JPH09143199A - 血小板第４因子の製造方法 - Google Patents
血小板第４因子の製造方法Info
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- JPH09143199A JPH09143199A JP7324035A JP32403595A JPH09143199A JP H09143199 A JPH09143199 A JP H09143199A JP 7324035 A JP7324035 A JP 7324035A JP 32403595 A JP32403595 A JP 32403595A JP H09143199 A JPH09143199 A JP H09143199A
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- Japan
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- platelet
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- platelet factor
- heparin
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
-
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血小板第４因子の量産に適した製造法を提供
する。 【解決手段】 血小板第４因子含有溶液を硫酸化キチン
に接触させて該因子を吸着させ、次いで該因子を溶離さ
せることよりなる血小板第４因子の製造方法。 【効果】 ヘパリンを固定化したカラムを用いてアフィ
ニティクロマトグラフィによって血小板第４因子を補集
する従来の方法にくらべ、本発明の方法では吸着剤硫酸
化キチンの入手が容易で、かつ操作も簡単であり、目的
物の収率もすぐれている。
する。 【解決手段】 血小板第４因子含有溶液を硫酸化キチン
に接触させて該因子を吸着させ、次いで該因子を溶離さ
せることよりなる血小板第４因子の製造方法。 【効果】 ヘパリンを固定化したカラムを用いてアフィ
ニティクロマトグラフィによって血小板第４因子を補集
する従来の方法にくらべ、本発明の方法では吸着剤硫酸
化キチンの入手が容易で、かつ操作も簡単であり、目的
物の収率もすぐれている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血小板第４因子の精製法
に関する。
に関する。
【０００２】
【従来の技術】心臓バイパス手術などの直視下心臓内手
術では、一定時間心臓に出入りする血液を遮断する必要
があり、一時的に心臓と肺の機能を人工心肺に代行をさ
せる。その人工心肺内での血液凝固を防ぐために、そこ
へ流入する血液にヘパリンが投与され、術後、患者の血
液凝固能回復のため硫酸プロタミンが投与されている。
また腎機能障害のある患者に対する血液透析療法におい
ても同様の目的でヘパリンと硫酸プロタミンが用いられ
ている。しかし、この硫酸プロタミン投与により、アレ
ルギー反応、血小板や白血球の減少、血圧低下、徐脈、
呼吸困難、熱感、一過性皮膚潮紅、悪心・嘔吐、肺水腫
などの種々の副作用が生じることが知られ、使用には注
意が必要とされる（日本薬局方１２改正：Ｖｉｅｒａ，
Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏ．Ａｍｅｒ．ｓｕｒｇｅｏ
ｎ，５０，１５１，１９８４）。
術では、一定時間心臓に出入りする血液を遮断する必要
があり、一時的に心臓と肺の機能を人工心肺に代行をさ
せる。その人工心肺内での血液凝固を防ぐために、そこ
へ流入する血液にヘパリンが投与され、術後、患者の血
液凝固能回復のため硫酸プロタミンが投与されている。
また腎機能障害のある患者に対する血液透析療法におい
ても同様の目的でヘパリンと硫酸プロタミンが用いられ
ている。しかし、この硫酸プロタミン投与により、アレ
ルギー反応、血小板や白血球の減少、血圧低下、徐脈、
呼吸困難、熱感、一過性皮膚潮紅、悪心・嘔吐、肺水腫
などの種々の副作用が生じることが知られ、使用には注
意が必要とされる（日本薬局方１２改正：Ｖｉｅｒａ，
Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏ．Ａｍｅｒ．ｓｕｒｇｅｏ
ｎ，５０，１５１，１９８４）。
【０００３】一方、血小板数に応じて血小板のヘパリン
中和作用が異なることから、血小板中にヘパリン中和物
質が存在することが報告された（Ｃ．Ｌ．Ｃｏｎｌｅｙ
など，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｌ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．，６９，２８４−２８７，１９４８）。以後、血小
板中のヘパリン中和物質として血小板第４因子（略称、
ＰＦ４）を始め、β−トロンボグロブリン、低親和性Ｐ
Ｆ４、血小板塩基性蛋白、フィブロネクチン、トロンボ
スポンディンなどが存在することが報告されたが、ＰＦ
４はこれらの中でヘパリンの親和性が最も強いものであ
った。このＰＦ４は分子量７．８ｋＤａのタンパク質で
あり、そのヘパリン中和活性は硫酸プロタミン投与で見
