JPH11514883A - アポトーシスに関与するシステインプロテアーゼ、ｃｍｈ−１をコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、プログラムされた細胞死に関与するシステインプロテアーゼであるCMH-1の活性な形態および不活性な形態の両方をコードするDNA配列に関する。本発明はさらに、それらのDNA配列によってコードされるポリペプチド、およびそれらのポリペプチドに対する抗体に関する。本発明はまた、これらのDNA配列を含む組換えDNA分子、およびそのような組換えDNA分子で形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、アポトーシスの促進および阻害の両方のための遺伝子治療における、本発明のDNA配列の使用に関する。本発明のDNA配列は、アポトーシスを経る可能性を有する細胞を診断することにおいても有用である。最後に、本発明のDNA配列によってコードされるポリペプチドは、アポトーシスのインヒビターの同定において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 アポトーシスに関与するシステインプロテアーゼ、 CMH-1をコードするDNA配列 発明の技術分野 本発明は、プログラムされた細胞死に関与するシステインプロテアーゼである CMH-1の活性な形態、活性化可能な形態、および不活性な形態をコードするDNA配 列に関する。本発明はさらに、それらのDNA配列によってコードされるポリペプ チド、およびそれらのポリペプチドに対する抗体に関する。本発明はまた、これ らのDNA配列を含む組換えDNA分子、およびそのような組換えDNA分子で形質転換 された宿主に関する。本発明はさらに、アポトーシスの促進および阻害の両方の ための遺伝子治療における本発明のDNA配列の使用に関する。本発明のDNA配列は 、アポトーシスを経る可能性を有する細胞を診断することにおいても有用である 。最後に、本発明のDNA配列によってコードされるポリペプチドは、アポトーシ スのインヒビターの同定において有用である。 発明の背景 プログラムされた細胞死（アポトーシス）は、胚発生、ホメオスタシスおよび 疾患（例えば、神経変性障害、自己免疫疾患、およびガンにおいて重要な役割を 果たしている[R．E．Ellisら、Ann ．Rev．Cell Biol.，7，663-98頁(1991)]。ア ポトーシスは、細胞収縮、染色質凝集、およびDNAフラグメント化を包含する一 組の細胞性事象によって特徴付けられる。プロテアーゼの活性化は、アポトーシ スの細胞性実行における重大な事象の１つである[S．J．Martinら、Cell，82，3 49-52頁(1995)]。 線虫、Caenorhabditis elegansにおける遺伝学的研究は、Ced-3遺伝子が、蠕 虫発生の間の細胞死のために不可欠であるという証拠を提供した[J．Yuanら、Ce ll ，75，641-652頁(1993)]。CED-3タンパクは、不活性なIL-1b前駆体を前炎症性 サイトカインに切断する、哺乳動物のインターロイキン-1b（IL-1b）変換酵素 （ICE）に28％の相同性を共有する[N．A．Thornberryら、Nature，356，768-74 頁(1992)]。ICEおよびCED-3の両方は、哺乳動物の酵素である、Tx/ICH-2/ICErel II、ICEreIII、Nedd-2/ICH-1、CPP32/Yama/Apopain、およびMch2も包含する新た に見出されたシステインプロテアーゼファミリーのメンバーである。[C．Fauche uら、EMBO J.，9，1914-22頁（1995）；N．A．Mundayら、J ．Biol.Chem.，270, 15870-76頁（1995）；L．Wangら、Cell，78，739-50頁（1994）；S．Kumarら、G enes Dev. ，8，1613-26頁；T．Fernandes-Alnemriら、J ．Biol．Chem.，269，30 761-64頁（1994）；T．Fernandes-Alnemriら、Cancer Res.，55，2737-42頁(199 5)]。