JPS6322526A

JPS6322526A - 肝細胞増殖因子

Info

Publication number: JPS6322526A
Application number: JP61166495A
Authority: JP
Inventors: Eiichi Aida; 合田　栄一; Hirohito Tsubouchi; 博仁坪内; Hiroyuki Nakayama; 中山　宏幸; Shiyuuichi Hirono; 弘野　修一; Kozo Takahashi; 耕三高橋; Shuji Hashimoto; 修治橋本; Yasushi Daikuhara; 大工原　恭
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-07-14
Filing date: 1986-07-14
Publication date: 1988-01-30
Anticipated expiration: 2011-12-18
Also published as: JP2564486B2; US5004805A; CA1300010C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本Ｒ明Ｌｔ、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇ
ｒｏｗｔｈ　　ｆａｃｔｏｒ　：　ＨＧ　Ｆ　）　、詳
しくはヒト血液に山来し、肝細胞の増殖を可能とする新
しい蛋白性物質に関する。

従　　来　　の　　技　　術肝臓は、生体内中間代謝の中心的役割を果たすｉ！５度
に分化の進んだ原性器官であり、その機能は肝臓を構成
する肝実質細胞が担っている。しかして、例えばラット
の肝臓はそのほぼ２／３を切除しても、残された組織が
急速に増殖を開始し、約１０日後には元の大きざに戻る
ことが知られ、この事実を利用して、ヒトでも肝癌ｊｋ
者等において肝組織の部分切除手術後、残された正常肝
組織からの増殖を持つ治療法が行なわれている。

上記肝臓の増殖（肝再生）機序につき、従来より各種の
研究が行なわれ、肝切除後のラットの血液中に何らかの
増殖促進因子が出現することが示唆され、該因子（ｒａ
ｔ　ｈｃｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏ
ｒ；ｒＨＧ　Ｆ　）の部分精製に成功した例も種々報告
されている。しかしながら報告された各ｒＨＧＦはその
分子艮や物理化学的性質の点で必ずしも一致せず、いま
だ不明な点が多く、またこれまでにヒトの血液中に同様
の肝細胞増殖因子が存在することを示した報告はなかっ
た。

本発明者らも、以前より上記肝細胞増殖促進因子につき
、鋭意研究を重ねてぎたが、その過程で劇症肝炎患３の
血清が高い肝細胞増殖活性を有すルコとを初めて見出し
た（　３１ｏｌｅｄ、Ｒｅｓ、、　６　。

２３１　（１９８５））。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、上記本発明者らの研究に係わる劇症肝
炎患者血液中に存在する新しい肝細胞増殖因子を分離精
製して、その性質や臨床的応用のための知見を得ること
にある。

問題点を解決するための手段本発明によれば、ヒト血液に由来し以下の理化学的性質
及び生理活性を有する蛋白性物質であることを１５徴と
する肝細胞増殖因子（ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ
　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　；　ｈ　ＨＧ　Ｆ　）
が１足供される。

１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　（非還元条件下）による１１１
定分子伝が約７６０００〜９２０００である、２）肝ｍ
胞を増殖させる活性を有する、３）８０℃、１０分間の
加熱処理により上記活性が失活する、４）トリプシン消化及びキモトリプシン消化により上記
活性が失活する、及び５）ヘパリンに強い親和性を有する。

本発明ｈＨＧＦの上記特性及びその他の性状については
、後記実施例において詳述する。

本発明のｈＨＧＦは急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、劇症
肝炎等の肝疾患の治療乃至は肝切除術後の治療薬として
、また上記各疾患の免疫学的診断を確立するための抗原
等として有用である。更に該ｈｌ−（ＧＦの利用によれ
ば、ヒトをはじめとじて各種動物由来の肝細胞を、該ｈ
ＨＧＦの存在下に生体外で極めて容易に増殖、維持する
ことができ、かくして増殖、維持される肝ｔ８胞は、例
えば肝機能等の基礎的研究用、各種ホルモンもしくは薬
剤等の肝細胞に対する作用の研究用、肝疾患治療薬等の
スクリーニング試験用等に有用であり、更に発癌試験用
及び肝炎ウィルスの生体外培養における宿主細胞として
も有用である。本発明はかかる有用な生理活性物質を提
供するものである。

