JPH09149790A

JPH09149790A - 新規セリンプロテアーゼ

Info

Publication number: JPH09149790A
Application number: JP8212196A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Tsuruoka; 伸夫鶴岡; Kyoko Yamashiro; 恭子山城; Masafumi Tsujimoto; 雅文辻本; Mare Yamaguchi; 希山口
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1997-06-10

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なアミノ酸配列の提供。【解決手段】配列番号：３に示すアミノ酸番号１〜２
２３のアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規セリンプロテ
アーゼ、それをコードする遺伝子、及び該セリンプロテ
アーゼの製造方法、並びに該セリンプロテアーゼを用い
る阻害物質のスクリーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セリンプロテアーゼは、動物、植物、微
生物に広く存在し、特に、高等動物では、食物の消化、
血液凝固・線溶、補体活性化、ホルモン産生、排卵・受
精、食作用、細胞増殖、発生・分化、老化、癌転移など
極めて多くの生体反応に関与していることがわかってい
る(Neurath, H. Science, 224, 350-357, 1984) 。ま
た、高等動物におけるセリンプロテアーゼは、その活性
中心の一次構造から、キモトリプシン族およびサブチリ
シン族に大別される。キモトリプシン族においては、そ
の活性発現のために、活性中心のセリン残基のほかにヒ
スチジン残基が必須であり、また、セリン残基やヒスチ
ジン残基の近傍のアミノ酸配列がよく保存されているこ
とが知られている。

【０００３】従って、これら保存された領域を使ってPC
R 法によりセリンプロテアーゼ遺伝子をクローニングす
る試みもなされている。すなわち、PCR プライマーとし
て、セリンプロテアーゼにおいてよく保存されているヒ
スチジン残基近傍のアラニン- アラニン- ヒスチジン-
システイン (AAHC) ならびにセリン残基近傍のアスパラ
ギン酸- セリン- グリシン- グリシン- プロリン (DSGG
P)を用いて、新規セリンプロテアーゼ遺伝子を単離した
ことが報告されている。

【０００４】例えば、Sakanariらは、線虫および原虫か
らラットトリプシン II と６７％の類似性をもつセリン
プロテアーゼ遺伝子を単離した(Sakanari, J. A., Stau
nton, C. E., Eakin, A. E., Craik, C. S. and McKerr
ow, J. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4863-48
67, 1989) 。また、Mueller-Hillのグループは、ラット
膵臓からラットトリプシン Vおよびラットエラスターゼ
IV を単離し(Kang, J., Wiegand, U. and Mueller-Hil
l, B., Gene, 110, 181-187, 1992)、また、同じグルー
プで、ヒト脳よりヒトトリプシン IV を単離した(Wiega
nd, U., Corbach, S., Minn, A., Kang, J. and Muelle
r-Hill, B., Gene, 136, 167-175, 1993) 。

【０００５】しかしながら、これら先行文献において
は、線虫や原虫ならびに膵臓や脳の組織由来のcDNAをも
とに単離されている。また、このようなPCR プライマー
を用いて単離されたセリンプロテアーゼ遺伝子は、ザイ
モーゲンとして存在するため、セリンプロテアーゼ活性
を持つタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかの
確認まで至っていないのが現状である。さらに、線虫や
原虫ならびに臓器ばかりでなく、培養により増殖させる
ことが可能な各種株化癌細胞のcDNAを使うことができれ
ば、セリンプロテアーゼ遺伝子の単離がより容易になる
ことは想像に難くないが、血清添加した培養細胞の上清
ではセリンプロテアーゼ活性を測定することができない
のが実状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の実情に
鑑みてなされたものであり、その目的は新規なセリンプ
ロテアーゼ、及びそれをコードする新規セリンプロテア
ーゼ遺伝子を提供することにある。さらに、本発明は当
該遺伝子を用いて当該プロテアーゼを大量に生産する方
法及び該酵素を用いる特異的阻害物質のスクリーニング
方法を提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規セリ
ンプロテアーゼ遺伝子を単離するための出発材料とし
て、ヒト結腸癌 COLO 201 細胞に着目した。すなわち、
本発明者らは、COLO 201細胞を無タンパク質培地で培養
した培養上清中にセリンプロテアーゼ酵素活性を認め、
このような新規セリンプロテアーゼ遺伝子の単離のため
には、COLO 201細胞のような癌細胞から調製したcDNAを
用いることが有効であることを発見した。かつ、単離し
た遺伝子が真に酵素活性をコードする遺伝子であるかど
うかを確認するために、成熟タンパク質として発現する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。

【０００８】

【発明の実施の形態】ヒト結腸癌由来のCOLO 201細胞
(ATCC CCL-224) は、動物細胞の培養に常用されている
任意の方法により培養することができる。かつ、タンパ
ク質を全く含まない培地を用いて静置培養することも可
能である。具体例を実施例１に記載する。

【０００９】培養上清中の酵素活性測定法は、市販の合
成基質に7-アミノ-4- メチルクマリンやp-ニトロアニリ
ドなどを結合させたものを用いて、容易に測定すること
ができる。具体例を実施例２に記載する。この結果、ヒ
ト結腸癌由来のCOLO 201細胞の培養上清中には、明らか
にセリンプロテアーゼ酵素活性を認めた。そこで、本酵
素活性を含め、ヒト結腸癌由来のCOLO 201細胞に発現し
ているすべてのセリンプロテアーゼ遺伝子を単離するこ
とを目的として、以下の実験を行った。すなわち、ヒト
結腸癌由来のCOLO 201細胞からmRNAを単離精製し、cDNA
ライブラリーを作製した。作製したcDNAライブラリーか
らセリンプロテアーゼモチーフをもとにデザインしたPC
R プライマーを用いてPCR によるスクリーニングを行
い、得られたPCR 産物をサブクローニングした。

【００１０】その結果、活性残基であるセリンおよびヒ
スチジン間にもセリンプロテアーゼに保存されているア
ミノ酸をコードする塩基配列を含むクローンが確認され
た。こうして得られた遺伝子をプローブとして、常法に
より全長の遺伝子をクローニングした結果、SP59遺伝
子、SP60遺伝子およびSP67遺伝子を単離し、新規セリン
プロテアーゼを確認することが出来た。具体例を実施例
３に記載する。

【００１１】以上の結果、本発明者らは、ヒト結腸癌由
来 COLO 201 細胞の cDNA から、既知のセリンプロテア
ーゼと類似性が３０％未満である新規セリンプロテアー
ゼ遺伝子 (SP59遺伝子、SP60遺伝子およびSP67遺伝子)
の単離に成功した。また、単離した新規セリンプロテア
ーゼ遺伝子をプローブとして、ヒト臓器でのmRNAの発現
を確認したところ、SP59遺伝子、SP60遺伝子およびSP67
遺伝子ともヒト臓器での発現が認められ、SP59遺伝子は
特に脳において強い発現を認め、約１. ４kbの大きさで
あった。具体例を実施例４に記載する。このことから、
単離された新規セリンプロテアーゼ遺伝子は、ヒト臓器
でも発現していることが確認された。