これらのシステインプロテアーゼの各々は、前駆体ポリペプチドのプロセ シングに由来する約20 kDaおよび10 kDaの２つのサブユニットから構成されてい る。それらは、触媒およびP1アスパラギン酸残基の結合のための保存されたアミ ノ酸残基を共有する[K．P．Wilsonら、Nature，370，270-73頁（1994）；および N．P．C．Walkerら、Cell，78，343-52頁(1994)]。 Ice/Ced-3遺伝子ファミリー中のシステインプロテアーゼの過剰発現は、トラ ンスフェクトされた繊維芽細胞のアポトーシスを導き[M．Miuraら、Cell，75，6 53-60頁（1993）；C．Faucheuら、EMBO J.，9，1914-22頁（1995）；T.Fernande s-Alnemriら、J ．Biol．Chem.，269，30761-64頁（1994）；T．Fernandes-Alnem riら、Cancer Res.，55，2737-42頁（1995）；Y．Guら、EMBO J.，9，1923-31頁 （1995）；M．Tewariら、Cell，81，3255-60頁(1995)]、そしてICEインヒビター は、神経栄養因子を枯渇したニューロンの細胞死をブロックする[V．Gaglardini ら、Science，263，826-28頁（1994）;およびC．E．Milliganら、Neuron，15，3 85-93頁(1995)]。ICEまたは関連するプロテアーゼの関与が、FasおよびTNFα媒 介性アポトーシスに関連付けられている[K．Kuidaら、Science，267，2000-03頁 （1995）；M．Enariら、Nature，375，78-79頁(1995)；M．Losら、Nature, 375 ，81-83頁（1995）；M.Tewariら、J ．Biol．Chem.，270，3255-3260頁(1995)；M ．Miuraら、Cell，75，653-660頁(1995)]。 さらに、ICE欠損マウスは抗Fas抗体によって誘導されるアポトーシスに抵抗性 であり、このことは胸腺細胞のFas媒介性アポトーシスにおけるICEについての生 理学的役割を示唆している(K．Kuidaら、1995)。 ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ(PARP)、U1核内低分子リポ核タンパク質の7 0 kDaタンパク質成分、ラミンB1、β-アクチンおよびトポイソメラーゼＩを包含 する多くのタンパク質は、アポトーシスの間、タンパク分解的に分解される。最 も注目すべきことに、116-kDa PARPのAsp214とGly215との間の、31-kDaポリペプ チドおよび85-kDaポリペプチドへの迅速なおよび完全な切断は、アポトーシスの 開始において生じる[S．H．Kauffmanら、Cancer Res.，53，3976-85頁（1993） ；Y．A．Lazebnikら、Nature，371，346-47頁(1995)]。 幾人かの研究者は、CPP32が、アポトーシス細胞の細胞質ゾル抽出液においてP ARPを切断するシステインプロテアーゼであることを示唆した[D．W．Nicholson ら、Nature，376，37-43頁（1995）；Y．A．Lazebnikら、(1995)]。細胞傷害性 Ｔリンパ球(CTL)特異的グランザイムＢはCPP32を切断し、そして活性化し、標的 細胞におけるPARP切断を生じ、このことはCTL媒介性アポトーシスにおけるCPP32 が関与するプロテアーゼ活性化カスケードを示唆する[A．J．Darmonら、Nature ，377，446-48頁(1995)]。さらに、CPP32は、低密度リポタンパク質レセプター および3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAシンターゼの遺伝子の転写調節に関 与するステロール応答エレメント結合タンパタ質(SREBP)を切断し、そして活性 化する[X．Wangら、J ．Biol．Chem.，270，18044-50頁(1995)]。 現在までのこれらの発展にもかかわらず、システインプロテアーゼのIce/Ced- 3遺伝子ファミリーの他のメンバーが、アポトーシスの機構を十分に理解するた めに、同定され、そして特徴付けられる必要がある。 