JPH0912598A - ヘモグロビンの分離精製方法 - Google Patents
ヘモグロビンの分離精製方法Info
- Publication number
- JPH0912598A JPH0912598A JP7163599A JP16359995A JPH0912598A JP H0912598 A JPH0912598 A JP H0912598A JP 7163599 A JP7163599 A JP 7163599A JP 16359995 A JP16359995 A JP 16359995A JP H0912598 A JPH0912598 A JP H0912598A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemoglobin
- liquid
- substance
- polyallylamine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 従来よりも、短時間で、簡単に、高収率で血
液等から、ヘモグロビンを分離精製する方法を提供す
る。 【構成】 ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン
酸ポケットに対して結合性を有する物質（例、ポリアリ
ルアミンのホスホン酸誘導体）とヘモグロビン含有液と
を、ｐＨ５．０〜６．８の液体中で接触させて、該物質
にヘモグロビンが結合された水不溶性の複合体を生成さ
せる工程、該複合体を該液体から分離する工程、及び、
分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触
させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体
に接触させて、該物質とヘモグロビンを解離させる工程
からなることを特徴とする。
液等から、ヘモグロビンを分離精製する方法を提供す
る。 【構成】 ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセリン
酸ポケットに対して結合性を有する物質（例、ポリアリ
ルアミンのホスホン酸誘導体）とヘモグロビン含有液と
を、ｐＨ５．０〜６．８の液体中で接触させて、該物質
にヘモグロビンが結合された水不溶性の複合体を生成さ
せる工程、該複合体を該液体から分離する工程、及び、
分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触
させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体
に接触させて、該物質とヘモグロビンを解離させる工程
からなることを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヘモグロビンの分離精
製方法に関する。
製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘモグロビンは、血色素として酸素運搬
にあずかる、ヘムとグロビンから構成される複合糖蛋白
質であり、古くから、生理学、生化学、分子生物学の分
野で最もよい研究素材の一つとして用いられてきてい
る。また、ヘモグロビンは、臨床検査化学の分野では、
種々の病態把握のための検査項目として広く測定されて
おり、治療医学の分野では、代替人工赤血球の材料とし
ても用いられるようになってきている。そのため、この
ように、利用価値の高いヘモグロビンを血液から簡単
に、高収率で得る技術が望まれている。
にあずかる、ヘムとグロビンから構成される複合糖蛋白
質であり、古くから、生理学、生化学、分子生物学の分
野で最もよい研究素材の一つとして用いられてきてい
る。また、ヘモグロビンは、臨床検査化学の分野では、
種々の病態把握のための検査項目として広く測定されて
おり、治療医学の分野では、代替人工赤血球の材料とし
ても用いられるようになってきている。そのため、この
ように、利用価値の高いヘモグロビンを血液から簡単
に、高収率で得る技術が望まれている。
【０００３】従来、ヘモグロビンの分離精製は、血液を
遠心分離等の処理によって、血球と血漿成分に分離し、
数度の遠心洗浄の後、低張塩処理などによって赤血球を
溶血させ、その後に、アルコール分画、電気泳動法、カ
ラムクロマトグラフィー法等の通常の蛋白質の分離精製
方法が採られてきた。例えば、特開昭５９−１８３３７
０号公報には、赤血球を等張塩化ナトリウム（ＮａＣ
ｌ）溶液で洗浄後、溶血させて四塩化炭素あるいは、ト
ルエンで脂質及び細胞残留物を除去する方法が開示され
ているが、このような方法は、非常に時間がかかり、熟
練を要するものであり、また収率もよくないものであっ
た。
遠心分離等の処理によって、血球と血漿成分に分離し、
数度の遠心洗浄の後、低張塩処理などによって赤血球を
溶血させ、その後に、アルコール分画、電気泳動法、カ
ラムクロマトグラフィー法等の通常の蛋白質の分離精製
方法が採られてきた。例えば、特開昭５９−１８３３７
０号公報には、赤血球を等張塩化ナトリウム（ＮａＣ
ｌ）溶液で洗浄後、溶血させて四塩化炭素あるいは、ト
ルエンで脂質及び細胞残留物を除去する方法が開示され
ているが、このような方法は、非常に時間がかかり、熟
練を要するものであり、また収率もよくないものであっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
欠点を解決するものであり、その目的は、従来よりも、
短時間で、簡単に、高収率で血液等から、ヘモグロビン
を分離精製する方法を提供することにある。
欠点を解決するものであり、その目的は、従来よりも、
短時間で、簡単に、高収率で血液等から、ヘモグロビン
を分離精製する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ヘモグロビン
の２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対して結合
性を有する物質とヘモグロビン含有液とを、ｐＨ５．０
〜６．８の液体中で接触させて、該物質にヘモグロビン
が結合された水不溶性の複合体を生成させる工程、該複
合体を該液体から分離する工程、及び、分離された複合
体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触させるか、又は
電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体に接触させて、
該物質とヘモグロビンを解離させる工程からなることを
特徴とするヘモグロビンの分離精製方法である。
の２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対して結合
性を有する物質とヘモグロビン含有液とを、ｐＨ５．０
〜６．８の液体中で接触させて、該物質にヘモグロビン
が結合された水不溶性の複合体を生成させる工程、該複
合体を該液体から分離する工程、及び、分離された複合
体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触させるか、又は
電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体に接触させて、
該物質とヘモグロビンを解離させる工程からなることを
特徴とするヘモグロビンの分離精製方法である。
【０００６】本発明の第１の工程は、ヘモグロビンの
２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対して結合性
を有する物質とヘモグロビン含有液とを、ｐＨ５．０〜
６．８の液体中で接触させて、該物質にヘモグロビンが
結合された水不溶性の複合体を生成させる工程である。
２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対して結合性
を有する物質とヘモグロビン含有液とを、ｐＨ５．０〜
６．８の液体中で接触させて、該物質にヘモグロビンが
結合された水不溶性の複合体を生成させる工程である。
【０００７】上記の、ヘモグロビンの２，３−ジホスホ
グリセリン酸ポケットについて説明する。ヘモグロビン
は、一般に、図１の模式図に示されるような、２つのα
鎖と２つのβ鎖からなる４量体構造をしており、β鎖の
会合部に２，３−ジホスホグリセリン酸が結合する部位
が存在しており、この部位は２，３−ジホスホグリセリ
ン酸ポケット（以下、ＤＰＧポケットという）と呼ばれ
ている。ＤＰＧポケットは、図１にアミノ酸残基につけ
たＮ末端からの通し番号で示したように、ヘモグロビン
のβ鎖のヒスチジン、リジンなどの塩基性アミノ酸残
基、及びβ鎖Ｎ末端バリンによって形成されるカチオン
性を帯びた部位であり、アニオン性の物質を結合し易
い。血液中の２，３−ジホスホグリセリン酸は、このＤ
ＰＧポケットに結合することにより、ヘモグロビンの酸
素解離能をアロステリックに調節していることが知られ
ている（今井清博、蛋白質、核酸、酵素、Vol.32 No.