【００１２】また、単離した新規セリンプロテアーゼ遺
伝子の構造から、成熟タンパク質として動物細胞で発現
する方法を考案した。すなわち、代表的なセリンプロテ
アーゼであるトリプシンは、プロ体であるトリプシノー
ゲンとして発現した後、十二指腸粘膜に分布する酵素エ
ンテロキナーゼの作用によりイソロイシンをＮ末端アミ
ノ酸とする成熟活性タンパク質として存在することが知
られている。

【００１３】そこで、SP59遺伝子の成熟タンパク質をコ
ードすると考えられる遺伝子の前にトリプシン遺伝子の
シグナル配列ならびにエンテロキナーゼ認識配列をコー
ドする遺伝子を繋いだキメラ遺伝子(Trp59遺伝子) を作
製した。作製したキメラ遺伝子であるTrp59 遺伝子をCO
S-1 細胞にトランスフェクションした後、COS-1 細胞の
培養上清にエンテロキナーゼを作用させた結果、セリン
プロテアーゼ酵素活性を確認した。具体的手法を実施例
５に記載する。

【００１４】以上の結果から、今回単離したセリンプロ
テアーゼ遺伝子は、その一次構造上、新規セリンプロテ
アーゼ遺伝子であることが明らかとなったばかりでな
く、成熟タンパク質として活性を発現することが明らか
となった。本発明においては、新規セリンプロテアーゼ
をコードする遺伝子のヌクレオチド配列として配列番
号：３、４および５に示すヌクレオチド配列を開示する
が、本発明のセリンプロテアーゼの遺伝子はこれに限定
されない。一旦、天然セリンプロテアーゼのアミノ酸配
列が決定されれば、コドンの縮重に基き、同じアミノ酸
配列をコードする種々のヌクレオチド配列を設計し、そ
れを調製することができる。この場合、使用すべき宿主
により高頻度で用いられるコドンを使用するのが好まし
い。

【００１５】本発明の天然セリンプロテアーゼをコード
する遺伝子を得るには、実施例３に記載する様にしてcD
NAを得ることができるが、これに限定されない。すなわ
ち、天然セリンプロテアーゼのアミノ酸配列をコードす
る１つのヌクレオチド配列が決定されれば天然セリンプ
ロテアーゼをコードする遺伝子は、本発明に具体的に開
示するストラテジーとは異なるストラテジーによりcDNA
としてクローニングすることができ、さらにはそれを生
産する細胞のゲノムからクローニングすることもでき
る。

【００１６】ゲノムからクローニングする場合、実施例
３において使用した種々のプライマーヌクレオチド又は
プローブヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ断片の選択のた
めプローブとして使用することができる。また、配列番
号：３、４または５に記載するヌクレオチド配列に基い
て設計された他のプローブを用いることもできる。ゲノ
ムから目的とするＤＮＡをクローニングするための一般
的方法は当業界においてよく知られている（Current Pr
otocols In Molecular Biology, John Wiley &Sons
社、第５章及び第６章）。

【００１７】本発明の天然セリンプロテアーゼをコード
する遺伝子はまた、化学合成によっても調製することが
できる。ＤＮＡの化学合成は当業界において自動ＤＮＡ
合成機、例えばアプライドバイオシステム社３９６ＤＮ
Ａ／ＲＮＡ合成機など採用して容易である。従って、当
業者は、配列番号：３、４および５に示されるヌクレオ
チド配列のＤＮＡを容易に合成することができる。

【００１８】本発明の天然型セリンプロテアーゼを生来
のコドンとは異なるコドンによりコードする遺伝子は、
前記のごとく化学合成により調製することもでき、また
配列番号：３、４または５に示すヌクレオチド配列を有
するＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として変異誘発プライマー
と共に用いる部位特定変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）等常法に従って得
ることもできる（例えば、Current Protocols In Molec
ular Biology, John Wiley & Sons 社、第８章を参照の
こと）。

【００１９】上記のようにして本発明のセリンプロテア
ーゼの遺伝子が得られると、これを用いて、常用の遺伝
子組換え法により組換えセリンプロテアーゼを製造する
ことができる。すなわち、本発明のセリンプロテアーゼ
をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該
発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞を
培養し、そして得られた培養物（細胞又は培地）から目
的とするセリンプロテアーゼを採取する。本発明のセリ
ンプロテアーゼは、生化学的又は化学的な修飾、例え
ば、Ｎ末端アシル化、例えばホルミル化、アセチル化な
どのＣ_1-6アシル化または欠失等がされた形で得られて
もよい。発現系は、シグナル配列の付加、改良や宿主の
選択によって分泌効率及び発現量の向上を図ることもで
きる。シグナル配列の付加及び改良手段としては、他の
構造ペプチドのシグナルペプチドをコードする遺伝子を
本発明のセリンプロテアーゼの構造遺伝子の５′側上流
に、切断可能な部分ペプチドをコードする遺伝子を介す
るように連結する方法が挙げられる。具体的例示として
は、実施例５に記載したトリプシン遺伝子のシグナル配
列およびエンテロキナーゼ認識配列をコードする遺伝子
を用いる方法があげられる。

【００２０】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バシルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバシルス・ズブチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。
真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、等の真
核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパ
ー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細
胞（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト
細胞、サル細胞、マウス細胞等、具体的には、ＣＯＳ−
１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、ミエロー
マ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｓｐ
−２／Ｏ細胞等を使用することができる。本発明におい
てはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイ
コ、キャベツルーパー等を用いることもできる。

【００２１】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウィルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細胞に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えば、ａｄｈｌプロモーター、ｐｑｋプロモ
ーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとし
てはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動
物細胞としてはＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓ４０のｅａｒ
ｌｙもしくはｌａｔｅプロモーター、ＣＭＶプロモータ
ー、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターまたはＳＲαプロモータ
ー等があげられる。また、発現ベクターには、以上の他
にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸還元酵素
遺伝子（メトトレキセート耐性）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４
１８耐性）等）等を含有しているのを用いるのが好まし
い。なお、エンハンサーを使用する場合、例えばＳＶ４
０のエンハンサー等を遺伝子の上流または下流に挿入す
る。

【００２２】発現ベクターによる宿主の形質転換は、当
業界においてよく知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons 社、に記載されて
いる。形質転換体の培養も常法に従って行うことができ
る。培養物からのセリンプロテアーゼの精製は、タンパ
ク質を単離・精製するための常法に従って、例えば、限
外濾過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセフア
ロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことが
できる。

【００２３】このようにして得られる本発明のセリンプ
ロテアーゼは、機能的タンパク質であることから、本酵
素を用いる本酵素特異的阻害物質のスクリーニングを可
能とし、当該スクリーニング方法は、各種疾患治療剤の
探索研究に有用である。スクリーニング方法の具体例と
して、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化
合物、合成化合物、発酵生産物のような、または、各種
細胞培養上清等より得られる天然成分、各種合成化合物
等の人工成分のような被験試料の本酵素阻害活性を、実
施例２と同様にして、酵素活性の測定を行なうことによ
り行うことができる。また、本発明のセリンプロテアー
ゼの部分ペプチドまたは前記した本酵素の遺伝子もしく
はその部分ペプチドをコードするＤＮＡで形質転換され
た宿主もしくはその細胞膜画分を使用する上記酵素活性
測定、結合親和性測定等も本発明のスクリーニング方法
の好ましい実施態様である。