以下、本発明のｈＨＧ　Ｆの製造方法につき詳述する。

本発明１１１−ＩＧＦは、ヒト血液、殊に劇症肝炎患者
の血液より効率よく、しかも高収率で単離することがで
きる。ここで原料として用いられる血液は、常法に従っ
て１ｎることができ、通常は血清もしくは血漿として有
利に使用し得る。尚、劇症肝炎患者の血液としては、血
漿交換療法に際して得られる患者血漿が好適である。

上記原料からの本発明ｈｌ−ＩＧＦの製造は、基本的に
はこの種の生体物質からの蛋白性物質の分離に汎用され
る通常の方法と同様にして、目的とするｈ）ｌ　Ｇ　Ｆ
の物理的、化学的性質を利用した各種処理操作に従い実
施することができる。該処理操作としては、例えば通常
の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマ
トグラフィー（ゲル濾過）、遠心分離、電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、透析法、これらの組み合せ等が挙げられる。

特に好ましい上記操作の一例としては、まず原料、例え
ば血漿を５６℃程度で約１５分間加熱後、硫安分画する
ことにより、硫安温度約１．１〜２．１〜１の沈澱画分
に活性物として収１グすることができる。上記活性物は
更に例えば通常の担体を使用するゲル濾過、ＤＥＡＥ等
の陰イＡン交操体を使用するイオン交換クロマトグラフ
ィー等により、精製Ｊることができる。殊に本発明者ら
の研究によれば、本発明のｈＨＧＦは、アフィゲルブル
ー（Ａｒｒｉ−Ｇｅｔ　　Ｂｌｕｅ　、　バイオ・７ト
ラホラトリ一ズ社）、ヘパリン及びヒドロキシアパタイ
トに強い結合性を有することが確認されており、之等の
クロマトグラフィーによる精製が最適である。

上記各処理の操作、条件等は、通常のこの種の方法にお
けるそれらと同様のものとすることができる。

上記方法により本発明ｈｌ−ＩＧＦが、単１ｌｉｌｌ精
製され、これは上記した特性にて特定される。

尚、本発明ｈＨＧＦは、ＳＤＳ処理によっても活性（肝
細胞増殖活性）が保持されることが確認されており、従
って上記精製手段として、５Ｏ８ＰＡＧＥ　（ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
をも好適に採用することができる。

実　　　施　　　例以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（１）肝細胞増殖活性（１−Ｉ　Ｇ　Ｆ活性）の測定セ
グレン（３ｅｇｌｅｎ　）の方法（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　
１ｎｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｌ　３　、　ｐ
　２９　、　Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９７６）　）に従い、ウィスター糸
紐ラット（体重２０００　）より、０．０５％コラ−ゲ
ナーゼ（タイプエ、シグマ社）を用いて肝実質細胞を単
離した。この肝実質細胞を直径１．５５ｃｎ＋のウェル
を有するマルヂーウエル　プラスデック　ディツシュ（
Ｎｕｎｃ）に５×１０４個１０．２ｍＱ／ｃｍ２の濃度
でまき込み、５％炭酸ガス含有空気気相下、３７℃でｌ
Ｆｉ層培養した（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、旦」−１９３７〜９４６　（１９７８
））。培養培地としては５％牛脂児血清（Ｆ　ＣＳ　、
　Ｆ　１ｌｔｒｏｎ、　Ａ　１ｔｏｎａ　。

Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）　、１　μｌｖｌデキサメサゾン
、１００Ｕ／１１１１２ペニシリン及び１　’ＯＯμｇ
／−ストレプトマイシンを添加したウィリアムスＥ培地
（フローラボラトリーズ社、以下「基本培地」と略す）
を使用した。培養開始後、４及び２０時間開目被検試料
を含む基本培地に培地交換し、４０時間開目基本培地の
みに交換した後、ＤＮＡ合成を測定した。

ＤＮＡ合成は、３Ｈ−チミジン（Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ社
）を４μＣｉ　／ｍＱ　（２Ｃｉ　／ｒａ　ｍｏｌ　）
添加した後、２時間３７℃で培養を続け、ＤＮＡへの取
り込みを測定することにより行なった。尚、上記３Ｈ−
チミジンによるラベルに際し、ｉｏｍｖヒドロキシウレ
アを添加した群をコントロール群とした。