られる副作用（白血球減少、血圧低下、肺水腫）を起こ
さないことが報告されている（Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｊ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５，３，１９
９２）。そこで、このＰＦ４はプロタミンに代わるヘパ
リン中和剤として期待される。
中和作用が異なることから、血小板中にヘパリン中和物
質が存在することが報告された（Ｃ．Ｌ．Ｃｏｎｌｅｙ
など，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｌ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．，６９，２８４−２８７，１９４８）。以後、血小
板中のヘパリン中和物質として血小板第４因子（略称、
ＰＦ４）を始め、β−トロンボグロブリン、低親和性Ｐ
Ｆ４、血小板塩基性蛋白、フィブロネクチン、トロンボ
スポンディンなどが存在することが報告されたが、ＰＦ
４はこれらの中でヘパリンの親和性が最も強いものであ
った。このＰＦ４は分子量７．８ｋＤａのタンパク質で
あり、そのヘパリン中和活性は硫酸プロタミン投与で見
られる副作用（白血球減少、血圧低下、肺水腫）を起こ
さないことが報告されている（Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｊ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５，３，１９
９２）。そこで、このＰＦ４はプロタミンに代わるヘパ
リン中和剤として期待される。
【０００４】また、ＰＦ４はヘパリン中和剤だけでなく
血管新生阻止作用が期待される。血管新生は既存の血管
から新しく毛細血管が作られることであり、正常な個体
では性周期に応じて変化する卵巣や子宮などの特殊な場
合でしか観察されず、その促進は創傷治癒過程以外では
生体にとって不利な場合（重症糖尿網膜症、未熟児網膜
症、尋常性乾鮮、悪性腫瘍）が多い、特に接触阻止がか
からない悪性腫瘍細胞は、その成長に酸素や栄養素の補
給が必要不可欠であり、そこではその補給路となる血管
の新生が盛んに行われている。血管新生の抑制は、悪性
腫瘍の抑制に有効であると考えられる。ＰＦ４の血管新
生阻害作用は報告されており（Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．
Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，７７−
７９，１９９０）、さらに、動物実験において悪性腫瘍
抑制に有用であるとの報告がなされている（Ｓｈａｐ
ｅ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２，８４８−８５３，１９９
０）。
血管新生阻止作用が期待される。血管新生は既存の血管
から新しく毛細血管が作られることであり、正常な個体
では性周期に応じて変化する卵巣や子宮などの特殊な場
合でしか観察されず、その促進は創傷治癒過程以外では
生体にとって不利な場合（重症糖尿網膜症、未熟児網膜
症、尋常性乾鮮、悪性腫瘍）が多い、特に接触阻止がか
からない悪性腫瘍細胞は、その成長に酸素や栄養素の補
給が必要不可欠であり、そこではその補給路となる血管
の新生が盛んに行われている。血管新生の抑制は、悪性
腫瘍の抑制に有効であると考えられる。ＰＦ４の血管新
生阻害作用は報告されており（Ｍａｉｏｎｅ，Ｔ．
Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，７７−
７９，１９９０）、さらに、動物実験において悪性腫瘍
抑制に有用であるとの報告がなされている（Ｓｈａｐ
ｅ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２，８４８−８５３，１９９
０）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来、ヒト由来のＰＦ
４の精製は、トロンビンなどの刺激で血小板より放出す
るタンパク質を含む溶液、または、血小板を凍結融解や
低張処理などにより溶血させることにより得られる血小
板抽出液などを原料として、ヘパリン固定化アフィニテ
ィーカラムを用いて行われてきた（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．
Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，２，３２４
−３２８，１９７６）。しかし、この方法では高価なヘ
パリン固定化アフィニティーカラムを使うこと、ならび
に、操作が煩雑なことなどの欠点があり、ＰＦ４を安価
にして、かつ、多量生産する工業的方法としては確立さ
れていない。そこで本発明者らは量産に適する新しいＰ
Ｆ４の製造法を探究した。
４の精製は、トロンビンなどの刺激で血小板より放出す
るタンパク質を含む溶液、または、血小板を凍結融解や
低張処理などにより溶血させることにより得られる血小
板抽出液などを原料として、ヘパリン固定化アフィニテ
ィーカラムを用いて行われてきた（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．
Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，２，３２４
−３２８，１９７６）。しかし、この方法では高価なヘ
パリン固定化アフィニティーカラムを使うこと、ならび
に、操作が煩雑なことなどの欠点があり、ＰＦ４を安価
にして、かつ、多量生産する工業的方法としては確立さ
れていない。そこで本発明者らは量産に適する新しいＰ
Ｆ４の製造法を探究した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】その結果、本発明者らは
たとえば血小板抽出液などのＰＦ４含有溶液を硫酸化キ
チンと接触させるとＰＦ４は特異的に硫酸化キチンに吸
着結合し、塩濃度を上げることにより溶出されることを
見出した。
たとえば血小板抽出液などのＰＦ４含有溶液を硫酸化キ
チンと接触させるとＰＦ４は特異的に硫酸化キチンに吸
着結合し、塩濃度を上げることにより溶出されることを
見出した。
【０００７】本発明はこの新知見に基づくもので、血小
板第４因子含有溶液を硫酸化キチンに接触させて同因子
を吸着させ、次いで吸着体から同因子を溶離させること
を特徴とする血小板第４因子の製造方法である。
板第４因子含有溶液を硫酸化キチンに接触させて同因子
を吸着させ、次いで吸着体から同因子を溶離させること
を特徴とする血小板第４因子の製造方法である。
【０００８】本発明において用いる原料の血小板第４因
子含有溶液としては、たとえば、人血液から遠心分離に
より回収した血小板を凍結・融解または、低張処理また
は、ホモジナイズなどにより破砕して得られる血小板抽
出液、または、血小板をトロンビンなどで刺激すること
により放出されるＰＦ４を含む溶液が挙げられる。
子含有溶液としては、たとえば、人血液から遠心分離に
より回収した血小板を凍結・融解または、低張処理また
は、ホモジナイズなどにより破砕して得られる血小板抽
出液、または、血小板をトロンビンなどで刺激すること
により放出されるＰＦ４を含む溶液が挙げられる。
【０００９】硫酸化キチンは甲殻類を原料として得られ
るキチンを硫酸化して製造、市販されている。
るキチンを硫酸化して製造、市販されている。
【００１０】硫酸化キチンはキチンの構造式中の水酸基
が一部または全てが硫酸化されていてもよく、２位のア
セタミノ基は一部脱アセチル化または硫酸化されていて
もよい。
が一部または全てが硫酸化されていてもよく、２位のア
セタミノ基は一部脱アセチル化または硫酸化されていて
もよい。
【００１１】ＰＦ４含有溶液と硫酸化キチンの接触は溶
液の液性を中性付近、ｐＨ約６〜９、好ましくはｐＨ約
７．５として行うのがよく、溶液の塩濃度は約１．５Ｍ
より低く、好ましくは約０．４Ｍとするのがよい。塩と
しては塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが普通用いら
れるが、ＰＦ４の吸着を妨げない限り硫酸ナトリウムな
どの他の塩でもよい。
液の液性を中性付近、ｐＨ約６〜９、好ましくはｐＨ約
７．５として行うのがよく、溶液の塩濃度は約１．５Ｍ
より低く、好ましくは約０．４Ｍとするのがよい。塩と
しては塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが普通用いら
れるが、ＰＦ４の吸着を妨げない限り硫酸ナトリウムな
どの他の塩でもよい。
【００１２】硫酸化キチンに対するＰＦ４含有溶液の割
合は特に限定されないが、たとえば人血液１Ｌから得ら
れる血小板抽出液に対しては硫酸化キチン１０〜１００
ｍＬを用いるのが好ましい。
合は特に限定されないが、たとえば人血液１Ｌから得ら
れる血小板抽出液に対しては硫酸化キチン１０〜１００
ｍＬを用いるのが好ましい。
【００１３】硫酸化キチンとＰＦ４含有溶液との接触時
間は特に限定されず、接触の操作はカラム法またはバッ
チ法のいずれを用いても行うことができる。上記の接触
により溶液中のＰＦ４は特異的に硫酸化キチンに吸着結
合する。
間は特に限定されず、接触の操作はカラム法またはバッ
チ法のいずれを用いても行うことができる。上記の接触
により溶液中のＰＦ４は特異的に硫酸化キチンに吸着結
合する。
【００１４】硫酸化キチンに結合したＰＦ４は中性付
近、ｐＨ約６〜９、好ましくはｐＨ約７．５で、吸着時
に用いたＰＦ４含有溶液の塩濃度よりも高い塩濃度、
０．５Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、の溶液を用いて溶
離することができる。塩としてはたとえば、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウムなどが好ましいが、イオン強度の変
化により溶出させるのであるから目的を達成しうる限り
他の塩でもよい。
近、ｐＨ約６〜９、好ましくはｐＨ約７．５で、吸着時
に用いたＰＦ４含有溶液の塩濃度よりも高い塩濃度、
０．５Ｍ以上、好ましくは１Ｍ以上、の溶液を用いて溶
離することができる。塩としてはたとえば、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウムなどが好ましいが、イオン強度の変
化により溶出させるのであるから目的を達成しうる限り
他の塩でもよい。
【００１５】かくして得られた、ＰＦ４はセファクリル