本発明の要旨 本発明は、CPP32に相同な34-kDaポリペプチドをコードする完全なcDNA配列を 提供する。全長cDNAは、プログラムされた細胞死（「アポトーシス」）において 重要であるシステインプロテアーゼ‐‐CMH-1‐‐のプロ酵素（「活性化可能」 ）形態をコードする。本発明はまた、CMH-1の活性な形態およびCMH-1の不活性な 変異された形態をコードするcDNA配列を提供する。 本発明はまた、任意の上記のcDNA配列を含む組換えDNA分子を提供する。本発 明の組換えDNA分子は、原核生物宿主および真核生物宿主の両方を形質転換する ために使用される。そのような形質転換された宿主もまた本発明の一部である。 形質転換された宿主は、大量の本発明のDNA配列を産生するために利用され得る 。さらに、本発明の形質転換された宿主は、それらのDNA配列によってコードさ れる任意のポリペプチドを産生するために利用され得る。 本発明のDNA配列は、治療適用および診断適用の両方において利用され得る。C MH-1のプロ酵素形態または活性な形態をコードするDNA配列は、特にガン細胞に おいて、アポトーシスを促進する遺伝子治療における使用のために適切である。 さらに、それらのDNA配列は、低密度リポタンパク質レセプターの転写に関与す るエレメントを活性化するその発現産物の能力によって、患者におけるコレステ ロールレベルを調節するために利用され得る。 CMH-1の不活性な変異体形態をコードするDNA配列は、細胞において酵素の天然 の活性な形態と競合することによって、アポトーシスを防止する遺伝子治療にお いて有用である。この治療上の使用は、神経学的疾患の防止において特に有用で ある。 本発明のDNA配列は、種々の細胞におけるCmh-1 mRNAレベルを検出し、そして 定量するための診断上のツールとして使用され得る。この方法は、化学療法的処 置に対するガン細胞の感受性を決定するために使用され得る。高いCmh-1 mRNAレ ベルは、細胞が化学療法に対して応答性であることを示唆する。この方法はまた 、正常にはアポトーシスを経ない細胞（特に神経学的疾患に関与する細胞）にお いて疾患を検出するためにも使用され得る。高レベルのCmh-1 mRNAは、疾患の状 態を示している。 本発明のCmh-1 DNA配列はまた、アンチセンス技術の使用を介して細胞におけ るCMH-1ポリペプチドの発現を阻害するために使用され得る。一本鎖アンチセン スDNAは細胞に導入され得、ここでCmh-1 mRNAにハイブリダイズし、そしてCmh-1 mRNAの翻訳を阻害し得る。そのような方法は、所望されないアポトーシス（例 えば、神経学的疾患に特徴的であるような）を防止するために使用され得る。 本発明の活性なCMH-1タンパク質は、潜在的なアポトーシスインヒビターをス クリーニングするための試薬として有用である。その天然の基質である、ポリ（ ADPリボース）ポリメラーセ(「PARP」)、または適切な合成ペプチド性基質の いずれかのCMH-1媒介性切断をブロックする化合物の能力は、そのような化合物 が潜在的なアポトーシスインヒビターであることを示唆する。 本発明はまた、CMH-1に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提 供する。これらの抗体は、患者または細胞におけるCMH-1レベルをアッセイする ために使用され得る。さらに、CMH-1抗体は、CMH-1活性を阻害することにおいて 、従って、アポトーシスを阻害することにおいて有用である。 図面の簡単な説明 図１は、ICEシステインプロテアーゼファミリーの種々のメンバーの各々の基 質側鎖結合ポケット(substrate side-Chain binding pocket)を裏打ちする(line )アミノ酸残基の比較を示す。CMH-1に存在するアミノ酸残基と同一のアミノ酸残 基を、太字で示す。 図２、パネルＡは、CMH-1の活性化形態(Ala24-Gln303)(レーン「CMH-1wt」)、 CMH-1の不活性化変異体(Ala24-Gln303)(レーン「CMH-1mt」)、短縮型PARP（Guら 、1995b）単独（レーン「PARP」）、短縮型PARPおよび活性化CMH-1(Ala24-Gln30 3)を一緒に（レーン「CMH-1wt+PARP」）、または短縮型PARPおよびCMH-1変異体 を一緒に（レーン「CMH-1mt+PARP」）、のT7のタグ化誘導体を発現するプラスミ ドでトランスフェクトされたCOS細胞の抽出物のイムノブロットを示す。