JPH09143093A - 軟骨・骨誘導性修復用材料 - Google Patents

軟骨・骨誘導性修復用材料

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JPH09143093A
JPH09143093A JP7322402A JP32240295A JPH09143093A JP H09143093 A JPH09143093 A JP H09143093A JP 7322402 A JP7322402 A JP 7322402A JP 32240295 A JP32240295 A JP 32240295A JP H09143093 A JPH09143093 A JP H09143093A
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cartilage
osteoinductive
polyoxyethylene polyoxypropylene
bone
polyoxypropylene glycols
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Takesada Shimura
武貞 志村
Satsuki Toriyama
五月 鳥山
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Sanofi Aventis KK
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Hoechst Japan Ltd
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 外科的手術を必要としない軟骨・骨誘導方法
において使用され、骨誘導因子と、生体吸収性が高く骨
誘導因子との親和性が良く温度によってゾル−ゲル可逆
変化を起こす担体とからなる軟骨・骨誘導性修復用材料
を提供する。 【解決手段】 骨誘導因子とポリオキシエチレンポリオ
キシプロピレングリコール類とからなり、ポリオキシエ
チレンポリオキシプロピレングリコール類の構成組成で
あるポリプロピレングリコールの分子量が約１５００か
ら４０００およびエチレンオキサイドの重量比が約４０
〜８０％／分子の範囲にあり、ポリオキシエチレンポリ
オキシプロピレングリコール類の対水溶液濃度が約１０
〜５０％である軟骨・骨誘導性修復用材料。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は骨誘導因子とポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレングリコール類を含む
軟骨・骨誘導性修復用材料に関する。また、本発明はポ
リオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類の
構成成分であるポリプロピレングリコールの分子量が約
１５００〜４０００の範囲にあり、エチレンオキサイド
含量が約４０〜８０％／分子の範囲にある軟骨・骨誘導
性修復用材料に関する。さらに、本発明は、骨誘導因子
とポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール
類とを含む軟骨・骨誘導性修復用材料を投与することに
より、温度によってゾル−ゲル可逆変化を起こし骨誘導
因子の薬効を持続させ得る。
【０００２】軟骨・骨の修復方法として、患者自身の自
家骨移植以外に骨誘導因子と適当な担体との組み合わせ
による軟骨・骨欠損部の補てつ剤を患部に埋め込む方法
が行われている。この場合、外科的手術時に患部を露出
し骨誘導因子を含む軟骨・骨修復用材料を直接患部に適
用する事が可能であるため、取り扱い易いブロック、ス
ポンジおよびシート等の固体形態が広く用いられてき
た。また、ゲルあるいはペースト等の半固体形態も使用
できる。これらの固体または半固体形態を可能にする担
体としては、例えばステンレスおよびチタン合金等の金
属やコラーゲンおよびハイドロキシアパタイト（ＨＡ
Ｐ）またはそれらの混合剤等が利用されている。
【０００３】一方、外科的手術を必要としない骨折や変
形関節症などの治療に骨誘導因子を投与する試みがなさ