上記培養によるラベル後、細胞を冷ＰＢＳ、２％過塩素
酸及び９５％エタノールで３回洗浄した。

次いで細胞を風乾し、２ｍＭＥＤＴＡ及び２０ｍＭ　　
ＮａＨＣＯ３を含有する２％ＳＤＳの０．８ｍＱで可溶
化し、その一部をとって放射能測定及び蛋白量測定に供
した。蛋白量の測定は、ＢＳＡを標準としてローリ−法
に従った。放射能測定により、被検試料により肝実質細
胞ＤＮＡに取込まれた３Ｈ−チミジン量を、コントロー
ルとのカウントの差として求め、これを肝実質細ｌ１１
１μり蛋白偕当り、１時間当りに換算してＤＮＡ合成活
性（ｄｐｍ　／ｈｒ／μ９蛋白）とし、被検試料のＨＧ
Ｆ活性の指標とした。

（２）本発明ｈｌ−ＩＧＦのｌ！ｌ造 ■　劇症肝炎患者の血漿交換療法に際して１１１られた
患者血漿を原料として用いた。

まず原料血漿９３０ｍＱを、５６℃で１５分間加熱し、
４℃で６０分間遠心分離（１０５０００（１）した。以
下の精製操作は全て４℃下で行なった。

次いで、上澄液を同門の蒸留水で希釈し、これに３．８
Ｍ硫酸アンモニウム（ｐ　）−１６，０）を添加して分
画した。１．１５Ｍ〜２．０５ＭＩＩｉ！ｌ酸アンモニ
ウム沈澱分画を、ＰＢＳ　ｌ）の少量に溶かし、同緩衝
液に対して透析した。

透析液をＰＢＳ　（−）で平衡化したアフィゲルブル−
のカラム（３，９Ｘ１１ｃｍ）にかけ、ＰＢＳ　（−）
２５０ｍａ及び１．４Ｍ　　Ｎａ　ＣＱを含むＰＢＳ　
（−）（ｐ　１−１７．４）２５０−で順次洗浄した。

次いで活性画分を２Ｍグアニジン塩酸（１）８７．４＞
３５０ｍ１２で溶出させ、溶出液をＰＢＳ　（−）に対
して７２時間（少なくとも５回液交換を行なう）透析し
た。

透析液に、トリトンＸ−１００（Ｔｒ目ｏｎＸ−１００
）を最終濃度が０．０１３％となるように添加し、これ
を０．０１３％トリトンｘ−ｉ　ｏ。

を含むＰＢＳ　（−）で平衡化したヘパリン−セファロ
ースカラム（ファルマシア社、１，６ｘ５ｃｎ＋）にか
けた。カラムを同ＰＢＳ　（−）　７５ｍ１２、次いで
０．５Ｍ　　Ｎａ　ＣＱを含む同ＰＢＳ　（−＞５０戒
で各々洗浄した後、０．５Ｍから１．７５ＭＮａＣＱの
リニアグラジェントにより溶出させた。

上記でＶｌられた活性画分＜０．８４〜１．１５Ｍ　　
ＮａＣＱ＞を、０．０１３％トリトンＸ−１００を含む
ＰＢＳ　（−）で２倍希釈した後、同ＰＢＳ　（−）で
平衡化したヒドロキシアバタイ］・カラム（バイオ・ラ
ドラボラトリーズ社、１゜６ｘ５ｃｍ１流速２０ｍＱ／
ｈｒ）にかけた。カラムを同バッファー２０ｍＧで洗浄
し、次いで０．１５ＭＮａＣＱ及び０．０１３％トリト
ンＸ−１００を含有する０、１Ｍリン酸ナトリウムバッ
ファー（ｐ　Ｈ７，１＞２０鵬で洗浄後、室温で、０．
１Ｍから０．５Ｍリン酸ナトリウムのリニアグラディエ
ンドにより溶出（２１＋１２フラクシヨン）させた。