6,81-88,1987 ）。
グリセリン酸ポケットについて説明する。ヘモグロビン
は、一般に、図１の模式図に示されるような、２つのα
鎖と２つのβ鎖からなる４量体構造をしており、β鎖の
会合部に２，３−ジホスホグリセリン酸が結合する部位
が存在しており、この部位は２，３−ジホスホグリセリ
ン酸ポケット（以下、ＤＰＧポケットという）と呼ばれ
ている。ＤＰＧポケットは、図１にアミノ酸残基につけ
たＮ末端からの通し番号で示したように、ヘモグロビン
のβ鎖のヒスチジン、リジンなどの塩基性アミノ酸残
基、及びβ鎖Ｎ末端バリンによって形成されるカチオン
性を帯びた部位であり、アニオン性の物質を結合し易
い。血液中の２，３−ジホスホグリセリン酸は、このＤ
ＰＧポケットに結合することにより、ヘモグロビンの酸
素解離能をアロステリックに調節していることが知られ
ている（今井清博、蛋白質、核酸、酵素、Vol.32 No.
6,81-88,1987 ）。
【０００８】本発明で用いられる、ＤＰＧポケットに対
して結合性を有する物質とは、ＤＰＧポケットに対して
結合性を有する化合物（以下、ＤＰＧポケットに対して
結合性を有する化合物のことを、ＤＰＧポケット結合性
化合物という）が担持された担体、または、ＤＰＧポケ
ットに対して結合性を有する高分子化合物である。
して結合性を有する物質とは、ＤＰＧポケットに対して
結合性を有する化合物（以下、ＤＰＧポケットに対して
結合性を有する化合物のことを、ＤＰＧポケット結合性
化合物という）が担持された担体、または、ＤＰＧポケ
ットに対して結合性を有する高分子化合物である。
【０００９】上記のＤＰＧポケット結合性化合物として
は、特開昭６３−２９８０６３号公報や特開平２−２５
９４６号公報に不安定型糖化ヘモグロビン解離剤として
記載されているものが挙げられ、例えば、リン酸縮合
体、フィチン酸およびフィチン酸塩のような多価リン酸
化合物が挙げられる。
は、特開昭６３−２９８０６３号公報や特開平２−２５
９４６号公報に不安定型糖化ヘモグロビン解離剤として
記載されているものが挙げられ、例えば、リン酸縮合
体、フィチン酸およびフィチン酸塩のような多価リン酸
化合物が挙げられる。
【００１０】リン酸縮合体としては、（ＨＰＯ3 ）
n （ｎは２以上の整数）で表されるメタリン酸、２原子
以上のリン原子を含みＰ−Ｏ−Ｐ結合を有するポリリン
酸またはそれらの類似体が挙げられる。メタリン酸とし
ては、トリメタリン酸、テトラメタリン酸などが、ポリ
リン酸としては、ピロリン酸、テトラポリリン酸、など
が挙げられる。
n （ｎは２以上の整数）で表されるメタリン酸、２原子
以上のリン原子を含みＰ−Ｏ−Ｐ結合を有するポリリン
酸またはそれらの類似体が挙げられる。メタリン酸とし
ては、トリメタリン酸、テトラメタリン酸などが、ポリ
リン酸としては、ピロリン酸、テトラポリリン酸、など
が挙げられる。
【００１１】また、ＤＰＧポケット結合性化合物として
は、他に、特開平６−３３１６２９号公報に不安定型糖
化ヘモグロビン解離剤として記載されているものが挙げ
られ、例えば、アンモニア、１級アミンまたは２級アミ
ンの窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメ
チレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換され
てなる化合物が挙げられる。上記アミンとしては、種々
のアルキルモノアミンやアミノ酸、直鎖アルキレンジア
ミン、ジアミノシクロヘキサン、ジエチレントリアミ
ン、トリエチレンテトラアミン、グリコールエーテルジ
アミン等が挙げられる。また、上記分子中の水素原子が
アルキル基、水酸基などに置換された化合物、例えばエ
チレンジアミンの１置換体として、水素原子がメチル基
に置換されて得られる１，２−ジアミノプロパン、プロ
ピレンジアミンの１置換体として、２の位置の炭素に結
合する水素原子が水酸基に置換された１，３−ジアミノ
−２−プロパノール等が挙げられる。
は、他に、特開平６−３３１６２９号公報に不安定型糖
化ヘモグロビン解離剤として記載されているものが挙げ
られ、例えば、アンモニア、１級アミンまたは２級アミ
ンの窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメ
チレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換され
てなる化合物が挙げられる。上記アミンとしては、種々
のアルキルモノアミンやアミノ酸、直鎖アルキレンジア
ミン、ジアミノシクロヘキサン、ジエチレントリアミ
ン、トリエチレンテトラアミン、グリコールエーテルジ
アミン等が挙げられる。また、上記分子中の水素原子が
アルキル基、水酸基などに置換された化合物、例えばエ
チレンジアミンの１置換体として、水素原子がメチル基
に置換されて得られる１，２−ジアミノプロパン、プロ
ピレンジアミンの１置換体として、２の位置の炭素に結
合する水素原子が水酸基に置換された１，３−ジアミノ
−２−プロパノール等が挙げられる。
【００１２】前記のメチレンホスホン酸基置換体の製造
方法は、古くから種々の方法が知られているが、例え
ば、Irani,R,R 等、J.Org.Chem.31,1603(1966)によって
開発された方法が挙げられる。この方法は、アミン、ホ
ルマリン、及び亜リン酸のMannich 反応を利用したもの
であり、ホスホン酸誘導体の合成方法として優れた方法
である。また、Motekaitis,R.J. 等、J.inorg.nucl.Che
m.33,3353(1971) によって開発された方法も該置換体の
製造方法として利用できる。この方法は、クロロメチレ
ンホスフィン酸を用いて、まずアミノ基の水素原子をメ
チレンホスフィン酸に置換し、続いて塩化水銀を加えて
加熱し、メチレンホスフィン酸をメチレンホスホン酸に
酸化する方法であり、得られるメチレンホスホン酸置換
体の純度も高く好ましい方法である。
方法は、古くから種々の方法が知られているが、例え
ば、Irani,R,R 等、J.Org.Chem.31,1603(1966)によって
開発された方法が挙げられる。この方法は、アミン、ホ
ルマリン、及び亜リン酸のMannich 反応を利用したもの
であり、ホスホン酸誘導体の合成方法として優れた方法
である。また、Motekaitis,R.J. 等、J.inorg.nucl.Che
m.33,3353(1971) によって開発された方法も該置換体の
製造方法として利用できる。この方法は、クロロメチレ
ンホスフィン酸を用いて、まずアミノ基の水素原子をメ
チレンホスフィン酸に置換し、続いて塩化水銀を加えて
加熱し、メチレンホスフィン酸をメチレンホスホン酸に
酸化する方法であり、得られるメチレンホスホン酸置換
体の純度も高く好ましい方法である。
【００１３】本発明で用いられる担体とは、前述のＤＰ
Ｇポケット結合性物質を固定化し得る、種々の水溶性ポ
リマーや、従来から生化学分野で担体として使用されて
きた種々の水不溶性物質が挙げられる。
Ｇポケット結合性物質を固定化し得る、種々の水溶性ポ
リマーや、従来から生化学分野で担体として使用されて
きた種々の水不溶性物質が挙げられる。
【００１４】上記の水溶性ポリマーとしては、例えば、
ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びその塩、ポ
リアミノ酸等が挙げられる。
ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びその塩、ポ
リアミノ酸等が挙げられる。
【００１５】上記の水不溶性物質としては、例えば、架
橋デキストランや架橋アガロースのようなクロマトグラ
フィー用担体として使用されてきたもの；ポリスチレン
ビーズのようなポリマービーズ；ガラスビーズ；ポリス
チレンラテックスのようなラテックス粒子等が挙げられ
る。
橋デキストランや架橋アガロースのようなクロマトグラ
フィー用担体として使用されてきたもの；ポリスチレン
ビーズのようなポリマービーズ；ガラスビーズ；ポリス
チレンラテックスのようなラテックス粒子等が挙げられ
る。
【００１６】担体にＤＰＧポケット結合性化合物を担持
させる方法は、ＤＰＧポケット結合性物質または水溶性
ポリマーもしくは水不溶性担体の種類に応じて、従来の
種々の方法が利用できる。例えば、前述のＤＰＧポケッ
ト結合性物質または水溶性ポリマーもしくは水不溶性担
体のいずれか一方の水酸基をブロモシアンで活性化し、
他方のアミノ基と反応させる方法や、両方のアミノ基を
グルタルアルデヒドで架橋する方法や、いずれか一方の
カルボキシル基と他方のアミノ基とを水溶性カルボジイ
ミドのような試薬で縮合させる方法等の化学結合法が挙
げられる。また、水不溶性担体の場合、ＤＰＧポケット