【００２４】すなわち、本発明のセリンプロテアーゼ
は、その部分ペプチドとして本発明のスクリーニング方
法に用いることができる。また、本発明のスクリーニン
グ方法においては、本発明のセリンプロテアーゼをコー
ドする遺伝子またはその部分ペプチドをコードするＤＮ
Ａを含んで成る組換えベクターにより形質転換され、本
発明のセリンプロテアーゼまたはその部分ペプチドを発
現する宿主細胞またはその細胞膜画分を使用してもよ
い。

【００２５】この場合の部分ペプチドとしては、活性部
位のセリン残基の近傍に存在するペプチド断片および例
えば実施例３（６）に用いたような本発明のセリンプロ
テアーゼに特異的な抗体の認識部位となり得るペプチド
断片などの本発明のセリンプロテアーゼに特有の領域か
らなるペプチド断片を挙げることができる。なお、該部
分ペプチドの作成は、本発明のセリンプロテアーゼにつ
いて前記した方法またはそれ自体公知のペプチドの合成
法もしくは適当なプロテアーゼによる該セリンプロテア
ーゼの切断により行なうことができる。

【００２６】また、上記の細胞膜画分は、本発明のセリ
ンプロテアーゼまたはその部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡを発現し得る宿主細胞を、発現が可能な条件下培養
し、得られたセリンプロテアーゼまたはその部分ペプチ
ドを含有する宿主細胞をそれ自体公知の方法で破砕した
後、得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。

【００２７】本発明のセリンプロテアーゼまたはその部
分ペプチドを用いる阻害物質のスクリーニング方法は、
本発明のセリンプロテアーゼもしくはその部分ペプチド
または該セリンプロテアーゼもしくはその部分ペプチド
を含有する宿主細胞もしくはその細胞膜画分を用いて、
被検試料をスクリーニングすることにより行なわれる。
具体的方法として、本発明のセリンプロテアーゼおよび
その部分ペプチドの基質、例えば、発色基質等の合成基
質、放射性核種により標識された基質等、を用いる酵素
活性測定法や結合親和性測定法により行なわれる。な
お、セリンプロテアーゼを含有する宿主細胞を用いる場
合、それ自体公知の方法で細胞を固定化（グルタルアル
デヒド、ホルムアルデヒド等で）して用いることができ
る。

【００２８】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を説明する。実施例１．ヒト結腸癌由来の COLO 201 細胞の培養と
培養上清の調製ヒト結腸癌由来の COLO 201 細胞 (ATCC CCL-224) を80
cm² の培養面積を持つＴフラスコ(Nunc)で培養した。す
なわち、Ｔフラスコあたり２×１０⁶ 細胞を植え、１０
％ウシ胎児血清 (FBS, GIBCO BRL社) を含むRPMI-1640
培地（日水製薬）を用いて、コンフルエントになるまで
培養した。次に、１０^-8M 亜セレン酸ナトリウム(Sigma
)含有タンパク質無添加 RPMI-1640培地に交換した。２
週間培養後、培養上清を回収し、0.22μｍの滅菌フィル
ター(Millipore) で濾過滅菌した後、培養上清中の酵素
活性を測定する材料に供した。

【００２９】実施例２．ヒト結腸癌由来の COLO 201
細胞の培養上清中の酵素活性の測定実施例１で得られた培養上清中のセリンプロテアーゼ酵
素活性は、テストチーム発色基質S-2251（H-D-バリル-L
- ロイシル-L- リジル-p- ニトロアニリド・二塩酸塩、
第一化学薬品）を用いて測定した。すなわち、精製水で
1 mg/ml に溶解したテストチーム発色基質S-2251 50 μ
ｌ、0.1 M Tris/HCl (pH7.5) 40 μl および COLO 201
細胞の培養上清10μl を加え、室温で６０分放置後、４
０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００３０】培養上清の代わりに培地を10μl 加えた時
の吸光度をブランクとした場合、 COLO 201 細胞の培養
上清の吸光度は、0.42であった。また、別の基質 H-D-
バリル-L- ロイシル-L- アルギニル-p- ニトロアニリド
・二塩酸塩( 第一化学薬品)を用いても同程度の活性を
示した。また、本測定系における各種プロテアーゼ阻害
剤の効果をみた結果、 COLO 201 細胞の培養上清中には
明らかにセリンプロテアーゼ酵素活性があることが確認
された（表１）。

【００３１】

【表１】

【００３２】実施例３．新規セリンプロテアーゼ遺伝
子のクローニングおよびタンパク質の同定（１）COLO 201細胞 mRNA の単離精製 COLO 201細胞 mRNA の調製は、アイソジェン（日本ジー
ン）を用いて添付の文書に従って行った。すなわち、CO
LO 201細胞をＴフラスコ(Nunc, 80cm² ) でコンフルエ
ントになるまで増殖させた後、Ｔフラスコあたり1 mlの
アイソジェンを加えることにより細胞を溶解した。さら
に、クロロホルム200 μl を加えて攪拌し、15,000 rp
m, 4 ℃で15分間遠心した。

【００３３】遠心後、水相を回収し、回収した水相に 5
00μl のイソプロパノールを加えて撹拌し、15,000 rp
m, 4 ℃で30分間遠心した。得られた全 RNAの沈殿を400
μlのジエチルピロカーボネート (DEPC) 処理した蒸留
水に溶解し、400 μl の２×溶出緩衝液 (20mM Tris-HC
l pH7.5, 2mM EDTA, 0.2% SDS)を加え混合した。さら
に、500 μl のOligotex-dT30(日本ロッシュ）懸濁液を
加えて混合し、65℃で5分間加熱した。氷中で急冷後、1
30 μl の5M NaCl を加えて37℃で10分間加温した。

【００３４】加温後、15,000 rpm, 4 ℃で3 分間遠心
し、上清を取り除いた後、沈殿を 500μl の洗浄緩衝液
(10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.1% SDS, 0.1M Na
Cl) に懸濁し、さらに、15,000 rpm, 4 ℃で3 分間遠心
した。上清を取り除いた後、沈殿を 400μl のDEPC処理
した蒸留水に懸濁した。65℃で5 分間加熱した後、15,0
00 rpm, 4 ℃で3 分間遠心し、上清を回収した。

【００３５】この上清に20μl の5M NaCl 、1 mlのエタ
ノールを加え、攪拌後、15,000 rpm, 4 ℃で20分間遠心
した。沈殿物を500 μl の70 %エタノールで洗い、軽く
風乾後、10μl のDEPC処理した蒸留水に溶解した。この
結果、Ｔフラスコ１６本から約 12 μgの polyA⁺RNA
を得た。（２）cDNAライブラリーの調製 cDNAライブラリーの調製は、スーパー・スクリプト・プ
ラスミド・システム（Super Script Plasmid System)(L
ife Technologies) を用いて行った。

【００３６】工程１． cDNA の合成 COLO 201細胞 mRNA 5 μｌ( 約 6μｇ）にオリゴdT Not
Iプライマー 2μｌ (1 μg)を加え、70℃で10分間熱し
た後、氷中で急冷した。この熱変性mRNAに、4μｌの5
×First strand buffer (250mM Tris-HCl pH8.3, 375mM
KCl, 15mM MgCl₂) , 1μｌの10mM dNTP,2 μｌの0.1M
DTT, DEPC処理した蒸留水および 5μｌ(1000U)のSuper
Script II RTを加え、37℃で1 時間反応させた。