れている。この投与形態は、非侵襲性投与すなわち注入
形態が患者の苦痛を軽減する点で切望されている。しか
しながら骨誘導因子の単なる水性液剤をこの形態で投与
すると、投与後の薬物の拡散消失が起こるため骨誘導因
子を効率よく投与するためには適応患部へ一定期間骨誘
導因子を滞留させる必要がある。そこで、投与時には通
針性を有する液状であって投与後にゲル状に相変化し患
部に骨誘導因子を滞留させ得る担体が考えられている。
この担体としては毒性が無く、生体との適合性が良く、
生体吸収性が高いものが好ましい。
【０００４】これまでに、骨誘導因子の担体としてはコ
ラーゲンが知られており、良好な生体適合性及び生体吸
収性が認められている（特公平５−７５４２５号）。さ
らに注射可能なコラーゲンとの組み合わせについても知
られており、注入可能な軟骨・骨形成材の可能性を有し
ている（特公平７−２３３２２号及び特公平５−５３１
４０号）。しかしながら、現在医薬品として利用可能な
コラーゲンはその起源がウシあるいはブタなどの天然物
由来の材料であるために、その分子量、アミノ酸組成
量、保水量等が一定しない。さらに、これらはヒトにと
って異種の蛋白質であることに起因する抗原性等の副作
用を有する。特に抗原性については、コラーゲンのテロ
ペプチド部位を排除したアテロコラーゲンを使用しても
完全に無くすことは出来ない（J．American Academy of
Dermatology 10, 638-646 and 647-651, 1984及びJ．A
merican Academy of Dermatology 21, 1203-1208, 198
9)。
【０００５】一方、ポリ乳酸やポリ乳酸グリコール酸共
重合体等の生体分解性ポリマーを医薬用担体として用い
ることは知られている（ＵＳ ５３８５８８７号及び特
公平６−２２５７０号）。しかし、これら生体分解性ポ
リマーの形状は固体形態または半固体形態であり、一定
形態を保持する点で外科的手術時に適用する材料群に属
する。仮に、この様な生分解性ポリマーを用いて注射可
能な複合体を作製できたとしても、その製造工程におい
て有機溶剤を使用せざるをえず、有効成分である骨誘導
因子の失活が問題となることが容易に予測される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上に示
したように従来法の不利点ないしは欠点を克服し、生体
吸収性が高く、有効成分である骨誘導因子との親和性が
良く、温度によってゾル−ゲル可逆変化を起こすことに
より骨誘導因子の薬効を持続させ、さらには抗原性等の
副作用の少ない軟骨・骨誘導性修復用材料を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは外科的手術
を必要としない骨修復方法において、有効成分となる骨
誘導因子とその担体との関係について鋭意検討していた
ところ、ある種のポリオキシエチレンポリオキシプロピ
レングリコール類に、生体吸収性が高く骨誘導因子との
親和性が良く温度によってゾル−ゲル可逆変化を起こす
ものがあることを見い出した。本発明者らは、ポリオキ
シエチレンポリオキシプロピレングリコール類水性溶液
に骨誘導因子を混合し投与時１℃から３０℃においては
注入可能な液体であり投与後３分以内に３７℃付近でゲ
ル化する骨形成材を作製し、マウス大腿部筋肉内に投与
後投与部位に骨誘導因子を保持させ、そこで異所性軟骨
・骨形成能があることを見い出し、本発明を完成した。
【０００８】本発明は、ポリオキシエチレンポリオキシ
プロピレングリコール類と骨誘導因子とを含む軟骨・骨
誘導性修復用材料に関するものである。
【０００９】ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン
グリコール類とは、親水性の低いポリプロピレングリコ
ールを疎水基としエチレンオキサイドを親水基として付
加した高分子型の非イオン性界面活性剤の総称であり、
ポリプロピレングリコールの分子量及びエチレンオキサ
イドとの混合比を変化させることにより種々の特性を有
する界面活性剤を構成することが可能となる。合成可能
なポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール
類の組成はポリプロピレングリコールの分子量が９００
から４０００の範囲にあり、総分子中のエチレンオキサ
イドの重量％が５％から９０％である。例えば、旭電化
社製のポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコ
ール類（アデカ(R)）は、ポリプロピレングリコールの
分子量と付加するエチレンオキサイドの重量比により系
統的に命名されており、その分類図を図１に示す。
【００１０】ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン
グリコール類の産業上の利用としては、一般洗浄剤・消
泡剤としての使用の他、医薬品の分野において軟下剤、
軟膏基材、人工血液、錠剤の被膜、賦形剤、注射剤の可
溶化剤および溶解促進剤などに使用されている。特にプ
ルロニックＦ−６８（ポリプロピレングリコールの分子
量１７５０、エチレンオキサイド含量が８０％）の溶血
防止作用は顕著であることより、血液の体外循環用添加
剤として（株）ミドリ十字からエキソコポール(R)とし
て市販されている。各種動物における毒性試験結果から
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類
は毒性及び刺激性が極めて低いことが明らかであり、抗
原性等の副作用を示すとの報告もない（フレグランスジ
ャーナル７，82-87，1974）。毒性試験の結果を表１に
示す。
【表１】 アデカ(R)プルロニックの急性毒性試験結果 アデカ(R)プルロニック 動 物 種 ＬＤ50（g／kg） L-44，L-62，L-64 ラット ５ F−68 マウス ＞１５ F−68 ラット、ウサギ、イヌ 急性毒性反応なし P−85 ラット ３４.６
【００１１】一方、取り扱い上において、ポリオキシエ
チレンポリオキシプロピレングリコール類は可逆的なゾ
ル−ゲル相変化を示す点においてコラーゲンの温度変化
における非可逆的相転移よりも優れる。この性質は相変
化を示す温度を至適なポリオキシエチレンポリオキシプ
ロピレングリコール類の選択及びそのポリオキシエチレ
ンポリオキシプロピレングリコール類の水溶液の濃度を
変えることにより制御可能である（Int．J．Pharm．22,
207-218, 1984, EP 0551626A1号）。
【００１２】以上のことから、ポリオキシエチレンポリ
オキシプロピレングリコール類は医薬用担体としての資
質に優れており、局所麻酔剤・抗癌剤等の低分子量の薬
物と組み合わせたり（Int．J．Pharm. 8, 89-99，1981
及びChem．Pharm．Bull. 32,4205-4208, 1984）、イン
ターロイキン等の高分子量の生理活性タンパク質を混合
する試みが既になされている（Pharm．Res. 9, 425-43
4,1992）。
【００１３】本発明は、ポリオキシエチレンポリオキシ
プロピレングリコール類と骨誘導因子とを含む軟骨・骨
誘導性修復用材料に関しポリオキシエチレンポリオキシ
プロピレングリコール類の構成成分のポリプロピレング
リコールの分子量が約１５００〜４０００の範囲にあ
り、エチレンオキシド含量が約４０〜８０％／分子の範
囲にある軟骨・骨誘導性修復用材料に関する。この構成
成分の範囲内であれば本発明のプルロニックの特性であ
る温度によるゾル−ゲル可逆変化を成し得るプルロニッ
クになる。
【００１４】さらに、本発明は、上記記載のポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレングリコール類の対水溶液
濃度が約１０〜５０％からなる軟骨・骨誘導性修復用材
料に関する。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン
グリコール類は一般的に水溶液の調製濃度等によりその
可逆変化温度が変動することも知られており、上記構成
成分の範囲にあるポリオキシエチレンポリオキシプロピ
レングリコール類では体温付近すなわち３７℃近辺では
対水溶液濃度約１０〜９０％の範囲でゲル化が起こる。
最適な例としてはポリプロピレングリコールの分子量３