イムノ ブロッティングを、抗T7抗体を使用して行った。矢印は、切断されたp20 CMH-1 の位置を示す。「PARP(T)」は、短縮型PARPを示す。「PARP(*)」は、切断された PARPのタグ化Ｎ末端フラグメントを示す。 図２、パネルＢは、ヌクレオソーム間DNAフラグメント化によって決定される 、活性なまたは不活性なCMH-1によるトランスフェクトされたCOS細胞におけるア ポトーシスの誘導を示す。 図３は、Ni-アフィニティークロマトグラフィー後の組換え(His)₆タグ化CMH-1 の精製を示す。タンパク質を、クーマシーブルー染色（レーン１）、または抗(H is)₆タグ抗体を用いるイムノブロッティング（レーン２）のいずれかによって検 出した。 図４、パネルＡは、テトラペプチドアルデヒドインヒビターDEVD-CHOの存在下 または非存在下においてPARPを切断する組換え活性なCMH-1の能力を示す（最初 の４つのレーン）。「PARP(T)」は、PARPの非切断短縮形態を示す。「PARP＊」 は、一次切断産物（32および12 kDa）を示す。 図４、パネルＡはまた、IL-1b前駆体を切断するCMH-1またはICEの能力を比較 する（最後の３つのレーン）。「pIL-1β」は、非切断前駆体を示す。「IL-1β 」は成熟切断産物を示す。 図４、パネルＢは、SDS-PAGEおよび蛍光光度分析した、³⁵S標識PARPをインビ トロで切断するCMH-1の能力に対する種々のプロテアーゼインヒビターの効果を 示す。 図５は、プローブとして全長Cmh-1 cDNAを使用する、心臓（レーン１）、脳（ レーン２）、胎盤（レーン３）、肺（レーン４）、肝臓（レーン５）、骨格筋（ レーン６）、腎臓（レーン７）、および膵臓（レーン８）における、ヒトCmh-1 のノーザンブロット分析を示す。 発明の詳細な説明 以下の定義は、明細書および請求の範囲を通して使用される。 「Cmh-1」は、CMH-1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（DNAまたはR NA、一本鎖または二本鎖のいずれか）をいう。二本鎖ヌクレオチド配列を定義す るために使用される場合は、その用語はアンチセンスヌクレオチド配列もいう。 「CMH-1」および「CMH-1ポリペプチド」は、配列番号２のアミノ酸29〜303と 少なくとも80％、およびより好ましくは少なくとも90％の相同性を共有するポリ ペプチドをいう。 「活性なCMH-1ポリペプチド」は、システインプロテアーゼ活性を有し、そし て実施例４に記載するアッセイによりPARPを切断し得るCMH-1ポリペプチドであ る。本発明の活性なCMH-1ポリペプチドの例は、配列番号 のアミノ酸24〜303お よび配列番号２のアミノ酸29〜303である。 「活性化可能な（activatable）CMH-1ポリペプチド」は、CMH-1ポリペプチド の不活性形態であり、これは、切断に際して、活性CMH-1ポリペプチドに変換さ れる（すなわちプロ酵素形態）。活性化可能なCMH-1ポリペプチドの例は、配列 番号２である。 「不活性なCMH-1ポリペプチド」は、変異、欠損、または置換によりシステイ ンプロテアーゼ活性を欠くCMH-1ポリペプチドである。不活性なCMH-1ポリペプチ ドの好ましい例は、１つ以上の以下の触媒性残基で変異されたCMH-1ポリペプチ ドである：配列番号２に存在するCys186、Trp232、またはArg233。 さらなる用語は、本願を通して必要な場合に定義される。 １つの実施態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号１にハイブリダイ ズするDNA配列、および遺伝コードの縮重がなければ配列番号１またはそれにハ イブリダイズする配列にハイブリダイズし、そして配列番号１またはそれにハイ ブリダイズする配列によりコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有す るポリペプチドをコードするDNA配列から選択される、活性な、活性化可能な、 または不活性なCMH-1ポリペプチドをコードする単離されたDNA配列を提供する。 