【００３７】次に、この反応液に91μｌのDEPC処理した
蒸留水, 30μｌの5 × Second strand buffer (100mM T
ris-HCl pH6.9, 450mM KCl, 23mM MgCl₂, 0.75mMβ - N
AD⁺, 50mM (NH₄)₂SO₄), 3μl の10mM dNTP, 1μl (10U)
のE.Coli DNAリガーゼ, 4μl (40U) のE.Coli DNA pol
imerase および 1μl (2U)のE.Coli RNase Hを加え、16
℃で2 時間反応後、2 μl (10U) のT4 DNAポリメラーゼ
を加え16℃で5 分間反応させた。

【００３８】さらに、この溶液に10μl の0.5M EDTA を
加えて混合した後、150 μl のフェノール: クロロホル
ム: イソアミルアルコール(25:24:1) を加え、攪拌後1
5,000rpmで5 分間遠心し、上清を回収した。得られた上
清に、10μl の5M KOAc, 400μl のエタノールを加え攪
拌し、15,000 rpmで10分間遠心した。遠心して得られた
沈殿物を500 μl の70% エタノールで洗い、軽く風乾
後、25μl のDEPC処理した蒸留水に溶解した。

【００３９】工程２． Sal I アダプターの付加工程１で得られた2 本鎖cDNA 25 μl に10μl の5 × T
4 DNA リガーゼ緩衝液(250mMTris-HCl pH7.6, 50mM MgC
l₂, 5mM ATP, 5mM DTT, 25% (w/v), PEG 8000), Sal I
アダプター溶液10μl (10 μｇ) および 5μl (5U)のT4
DNAリガーゼを加え、16℃にて16時間反応後、50μl の
フェノール: クロロホルム: イソアミルアルコール(25:
24:1) を加え、攪拌後15,000 rpmで5 分間遠心し、上清
を回収した。回収した上清に、5 μl の5M KOAc, 125μ
l のエタノールを加え攪拌し、-80 ℃, 20分間冷却後、
15,000 rpmで10分間遠心した。遠心して得られた沈殿物
を200 μl の70% エタノールで洗い、軽く風乾後、40μ
l のDEPC処理した蒸留水に溶解した。

【００４０】工程３．制限酵素Not I による切断工程２の反応液20μl にNot I 4 μl (60U) を加え、37
℃で3 時間反応後、フェノール: クロロホルム: イソア
ミルアルコール(25:24:1) 抽出を行い、上清を回収し
た。この上清をクロマスピン-1000 カラム（クロンテッ
ク）で１キロ塩基対以上のサイズを分画し50μl の溶出
液を得た。

【００４１】工程４． pSPORTベクターとのライゲーシ
ョンサイズ分画したcDNA溶液 3μl にSal I およびNot I で
消化したpSPORTベクター1 μl (50ng;Life Technologie
s)を加え、さらに11μl のDEPC処理した蒸留水、4 μl
の5 ×T4 DNAリガーゼ緩衝液および1 μl の5 ×T4 DNA
リガーゼを加え、室温で3 時間反応させた。

【００４２】反応後、フェノール: クロロホルム: イソ
アミルアルコール(25:24:1) 抽出を行い、5 μl (5μ
ｇ) の酵母tRNA、 5μl の5M KOAc および 125μl のエ
タノールを加えて攪拌し、-80 ℃で20分間冷却後、15,0
00 rpmで10分間遠心した。遠心して得られた沈殿物を20
0 μl の70% エタノールで洗い、軽く風乾後、5 μl の
TE (10mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA)に溶解した。

【００４３】工程５．大腸菌DH10B への形質転換工程４で得られたライゲーション後cDNAを大腸菌Electr
o MAX DH10B(F', mcrA, φ 80dlacZΔM15,Δ(mrr-hsdRM
S-mcrBC)，ΔlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139,Δ
(ara, leu)7697, galU, galK, λ-, rpsL, nupG:Life T
echnologies)にエレクトロポレーション法により形質転
換した。すなわち、50μｌのDH10B 細胞に 2μｌのライ
ゲーション後cDNAを加え、終容量26μｌ× 2本として、
エレクトロポレーター（Bio-Rad ）で400V, 330 μＦの
条件で実施した。

【００４４】次に、4 mlのSOC 培地 (2%バクト・トリプ
トン, 0.5%バクト・酵母エキス, 10mM NaCl, 2.5mM KC
l, 10mM MgSO₄, 10mM MgCl₂, 20mMグルコース) で大腸
菌を回収し、37℃で1 時間振とう培養後、50 mg/mlのア
ンピシリンを含むLBプレート (1%バクト・トリプトン,
0.5%バクト・酵母エキス, 0.5% NaCl, 0.1% グルコー
ス, 1.5%バクト・アガー) にまいて37℃で一夜培養し
た。その結果、約 1.1× 10⁶個のクローンを含むcDNAラ
イブラリーが得られた。

【００４５】（３）セリンプロテアーゼ保存領域を用い
たPCR 活性残基 (His)近傍のアミノ酸保存領域を基に配列番
号：１に示すオリゴマーKY185 を合成した。また、活性
残基 (Ser)近傍のアミノ酸保存領域を基に配列番号：２
に示すオリゴマーKY189 を合成した。実施例３（２）工
程３．で得られたcDNAをテンプレート、オリゴマーKY18
5 - KY189 をプライマーとして、 Ampli-Taqポリメラー
ゼ (パーキンエルマー社) にてPCR を行った。このPCR
反応液をpCR IIベクター（インビトロジェン）にサブク
ローニングし、431 塩基対のDNA 断片を持つクローンを
得た。これらクローンのシークエンスを行った結果、2
つの活性残基 (His, Ser) の間にあるセリンプロテアー
ゼに保存されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
むことが確認された。

【００４６】（４）セリンプロテアーゼのスクリーニン
グ前記実施例３.(３）で得られたプラスミドをテンプレー
トとしたPCR により、蛍光標識プローブを作成した。こ
のプローブを用い、実施例３（２）工程５．で得られた
約110 万クローンのcDNAライブラリーを常法によりスク
リーニングした。その結果、約20万個から6 個の陽性ク
ローンを得た。挿入DNA 断片の大きさを調べ、最長のク
ローンpSPORT / SP59-#3 (約1.4 キロ塩基対) を選び、
本遺伝子のシークエンスをTaq Dye Deoxy Terminator C
ycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)で決定し
た。

【００４７】（５）塩基配列の特徴 pSPORT / SP59-#3のcDNAの塩基配列を配列番号：３に示
す。その結果、pSPORT/ SP59-#3のcDNAの全長は1,438
塩基対で、155 塩基対の5'非翻訳領域、732 塩基対の翻
訳領域、551 塩基対の3'非翻訳領域から成る。翻訳領域
はアミノ酸244残基をコードしていることが明らかとな
った。

【００４８】（６）SP59タンパク質のペプチドフラグメ
ントに対する抗体の作製 SP59のアミノ酸配列のうち、配列番号：６の部分ペプチ
ド（配列番号：３のアミノ酸番号56〜67にCys を付加し
たもの）、配列番号：７の部分ペプチド（配列番号：３
のアミノ酸番号96〜110 番）および配列番号：８の部分
ペプチド（配列番号：３のアミノ酸番号210 〜223 番）
を合成して、純度90％以上の各部分ペプチドを得た。