Ｓ−１００（ファルマシア社製）、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ
２０００（東ソー社製）などによりさらに脱塩、精製す
ることが可能である。
Ｓ−１００（ファルマシア社製）、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ
２０００（東ソー社製）などによりさらに脱塩、精製す
ることが可能である。
【００１６】次に実施例を挙げてさらに詳しく本発明を
説明するが、本発明はこれらによってなんら限定される
ものではない。
説明するが、本発明はこれらによってなんら限定される
ものではない。
【００１７】実施例１ 〔本発明によるＰＦ４の製造〕採取したヒト血液を２２
℃で３，５００ｘｇ、６分間の遠心分離により血漿を除
き、残った血球成分に９倍量の０．１５５Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液を加え室温で１０分間放置する。その後、４
℃で２２０ｘｇ、７分間遠心分離し、沈澱する白血球を
除く。この白血球を除いた上清をさらに４℃で１，２０
０ｘｇ、１０分間の遠心分離し、沈澱する血小板を採取
する。採取した血小板は生理食塩水で洗浄した後、−２
０℃で凍結する。凍結した血小板を融解し、４倍量の１
５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）と混合し、４℃
で７００ｘｇ、１０分間の遠心分離を行い上清を血小板
抽出液とした。血小板抽出液に最終濃度が０．４Ｍとな
るように塩化ナトリウムを加え、１５ｍＭトリス塩酸，
０．４Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化した硫酸化キチン
〔スルホン化キトパール（商品名）富士紡績社製〕に添
加した。結合したＰＦ４は１５ｍＭトリス塩酸，１．０
Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した。
℃で３，５００ｘｇ、６分間の遠心分離により血漿を除
き、残った血球成分に９倍量の０．１５５Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液を加え室温で１０分間放置する。その後、４
℃で２２０ｘｇ、７分間遠心分離し、沈澱する白血球を
除く。この白血球を除いた上清をさらに４℃で１，２０
０ｘｇ、１０分間の遠心分離し、沈澱する血小板を採取
する。採取した血小板は生理食塩水で洗浄した後、−２
０℃で凍結する。凍結した血小板を融解し、４倍量の１
５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）と混合し、４℃
で７００ｘｇ、１０分間の遠心分離を行い上清を血小板
抽出液とした。血小板抽出液に最終濃度が０．４Ｍとな
るように塩化ナトリウムを加え、１５ｍＭトリス塩酸，
０．４Ｍ塩化ナトリウム溶液で平衡化した硫酸化キチン
〔スルホン化キトパール（商品名）富士紡績社製〕に添
加した。結合したＰＦ４は１５ｍＭトリス塩酸，１．０
Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した。
【００１８】一方、従来の方法に従い上記の硫酸化キチ
ンと同量の１５ｍＭトリス塩酸，１．０Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液で平衡化したヘパリン−セファロース（ファルマ
シア社製）へ、最終濃度が１．０Ｍとなるように塩化ナ
トリウムを加えた血小板抽出液を、上記と同量添加し、
結合したＰＦ４を１５ｍＭトリス塩酸で緩衝化した２．
０Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した。その結果、本発明
の方法の場合、ヒト血液１Ｌあたり２０ｍｇが得られた
のに対して、従来法の場合、ヒト血液１Ｌあたり１０ｍ
ｇのＰＦ４が得られた。
ンと同量の１５ｍＭトリス塩酸，１．０Ｍ塩化ナトリウ
ム溶液で平衡化したヘパリン−セファロース（ファルマ
シア社製）へ、最終濃度が１．０Ｍとなるように塩化ナ
トリウムを加えた血小板抽出液を、上記と同量添加し、
結合したＰＦ４を１５ｍＭトリス塩酸で緩衝化した２．
０Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した。その結果、本発明
の方法の場合、ヒト血液１Ｌあたり２０ｍｇが得られた
のに対して、従来法の場合、ヒト血液１Ｌあたり１０ｍ
ｇのＰＦ４が得られた。
【００１９】試験例１ （ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）実施例１
で得られたＰＦ４とＳＤＳ化剤（２％ＳＤＳ、１０Ｍ尿
素、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍショ糖、５％β−メルカ
プトエタノール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．４）を等量混合し、１００℃、５分間加熱処理し
た。これを１５％から２５％の濃度勾配をかけたポリア
クリルアミドゲル（第一化学薬品社製）上で、０．１％
ＳＤＳ存在下で電気泳動した。ゲル上に分離されたタン