本明細書中で使用する、用語「ハイブリダイズする」は、変性したDNA配列が 、別の変性したDNA配列に相補的塩基対合を介して、少なくとも80％の相同性を 有する配列がそのようなハイブリダイズすることを可能にする条件下で、水素結 合する能力をいう。そのような条件は、当該分野において周知であり、そしてハ イブリダイゼーションおよび洗浄の両方について、５×SSCおよび65℃に実質的 に等価である塩および温度条件により例証される。 単一の全長cDNAのみが、添付した配列表に示されているが、以下と同じアミノ 酸配列（配列番号２）をコードする任意の他のDNA配列もまた、出願人の発明の 一部であることは、当業者に容易に明らかである： そのようなDNA配列は、同じアミノ酸をコードするために遺伝コードの重復性を 単に利用する。それらの特異的な配列はスペースを考えて本明細書には示さない が、当業者が発明的技能を働かせることなしに、単に遺伝コードを参照して、そ のようなDNA配列の全てを確認し得ることが理解されるべきである。 遺伝子的に重複するDNA配列に加えて、本発明はまた、配列番号２に少なくと も80％、そして好ましくは少なくとも90％相同である他のアミノ酸配列をコード するDNA配列も含む。本発明のこの局面は、単離されたDNA配列が活性なCMH-1を コードすることを必要としないので、配列番号１のいずれのヌクレオチドも、本 発明のDNA配列を生成させるために改変され得る。これらの付加的な配列の同定 および単離は、配列番号１またはその一部をプローブとして用いる、標準的なDN Aライブラリースクリーニング技術（ハイブリダイゼーション、PCR）により達成 され得る。そのような相同な配列は、任意の哺乳動物組織cDNAライブラリーにお いて、ならびに昆虫cDNAライブラリー、酵母および他の真菌cDNAライブラリーな らびに原核生物cDNAライブラリーにおいて見出され得る。 別の実施態様によれば、本発明は、配列番号１のヌクレオチド117〜959、配列 番号１のヌクレオチド132〜959；前記のDNA配列のいずれかにハイブリダイズす るDNA配列；および遺伝コードの縮重が無ければ、任意の前記のDNA配列にハイブ リダイズし、そして任意の前記のDNA配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプ チドをコードするDNA配列から選択される、活性なCMH-1ポリペプチドをコードす る単離されたDNA配列を提供する。最も好ましくは、この実施態様によるDNA配列 は、配列番号２のアミノ酸24〜303またはアミノ酸29〜303をコードするDNA配列 である。 この実施態様において、単離されたDNA配列は、触媒的に活性なCMH-1をコード していなければならない。配列番号１のヌクレオチド117〜959と同じアミノ酸（ 配列番号２のアミノ酸24〜303）または配列番号１のヌクレオチド132〜959と同 じアミノ酸（配列番号２のアミノ酸29〜303）をコードする全てのDNA配列は、明 確に本発明の範囲内となる。そのような遺伝子的に縮重の配列は、当業者により 、発明的技能を働かせることなしに周知の遺伝コードを利用して推定され得る。 活性なCMH-1ポリペプチドをコードするさらなるDNA配列は、配列番号１のヌク レオチド117〜959または132〜959あるいはそれらの一部をプローブとして使用し て、標準的なDNAライブラリースクリーニング技術により同定され得る。そのよ うな相同性のDNA配列は、コードされる触媒性残基である配列番号２のHis144ま たはCys186を変化させるヌクレオチドを含むべきでない。好ましくは、そのよう な相同性のDNA配列はまた、配列番号２のP1（Arg87、Gln184、Arg233、Ser239） 部位のアミノ酸を変化させるヌクレオチドを含まない。配列番号２のP2(Tyr229 、Trp232)、P3(Asn180、Pro235)およびP4(Ser234、Arg237、Trp240、Ser275)部 位のアミノ酸を変化させるヌクレオチドを含まないホモログがより好ましい。配 列番号２のその他のアミノ酸のいくつかまたは全部について保存的アミノ酸置換 のみをコードするヌクレオチドを含む相同性のDNA配列がさらにより好ましい。 