【００４９】各ペプチドフラグメントは、Ｎ−（ｍ−マ
レイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド（MBS 、ナ
カライテスク）で活性化したウシ血清アルブミン（BSA
、ナカライテスク）に結合させて免疫した。すなわ
ち、５mgのBSA を50ｍＭリン酸緩衝液（pH8.0 ）に溶解
した後、DMSOに溶解したMBS を1.25mg加え、室温で30分
間攪拌し、MBS 活性化BSA を得た。次に、MBS 活性化BS
A に50ｍＭリン酸緩衝液（pH7.0 ）に溶解した各ペプチ
ドフラグメント５mgを加え、室温で３時間攪拌すること
によりカップリングした。カップリングした各ペプチド
フラグメントをFreund完全アジュバント（ナカライテス
ク）と混和し、常法により抗血清を作製した。

【００５０】（７）ヒト膵臓癌由来のHPC-Y3細胞培養上
清からのSP59タンパク質の精製実施例１と同様にして得られたHPC-Y3細胞培養上清の凍
結乾燥品10mgを0.1 ＭNaClを含む10ｍＭTris／HCl ，pH
7.4 に１mg／mlによるように溶解し、４ml／分の流速で
Superose６（ファルマシア）を用いたゲル濾過クロマト
グラフィーに供した。各フラクションを（６）で得たSP
59部分ペプチド抗体を用いたウエスタンブロットおよび
合成基質（Boc-Phe-Ser-Arg-４−メチル−クマリル−７
−アミド（以下、MCA ）、Boc-Gln-Ala-Arg-MCA)を用い
た酵素活性の測定を実施した。その結果、フラクション
63-70 に溶出した画分に活性を認め、同画分をMonoＱカ
ラム（ファルマシア）によるイオン交換クロマトグラフ
ィーにそのままアプライした。

【００５１】次に、MonoＱカラム非結合画分をそのまま
10ｍＭリン酸緩衝液、pH6.8 であらかじめ平衡化したヒ
ドロキシアパタイトカラム（ペンタックス）にアプライ
したのち、リン酸緩衝液のリニアグラジエントで溶出さ
せたところ、活性画分は、150 ｍＭ濃度のリン酸緩衝液
で溶出した。ついで、20ｍＭリン酸緩衝液、pH6.8 であ
らかじめ平衡化したMonoＳカラムにアプライし、0.1 Ｍ
NaCl濃度でシングルピークとして活性画分が溶出した。
溶出画分をＣ４カラムで脱塩したのち、Ｎ末端アミノ酸
分析に供した。

【００５２】（８）Ｎ末端アミノ酸配列の分析 SP59タンパク質のＮ末端アミノ酸配列分析を、以下の通
り行った。すなわち、HPC-Y3細胞無タンパク質培養上清
から、前述した方法で精製したSP59タンパク質を用い
て、SDS −ポリアクリルアミド電気泳動を行なった。電
気泳動後、Matsudaira(Matsudaira, P.(1987)J.Biol.Ch
em.262, 10035-10038)の方法に従ってＰＶＤＦ膜に転写
した。さらに、Speicher(Speicher, D.W.(1989)"Techni
ques in Protein Chemistry"(Hugli, T.E.ed.), pp.24-
35.Academic Press, San Diego) の方法に従ってクーマ
シーブルー染色することによりSP59タンパク質を検出し
た。このSP59タンパク質染色画分を切り取り、十分に洗
浄、風乾後、Ｎ末端アミノ酸配列分析の試料とした。分
析には、アプライド・バイオシステムズ（Applied Bios
ystems) の477 Ａ気相シークエンサーを用いた。

【００５３】フェニルチオヒダントイン誘導体は、アプ
ライド・バイオシステムズの１２０Ａオンラインシステ
ムの逆相HPLC(Hewick, R.M., Hunkapiller, M.W., Hoo
d, L.E., & Dreyer, W.J.(1981) J.Biol.Chem.256, 799
0-7997)によって同定した。その結果、SP59タンパク質
の成熟型Ｎ末端アミノ酸配列は、推定された通り、アミ
ノ酸配列（LVHG）であることを確認した。また、成熟型
SP59タンパク質のＮ末端アミノ酸ロイシンが１つ欠失し
たアミノ酸列（VHG ）も同時に存在することが明らかと
なった。

【００５４】（９）SP60およびSP67の遺伝子のクローニ
ングおよびタンパク質の同定 COLO201 細胞から、前述した方法と同様にしてSP60およ
びSP67の遺伝子のクローニングおよびタンパク質の同定
を行ない、セリンプロテアーゼに特有の触媒三つ組残基
（catalytic triad)を有するSP60（配列番号：４）およ
びSP67（配列番号：５）を得た。これらのＤＮＡは、SP
59と同様にして発現せしめ、セリンプロテアーゼを得る
ことができる。

【００５５】実施例４． SP59遺伝子のNorthernブロッ
トによるヒト臓器での発現 pSPORT / SP59-#3を制限酵素Mlu I で消化し、約1.4 キ
ロ塩基対のDNA 断片を単離・精製し、α-³²P dCTP(Amer
sham) で標識し、プローブとした。このプローブと16種
の臓器から調製したmRNAをブロッティングしたメンブラ
ンフィルター（クロンテック）を65℃で2 時間反応させ
た。

【００５６】次に、このメンブランフィルターを0.1% S
DSを含む2 ×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸ナトリウ
ム) で室温, 20分間、続いて、1 ×SSC, 0.1% SDS に替
え65℃, 30分間で2 回洗い、BAS2000 用イメージングプ
レート（富士写真フィルム）に30分間露光させ、解析し
た。その結果を図１に示した。SP59遺伝子のヒト臓器で
のmRNAの発現は、特に脳において強い発現を認め、約
１. ４kbの大きさであった。また、SP60遺伝子およびSP
67遺伝子について、SP59遺伝子と同様に試験を行った結
果、それぞれ結腸、前立腺、小腸および腎、並びに結
腸、小腸、前立腺および膵臓に強い発現を認めた。

【００５７】実施例５． SP59遺伝子がコードする新規
セリンプロテアーゼ成熟タンパク質の酵素活性の測定（１）発現プラスミドの構築 pSPORT / SP59-#3をMlu I で消化後、約1.4 キロ塩基対
のDNA 断片を単離・精製し、TEに溶解した。同様に、SV
40プロモーターをもつpdKCR ベクター(Nikaido, T.ら、
Nature, 311 ,631-635(1984):pKCR ベクターのpBR322部
分がpBR327に置換したベクター）もMlu I にて消化後、
アルカリホスファターゼにより脱リン酸化し、フェノー
ル: クロロホルム: イソアミルアルコール(25:24:1) 抽
出を行い、エタノール沈殿しTEに溶解した。

【００５８】常法に従い、pSPORT / SP59-#3のDNA 断片
とpdKCR ベクターDNA 断片をライゲーションし、大腸菌
JM109 を形質転換させ、生じたコロニーをPCR 法により
解析して目的とするセリンプロテアーゼSP59発現プラス
ミドpdKCR / SP59を得た。次に、トリプシンIIの開始メ
チオニンに続くシグナル配列ならびにエンテロキナーゼ
認識配列をコードする遺伝子を増幅し、かつ５′側上流
にEco R I ，３′側下流にBsp MI制限酵素認識部位を付
加するようにプライマーを設計した。KY239 およびKY24
0 を、配列番号：９および１０に示す。