パク質を０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−
２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製：５０％メタノール、１０
％酢酸に溶解）で染色したところ、７．８ｋＤａに単一
のバンドが認められた（図１．）。
で得られたＰＦ４とＳＤＳ化剤（２％ＳＤＳ、１０Ｍ尿
素、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍショ糖、５％β−メルカ
プトエタノール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．４）を等量混合し、１００℃、５分間加熱処理し
た。これを１５％から２５％の濃度勾配をかけたポリア
クリルアミドゲル（第一化学薬品社製）上で、０．１％
ＳＤＳ存在下で電気泳動した。ゲル上に分離されたタン
パク質を０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−
２５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製：５０％メタノール、１０
％酢酸に溶解）で染色したところ、７．８ｋＤａに単一
のバンドが認められた（図１．）。
【００２０】試験例２ （ウエスターンブロッティング法）試験例１と同様にポ
リアクリルアミドゲルに展開した蛋白質をザルツブロッ
ト装置（ザルトリウス社製）中で電気的にＰＶＤＦ膜
（第一化学薬品社製）に移行後（２０％エタノールを含
むトリス−グリシン緩衝液を用い、２００ｍＡで３０分
通電することで行った。）、膜をＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ，５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．５）でよく洗浄
した後、５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ中に１時間保持し
非吸着部分をブロックした。次に、１％ＢＳＡを含むＴ
ＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ＴＢＳ）で５００
倍に希釈したヤギ抗ヒトＰＦ４抗血清（ＡＴＡＢ社製）
と膜を室温で１時間反応させた。反応後、膜をＴＴＢＳ
でよく洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳ５００倍
に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ヤギＩｇＧ
（ＢｉｏＭａｋｏｒ社製）と反応させた。反応後、ニト
ロブルーテトラゾリウム、ブロモクロロインドリルリン
酸を含む基質溶液で発色させたところ、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動、と同じ分子量領域に単一の
バンドが認められた（図１．）。
リアクリルアミドゲルに展開した蛋白質をザルツブロッ
ト装置（ザルトリウス社製）中で電気的にＰＶＤＦ膜
（第一化学薬品社製）に移行後（２０％エタノールを含
むトリス−グリシン緩衝液を用い、２００ｍＡで３０分
通電することで行った。）、膜をＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ，５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．５）でよく洗浄
した後、５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳ中に１時間保持し
非吸着部分をブロックした。次に、１％ＢＳＡを含むＴ
ＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ＴＢＳ）で５００
倍に希釈したヤギ抗ヒトＰＦ４抗血清（ＡＴＡＢ社製）
と膜を室温で１時間反応させた。反応後、膜をＴＴＢＳ
でよく洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＴＴＢＳ５００倍
に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ヤギＩｇＧ
（ＢｉｏＭａｋｏｒ社製）と反応させた。反応後、ニト
ロブルーテトラゾリウム、ブロモクロロインドリルリン
酸を含む基質溶液で発色させたところ、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動、と同じ分子量領域に単一の
バンドが認められた（図１．）。
【００２１】試験例３ （アミノ酸配列分析）実施例１で得られたＰＦ４を上記
の方法によりＰＶＤＦ膜に転写後、ＴＢＳで洗浄し、
０．１％ボンソーＳを含む１％酢酸で染色する。脱イオ
ン水、メタノールでの洗浄後、膜を乾燥させ染色された
部位を切り取りアミノ酸配列分析装置（アプライドバイ
オシステムズ社製）でＮ末９残基を測定したところ、す
でに報告されている配列（Ｄｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，６，２２５６−２２５８，１９７７）と一致
した。
の方法によりＰＶＤＦ膜に転写後、ＴＢＳで洗浄し、
