なくとも１００Ｕ／ｍｇ
    −タンパク質の比活性で含有することを特徴とする請求
    項１１から１４のいずれかの製剤。
  16. 【請求項１６】 因子Ｘａを主に因子Ｘａβとして含有
    することを特徴とする請求項１１から１５のいずれかの
    製剤。
  17. 【請求項１７】 プロトロンビンと因子Ｘａが複合体と
    して存在することを特徴とする請求項１１から１６のい
    ずれかの製剤。
  18. 【請求項１８】 さらに安定化量の抗トロンビンIII
    （任意にヘパリンを伴ってもよい）を含有することを特
    徴とする請求項１から１７のいずれかの製剤。
  19. 【請求項１９】 精製されたプロトロンビンを単独の活
    性成分として含有する製剤であって、とりわけ液剤また
    は液体急速凍結製剤の形の製剤。
  20. 【請求項２０】 生物学的に活性な精製プロトロンビン
    を含有する血液凝固疾患処置用製剤。
  21. 【請求項２１】 少なくとも１５０Ｕ−プロトロンビン
    ／ｋｇの投与量で血栓塞栓副作用を伴わない（これはヴ
    ェスラー血栓症モデルにおいて最大３の評点によって表
    される）ことを特徴とする請求項１９または２０の製
    剤。
  22. 【請求項２２】 ０．１Ｕ／Ｕ−プロトロンビン未満の
    因子ＶＩＩＩ：Ｃまたは因子ＶＩＩＩ：Ａｇを含有する
    ことを特徴とする請求項１１から２１のいずれかの製
    剤。
  23. 【請求項２３】 ０．１Ｕ／Ｕ−プロトロンビン未満の
    因子ＩＸを含有することを特徴とする請求項１１から２
    ２のいずれかの製剤。
  24. 【請求項２４】 ０．１Ｕ／Ｕ−プロトロンビン未満の
    因子Ｘを含有することを特徴とする請求項１１から２３
    のいずれかの製剤。
  25. 【請求項２５】 ０．０１ｍｇ／Ｕ−プロトロンビン未
    満のリン脂質を含有することを特徴とする請求項１１か
    ら２４のいずれかの製剤。
  26. 【請求項２６】 少なくとも５０Ｕ−プロトロンビン／
    ｋｇ−体重の投与量を与え、任意にボーラス注射も可能
    である濃度の請求項１１から２５のいずれかの製剤。
  27. 【請求項２７】 ５０〜５００Ｕ−プロトロンビン／ｋ
    ｇ−体重の投与量を与える濃度の請求項２６の製剤。
  28. 【請求項２８】 凝固因子類が組換えＤＮＡ技術によっ
    て製造されることを特徴とする請求項１から２７のいず
    れかの製剤。
  29. 【請求項２９】 好ましくは光学的に透明な溶液に再構
    成されうる凍結乾燥物として存在することを特徴とする
    請求項１から２８のいずれかの製剤。
  30. 【請求項３０】 適当な適用装置中に、好ましくは医薬
    的に許容される溶液でのインサイトゥー再構成が可能な
    注射器中の凍結乾燥物として、存在することを特徴とす
    る請求項１から２９のいずれかの製剤。
  31. 【請求項３１】 ウイルスを不活化するか、ウイルス力
    価を減少させるために処理されることを特徴とする請求
    項１から３０のいずれかの製剤。
  32. 【請求項３２】 プロトロンビン、因子Ｘａおよび任意
    に因子ＶまたはＶａからなる複合体。
  33. 【請求項３３】 プロトロンビンおよび因子ＶまたはＶ
    ａからなる複合体。
  34. 【請求項３４】 因子Ｘおよび因子ＶまたはＶａからな
    る複合体。
  35. 【請求項３５】 請求項３２から３４のいずれかの複合
    体と、さらにカルシウムイオンを含有する製剤。
  36. 【請求項３６】 さらにトロンビンを含み、任意にリン
    脂質を含有することを特徴とする診断用の請求項３５の
    製剤。
  37. 【請求項３７】 プロトロンビン複合体濃縮物をクロマ
    トグラフィー精製にかけ、そのプロトロンビン含有画分
    を医薬製剤に加工することを特徴とする精製医薬プロト
    ロンビン製剤の製造法。
  38. 【請求項３８】 下記の操作の組み合わせによって特徴
    づけられる請求項３７の方法： ・プロトロンビン複合体調製物を固体状態で、あるいは
    プロトロンビン含有溶液として準備する、 ・好ましくは熱処理によるウイルス不活化処理、 ・任意に該プロトロンビン複合体調製物を溶解すること
    によりプロトロンビン含有溶液を得る、 ・任意に、該プロトロンビン含有溶液を固形担体として
    のアルカリ土類塩で処理することによりプロトロンビン
    を吸着した後、脱着する、 ・任意に、好ましくは該プロトロンビン含有溶液の沈殿
    または限外ろ過／ダイアフィルトレーションとゲルろ過
    による、１回または複数回の濃縮、 ・該プロトロンビン含有溶液を陰イオン交換剤で処理す