【００５９】これらプライマーKY239 およびKY240 を用
い、pCR II/Trypsin II プラスミド（２つの特異的プラ
イマー（Emi, M., Nakamura et al., Gene, 41. 305-31
0, 1986)を用いて実施例３（２）工程５で得られたcDNA
ライブラリーより増幅し、pCRII ベクターにサブクロー
ニングして得た）をテンプレートとしたPCR を行い、そ
の産物を制限酵素（Eco RIおよびBsp MI) で消化後、約
75bpのDNA 断片を単離・精製した。

【００６０】同様に、SP59遺伝子の成熟タンパク質をコ
ードする遺伝子の上流にBsp MI制限酵素認識部位を付加
するようにプライマーKY241 、およびKY207 を設計し
た。KY241 およびKY207 は、配列番号：１１および１２
に示した。これらプライマーKY241 およびKY207 を用
い、pSPORT / SP59-#3プラスミドをテンプレートとした
PCR を行い、その産物を制限酵素（Bsp MIおよびBpu 11
02I)で消化後、DNA 断片を単離・精製した。次に、得ら
れたトリプシンIIのシグナル配列ならびにエンテロキナ
ーゼ認識配列をコードするDNA 断片とSP59遺伝子の成熟
タンパク質をコードするDNA 断片を、常法に従い、制限
酵素（Eco RIおよびBpu 1102I)で前消化したpdKCR/SP59
ベクターにライゲーションし、大腸菌JM109 を形質転換
させた。形質転換したコロニーのうち目的のキメラ遺伝
子を含むコロニーをPCR 法により確認し、目的とするキ
メラ遺伝子（Trp59)の発現プラスミド（pdKCR/Trp59)を
得た。

【００６１】（２）COS-1 細胞における発現実施例５（１）で作製したキメラ遺伝子(Trp59) の発現
プラスミドを用いて、動物細胞での発現を試みた。発現
用動物細胞としてCOS-1 細胞を用い、リポフェクチン法
により発現プラスミドとしてpdKCR/Trp59 及びpdKCR を
それぞれトランスフェクションした。すなわち、直径１
０cmの培養用ディシュ (Corning, 430167)にCOS-1 細胞
を１×１０⁶ 細胞を植え込んだ。培地としては、１０％
ウシ胎児血清を含むDulbecco's minimum essential med
ium (DMEM,日水製薬) を用いた。

【００６２】翌日、Opti-MEM 培地(Life Technologie
s) 5ml で細胞をリンスした後、さらに、5ml のOpti-ME
M培地を加え、３７℃で２時間培養した。培養後、ディ
シュ１枚あたり上述のプラスミド１μｇおよびリポフェ
クチン（ファルマシア）１０μｇの混液を加え、さら
に、３７℃で５時間培養した。培養後、Opti-MEM培地を
５ml加え、合計１０mlとし、３７℃で７２時間培養し
た。培養後、遠心操作により培養上清を集め、酵素活性
の測定サンプルとした。

【００６３】（３）酵素活性の測定実施例５（２）で得られた細胞培養上清中の酵素活性を
測定した。すなわち、COS-1 細胞の培養上清 50 μｌに
エンテロキナーゼ(1 mg/ml, Biozyme Laboratories)10
μｌを混和し、室温で15分間反応させた。次に、DMSOに
溶解した合成基質Boc-Phe-Ser-Arg-MCA （ペプチド研究
所）を0.1 M Tris/HCl, pH8.0 で希釈した0.2 M 基質溶
液を50μｌ加え、さらに、室温で60分間反応させた。反
応後、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍにおけ
る蛍光を測定した。

【００６４】その結果、図２に示したように、Trp59 遺
伝子を発現したCOS-1 細胞の培養上清にエンテロキナー
ゼを加えることにより酵素活性を認めた。この結果、SP
59遺伝子がコードする新規セリンプロテアーゼ成熟タン
パク質は、酵素活性を示すことが明らかとなった。以上
の結果から、今回単離したセリンプロテアーゼ遺伝子
は、その一次構造上、新規セリンプロテアーゼ遺伝子で
あることが明らかとなったばかりでなく、成熟タンパク
質として活性を発現することが明らかとなった。

【００６５】

【発明の効果】本発明者らは、ヒト結腸癌由来のCOLO 2
01細胞から新規セリンプロテアーゼ遺伝子を単離し、か
つ単離した遺伝子が成熟タンパク質としてセリンプロテ
アーゼ酵素活性を持っていることを明らかにした。ま
た、今回初めて得られた新規セリンプロテアーゼ遺伝子
が結腸癌由来にもかかわらず、 SP59 遺伝子は、ヒト脳
に強く発現していることが明らかとなった。

【００６６】このように、癌細胞を用いたセリンプロテ
アーゼ遺伝子の単離は、新規遺伝子のリソースとして有
用であることが明白である。さらに、新規セリンプロテ
アーゼ遺伝子を単離したとしても、あるいは、単離した
遺伝子を用いてmRNAの発現を検討したとしても、翻訳さ
れたタンパク質が、その臓器局所で機能的に発現してい
るかどうかは、保証の限りではない。

【００６７】今回、前述した方法で新規セリンプロテア
ーゼ遺伝子を発現させ、機能的なタンパク質をコードす
ることを明らかにしたことは、当該遺伝子の有用性を証
明するものである。また、当該遺伝子を用いて発現した
タンパク質が、機能的なタンパク質であることから、本
酵素特異的阻害剤のスクリーニング系を確立することに
より、各種疾患治療剤をスクリーニングすることが、初
めて可能となる。

【００６８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GTGCTCACNG CNGCBCAYTG 20

【００６９】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AGCGGNCCNC CDGARTCVCC 20

【００７０】配列番号：３配列の長さ：１４３８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 GGACACACGC TGTAGCTGTC TCCCCGGCTG GCTGGCTCGC TCTCTCCTGG GGACACAGAG 60 GTCGGCAGGC AGCACACAGA GGGACCTACG GGCAGCTGTT CCTTCCCCCG ACTCAAGAAT 120