上記溶出パターンを第１図に示ず。図において横軸はフ
ラクションＮｏ、を、縦軸はＨＧ　Ｆ活性（曲線（１）
で示される）及びリン酸ナトリウム溌度（曲線（２）で
示される）をそれぞれ示す。

活性の最も高い画分くフラクションＮ０．６０〜６６）
を集め、−２０’Ｃで保存した。

かくして、原料血漿から、２０万倍以上に精製されたｈ
　ＨＧＦを得た。

該ｈｌ−ＩＧＦのＨＧＦ活性は、加熱処理（８０℃、１
０分間）及び酵素処理（０，ｌｆｆ１ｇ／−トリプシン
、３７℃、３０分間及び０．１１１０／ＩＩＩＱキモト
リプシン、３７℃、３０分間）により失活した。また０
、５Ｍ酢酸、０．１Ｍ酢Ｍ緩衝液（ｐＨ４，０）、同（
ｐ　）−１５，０）、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液（Ｅ）１１
７．４）及び０．１Ｍグリシン！ｌ衝液＜ｏ　１−１９
．５）のいずれの処理（４℃、２０時間）によっても安
定であった。

■　５ＤＳ−ＰＡＧＥレムリ（ｌａｃｍＩＩｌｌｉ）の方法（Ｎａｔｕｒｅ　
、　２２７゜６８０−６８５　（１９７０））に従い、
３％スタッキングゲル及び８％分離ゲル（厚さ１ｍｍ）
を用いて、ｔＷ下に５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。

即ち、上記■で得たｈＨＧＦを、セントリコン１０（ア
ミコン社）を用いて約１０倍に濃縮し、この濃縮ｈトＩ
ＧＦを、サンプルバッファーの２倍濃縮液（６％ＳＤＳ
、２０％グリセロール及び０．０２５％ブロモフェノー
ルブルーを合む１２５ＩＩＩＭトリス・塩酸緩衝液（ｆ
）Ｈ６，８）からなる）の等昂と混合した侵、２５℃で
１時間処理してサンプルとした。電気泳動後、分離ゲル
の３レーンを剃刀の刃で１．５Ｈにスライスした。

切片を試験管に入れ、細かく切り、撹拌下、室温で２０
時間を要して、０．０１３％トリトンＸ−１００及び０
．０２％ＳＤＳを含むＰＢＳ　（−）１−で抽出し、Ｈ
ＧＦ活性の測定に供した。他のル−ンは、１０％三塩化
酢酸で固定後、銀染色を行ない、分子量スタンダード（
ファルマシア社）から、推定分子伝を算出した。

上記結果を第２図に示す。図において横軸はスライスＮ
Ｏ１を、縦軸はＨＧ　Ｆ活性を示す。

上記５ＤＳ−ＰＡＧＥによれば、非還元条件下で、本発
明ｈ　ＨＧＦは、分子■約７６０００〜９２０００にわ
たるバンドとして泳動され、該バンド（スライスＮｏ、
２９〜３４）に一致したトＩＧＦ活性が確認された。

■　上記■において、ゲルスライスから抽出されたｈ＋
（Ｇｒ：につき、再度、上記■と同様にして５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行なった。

その結果を第３図に示す。図において横軸はレーンＮｏ
、を示し、レーン１は上記■におけるスライスＮｏ、２
９を、レーン２は同スライスＮｏ、３０を、レーン３は
同スライスＮ０．３１を、レーン４は同スライスＮｏ、
３２を、レーン５は同スライスＮｏ、３３を、レーン６
は同スライスＮＯ，３４をそれぞれ示ず。また縦軸は分
子量スタンダードから求めた分子量（Ｘ１０−”）を示
す。

上記結果によれば、ｈＨＧＦには、わずかに分子量の異
なるいくつかの分子型が存在し、それらは上記方法によ
り単離することができた。単離されたそれぞれの分子量
を、それらのトＩＧＦ活性と共に、下記第１表にポリ。