次いで、任意のこれらのDNA配列の翻訳産物は、以下に記載のように、システイ ンプロテアーゼ活性についてアッセイされ得る。 別の実施態様によれば、本発明は、配列番号１にハイブリダイズし、そして配 列番号１に少なくとも80％相同であり、そして配列番号２のアミノ酸144または1 86のいずれかにおいて活性部位変異をコードするDNA配列、ならびに遺伝コード の縮重が無ければ、前記のDNA配列にハイブリダイズし、そして前記のDNA配列と 同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列から選択される、 不活性なCMH-1ポリペプチドをコードする単離されたDNA配列を提供する。配列番 号１のアミノ酸144および186の両方における変異をコードするDNA配列が、より 好ましい。配列番号２の以下のアミノ酸の１つ以上における変異をさらにコード するDNA配列が、さらにより好ましい：87、184、233、239、229、232、180、235 、234、237、240および275。配列番号２の以下の変異をコードするDNA配列が、 最も好ましい：Cys186→Ser、Trp232→AlaおよびArg233→Glu。 上記のように、本発明のこの局面によるDNA配列は、標準的なcDNAライブラリ ースクリーニングを通じて同定および単離され得る。特異的な変異は、部位特異 的変異誘発の使用を通じてCmh-1 DNAに導入され得る。次いで、そのようなDNA配 列の翻訳産物は、以下に記載のように、システインプロテアーゼ活性（の欠如） についてアッセイされ得る。 本発明の別の実施態様によれば、任意の上記のDNA配列は、組換えDNA分子にお いて用いられ得る。本発明の単離されたDNA配列は、任意の多数の市販のまたは そうでなければ公的に入手可能なクローニングベクターに挿入され得る。有用な 発現ベクターは、例えば、染色体の、非染色体の、および合成のDNA配列のセグ メントからなり得る。適切なベクターとしては、SV40の誘導体および公知の細菌 プラスミド（例えば、E.coliプラスミドcol E1、pCR1、pBR322、pMB9およびそれ らの誘導体、RP4のようなプラスミド）；ファージDNA（例えば、λファージの多 数の誘導体（例えば、NM989）および他のファージDNA（例えば、M13および線状 一本鎖ファージDNA））；2μプラスミドまたはその誘導体のような酵母プラスミ ド；昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターのような真核生物細胞にお いて有用なベクター；ファージDNAまたはその他の発現制御配列を用いるように 改変されたプラスミドのようなプラスミドとファージDNAとの組み合わせに由来 するベクター、などが挙げられる。 クローニングベクターの選択は、もちろん、得られる組換えDNA分子で形質転 換されるべき細胞のタイプ（単数または複数）およびその組換えDNA分子の最終 的な使用（すなわち、DNA生産、遺伝子治療、ポリペプチド発現）に依存する。 好ましい真核生物ベクターはSV40由来のベクターである。好ましい原核生物ベク ターはE.coli発現ベクターである。好ましいウイルスベクターは改変された真核 生物ウイルスベクターであり、好ましくは弱毒化されたアデノウイルスベクター （これは、遺伝子治療に使用され得る）（例えば、PCT公報第WO 94/26915号およ び同第WO 94/28938号、その開示は本明細書で参考として援用される）である。 組換えDNA分子を生じさせるために本発明のDNA配列をベクターに挿入するため の技術は、標準的な分子生物学的技術を含み、そしてそれらは当該分野で周知で ある（例えば、J.Sambrookら、Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)を参 照のこと）。 好ましい実施態様によれば、本発明の組換えDNA分子は、本発明のDNA配列に作 動可能に連結された発現制御配列をさらに含む。用語「発現制御配列」は、別の DNA配列の転写および翻訳を制御および調節するDNA配列をいう。それは、５’お よび３’両方の非コードDNA配列を含み、そして必要に応じてATG開始コドンを含 有する。 