【００７１】 CCCCGGAGGC CCGGAGGCCT GCAGCAGGAG CGGCC ATG AAG AAG CTG ATG GTG 173 Met Lys Lys Leu Met Val -20 GTG CTG AGT CTG ATT GCT GCA GCC TGG GCA GAG GAG CAG AAT AAG TTG 221 Val Leu Ser Leu Ile Ala Ala Ala Trp Ala Glu Glu Gln Asn Lys Leu -15 -10 -5 -1 1 GTG CAT GGC GGA CCC TGC GAC AAG ACA TCT CAC CCC TAC CAA GCT GCC 269 Val His Gly Gly Pro Cys Asp Lys Thr Ser His Pro Tyr Gln Ala Ala 5 10 15 CTC TAC ACC TCG GGC CAC TTG CTC TGT GGT GGG GTC CTT ATC CAT CCA 317 Leu Tyr Thr Ser Gly His Leu Leu Cys Gly Gly Val Leu Ile His Pro 20 25 30 CTG TGG GTC CTC ACA GCT GCC CAC TGC AAA AAA CCG AAT CTT CAG GTC 365 Leu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Lys Pro Asn Leu Gln Val 35 40 45 TTC CTG GGG AAG CAT AAC CTT CGG CAA AGG GAG AGT TCC CAG GAG CAG 413 Phe Leu Gly Lys His Asn Leu Arg Gln Arg Glu Ser Ser Gln Glu Gln 50 55 60 65 AGT TCT GTT GTC CGG GCT GTG ATC CAC CCT GAC TAT GAT GCC GCC AGC 461 Ser Ser Val Val Arg Ala Val Ile His Pro Asp Tyr Asp Ala Ala Ser 70 75 80 CAT GAC CAG GAC ATC ATG CTG TTG CGC CTG GCA CGC CCA GCC AAA CTC 509 His Asp Gln Asp Ile Met Leu Leu Arg Leu Ala Arg Pro Ala Lys Leu 85 90 95 TCT GAA CTC ATC CAG CCC CTT CCC CTG GAG AGG GAC TGC TCA GCC AAC 557 Ser Glu Leu Ile Gln Pro Leu Pro Leu Glu Arg Asp Cys Ser Ala Asn 100 105 110

【００７２】 ACC ACC AGC TGC CAC ATC CTG GGC TGG GGC AAG ACA GCA GAT GGT GAT 605 Thr Thr Ser Cys His Ile Leu Gly Trp Gly Lys Thr Ala Asp Gly Asp 115 120 125 TTC CCT GAC ACC ATC CAG TGT GCA TAC ATC CAC CTG GTG TCC CGT GAG 653 Phe Pro Asp Thr Ile Gln Cys Ala Tyr Ile His Leu Val Ser Arg Glu 130 135 140 145 GAG TGT GAG CAT GCC TAC CCT GGC CAG ATC ACC CAG AAC ATG TTG TGT 701 Glu Cys Glu His Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gln Asn Met Leu Cys 150 155 160 GCT GGG GAT GAG AAG TAC GGG AAG GAT TCC TGC CAG GGT GAT TCT GGG 749 Ala Gly Asp Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly 165 170 175 GGT CCG CTG GTA TGT GGA GAC CAC CTC CGA GGC CTT GTG TCA TGG GGT 797 Gly Pro Leu Val Cys Gly Asp His Leu Arg Gly Leu Val Ser Trp Gly 180 185 190 AAC ATC CCC TGT GGA TCA AAG GAG AAG CCA GGA GTC TAC ACC AAC GTC 845 Asn Ile Pro Cys Gly Ser Lys Glu Lys Pro Gly Val Tyr Thr Asn Val 195 200 205 TGC AGA TAC ACG AAC TGG ATC CAA AAA ACC ATT CAG GCC AAG 887 Cys Arg Tyr Thr Asn Trp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Ala Lys 210 215 220 TGACCCTGAC ATGTGACATC TACCTCCCGA CCTACCACCC CACTGGCTGG TTCCAGAACG 947 TCTCTCACCT AGACCTTGCC TCCCCTCCTC TCCTGCCCAG CTCTGACCCT GATGCTTAAT 1007 AAACGCAGCG ACGTGAGGGT CCTGATTCTC CCTGGTTTTA CCCCAGCTCC ATCCTTGCAT 1067 CACTGGGGAG GACGTGATGA GTGAGGACTT GGGTCCTCGG TCTTACCCCC ACCACTAAGA 1127 GAATACAGGA AAATCCCTTC TAGGCATCTC CTCTCCCCAA CCCTTCCACA CGTTTGATTT 1187 CTTCCTGCAG AGGCCCAGCC ACGTGTCTGG AATCCCAGCT CCGCTGCTTA CTGTCGGTGT 1247 CCCCTTGGGA TGTACCTTTC TTCACTGCAG ATTTCTCACC TGTAAGATGA AGATAAGGAT 1307 GATACAGTCT CCATAAGGCA GTGGCTGTTG GAAAGATTTA AGGTTTCACA CCTATGACAT 1367 ACATGGAATA GCACCTGGGC CACCATGCAC TCAATAAAGA ATGAATTTTA TTAAAAAAAA 1427 AAAAAAAAAA A 1438

【００７３】配列番号：４配列の長さ：６９９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 GTG GTG GGT GGG GAG GAG GCC TCT GTG GAT TCT TGG CCT TGG CAG GTC 48 Val Val Gly Gly Glu Glu Ala Ser Val Asp Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 AGC ATC CAG TAC GAC AAA CAG CAC GTC TGT GGA GGG AGC ATC CTG GAC 96 Ser Ile Gln Tyr Asp Lys Gln His Val Cys Gly Gly Ser Ile Leu Asp 20 25 30 CCC CAC TGG GTC CTC ACG GCA GCC CAC TGC TTC AGG AAA CAT ACC GAT 144 Pro His Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Arg Lys His Thr Asp 35 40 45 GTG TTC AAC TGG AAG GTG CGG GCA GGC TCA GAC AAA CTG GGC AGC TTC 192 Val Phe Asn Trp Lys Val Arg Ala Gly Ser Asp Lys Leu Gly Ser Phe 50 55 60 CCA TCC CTG GCT GTG GCC AAG ATC ATC ATC ATT GAA TTC AAC CCC ATG 240 Pro Ser Leu Ala Val Ala Lys Ile Ile Ile Ile Glu Phe Asn Pro Met 65 70 75 80 TAC CCC AAA GAC AAT GAC ATC GCC CTC ATG AAG CTG CAG TTC CCA CTC 288 Tyr Pro Lys Asp Asn Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln Phe Pro Leu 85 90 95

【００７４】 ACT TTC TCA GGC ACA GTC AGG CCC ATC TGT CTG CCC TTC TTT GAT GAG 336 Thr Phe Ser Gly Thr Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Phe Phe Asp Glu 100 105 110 GAG CTC ACT CCA GCC ACC CCA CTC TGG ATC ATT GGA TGG GGC TTT ACG 384 Glu Leu Thr Pro Ala Thr Pro Leu Trp Ile Ile Gly Trp Gly Phe Thr 115 120 125 AAG CAG AAT GGA GGG AAG ATG TCT GAC ATA CTG CTG CAG GCG TCA GTC 432 Lys Gln Asn Gly Gly Lys Met Ser Asp Ile Leu Leu Gln Ala Ser Val 130 135 140 CAG GTC ATT GAC AGC ACA CGG TGC AAT GCA GAC GAT GCG TAC CAG GGG 480 Gln Val Ile Asp Ser Thr Arg Cys Asn Ala Asp Asp Ala Tyr Gln Gly 145 150 155 160 GAA GTC ACC GAG AAG ATG ATG TGT GCA GGC ATC CCG GAA GGG GGT GTG 528 Glu Val Thr Glu Lys Met Met Cys Ala Gly Ile Pro Glu Gly Gly Val 165 170 175 GAC ACC TGC CAG GGT GAC AGT GGT GGG CCC CTG ATG TAC CAA TCT GAC 576 Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Tyr Gln Ser Asp 180 185 190 CAG TGG CAT GTG GTG GGC ATC GTT AGC TGG GGC TAT GGC TGC GGG GGC 624 Gln Trp His Val Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Gly Gly 195 200 205 CCG AGC ACC CCA GGA GTA TAC ACC AAG GTC TCA GCC TAT CTC AAC TGG 672 Pro Ser Thr Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Ala Tyr Leu Asn Trp 210 215 220 ATC TAC AAT GTC TGG AAG GCT GAG CTG 699 Ile Tyr Asn Val Trp Lys Ala Glu Leu 225 230