結合性物質を予めアルブミンなどの蛋白質に前記化学結
合法により結合し、この結合物を水不溶性担体に物理吸
着させることもできる。
させる方法は、ＤＰＧポケット結合性物質または水溶性
ポリマーもしくは水不溶性担体の種類に応じて、従来の
種々の方法が利用できる。例えば、前述のＤＰＧポケッ
ト結合性物質または水溶性ポリマーもしくは水不溶性担
体のいずれか一方の水酸基をブロモシアンで活性化し、
他方のアミノ基と反応させる方法や、両方のアミノ基を
グルタルアルデヒドで架橋する方法や、いずれか一方の
カルボキシル基と他方のアミノ基とを水溶性カルボジイ
ミドのような試薬で縮合させる方法等の化学結合法が挙
げられる。また、水不溶性担体の場合、ＤＰＧポケット
結合性物質を予めアルブミンなどの蛋白質に前記化学結
合法により結合し、この結合物を水不溶性担体に物理吸
着させることもできる。
【００１７】また、本発明で用いられる、ＤＰＧポケッ
トに対して結合性を有する高分子化合物とは、１級アミ
ンまたは２級アミンを有するポリマー、例えばポリアリ
ルアミンやポリリジンなどのポリマーの窒素原子に結合
した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基
（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子化合
物やビニルホスホン酸のようなホスホン基を有するモノ
マーの重合体が挙げられる。上記の１級アミンまたは２
級アミンを有するポリマーの窒素原子に結合した少なく
とも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2
ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子化合物の製造方
法は、１級または２級アミンを有するポリマーを直接前
述のような反応を介してメチルホスホン化する方法が挙
げられる。
トに対して結合性を有する高分子化合物とは、１級アミ
ンまたは２級アミンを有するポリマー、例えばポリアリ
ルアミンやポリリジンなどのポリマーの窒素原子に結合
した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基
（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子化合
物やビニルホスホン酸のようなホスホン基を有するモノ
マーの重合体が挙げられる。上記の１級アミンまたは２
級アミンを有するポリマーの窒素原子に結合した少なく
とも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2
ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子化合物の製造方
法は、１級または２級アミンを有するポリマーを直接前
述のような反応を介してメチルホスホン化する方法が挙
げられる。
【００１８】ヘモグロビンのＤＰＧポケットに対して結
合性を有する上述したような種々の物質は、多価のリン
酸基やホスホン酸基というアニオン性官能基を有するた
め、カチオン性を帯びたＤＰＧポケットに結合すること
ができる。この結合は、イオン相互作用によって生じて
いるため、上記のＤＰＧポケットに対して結合性を有す
る物質（以下、ＤＰＧポケットに対して結合性を有する
物質のことを、ＤＰＧポケット結合性物質という）とヘ
モグロビンの反応は、後述の実施例から明らかなよう
に、反応溶液のｐＨやイオン強度に強く影響を受ける。
合性を有する上述したような種々の物質は、多価のリン
酸基やホスホン酸基というアニオン性官能基を有するた
め、カチオン性を帯びたＤＰＧポケットに結合すること
ができる。この結合は、イオン相互作用によって生じて
いるため、上記のＤＰＧポケットに対して結合性を有す
る物質（以下、ＤＰＧポケットに対して結合性を有する
物質のことを、ＤＰＧポケット結合性物質という）とヘ
モグロビンの反応は、後述の実施例から明らかなよう
に、反応溶液のｐＨやイオン強度に強く影響を受ける。
【００１９】本発明においてＤＰＧポケット結合性物質
とヘモグロビン含有液とを接触させて、該物質にヘモグ
ロビンが結合された水不溶性の複合体を生成させる工程
は、反応の媒体である液体のｐＨが５．０〜６．８の範
囲で行われる。ｐＨが５．０よりも低くなると、蛋白質
の変性により、ヘモグロビン以外の蛋白質が不純物とし
て混入する恐れが有り、６．８より高くなると、ヘモグ
ロビンとの結合反応が極度に低下する。
とヘモグロビン含有液とを接触させて、該物質にヘモグ
ロビンが結合された水不溶性の複合体を生成させる工程
は、反応の媒体である液体のｐＨが５．０〜６．８の範
囲で行われる。ｐＨが５．０よりも低くなると、蛋白質
の変性により、ヘモグロビン以外の蛋白質が不純物とし
て混入する恐れが有り、６．８より高くなると、ヘモグ
ロビンとの結合反応が極度に低下する。
【００２０】上記の反応の媒体である液体としては、水
でもよいが、より好ましくは、５．０〜６．８のｐＨの
範囲で緩衝能を有するリン酸緩衝液や、クエン酸緩衝
液、フタル酸緩衝液等が好適である。
でもよいが、より好ましくは、５．０〜６．８のｐＨの
範囲で緩衝能を有するリン酸緩衝液や、クエン酸緩衝
液、フタル酸緩衝液等が好適である。
【００２１】本工程に用いられるヘモグロビン含有液と
は、例えば、血液の溶血液など、ヘモグロビンを含む溶
液であれば種類を問わない。
は、例えば、血液の溶血液など、ヘモグロビンを含む溶
液であれば種類を問わない。
【００２２】本発明の第２の工程は、ＤＰＧポケット結
合性物質にヘモグロビンが結合された水不溶性の複合体
を反応媒体である液体から分離する工程である。
合性物質にヘモグロビンが結合された水不溶性の複合体
を反応媒体である液体から分離する工程である。
【００２３】上記の分離方法としては、上記の複合体生
成反応終了後の液体を単に静置するか、または、より短
時間で分離するには、遠心分離などの手段を用いて、該
複合体を沈殿させた後、デカンテーション等の手段で液
体を除去することにより分離できる。
成反応終了後の液体を単に静置するか、または、より短
時間で分離するには、遠心分離などの手段を用いて、該
複合体を沈殿させた後、デカンテーション等の手段で液
体を除去することにより分離できる。
【００２４】本発明の第３の工程は、上記のようにして
分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触
させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体
に接触させて、ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビ
ンを解離させる工程である。
分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触
させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体
に接触させて、ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビ
ンを解離させる工程である。
【００２５】上記のｐＨ７．０〜１０．０の液体として
は、７．０〜１０．０のｐＨの範囲で緩衝能を有するリ
ン酸緩衝液や、Ｇｏｏｄの緩衝液、ホウ酸緩衝液、重炭
酸緩衝液等が好適である。ｐＨが７．０未満では、複合
体の解離効果が不十分であり、ｐＨが１０を超えると、
ヘモグロビンが変性する恐れがある。
は、７．０〜１０．０のｐＨの範囲で緩衝能を有するリ
ン酸緩衝液や、Ｇｏｏｄの緩衝液、ホウ酸緩衝液、重炭
酸緩衝液等が好適である。ｐＨが７．０未満では、複合
体の解離効果が不十分であり、ｐＨが１０を超えると、
ヘモグロビンが変性する恐れがある。
【００２６】上記の電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の
液体としては、例えば、水に溶けてイオン化する物質の
溶液が挙げられる。上記のイオン化する物質としては、
特に限定されないが、水への解離度が高い強酸と強塩基
より得られる塩が反応媒体のｐＨを変動させにくいので
好適であり、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウム等
が好ましい。この液体の電気伝導度が６．５ｍＳ／ｃｍ
未満になると、複合体の解離効果が不十分であり、一
方、適用可能な溶液の電気伝導度の上限値は、そのイオ
ン化する物質の水に対する飽和溶解度における電気伝導
度まで使用可能である。この場合、イオン化する物質の
水溶液中の濃度が高くなり、解離後のヘモグロビンが塩