０．１％ボンソーＳを含む１％酢酸で染色する。脱イオ
ン水、メタノールでの洗浄後、膜を乾燥させ染色された
部位を切り取りアミノ酸配列分析装置（アプライドバイ
オシステムズ社製）でＮ末９残基を測定したところ、す
でに報告されている配列（Ｄｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，７４，６，２２５６−２２５８，１９７７）と一致
した。
【００２２】試験例４ （ＰＦ４のヘパリン中和活性）アンチトロンビンIII は
トロンビンと結合することにより、トロンビンの活性を
阻害するが、その阻害はヘパリンの存在で著しく促進さ
れる。アンチトロンビンIII 、トロンビン、ヘパリンが
添加された溶液中へＰＦ４を添加することにより、回復
するトロンビンの活性をトロンビンの合成基質分解初速
度でもとめ、ＰＦ４のヘパリン中和活性を算出した。ヘ
パリン（最終濃度７．２×１０-3ｕｎｉｔｓ／ｍＬ：和
光純薬社製）、実施例１において本発明または従来法で
得られたＰＦ４、アンチトロンビンIII （最終濃度２．
９μｇ／ｍＬ：生化学工業社製）、４０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ７．４を混合し（全量２ｍＬ）、３７℃で、３
０秒間放置後、トロンビン（最終濃度０．１８μｇ／ｍ
Ｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１５μＬを加え、３７℃、１分間
放置する、発色基質Ｓ−２２３８（最終濃度０．１ｍＭ
／ｍＬ：第一化学社製）を添加後、トロンビンによる発
色基質の分解を４０５ｎｍの吸収の上昇で経時的に測定
した。その結果、本発明の方法により得られたＰＦ４
は、従来法（ヘパリン−セファロース）で得たものと同
等の比活性を有していた（図２．）。
トロンビンと結合することにより、トロンビンの活性を
阻害するが、その阻害はヘパリンの存在で著しく促進さ
れる。アンチトロンビンIII 、トロンビン、ヘパリンが
添加された溶液中へＰＦ４を添加することにより、回復
するトロンビンの活性をトロンビンの合成基質分解初速
度でもとめ、ＰＦ４のヘパリン中和活性を算出した。ヘ
パリン（最終濃度７．２×１０-3ｕｎｉｔｓ／ｍＬ：和
光純薬社製）、実施例１において本発明または従来法で
得られたＰＦ４、アンチトロンビンIII （最終濃度２．
９μｇ／ｍＬ：生化学工業社製）、４０ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ７．４を混合し（全量２ｍＬ）、３７℃で、３
０秒間放置後、トロンビン（最終濃度０．１８μｇ／ｍ
Ｌ：ＳＩＧＭＡ社製）１５μＬを加え、３７℃、１分間
放置する、発色基質Ｓ−２２３８（最終濃度０．１ｍＭ
／ｍＬ：第一化学社製）を添加後、トロンビンによる発
色基質の分解を４０５ｎｍの吸収の上昇で経時的に測定
した。その結果、本発明の方法により得られたＰＦ４
は、従来法（ヘパリン−セファロース）で得たものと同
等の比活性を有していた（図２．）。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば入手容易な硫酸化キチン
を吸着剤として用いることにより血小板第４因子含有溶
液から該因子を特異的に吸着、採取することができ、そ
の収率もヘパリン固定化アフィニティーカラムを用いる
従来法にくらべて遙かに高い。したがって本発明の方法
は血小板第４因子の工業的量産法として適している。
を吸着剤として用いることにより血小板第４因子含有溶
液から該因子を特異的に吸着、採取することができ、そ
の収率もヘパリン固定化アフィニティーカラムを用いる
従来法にくらべて遙かに高い。したがって本発明の方法
は血小板第４因子の工業的量産法として適している。
【図１】実施例１で得られた本発明方法および従来法で
得られた血小板第４因子のウエスターン・ブロット（写
真）の複写である。
得られた血小板第４因子のウエスターン・ブロット（写
真）の複写である。
【図２】本発明の方法により得られた血小板第４因子の
ヘパリン中和作用を示すグラフである。
ヘパリン中和作用を示すグラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成８年５月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図 １】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた本発明方法および従来法で
得られた血小板第４因子のウエスターン・ブロット法に
よる電気泳動の写真である。
得られた血小板第４因子のウエスターン・ブロット法に
よる電気泳動の写真である。
【図２】本発明の方法により得られた血小板第４因子の
ヘパリン中和作用を示すグラフである。
ヘパリン中和作用を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西室 悟司 兵庫県神戸市東灘区住吉本町３丁目10番26 号103
Claims (5)
- 【請求項１】 血小板第４因子含有溶液を硫酸化キチン
に接触させて同因子を吸着させ、次いで吸着体から同因
子を溶離させることを特徴とする血小板第４因子の製造
方法。 - 【請求項２】 硫酸化キチンはキチンの水酸基の少なく
とも一部が硫酸化され、アセタミノ基はそのままかまた