８５０、エチレンオキサイド含量が７０％であるポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（プル
ロニックＦ−１２７）を対水溶液濃度１５〜３０％で調
製する。
【００１５】骨誘導因子（Bone morphogenetic protei
n：ＢＭＰ）とは未分化間葉系細胞を軟骨細胞へ誘導
し、骨組織を形成する活性をもつ蛋白質である。
【００１６】本発明で用いられる骨誘導因子の例として
は、ＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属するＢＭ
Ｐ−２からＢＭＰ−９等の一連のタンパク質、ＭＰ５２
と称されるタンパク質、ＧＤＦ−５と称されるタンパク
質などがあげられるが、これらに限定されるものではな
い。ＢＭＰ−２としては、Ｗａｎｇらが報告した遺伝子
組み替え技術によりChinese hamster ovary（ＣＨＯ）
細胞を用いて生産したタンパク質ＢＭＰ−２（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 87, 2220−2224，1990およびUS48
77864号）およびＭＰ５２としては本発明者らが提案し
た遺伝子組み換え技術により製造される新規なタンパク
質ＭＰ５２（特願平７−９３６４４号）が特に好適であ
る。この新規なタンパク質は、ＭＰ５２由来の配列表配
列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の
Ｎ末端にメチオニンをコードするコドンを付加したＤＮ
Ａを含有するプラスミドを構築し、そのプラスミドを大
腸菌に形質転換し、その大腸菌を培養することによって
得られるインクルージョンボディを可溶化し、精製する
ことによって得られる単量体のタンパク質を二量体に再
生し、これを精製することによって得られる。
【００１７】ＢＭＰ−２およびＭＰ５２を有効成分とす
る１５〜３０％ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
ングリコール類の水性溶液をマウス大腿部筋肉内に注射
し、投与後投与部位にＭＰ５２を保持させ、そこで異所
性軟骨・骨形成能があることを観察した。
【００１８】このようにポリオキシエチレンポリオキシ
プロピレングリコール類と骨誘導因子との組み合わせか
らなる軟骨・骨誘導性修復用注入材料は今まで報告され
ておらず、軟骨・骨修復、特に骨折治療剤として有効で
ある。
【００１９】
【実施例】以下に、実施例および参考例を示して本発明
の効果を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実
施例により限定されるものではない。
【００２０】実施例１ ＢＭＰ−２を含有する軟骨・
骨誘導性修復用材料の調製法 アデカ(R)プルロニックＦ−１２７（旭電化工業）は、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類
種の中で最も毒性が少ないものの一つとして知られてい
る（製薬工場 ６，875-880，1986）。このアデカ(R)プ
ルロニックＦ−１２７ ３.０ｇを注射用蒸留水７.０ｇ
に氷冷下溶解し、３０％アデカ(R)プルロニックＦ−１
２７水溶液を調製した。氷冷下アデカ(R)プルロニック
Ｆ−１２７水溶液を９６−ウエルタイタープレートに３
６０μｌ／ウエルで分注し、８０μｇ ＢＭＰ−２を含
む０.０１Ｎ ＨＣｌ ４０μｌを各ウエルに加え混和
後、４℃で０.２２μｍのフィルターを透過させて滅菌
し、全量約４００μｌのＢＭＰ−２注射剤とした（アデ
カ(R)プルロニックＦ−１２７の最終濃度は２７％）。
同様にアデカ(R)プルロニックＦ−１２７の最終濃度が
１０、１５、１８及び２２.５％のＢＭＰ−２注射剤も
作製した。その結果、アデカ(R)プルロニックＦ−１２
７最終濃度２７％では５℃以下、アデカ(R)プルロニッ
クＦ−１２７最終濃度２２.５％では１０℃以下、アデ
カ(R)プルロニックＦ−１２７最終濃度１０％から１８
％では２５℃以下で注入可能であり、３７℃においてゲ
ル状に相変化したアデカ(R)プルロニックＦ−１２７注
射剤は、最終濃度が１５％以上の製剤であった。従っ
て、室温で液状であり３７℃でゲル状を示したアデカ