析効果により沈殿する場合は、該溶液を分離した後、ヘ
モグロビンを他の適当な液体に溶解すればよい。
液体としては、例えば、水に溶けてイオン化する物質の
溶液が挙げられる。上記のイオン化する物質としては、
特に限定されないが、水への解離度が高い強酸と強塩基
より得られる塩が反応媒体のｐＨを変動させにくいので
好適であり、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウム等
が好ましい。この液体の電気伝導度が６．５ｍＳ／ｃｍ
未満になると、複合体の解離効果が不十分であり、一
方、適用可能な溶液の電気伝導度の上限値は、そのイオ
ン化する物質の水に対する飽和溶解度における電気伝導
度まで使用可能である。この場合、イオン化する物質の
水溶液中の濃度が高くなり、解離後のヘモグロビンが塩
析効果により沈殿する場合は、該溶液を分離した後、ヘ
モグロビンを他の適当な液体に溶解すればよい。
【００２７】この工程によって、ＤＰＧポケット結合性
物質とヘモグロビンを解離した後に、ＤＰＧポケット結
合性物質が水不溶性である場合には、上澄み液としてヘ
モグロビンを回収することができ、ＤＰＧポケット結合
性物質が水溶性である場合には、この状態のままヘモグ
ロビン溶液として用いることもできるし、必要に応じ
て、アニオン吸着樹脂などを用いてＤＰＧポケット結合
性物質を除くこともできる。
物質とヘモグロビンを解離した後に、ＤＰＧポケット結
合性物質が水不溶性である場合には、上澄み液としてヘ
モグロビンを回収することができ、ＤＰＧポケット結合
性物質が水溶性である場合には、この状態のままヘモグ
ロビン溶液として用いることもできるし、必要に応じ
て、アニオン吸着樹脂などを用いてＤＰＧポケット結合
性物質を除くこともできる。
【００２８】また、上記の第１工程のＤＰＧポケット結
合性物質とヘモグロビンの複合体を生成させる工程およ
び第３工程の上記複合体を解離させる工程で使用される
反応媒体である液体の最適のイオン強度は、用いるＤＰ
Ｇポケット結合性物質の種類や濃度、ヘモグロビン濃
度、ｐＨによって変化し、目的に応じて最適のイオン強
度が選択されるべきである。例えば、ＤＰＧポケット結
合性物質としてポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を
用い、ヘモグロビン含有液として血液を用い、複合体の
解離物質として塩化ナトリウムを用いた場合を取り上げ
ると、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体濃度０．０
０２〜０．０２重量％、反応溶液のｐＨ５．０〜７．
０、血液の希釈度２５０〜１０００倍希釈のそれぞれの
変動させうる条件の中から、ある一つの条件を設定した
場合、塩化ナトリウム濃度を１０〜１００ｍＭの範囲か
ら最適の条件を設定することができる。
合性物質とヘモグロビンの複合体を生成させる工程およ
び第３工程の上記複合体を解離させる工程で使用される
反応媒体である液体の最適のイオン強度は、用いるＤＰ
Ｇポケット結合性物質の種類や濃度、ヘモグロビン濃
度、ｐＨによって変化し、目的に応じて最適のイオン強
度が選択されるべきである。例えば、ＤＰＧポケット結
合性物質としてポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を
用い、ヘモグロビン含有液として血液を用い、複合体の
解離物質として塩化ナトリウムを用いた場合を取り上げ
ると、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体濃度０．０
０２〜０．０２重量％、反応溶液のｐＨ５．０〜７．
０、血液の希釈度２５０〜１０００倍希釈のそれぞれの
変動させうる条件の中から、ある一つの条件を設定した
場合、塩化ナトリウム濃度を１０〜１００ｍＭの範囲か
ら最適の条件を設定することができる。
【００２９】また、上記の第１工程で、ヘモグロビン含
有液として血液を用いる場合、赤血球をまず溶血させる
必要がある。赤血球の溶血方法としては既存の種々の方
法を用いることができるが、例えば、古くからよく知ら
れる蒸留水等の低張液での処理や、血液の凍結融解によ
り赤血球を破壊せしめる方法が挙げられ、また、通常、
よく用いられる種々の溶血剤で処理してもよい。このよ
うな溶血剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアル
キルアリールエーテル；高級脂肪族アルコール；スルホ
ネート化合物またはサルフェート化合物のポリオキシエ
チレンエーテル；ソルビット脂肪酸エステルのポリオキ
シエチレン付加体等の界面活性剤が使用できる。溶血剤
の使用量は、その種類等によっても異なるが、通常血液
１ｍｌ当たり、１０〜２００ｍｇである。溶血剤が過剰
である場合には、ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロ
ビンとの反応が阻害される場合があり、溶血液の適当な
希釈が必要である。
有液として血液を用いる場合、赤血球をまず溶血させる
必要がある。赤血球の溶血方法としては既存の種々の方
法を用いることができるが、例えば、古くからよく知ら
れる蒸留水等の低張液での処理や、血液の凍結融解によ
り赤血球を破壊せしめる方法が挙げられ、また、通常、
よく用いられる種々の溶血剤で処理してもよい。このよ
うな溶血剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアル
キルアリールエーテル；高級脂肪族アルコール；スルホ
ネート化合物またはサルフェート化合物のポリオキシエ
チレンエーテル；ソルビット脂肪酸エステルのポリオキ
シエチレン付加体等の界面活性剤が使用できる。溶血剤
の使用量は、その種類等によっても異なるが、通常血液
１ｍｌ当たり、１０〜２００ｍｇである。溶血剤が過剰
である場合には、ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロ
ビンとの反応が阻害される場合があり、溶血液の適当な
希釈が必要である。
【００３０】また、本発明のヘモグロビンの分離精製方
法は、天然ヘモグロビン（Fe2+）だけでなく、シアンメ
トヘモグロビン（Fe3+）でも同様に適用できるので、安
定なヘモグロビン標準物質としてシアンメトヘモグロビ
ンを分離調製する際にも好適に用いられる。
法は、天然ヘモグロビン（Fe2+）だけでなく、シアンメ
トヘモグロビン（Fe3+）でも同様に適用できるので、安
定なヘモグロビン標準物質としてシアンメトヘモグロビ
ンを分離調製する際にも好適に用いられる。
【００３１】
【実施例】次に本発明を実施例によって説明するが、本
発明はこの実施例に制限されるものではない。
発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００３２】（参考例１）ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の合成 ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績社製、MW.7500 〜1
1,000）５．７ｇとホスホン酸（ナカライテスク社製）
１６．４ｇを１００ｍｌの脱イオン水に溶解し、５００
ｍｌのセパラブルフラスコに入れた。これに、温度計、
撹拌棒、環流管、滴下ロートをセットした。次に、濃塩
酸（１１．３３Ｎ）１００ｍｌを添加し、マントルヒー
ターにて加熱した。次に環流状態に達したところで、滴
下ロートに６０ｍｌのホルムアルデヒド水（３７重量
％）を入れ、１時間かけてゆっくり滴下した。それから
さらに、１時間反応を続けた。次に、この溶液を２０℃
に冷却し、水酸化ナトリウム５４ｇを加えた。次にこの
溶液を約８００ｍｌのアセトンにコマゴメピペットを用
いゆっくり滴下し、白色沈殿を生成させた。この沈殿物
を吸引ロートを用いて濾過した。沈殿物は、アセトン：
水＝４：１の溶液で３回洗浄濾過し、沈殿物をスパーテ
ルでサンプル瓶に回収し、約２００ｍｌの脱イオン水を
少量ずつ加えながら、沈殿物を泥濘状にし、これを透析
チューブにつめ、脱イオン水に一昼夜以上、外液を５回
交換して、透析した。透析チューブ内で溶解したポリア
リルアミンのホスホン酸誘導体をもう一度アセトンに滴
下し、沈殿させ、上記のように濾過し、沈殿物を２０℃
で減圧乾燥して６．４ｇのポリアリルアミンのホスホン
酸誘導体を得た。
1,000）５．７ｇとホスホン酸（ナカライテスク社製）
１６．４ｇを１００ｍｌの脱イオン水に溶解し、５００
ｍｌのセパラブルフラスコに入れた。これに、温度計、
撹拌棒、環流管、滴下ロートをセットした。次に、濃塩
酸（１１．３３Ｎ）１００ｍｌを添加し、マントルヒー