は一部脱アセチル化されて硫酸化されたものである請求
項１または２記載の方法。 - 【請求項３】 硫酸化キチンに接触させる血小板第４因
子含有溶液に低濃度の塩を含有させ、それよりも高濃度
の塩を含有する溶液でキチンから同因子を溶離させる請
求項１記載の方法。 - 【請求項４】 血小板第４因子含有溶液に約１．５Ｍ以
下、好ましくは約０．４Ｍの塩を含有させ、硫酸化キチ
ンからの同因子を溶離をそれよりも高濃度の塩を含有す
る溶液を用いて行い、その塩の濃度が少なくとも０．５
Ｍ、好ましくは少なくとも１Ｍである請求項１または４
記載の方法。 - 【請求項５】 血小板第４因子の硫酸化キチンへの接触
と吸着体からの同因子の溶離を中性付近のｐＨで行う請
求項１または４記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7324035A JPH09143199A (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | 血小板第４因子の製造方法 |
| KR1019960054597A KR970027103A (ko) | 1995-11-17 | 1996-11-15 | 혈소판 인자-4의 제조 방법 |
| CN96114490A CN1157829A (zh) | 1995-11-17 | 1996-11-15 | 生产血小板因子-4的方法 |
| DE69606959T DE69606959T2 (de) | 1995-11-17 | 1996-11-15 | Verfahren zur Herstellung von Plättchen-Faktor-4 |
| EP96308341A EP0776907B1 (en) | 1995-11-17 | 1996-11-15 | Process for producing platelet factor-4 |
| AT96308341T ATE190319T1 (de) | 1995-11-17 | 1996-11-15 | Verfahren zur herstellung von plättchen-faktor-4 |
| US08/749,401 US5847084A (en) | 1995-11-17 | 1996-11-15 | Process for obtaining platelet factor-4 |
| TW085114251A TW408128B (en) | 1995-11-17 | 1996-11-20 | Process for obtaining platelet factor-IV |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7324035A JPH09143199A (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | 血小板第４因子の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09143199A true JPH09143199A (ja) | 1997-06-03 |
Family
ID=18161433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7324035A Pending JPH09143199A (ja) | 1995-11-17 | 1995-11-17 | 血小板第４因子の製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5847084A (ja) |
| EP (1) | EP0776907B1 (ja) |
| JP (1) | JPH09143199A (ja) |
| CN (1) | CN1157829A (ja) |
| AT (1) | ATE190319T1 (ja) |
| DE (1) | DE69606959T2 (ja) |
| TW (1) | TW408128B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974107A (zh) * | 2010-09-16 | 2011-02-16 | 山东海科化工集团有限公司 | 一种酯化物的分离方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7265097B2 (en) * | 2002-08-20 | 2007-09-04 | Chitogenics, Inc. | Methods of drug delivery using sulphated chitinous polymers |
| WO2005103281A2 (en) * | 2004-04-26 | 2005-11-03 | Children's Medical Center Corporation | Platelet biomarkers for the detection of disease |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4278594A (en) * | 1979-06-19 | 1981-07-14 | David Amrani | Process for separation and isolation of AHF, von Willebrand's ristocetin cofactor (VWF:RCF) and fibronectin from blood plasma |