(R)プルロニックＦ−１２７最終濃度１８％の製剤が最
適である。
【００２１】実施例２ ＭＰ５２を含有する軟骨・骨
誘導性修復用材料の調製法 実施例１のＢＭＰ−２を用いた軟骨・骨誘導性修復用材
料の調製方法と同様にアデカ(R)プルロニックＦ−１２
７の最終濃度が１０、１５、１８、２２.５および２７
％のＭＰ５２注射剤を作製した結果、ＭＰ５２を用いて
もＢＭＰ−２の場合と同様な注射剤つまりアデカ(R)プ
ルロニックＦ−１２７最終濃度２７％では５℃以下、ア
デカ(R)プルロニックＦ−１２７最終濃度２２.５％では
１０℃以下、アデカ(R)プルロニックＦ−１２７最終濃
度１０％から１８％では２５℃以下で注入可能な製剤が
得られた。
【００２２】実施例３ イン・ビボ（in vivo）にお
ける軟骨・骨誘導性修復用材料投与後のＭＰ５２の残存
性 麻酔下雄性マウス（ＩＣＲ系、８週令）の右後足大腿部
の筋肉内に、実施例２の処方に125Ｉ標識ＭＰ５２を添
加して同様に作製した１８、２２.５及び２７％アデカ
(R)プルロニックＦ−１２７最終濃度の125Ｉ標識ＭＰ５
２注射剤を２３Ｇ針で１００μｌ投与し(約３７ＫＢｑ
125Ｉ−ＭＰ５２／部位)、右後足からの放射能消失経過
を０.５、２及び８時間後のその残存率を観察した。こ
の時対照として、125Ｉ−ＭＰ５２水溶液の注射剤を用
いた。結果を表２に示す。
【表２】 表２から、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレング
リコール類を医薬用担体として用いた場合、残存するＭ
Ｐ５２は単にＭＰ５２水溶液を注入した場合に比較して
明らかに薬物を保持することが示された。また実施例１
の注射剤についても同様の結果が得られた。
【００２３】実施例４ 異所性軟骨・骨形成能による
薬効試験 麻酔下雄性マウス（ＩＣＲ系、８週令）の右後足大腿部
の筋肉内に、実施例２で作製した１８％アデカ(R)プル
ロニックＦ−１２７最終濃度のＭＰ５２注射剤を２３Ｇ
針で１００μｌ投与した（２０μｇ ＭＰ５２／部
位）。この時対照としては、ＭＰ５２を含有しないアデ
カ(R)プルロニックＦ−１２７の注射剤を用いた。軟骨
・骨形成の判断は、投与２週間後に行った。マウスを頚
椎脱臼により屠殺後、投与部位である右後足を切り出し
軟Ｘ線照射器により撮像を得、投与部位における骨形成
の有無を確認した。結果を図２に示す（ｎ＝５）。軟Ｘ
線撮像の結果、アデカ(R)プルロニックＦ−１２７のみ
（図２−ａ）では投与部位である筋肉内に影は認められ
なかったが、ＭＰ５２を含有するアデカ(R)プルロニッ
クＦ−１２７（図２−ｂ）では試験した動物の８０％以
上に明らかな影が確認された。 さらに、軟Ｘ線撮影終了後、検体を１０％ホルマリン内
で保存し、組織学的検査を実施した。図２−ｂに示した
５匹のマウスのうち右端のマウスの組織染色の顕微鏡写
真を図３に示す。図３においてフォンコッサ（von-Koss
a）染色（図３−ａ）により影の部分にカルシウムの沈
着が観察され、ヘマトキシリン−エオシン（Hematoxyli
n-Eosin）染色（図３−ｂ）の結果から骨芽細胞、骨基
質および骨髄が認められ骨の形成が確認された。また炎
症反応は観察されなかった。図中のＢＭ、ＯＢおよびＭ
Ａはそれぞれ骨基質、骨芽細胞および骨髄を示す。実施
例１で作製した１８％アデカ(R)プルロニックＦ−１２
７最終濃度のＢＭＰ−２注射剤についての同様の試験を
実施したところ、同様の結果が得られた。 以上の結果からポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
ングリコール類を骨形成因子の担体として使用する場合
の安全性、有用性が確認された。
【００２４】参考例 新規なタンパク質ＭＰ５２の調
製 １．ベクターの作製 (１) 変異型ＭＰ５２成熟型部分の単離 ヒトＭＰ５２ｃＤＮＡは、WO 93／16099に記載されたｃ
ＤＮＡを含んだプラスミドベクター（ｐＳＫ５２ｓ）を
鋳型ＤＮＡとして、成熟型部分のみをポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。開始コドンＡＴＧ周
辺のＡＴ含量を上げる事により、目的タンパク質の生産
性を上げる方法｛M. Nobuharaらの報告（Agric. Biol.