ターにて加熱した。次に環流状態に達したところで、滴
下ロートに６０ｍｌのホルムアルデヒド水（３７重量
％）を入れ、１時間かけてゆっくり滴下した。それから
さらに、１時間反応を続けた。次に、この溶液を２０℃
に冷却し、水酸化ナトリウム５４ｇを加えた。次にこの
溶液を約８００ｍｌのアセトンにコマゴメピペットを用
いゆっくり滴下し、白色沈殿を生成させた。この沈殿物
を吸引ロートを用いて濾過した。沈殿物は、アセトン：
水＝４：１の溶液で３回洗浄濾過し、沈殿物をスパーテ
ルでサンプル瓶に回収し、約２００ｍｌの脱イオン水を
少量ずつ加えながら、沈殿物を泥濘状にし、これを透析
チューブにつめ、脱イオン水に一昼夜以上、外液を５回
交換して、透析した。透析チューブ内で溶解したポリア
リルアミンのホスホン酸誘導体をもう一度アセトンに滴
下し、沈殿させ、上記のように濾過し、沈殿物を２０℃
で減圧乾燥して６．４ｇのポリアリルアミンのホスホン
酸誘導体を得た。
【００３３】（参考例２）ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの反応性評
価 ＤＰＧポケット結合性物質として、参考例１で合成した
ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を使用し、そのヒ
トヘモグロビンとの反応性を評価した。ヒトヘモグロビ
ンはＳｉｇｍａ社より購入したものを用いた。反応緩衝
液として、１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含有する１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２４）を用い、この反応緩
衝液に図２にＨｂ Ｃｏｎｃ．として示した０．２〜
０．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度でヒトヘモグロビンを溶解
した。次に、この溶液に上記ポリアリルアミンのホスホ
ン酸誘導体を最終濃度０．００４重量％になるように添
加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応させた後、溶液
の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ２６
０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）で
測定した。この結果を図２に示した。図２から明らかな
ようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ヒトヘ
モグロビンと反応し、ヒトヘモグロビンの濃度に依存し
て濁度が増加し、水不溶性複合体が形成されることが示
された。
価 ＤＰＧポケット結合性物質として、参考例１で合成した
ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を使用し、そのヒ
トヘモグロビンとの反応性を評価した。ヒトヘモグロビ
ンはＳｉｇｍａ社より購入したものを用いた。反応緩衝
液として、１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含有する１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２４）を用い、この反応緩
衝液に図２にＨｂ Ｃｏｎｃ．として示した０．２〜
０．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度でヒトヘモグロビンを溶解
した。次に、この溶液に上記ポリアリルアミンのホスホ
ン酸誘導体を最終濃度０．００４重量％になるように添
加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応させた後、溶液
の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ２６
０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）で
測定した。この結果を図２に示した。図２から明らかな
ようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ヒトヘ
モグロビンと反応し、ヒトヘモグロビンの濃度に依存し
て濁度が増加し、水不溶性複合体が形成されることが示
された。
【００３４】（参考比較例１）ポリアリルアミンのホス
ホン酸誘導体（最終濃度０．００４重量％）の代わりに
ポリアリルアミン塩酸塩（最終濃度０．００４重量％）
を用いたことの他は、、参考例２と同様に行った。結果
は、図２に参考例２の結果と一緒に示した。この結果か
ら明らかなように、ホスホン酸誘導体化していないポリ
アリルアミンは、ヒトヘモグロビンと反応しなかった。
ホン酸誘導体（最終濃度０．００４重量％）の代わりに
ポリアリルアミン塩酸塩（最終濃度０．００４重量％）
を用いたことの他は、、参考例２と同様に行った。結果
は、図２に参考例２の結果と一緒に示した。この結果か
ら明らかなように、ホスホン酸誘導体化していないポリ
アリルアミンは、ヒトヘモグロビンと反応しなかった。
【００３５】（参考例３）ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの反応性評
価（ｐＨ依存性 ） １／１５Ｍリン酸２ナトリウム水溶液と１／１５Ｍリン
酸１カリウム水溶液ととを種々の比率で混合し、図３に
示したようにｐＨ５．２〜８．４のＳφｒｅｎｓｅｎの
リン酸緩衝液を調製し、それを１０ｍＭになるように脱
イオン水で希釈した。各々のｐＨの緩衝液にヒトヘモグ
ロビン（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌに
なるように溶解した。次に、参考例１で得られたポリア
リルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４重
量％になるように添加し、２０℃で５分間攪拌しながら
反応させた後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津
製作所製ＵＶ２６０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（Ｏ
Ｄ６６０ｎｍ）で測定した。この結果を図３に示した。
図３から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸
誘導体は、ｐＨ５．０〜７．０でヒトヘモグロビンと反
応し、濁度が増加した。また、ｐＨが７．０を超えると
濁度が急激に低下していることが分かる。
価（ｐＨ依存性 ） １／１５Ｍリン酸２ナトリウム水溶液と１／１５Ｍリン
酸１カリウム水溶液ととを種々の比率で混合し、図３に
示したようにｐＨ５．２〜８．４のＳφｒｅｎｓｅｎの
リン酸緩衝液を調製し、それを１０ｍＭになるように脱
イオン水で希釈した。各々のｐＨの緩衝液にヒトヘモグ
ロビン（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌに
なるように溶解した。次に、参考例１で得られたポリア
リルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４重
量％になるように添加し、２０℃で５分間攪拌しながら
反応させた後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津
製作所製ＵＶ２６０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（Ｏ
Ｄ６６０ｎｍ）で測定した。この結果を図３に示した。
図３から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸
誘導体は、ｐＨ５．０〜７．０でヒトヘモグロビンと反
応し、濁度が増加した。また、ｐＨが７．０を超えると
濁度が急激に低下していることが分かる。
【００３６】（参考例４）ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの反応性評
価（電気伝導度依存性） 反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液を使用し、これにＮ
ａＣｌを溶解し、図４および図５に示したような電気伝
導度（Electric Conductivity ）１．３３５〜９．７５
ｍＳ／ｃｍの緩衝液を調製した。各々の電気伝導度の緩
衝液にヒトヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が