    ることよりプロトロンビンを吸着した後、選択的に脱着
    する、 ・該プロトロンビン含有溶液を疎水性クロマトグラフィ
    ー材料で処理する、 ・該プロトロンビン含有溶液を医薬製剤に仕上げる。
  39. 【請求項３９】 少なくとも１５０Ｕ−プロトロンビン
    ／ｋｇの投与量において血栓塞栓副作用を伴わず（これ
    はヴェスラー血栓症モデルにおいて最大３の評点によっ
    て表される）、凍結乾燥物として最大１分の再構成時間
    で少なくとも１０Ｕ−プロトロンビン／ｍｌの活性を有
    する透明溶液に再構成され得ることを特徴とする請求項
    ３７または３８の方法によって得られるプロトロンビン
    製剤。
  40. 【請求項４０】 患者血液中に超平均的プロトロンビン
    濃度を確立するための医薬製剤を製造するための精製プ
    ロトロンビナーゼ因子類、とりわけ精製プロトロンビン
    および任意に精製因子Ｘａの使用。
  41. 【請求項４１】 該超平均的プロトロンビン濃度が少な
    くとも１．５Ｕ−プロトロンビン／ｍｌ−血液、好まし
    くは少なくとも２Ｕ／ｍｌに達する請求項４０の使用。
  42. 【請求項４２】 因子ＶＩＩＩ阻害因子状態、血友病Ａ
    またはＢもしくはフォン・ヴィレブラント病処置用医薬
    製剤を製造するための精製プロトロンビナーゼ因子類、
    とりわけ精製プロトロンビンおよび任意に精製因子Ｘａ
    の使用。
  43. 【請求項４３】 非血友病患者における急性出血、増大
    した出血強度または増大した出血危険性を処置するため
    の医薬製剤を製造するためのプロトロンビナーゼまたは
    プロ−プロトロンビナーゼの成分である少なくとも２つ
    の凝固因子の使用。
  44. 【請求項４４】 血小板障害がもたらす出血の処置用医
    薬製剤を製造するための請求項４３の使用。
  45. 【請求項４５】 ヘパリンが誘発する血小板減少症の処
    置用医薬製剤を製造するための請求項４３または４４の
    使用。
  46. 【請求項４６】 該医薬製剤が一次的止血活性を含有す
    ることを特徴とする請求項４３から４５のいずれかの使
    用。
  47. 【請求項４７】 プロトロンビナーゼまたはプロ−プロ
    トロンビナーゼの成分であり、リン脂質を含まない少な
    くとも2つの凝固因子と、さらに一次的止血活性を有す
    るタンパク質（とりわけｖＷＦ）とを含有する血液凝固
    疾患患者処置用医薬製剤。
  48. 【請求項４８】 成分：ａ）プロトロンビナーゼまたは
    プロ−プロトロンビナーゼの成分であり、リン脂質を含
    まない少なくとも2つの凝固因子を含有する医薬製剤、
    ｂ）一次的止血活性を有するタンパク質（とりわけｖＷ
    Ｆ）、を含有する血液凝固疾患患者処置用キット。
  49. 【請求項４９】 抗凝血薬治療の間の出血処置用医薬製
    剤を製造するための請求項４３から４５のいずれかの使
    用。
  50. 【請求項５０】 凝固阻害因子または抗凝血薬もしくは
    栓球機能阻害因子の解毒薬としての医薬製剤を製造する
    ための請求項４９の使用。
  51. 【請求項５１】 該凝固阻害因子または抗凝血薬が、Ａ
    ＰＡＰ、ベンズアミジン誘導体、ヒルジン、ヘパリン、
    ヘパリン類縁体（とりわけ五糖類）、ＡＴＩＩＩヘパリ
    ン複合体、ＡＴ ＩＩＩ、アンチスタシン、ダニ抗凝血
    ペプチド、不活性凝固因子（とりわけ活性部位阻害凝固
    因子）、ＴＦＰＩ、栓球膜表面受容体の拮抗配位子（と
    りわけＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体）および遺
    伝操作的または合成的に製造されるそれらの類縁体（と
    りわけペプチド）ならびに経口抗凝血薬からなる群より
    選択されることを特徴とする請求項５０の使用。
  52. 【請求項５２】 栓球機能阻害因子がチクロピジンまた
    はアセチルサリチル酸であることを特徴とする請求項５
    ０の使用。
  53. 【請求項５３】 成分： ａ）凝固阻害因子または抗凝血薬もしくは栓球機能阻害
    因子、および、 ｂ）請求項１から３６のいずれかの医薬製剤、を含む患
    者の抗凝血薬治療用キット。
  54. 【請求項５４】 頭蓋内出血（とりわけトロンビン生成
    欠陥の場合）処置用医薬製剤を製造するための請求項４
    ３の使用。
  55. 【請求項５５】 未成熟な幼児を処置するための請求項
    ５４の使用。
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