Chem., 52(6), 1331〜1338, 1988)｝に従い成熟型のＭ
Ｐ５２遺伝子の一部のＤＮＡを置換した。置換の方法
は、配列番号２の順方向ＰＣＲプライマーを用い、ＰＣ
Ｒ法で行った。ＰＣＲプライマーのＤＮＡ配列は、順方
向プライマーとして配列番号２、及び逆方向プライマー
として配列番号３記載のＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、同
じ試験管中で、鋳型ＤＮＡ（１０ナノグラム）、順方向
及び逆方向ＰＣＲプライマー各々５０ピコモル、ｄＮＴ
Ｐ（０.２ミリモル）、及びＭｇＣｌ2（１.５ミリモ
ル）をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ）と共に加え
ることにより行った。各サイクルが、変性（９４℃、１
分間）、プライマーアニーリング（５５℃、１分間）、
およびプライマー伸長（７２℃、２分間）からなる３０
サイクルのＰＣＲを行った（以下のＰＣＲはすべてこの
条件で行った）。ＰＣＲ反応からの生成物を１.５％低
融点アガロース（ＦＭＣ社）中で電気泳動により分離
し、配列番号１のアミノ酸配列に相当する約３６０bpか
らなるＤＮＡを切り出した（これをフラグメント１とす
る）。 (２) 本タンパク質の大腸菌発現ベクターの構築 プラスミドの複製数を上げるためには、複製オリジンを
ｐＢＲ系からｐＵＣ系に改変した。市販の大腸菌発現ベ
クターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・バイオテク株
式会社より購入）のｔａｃプロモーター領域を制限酵素
ＳｓｐＩとＥｃｏＲＩで消化後、Mung Bean Nuclease
（宝酒造株式会社，カタログ番号２４２０Ａ）で処理
し、フラグメント１の開始コドン側にＴ４ＤＮＡ Ligas
e（宝酒造株式会社，カタログ番号２０１１Ａ）で結合
させ、ｐＫＫ２２３−３のｒｒｎＢＴ1Ｔ2ターミネータ
ー領域を制限酵素ＳａｌＩとＳｓｐＩで消化し、Ｓａｌ
Ｉで消化したフラグメント１の終止コドン側に結合さ
せ、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に組み込むことにより、
本タンパク質の生産のための発現ベクター｛ｐＫＯＴ２
４５（受託番号微工研寄第Ｐ−１４８９５号）｝（図
４）を構築した。ｐＫＯＴ２４５のＤＮＡの長さは３.
７kbである。作製した本タンパク質発現ベクターは、Ph
armacia ALF DNA シークエンサーによりその塩基配列の
決定を行った。 (３) 形質転換 形質転換は、Kushnerらの塩化ルビジウム法（Genetic E
ngineering, p.17, Elsevier (1978)）に従った。即
ち、ｐＫＯＴ２４５を宿主大腸菌Ｗ３１１０Ｍへ上記の
手法に従い移入し、本タンパク質生産大腸菌とした。
【００２５】２．培養 (１) 培養 本タンパク質発現大腸菌を改変ＳＯＣ培地（Bacto tryp
tone 20ｇ/l, Bacto yeast extract ５ｇ/ｌ, NaCl 0.5
ｇ/ｌ, MgCl2・6H2O 2.03ｇ/ｌ, Glucose 3.6ｇ/ｌ）で
前培養し、生産用培地（Bacto tryptone ５ｇ/ｌ, Citr
ic acid 4.3ｇ/ｌ, K2HPO4 4.675ｇ/ｌ, KH2PO4 1.275
ｇ/ｌ, NaCl 0.865ｇ/ｌ, FeSO4・7H2O 100mg/ｌ, CuSO4
・5H2O １mg/ｌ, MnSO4・nH2O 0.5mg/ｌ, CaCl2・2H2O ２m
g/ｌ, Na2B4O7・10H2O 0.225mg/ｌ, (NH4)6Mo7O24 0.1mg
/ｌ, ZnSO4・7H2O 2.25mg/ｌ, CoCl2・6H2O ６mg/ｌ, MgS
O4・7H2O 2.2ｇ/ｌ, Thiamine HCl 5.0mg/ｌ, Glucose
３ｇ/ｌ）５Ｌに対し菌体懸濁液を１００ml添加し、１
０Ｌの培養槽で通気攪拌しながら培養し、対数増殖前期
（OD550＝5.0）に達した段階で１mMの濃度でイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに
OD550が150に達するまで培養した。培養中、温度は３２
℃、pHはアンモニアを添加することにより7.15に制御
し、溶存酸素濃度の低下を防ぐために攪拌速度をあげる
ことにより空気飽和の５０％に溶存酸素濃度を制御し
た。また、高菌体濃度とするために溶存酸素濃度の急激
な上昇を指標として、５０％グルコース溶液を0.2％濃
度で添加しながら培養した。 (２) 大腸菌インクルージョンボディの調製 上記方法により得られた培養液を遠心して菌体を回収
し、１０mMエチレンヂアミン四酢酸を含む２５mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を（pH7.3）に懸濁し菌体破砕装置
（ゴーリン社製）を用いて細菌を破砕し、再度遠心して
インクルージョンボディを含む沈殿を回収した。
【００２６】３．精製 (１) 大腸菌インクルージョンボディの可溶化 大腸菌インクルージョンボディを１％ Triton X−100で
３回洗浄後、３０００×ｇで３０分間、４℃で遠心し、
得られた沈殿を２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH８.