０．２５ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、参考
例１で得られたポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を
添加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応させた後、溶
液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ２６
０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）で
測定した。この結果を図４および図５に示した。なお、
図４は、リン酸緩衝液のｐＨ６．２４、ポリアリルアミ
ンのホスホン酸誘導体の反応時の濃度が０．００４重量
％の場合の結果を、図５は、リン酸緩衝液のｐＨ６．０
０、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の反応時の濃
度が０．００６重量％の場合の結果を示した。図４およ
び図５から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン
酸誘導体とヒトヘモグロビンとの反応による濁度は、反
応時のｐＨやポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の濃
度が変わると電気伝導度依存性も異なるパターンを示
し、各条件により最適の電気伝導度（言い換えると、Ｎ
ａＣｌ濃度）があることが分かる。
価（電気伝導度依存性） 反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液を使用し、これにＮ
ａＣｌを溶解し、図４および図５に示したような電気伝
導度（Electric Conductivity ）１．３３５〜９．７５
ｍＳ／ｃｍの緩衝液を調製した。各々の電気伝導度の緩
衝液にヒトヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が
０．２５ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、参考
例１で得られたポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を
添加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応させた後、溶
液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ２６
０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）で
測定した。この結果を図４および図５に示した。なお、
図４は、リン酸緩衝液のｐＨ６．２４、ポリアリルアミ
ンのホスホン酸誘導体の反応時の濃度が０．００４重量
％の場合の結果を、図５は、リン酸緩衝液のｐＨ６．０
０、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の反応時の濃
度が０．００６重量％の場合の結果を示した。図４およ
び図５から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン
酸誘導体とヒトヘモグロビンとの反応による濁度は、反
応時のｐＨやポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の濃
度が変わると電気伝導度依存性も異なるパターンを示
し、各条件により最適の電気伝導度（言い換えると、Ｎ
ａＣｌ濃度）があることが分かる。
【００３７】（参考例５）ＤＰＧポケット結合性物質の反応特異性の評価 参考例１で得られたポリアリルアミンのホスホン酸誘導
体の特異性を評価した。反応緩衝液として、１０ｍＭの
濃度でＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝６．２１）を用い、これに、ヒトヘモグロビン（Ｓｉ
ｇｍａ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）、牛アルブミ
ン（ＭＩＬＥＳ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）また
はヒト血漿希釈液（最終希釈度２５０倍）を上記の括弧
内の終濃度または最終希釈度となるように添加し、次い
で上記のポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を図６に
示した０．００〜０．０５重量％の範囲の種々の濃度と
なるように添加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応さ
せた後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所
製ＵＶ２６０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６
０ｎｍ）で測定した。この結果を図６に示した。図６か
ら、明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導
体は、ヘモグロビンとは反応し、牛アルブミンや血漿希
釈液とは反応しなかった。
体の特異性を評価した。反応緩衝液として、１０ｍＭの
濃度でＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝６．２１）を用い、これに、ヒトヘモグロビン（Ｓｉ
ｇｍａ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）、牛アルブミ
ン（ＭＩＬＥＳ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）また
はヒト血漿希釈液（最終希釈度２５０倍）を上記の括弧
内の終濃度または最終希釈度となるように添加し、次い
で上記のポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を図６に
示した０．００〜０．０５重量％の範囲の種々の濃度と
なるように添加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応さ
せた後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所
製ＵＶ２６０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６
０ｎｍ）で測定した。この結果を図６に示した。図６か
ら、明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導
体は、ヘモグロビンとは反応し、牛アルブミンや血漿希
釈液とは反応しなかった。
【００３８】（実施例１）ヒト血液からのヘモグロビンの分離精製 正常ヒト血液１００μｌに蒸留水１２．５ｍｌを添加
し、次に、５０ｍＭの濃度でＮａＣｌを、０．０１２重
量％の濃度で参考例１で得られたポリアリルアミンのホ
スホン酸誘導体を溶解している１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ＝６．００）を１２．５ｍｌ添加し、撹拌後、４
℃で２４時間静置した。次に上澄み液と赤色の沈殿物を
デカンテーションで分離した。得られた赤色の沈殿物
に、ダルベッコのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、１３８
ｍＭＮａＣｌ）を２５ｍｌ添加し、沈殿物を再溶解させ
た。この再溶解溶液（後出の図７および表１において、
この液のことを、精製品という）；先に分離した上澄み
液；および上記の正常ヒト血液１００μｌに蒸留水１
２．５ｍｌを添加した液に、ポリアリルアミンのホスホ
ン酸誘導体を含むリン酸緩衝液１２．５ｍｌの代わり
に、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を含まないリ
ン酸緩衝液１２．５ｍｌを添加した液（後出の図７およ
び表１において、この液のことを、出発原料という）、
それぞれの波長２４０〜７００ｎｍの吸収曲線を比較
し、図７に示した。また、５４０ｎｍの吸光度の値から
正常ヒト血液中のヘモグロビンの回収率を測定し、結果
を表１に示した。
し、次に、５０ｍＭの濃度でＮａＣｌを、０．０１２重
量％の濃度で参考例１で得られたポリアリルアミンのホ
スホン酸誘導体を溶解している１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ＝６．００）を１２．５ｍｌ添加し、撹拌後、４