尚、ＨＧＦ活性は染色強度に応じた値が得られた。

第　　１　　表レーン　　分　子　吊　　トＩＧＦ活性（ｄｐｍ／Ｎ０
０（非還元条件）　　　ｈｒ／μｇ蛋白）１　　約９２
０００　　　　１７．３２　　約８８０００　　　　３８．６３　　約８６０００　　　　９３．９４　　約８３０００と約８１０００　　　　３１．２５　　約７９０００　　　　７０．５６　　約７９０００と約７６０００　　　１０．５尚、上記において、還元条件下での５ＯＳ−ＰＡＧＥに
よれば、いずれも分子ｆｆ１５６０００〜６５０００及
び３２０ｏＯ〜３５０００の両グループにメインバンド
を与えた。このことより、ｈＨＧＦはこれらがジスルフ
ィド結合により結合した蛋白性物質であり、上記７種の
分子型はいずれも実質的にｈＨＧＦとして同一であると
推定された。

■　用量依存効果上記■で得られたｈＨＧＦを用いて、ＨＧＦ活性の川口
依存性を調べた。

結果を第４図に示す。図中、横軸はｈトＩＧＦの濃度（
ｎｌＪ／　１１１０　）を、縦軸はＨＧＦ活性（ｄｐｍ
／ｈｒ／μｇ蛋白）を示す。また図においてｒｍＥＧＦ
Ｊはマウス上皮生長因子（和光純薬社）の２５　ｎｇ／
−を用いた結果を示す。

■　上記■で得たｈＨＧＦ、インスリン、マウス上皮生
長因子（ｍＥＧＦ、和光純薬社）及びヒト上皮生良因子
（ｈ　ＥＧＦ、湧水製薬社）の組合せによる、肝細胞増
殖効果を確認試験した。

結果を下記第２表に示す。

表中、ラベリング　インデックスは、オートラジオグラ
フィー　（３ｉｏｎｅｄ、Ｒｅｓ、　６．２３１（１９
８５））に従って、３）（−チミジンでラベルされた核
数の計測によって算出されたものであり、少なくとも２
５０個以上の細胞の測定による百分率で示される。該イ
ンデックスは、肝実質細胞の増殖を反映する指標である
。また、表中ＨＧＦ活性及びラベリング　インデックス
の結果は、それぞれ平均値±ＳＤ　（３回試験の場合、
２回数試験の場合は、平均値）で示される。

第　　２　　表第２表より、ｈトＩＧＦの肝臓細胞増殖活性は、インス
リン、ｍＥ　Ｇ　Ｆ及びｈＥ　Ｇ　Ｆのそれらよりも強
く、しかもそれらと相加的或いは相乗的であることが判
る。

尚、ｈｌ」ＧＦの肝細胞増殖活性は、位相差顕微鏡下に
おける、肝実質細胞の核分裂像の観察及びウェル内の総
核数の増加によっても観察された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ｈＨＧＦのヒト０キシアパタイトカラム
からの溶出を示すグラフである。第２図及び第３図は、
それぞれ本発明ｈＨＧＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
結果を示すものである。第４図は本発明ｈ　ＨＧＦのｍ
ｍ依存曲線を示すものである。（以　上）一″へ代理人　弁理士　三　枝　英　二　；Ｊ、仄二図面の浄
２″（内容に変更なし〕第２図スライスＮｏ。図面の６會シ（）’Ｉ　Ｏ−ｉ：：変更なし）第３図レーンＮ。手続補正力（方式）昭和６１年１０月２７日１　事件の表示昭和６１年特許願第１６６４９５号２　発明の名称肝細胞増殖因子３　補正をする者事件との関係　　特許出願人橋　本　修　治　（ほか３名）４代理人大阪市東区平野町２の１０　沢の鴎ビル（６５２１）弁
理士　三枝英二５　補正命令の日付昭和６１年９月３０日６　補正の対象図面（第２図及び第３図）７　補正の内容別紙添附の通り補　　正　　の　　内　　容１　第２図及び第３図を別紙の通り訂正します。（以　上）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト血液に由来し、以下の理化学的性質及び生理
活性を有する蛋白性物質であることを特徴とする肝細胞
増殖因子。１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）による推定分子
量が約７６０００〜９２０００である、２）肝細胞を増殖させる活性を有する、３）８０℃、１０分間の加熱処理により上記活性が失活
する、４）トリプシン消化及びキモトリプシン消化により上記
活性が失活する、及び５）ヘパリンに強い親和性を有する。