| CA1221307A (en) * | 1982-12-02 | 1987-05-05 | Nobutaka Tani | Adsorbent and process for preparing the same |
| US4894440A (en) * | 1986-09-17 | 1990-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of isolating megakaryocyte stimulatory factor |
| US5258502A (en) * | 1989-01-30 | 1993-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Immobilization and purification of fusion proteins using chitin-binding ability |
| US5053133A (en) * | 1990-02-09 | 1991-10-01 | Elias Klein | Affinity separation with activated polyamide microporous membranes |
| US5204321A (en) * | 1990-02-16 | 1993-04-20 | Repligen Corporation | Heparin neutralization with platelet factor 4 |
| US5298488A (en) * | 1990-10-26 | 1994-03-29 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | CM-chitin derivatives and use thereof |
| US5324823A (en) * | 1991-03-26 | 1994-06-28 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | Adsorbent for cellular fibronectin and a method for fractional purification of fibronectin |
| ZA936925B (en) * | 1992-09-25 | 1995-03-20 | Lilly Co Eli | Modified platelet factor-4. |
-
1995
- 1995-11-17 JP JP7324035A patent/JPH09143199A/ja active Pending
-
1996
- 1996-11-15 EP EP96308341A patent/EP0776907B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-15 CN CN96114490A patent/CN1157829A/zh active Pending
- 1996-11-15 US US08/749,401 patent/US5847084A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-15 DE DE69606959T patent/DE69606959T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-15 AT AT96308341T patent/ATE190319T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-20 TW TW085114251A patent/TW408128B/zh not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974107A (zh) * | 2010-09-16 | 2011-02-16 | 山东海科化工集团有限公司 | 一种酯化物的分离方法 |
| CN101974107B (zh) | 2010-09-16 | 2012-07-04 | 山东海科化工集团有限公司 | 一种酯化物的分离方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0776907A2 (en) | 1997-06-04 |
| ATE190319T1 (de) | 2000-03-15 |
| EP0776907B1 (en) | 2000-03-08 |
| EP0776907A3 (ja) | 1997-06-18 |
| CN1157829A (zh) | 1997-08-27 |
| DE69606959D1 (de) | 2000-04-13 |
| DE69606959T2 (de) | 2000-07-06 |
| US5847084A (en) | 1998-12-08 |
| TW408128B (en) | 2000-10-11 |
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