℃で２４時間静置した。次に上澄み液と赤色の沈殿物を
デカンテーションで分離した。得られた赤色の沈殿物
に、ダルベッコのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、１３８
ｍＭＮａＣｌ）を２５ｍｌ添加し、沈殿物を再溶解させ
た。この再溶解溶液（後出の図７および表１において、
この液のことを、精製品という）；先に分離した上澄み
液；および上記の正常ヒト血液１００μｌに蒸留水１
２．５ｍｌを添加した液に、ポリアリルアミンのホスホ
ン酸誘導体を含むリン酸緩衝液１２．５ｍｌの代わり
に、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を含まないリ
ン酸緩衝液１２．５ｍｌを添加した液（後出の図７およ
び表１において、この液のことを、出発原料という）、
それぞれの波長２４０〜７００ｎｍの吸収曲線を比較
し、図７に示した。また、５４０ｎｍの吸光度の値から
正常ヒト血液中のヘモグロビンの回収率を測定し、結果
を表１に示した。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【発明の効果】本発明の構成は上記の通りであり、ＤＰ
Ｇポケット結合性物質を利用し、従来よりも、短時間
で、簡単な操作で、高収率で、血液等からヘモグロビン
を分離精製できる。
Ｇポケット結合性物質を利用し、従来よりも、短時間
で、簡単な操作で、高収率で、血液等からヘモグロビン
を分離精製できる。
【図１】ヘモグロビンの構造を示す模式図である。
【図２】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応性を示すグラフである。
反応性を示すグラフである。
【図３】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応における、反応時のｐＨ依存性を示すグラフであ
る。
反応における、反応時のｐＨ依存性を示すグラフであ
る。
【図４】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応における、反応時の溶液の電気伝導度依存性を示す
グラフである。
反応における、反応時の溶液の電気伝導度依存性を示す
グラフである。
【図５】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応における、反応時の溶液の電気伝導度依存性を示す
グラフである。
反応における、反応時の溶液の電気伝導度依存性を示す
グラフである。
【図６】ＤＰＧポケット結合性物質の反応特異性を示す
グラフである。
グラフである。
【図７】ヒト血液からヘモグロビンの分離精製を行った
際の、出発原料、上澄み液、精製品の波長２４０〜７０
０ｎｍの吸収曲線である。
際の、出発原料、上澄み液、精製品の波長２４０〜７０
０ｎｍの吸収曲線である。
Claims (1)
- 【請求項１】 ヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセ
リン酸ポケットに対して結合性を有する物質とヘモグロ
ビン含有液とを、ｐＨ５．０〜６．８の液体中で接触さ
せて、該物質にヘモグロビンが結合された水不溶性の複
合体を生成させる工程、該複合体を該液体から分離する
工程、及び、分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０
の液体に接触させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃ
ｍ以上の液体に接触させて、該物質とヘモグロビンを解
離させる工程からなることを特徴とするヘモグロビンの
分離精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7163599A JPH0912598A (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | ヘモグロビンの分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7163599A JPH0912598A (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | ヘモグロビンの分離精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912598A true JPH0912598A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=15776991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7163599A Pending JPH0912598A (ja) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | ヘモグロビンの分離精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0912598A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063814A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Oxygenix Co., Ltd. | ヘモグロビン精製法 |
| JP2014240391A (ja) * | 2010-05-17 | 2014-12-25 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | 生体分子の精製のための刺激応答性ポリマー |
| US9803165B2 (en) | 2008-12-16 | 2017-10-31 | Emd Millipore Corporation | Stirred tank reactor and method |
| US10233211B2 (en) | 2006-12-21 | 2019-03-19 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US10793593B2 (en) | 2006-12-21 | 2020-10-06 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63500305A (ja) * | 1985-06-26 | 1988-02-04 | ヘモソ−ル インコ−ポレイテツド | アフイニテイ−クロマトグラフイ−によるヘモグロビンおよび変性ヘモグロビンの精製 |
| JPS63298063A (ja) * | 1987-05-28 | 1988-12-05 | Sekisui Chem Co Ltd | 糖化ヘモグロビンの測定法 |
| JPH02259467A (ja) * | 1989-03-30 | 1990-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 |
| JPH06331629A (ja) * | 1993-05-20 | 1994-12-02 | Sekisui Chem Co Ltd | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤およびこれを用いた糖化ヘモグロビンの測定法 |
-
1995
- 1995-06-29 JP JP7163599A patent/JPH0912598A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63500305A (ja) * | 1985-06-26 | 1988-02-04 | ヘモソ−ル インコ−ポレイテツド | アフイニテイ−クロマトグラフイ−によるヘモグロビンおよび変性ヘモグロビンの精製 |
| JPS63298063A (ja) * | 1987-05-28 | 1988-12-05 | Sekisui Chem Co Ltd | 糖化ヘモグロビンの測定法 |
| JPH02259467A (ja) * | 1989-03-30 | 1990-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 |
| JPH06331629A (ja) * | 1993-05-20 | 1994-12-02 | Sekisui Chem Co Ltd | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤およびこれを用いた糖化ヘモグロビンの測定法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063814A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Oxygenix Co., Ltd. | ヘモグロビン精製法 |