３、８Ｍ尿素、１０mM ＤＴＴ、１mM ＥＤＴＡで超音波
をかけながら可溶化した。 (２) 単量体精製 その可溶化液を２００００×ｇで３０分間、４℃で遠心
し、その上清を回収した。得られた上清を２０mM Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ緩衝液pH８.３、６Ｍ尿素、１mM ＥＤＴＡ
で平衡化したSP−Sepharose FF（ファルマシア社）に通
し、同溶液で洗浄後、０.５Ｍ食塩を含む同溶液で溶出
させた。溶出液にＮａ2ＳＯ3とＮａ2Ｓ4Ｏ6をそれぞれ
最終濃度が１１１mM、１３mMになるように加え４℃、１
５時間スルホン化を行った。スルホン化溶液を２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH８.３、６Ｍ尿素、０.２Ｍ
食塩、１mM ＥＤＴＡで平衡化したSephacryl S−200
（ファルマシア社）でゲル濾過を行い、単一なスルホン
化された本タンパク質単量体を得た。 (３) リフォールディング スルホン化された本タンパク質単量体の溶液に９倍量の
５０mM Ｎａ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液pH９.８、１Ｍ塩化
ナトリウム、３０mM ＣＨＡＰＳ、５mM ＥＤＴＡ、２mM
ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、１mM ＧＳＳＧ（酸化
型グルタチオン）を加えた後、３日間、４℃で撹拌しリ
フォールディングを行った。 (４) 二量体精製 リフォールディングされた試料を０.０５％ＴＦＡ、２
５％アセトニトリルで平衡化しておいた逆相ＨＰＬＣの
RESOURCE RPCカラム（ファルマシア社）に通し、０.０
５％ＴＦＡ、２５〜４５％アセトニトリルグラジェント
により溶出した。溶出液は吸光度光度計を用い２８０nm
の吸光度によりモニターした。ＭＰ５２二量体画分を回
収し、凍結乾燥した。これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン
酸緩衝液、pH８.０、８Ｍ尿素、１Ｍ食塩で平衡化して
おいたSephacryl S−200でゲル濾過を行った後、本タン
パク質二量体画分を上述と同様の条件で逆相ＨＰＬＣの
RESOURCE RPCカラムに通し精製された本タンパク質二量
体画分を得た。
【００２７】(５) 精製された本タンパク質の物理化学
的性質の測定 （ア）Ｎ末端アミノ酸配列分析 上記で得られた精製された本タンパク質につき、Ｎ末端
アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー、モデル４７６
Ａ（アプライドバイオシステムズ社）により分析したと
ころ、配列表配列番号１で示すＮ末端から３０番目まで
のアミノ酸配列が確認された。 （イ）アミノ酸組成分析 上記で得られた精製された本タンパク質のアミノ酸組成
をアミノ酸分析機〔PICO TAGシステム(ウォーターズ
社)〕により調べた。その結果を表３に示す。表に示さ
れた数は１モノマー当りのアミノ酸残基数を示す。
【表３】 （ウ）電気泳動による分析 上記で得られた精製された本タンパク質の分子量を非還
元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、約
２８KDaの分子量を示した。上記(ア)、(イ)および(ウ)
に示された結果より、本タンパク質はＮ末端が単一にＰ
ｒｏから始まる１１９残基からなるタンパク質であるこ
とが解った。
【００２８】
【発明の効果】本発明にかかる軟骨・骨誘導性修復用材
料は、外科的手術を必要としない骨折治療法において、
生体吸収性が高く、有効成分である骨誘導因子との親和
性が良く、温度によってゾル−ゲル可逆変化を起こすこ
とから操作が簡便なうえ、患者に外科的手術による苦痛
を与えることなく患部に投与できる。これにより骨誘導
因子の薬効を持続させ、さらには副作用の少ない軟骨・
骨誘導性修復用材料が提供できる。
【００２９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源： 生物名：ヒト（homo sapiens） 組織の種類：ヒト胎児 配列の特徴： 存在位置： 他の情報：ＭＰ５２アミノ酸配列の３８３番目から５０