【００７５】配列番号：５配列の長さ：７２３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 GTT GTT GGG GGC ACG GAT GCG GAT GAG GGC GAG TGG CCC TGG CAG GTA 48 Val Val Gly Gly Thr Asp Ala Asp Glu Gly Glu Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 AGC CTG CAT GCT CTG GGC CAG GGC CAC ATC TGC GGT GCT TCC CTC ATC 96 Ser Leu His Ala Leu Gly Gln Gly His Ile Cys Gly Ala Ser Leu Ile 20 25 30 TCT CCC AAC TGG CTG GTC TCT GCC GCA CAC TGC TAC ATC GAT GAC AGA 144 Ser Pro Asn Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Ile Asp Asp Arg 35 40 45 GGA TTC AGG TAC TCA GAC CCC ACG CAG TGG ACG GTC TTC CTG GGC TTG 192 Gly Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp Thr Val Phe Leu Gly Leu 50 55 60 CAC GAC CAG AGC CAG CGC AGC GCC CCT GGG GTG CAG GAG CGC AGG CTC 240 His Asp Gln Ser Gln Arg Ser Ala Pro Gly Val Gln Glu Arg Arg Leu 65 70 75 80 AAG CGC ATC ATC TCC CAC CCC TTC TTC AAT GAC TTC ACC TTC GAC TAT 288 Lys Arg Ile Ile Ser His Pro Phe Phe Asn Asp Phe Thr Phe Asp Tyr 85 90 95 GAC ATC GCG CTG CTG GAG CTG GAG AAA CCG GCA GAG TAC AGC TCC ATG 336 Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Pro Ala Glu Tyr Ser Ser Met 100 105 110

【００７６】 GTG CGG CCC ATC TGC CTG CCG GAC GCC TCC CAT GTC TTC CCT GCC GGC 384 Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ala Ser His Val Phe Pro Ala Gly 115 120 125 AAG GCC ATC TGG GTC ACG GGC TGG GGA CAC ACC CAG TAT GGA GGC ACT 432 Lys Ala Ile Trp Val Thr Gly Trp Gly His Thr Gln Tyr Gly Gly Thr 130 135 140 GGC GCG CTG ATC CTG CAA AAG GGT GAG ATC CGC GTC ATC AAC CAG ACC 480 Gly Ala Leu Ile Leu Gln Lys Gly Glu Ile Arg Val Ile Asn Gln Thr 145 150 155 160 ACC TGC GAG AAC CTC CTG CCG CAG CAG ATC ACG CCG CGC ATG ATG TGC 528 Thr Cys Glu Asn Leu Leu Pro Gln Gln Ile Thr Pro Arg Met Met Cys 165 170 175 GTG GGC TTC CTC AGC GGC GGC GTG GAC TCC TGC CAG GGT GAT TCC GGG 576 Val Gly Phe Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly 180 185 190 GGA CCC CTG TCC AGC GTG GAG GCG GAT GGG CGG ATC TTC CAG GCC GGT 624 Gly Pro Leu Ser Ser Val Glu Ala Asp Gly Arg Ile Phe Gln Ala Gly 195 200 205 GTG GTG AGC TGG GGA GAC GGC TGC GCT CAG AGG AAC AAG CCA GGC GTG 672 Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln Arg Asn Lys Pro Gly Val 210 215 220 TAC ACA AGG CTC CCT CTG TTT CGG GAC TGG ATC AAA GAG AAC ACT GGG 720 Tyr Thr Arg Leu Pro Leu Phe Arg Asp Trp Ile Lys Glu Asn Thr Gly 225 230 235 240 GTA 723 Val

【００７７】配列番号：６配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 Leu Arg Gln Arg Glu Ser Ser Gln Glu Gln Ser Ser Cys 1 5 10

【００７８】配列番号：７配列の長さ：１５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 Lys Leu Ser Glu Leu Ile Gln Pro Leu Pro Leu Glu Arg Asp Cys 1 5 10 15

【００７９】配列番号：８配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：配列 Cys Arg Tyr Thr Asn Trp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Ala Lys 1 5 10

【００８０】配列番号：９配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CACAGAATTC CACCATGAAT CTACTT 26

【００８１】配列番号：１０配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TAGCACCTGC CGATCTTGTC ATCATCA 27

【００８２】配列番号：１１配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCAGACCTGC AGAACAAGTT GGTGCATG 28

【００８３】配列番号：１２配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AAAACCAGGG AGAATCAG 18

【図面の簡単な説明】

【図１】Northern Blotting によるSP59遺伝子の各種ヒ
ト臓器での発現をみた結果を示すニトロセルロース膜の
図面に代わる写真である。PBL:peripheral blood lymph
ocyte(末梢リンパ球）

【図２】COS-1 細胞で発現したSP59遺伝子のコードする
成熟タンパク質の酵素活性を検討した結果を示す図であ
る。エンテロキナーゼを加えた場合を白のカラムで、ま
た、エンテロキナーゼを加えない場合を斜線のカラムで
示した。なお、pdKCR は使用した発現用ベクターのみを
トランスフェクションしたCOS-1 細胞の培養上清を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者山口希京都府京都市北区鞍馬口通り寺町西入ル新御霊口町285−79

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：３に示すアミノ酸番号１から
２２３までのアミノ酸配列（但し、アミノ酸番号１のロ
イシンは欠失していてもよい）、配列番号：４に示すア
ミノ酸番号１から２３３までのアミノ酸配列もしくは配
列番号：５に示すアミノ酸番号１から２４１までのアミ
ノ酸配列を含んで成るセリンプロテアーゼまたはその部
分ペプチド。
【請求項２】配列番号：３に示すアミノ酸番号１から
２２３までのアミノ酸配列（但し、アミノ酸番号１のロ
イシンは欠失していてもよい）、配列番号：４に示すア
ミノ酸番号１から２３３までのアミノ酸配列もしくは配
列番号：５に示すアミノ酸番号１から２４１までのアミ
ノ酸配列を含んで成るセリンプロテアーゼまたはその部
分ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】配列番号：３のヌクレオチド番号２１９
〜８８７、同２２２〜８８７、配列番号：４のヌクレオ
チド番号１〜６９９もしくは配列番号：５のヌクレオチ
ド番号１〜７２３のヌクレオチド配列またはその部分ヌ
クレオチド配列を含んで成る、請求項２に記載のＤＮ
Ａ。
【請求項４】請求項２又は３に記載のＤＮＡを含んで
成る組換えベクター。
【請求項５】請求項４に記載の組換えベクターにより
形質転換された宿主。
【請求項６】請求項１に記載のセリンプロテアーゼま
たはその部分ペプチドの製造方法において、請求項５に
記載の宿主を培養し、培養物から前記セリンプロテアー
ゼまたはその部分ペプチドを採取することを特徴とする
方法。
【請求項７】請求項１に記載のセリンプロテアーゼま
たはその部分ペプチドを用いる阻害物質のスクリーニン
グ方法。