| JPWO2005063814A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2007-12-20 | 株式会社 オキシジェニクス | ヘモグロビン精製法 |
| US10233211B2 (en) | 2006-12-21 | 2019-03-19 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US10793593B2 (en) | 2006-12-21 | 2020-10-06 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US9803165B2 (en) | 2008-12-16 | 2017-10-31 | Emd Millipore Corporation | Stirred tank reactor and method |
| JP2014240391A (ja) * | 2010-05-17 | 2014-12-25 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | 生体分子の精製のための刺激応答性ポリマー |
| US9731288B2 (en) | 2010-05-17 | 2017-08-15 | Emd Millipore Corporation | Stimulus responsive polymers for the purification of biomolecules |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rosenberg et al. | Fractionation of the protein components of human erythrocyte membranes | |
| Thompson et al. | Lipid and subunit III depleted cytochrome c oxidase purified by horse cytochrome c affinity chromatography in lauryl maltoside | |
| Reinhammar | Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera | |
| Safer et al. | Undecagold clusters for site-specific labeling of biological macromolecules: simplified preparation and model applications | |
| EP0031955B1 (en) | Process for purification of lipoprotein cholesterol for use as a cholesterol reference material | |
| Scanu et al. | Molecular weight and subunit structure of human serum high density lipoprotein after chemical modification by succinic anhydride | |
| Chakrabarti | Cooperativity of warfarin binding with human serum albumin induced by free fatty acid anion | |
| Malik et al. | Control of intra-and extra-cellular sulphydryl-disulphide balances with gold phosphine drugs: 31P nuclear magnetic resonance studies of human blood | |
| Subramanian et al. | The major alkaline proteinase of Aspergillus oryzae, aspergillopeptidase B. II. Partial specific volume, molecular weight, and amino acid composition | |
| Pollack et al. | A new iron-binding protein isolated from intestinal mucosa | |
| JPH0912598A (ja) | ヘモグロビンの分離精製方法 | |
| Hennessey Jr et al. | Secondary structure of the Neurospora crassa plasma membrane H+-ATPase as estimated by circular dichroism. | |
| JPS6351335A (ja) | 肥満細胞脱顆粒抑制剤 | |
| Marfey et al. | Cross-linking of phospholipids in human erythrocyte membrane | |
| MacLennan et al. | Studies on the electron transfer system: LXIII. Solubilization and fractionation of mitochondrial proteins by succinylation | |
| JP3478913B2 (ja) | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 | |
| Harris et al. | The carboxymethylation of human metmyoglobin | |
| Fronticelli et al. | [10] Conformational and functional characteristics of bovine hemoglobin | |
| Siegelman et al. | Plastocyanin: Possible significance of quaternary structure | |
| Quesada et al. | A rapid method for the functional reconstitution of amino acid transport systems from rat liver plasma membranes. Partial purification of System A | |
| Brandt et al. | Coupling of dyes to biopolymers by sensitized photooxidation. Affinity labeling of a binding site in bovine serum albumin | |
| Stoffel et al. | Surface Localization of Apolipoprotein AII in Lipoprotein-Complexes | |
| Walker | Properties of chemically modified protein S: the effect of the conversion of. gamma.-carboxyglutamic acid to. gamma.-methyleneglutamic acid on functional properties | |
| Akopyan et al. | ON THE ISOLATION AND PURIFICATION OF STRUCTURE‐BOUND PROTEINS: Monoamine Oxidases of Mitochondrial Membranes | |
| Yu et al. | Interactions between arginine-rich histones and deoxyribonucleic acids. II. Circular dichroism |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040630 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041027 |