１番目のアミノ酸配列。 配列： CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48 Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala 5 10 15 CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96 Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp 20 25 30 GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144 Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu 35 40 45 GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192 Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His 50 55 60 GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240 Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288 Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe 85 90 95 ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336 Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 110 GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357 Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：ＭＰ５２成熟型単離用順方向ＰＣＲプライ
マー。 配列： ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＣ ＴＡＧＣＡＡＣＴＣＧ ＴＣＡＧＧＧＣ ２７
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：ＭＰ５２成熟型単離用逆方向ＰＣＲプライ
マー。 配列： ＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣ ＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣ ＡＣＧＡＣＴ ２６
【図面の簡単な説明】
【図１】アデカ(R)プルロニックの分類図である。横軸
はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール
類の総分子中のエチレンオキサイドの含量を重量％で表
し、縦軸はポリオキシエチレンポリオキシプロピレング
リコール類の構成成分のポリプロピレングリコールの分
子量を表す。
【図２】実施例４で得られたマウスの右後足大腿部の骨
・軟骨石灰化組織の軟Ｘ線写真である。(ａ)はアデカ
(R)プルロニックＦ−１２７のみ、(ｂ)はＭＰ５２含有
アデカ(R)プルロニックＦ−１２７をそれぞれ投与後２
週間に撮影した。筋肉内に黒く見える部分が異所性に形
成された骨である。
【図３】実施例４で得られたマウスの右後足大腿部の非
脱灰切片の組織染色顕微鏡写真である。フォンコッサ
（von-Kossa）染色(ａ)において骨基質の形成が、ヘマ
トキシリン−エオシン（Hematoxylin-Eosin）染色(ｂ)
において骨芽細胞をともなった骨基質の形成および骨髄
の形成が確認される。
【図４】参考例１（２）で得られたタンパク質ＭＰ５２
の発現ベクター（ｐＫＯＴ２４５）のプラスミドマップ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
    ングリコール類と骨誘導因子とを含む軟骨・骨誘導性修
    復用材料。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリオキシエチレンポ
    リオキシプロピレングリコール類の構成成分であって、
    ポリプロピレングリコールの分子量が約１５００〜４０
    ００の範囲にあり、エチレンオキサイド含量が約４０〜
    ８０％／分子の範囲にある軟骨・骨誘導性修復用材料。
  3. 【請求項３】 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレ
    ングリコール類の対水溶液濃度が約１０〜５０％からな
    る請求項２に記載の軟骨・骨誘導性修復用材料。
  4. 【請求項４】 骨誘導因子がタンパク質ＢＭＰ−２であ
    る請求項１〜３に記載の軟骨・骨誘導性修復用材料。
  5. 【請求項５】 骨誘導因子がタンパク質ＭＰ５２である
    請求項１〜３に記載の軟骨・骨誘導性修復用材料。
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