用語「作動可能に連結」は、発現制御配列がDNA配列の転写および翻訳を制御 および調節するような、目的のコードDNA配列に関しての発現制御配列の配置を いう。用語「作動可能に連結」は、発現されるべきDNA配列の前に適切な開始シ グナル（例えば、ATG）を有すること、ならびに発現制御配列の制御下でのDNA配 列の発現およびDNA配列によりコードされる所望の産物の産生を可能にするよう に適正なリーディングフレームを維持することを含む。組換えDNA分子に挿入し ようと所望する遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、そのような開始シ グナルがその遺伝子の前に挿入され得る。 発現制御配列の選択は、組換えDNA分子の性質、組換えDNA分子により形質転換 される宿主、および本発明のDNA配列の構成性発現または誘導性発現のいずれが 所望されるかに依存する。そのような有用な発現制御配列としては、例えば、SV 40またはアデノウイルスの初期および後期プロモーター、lac系、trp系、TACま たはTRC系、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコート タンパク質の制御領域、3-ホスホグリセレートキナーセまたは他の解糖酵素のプ ロモーター、酸性ホスファターゼ（例えば、Pho5）のプロモーター、酵母α−接 合因子のプロモーター、ならびに原核生物、真核生物またはそれらのウイルスの 遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、およびそれらの種々の組み 合わせが挙げられる。 これらの組換えDNA分子はCMH-1ポリペプチドを生産するために使用される。好 ましい発現制御配列は、真核生物ベクターが用いられる場合、SRαプロモーター であり、そして原核生物ベクターが用いられる場合、任意の誘導性プロモーター である。市販のpET-15b E.coliベクター（Novagen）中に含まれる発現制御配列 が、最も好ましい。 本発明はまた、本発明の組換えDNA分子により形質転換された宿主細胞を提供 する。これらの宿主としては、周知の真核生物および原核生物宿主（例えば、E. coli 、Pseudomnas、Bacillus、Streptomycesの株、真菌（例えば、酵母）、なら びに動物細胞（例えば、CHO、R1.1、B-WおよびL-M細胞、アフリカミドリザル腎 細胞（例えば、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40およびBMT10）、昆虫細胞（例えば、 Sf9）、ならびにヒト細胞）、ならびに組織培養の植物細胞が挙げられ得る。真 核生物細胞は、本発明の組換えDNA分子を、染色体外エレメントとして有し得る か、あるいはその全てまたは一部を宿主染色体中に組み込み得る。 ベクター、発現制御配列および宿主の全てが等しく良好に機能して、本発明の DNA配列を複製および／または発現させるわけではないことが理解される。また 、全ての宿主が同じ発現系で等しく良好に機能するわけでもない。しかし、当業 者は過度の実験を行うことなく適切なベクター、発現制御配列、および宿主を選 択して、本発明の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成し得る。例えば、 ベクターの選択において、ベクターは宿主の中で機能しなければならないので、 宿主を考慮に入れなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御 する能力、ならびに抗生物質および他の選択マーカーのようなベクターによりコ ードされる任意の他のタンパク質の発現も考慮に入れられる。 発現制御配列の選択においては、種々の因子が通常は考慮に入れられる。これ らの因子としては、例えば、系の相対的な強さ、制御可能性、および発現される べき特定のDNA配列または遺伝子との適合性（特に、潜在的な二次構造に関して ）が挙げられる。適切な単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとの適合性 、タンパク質を適正に折り畳むその能力、およびその発酵の要求性、ならびに発 現されるべきDNA配列によりコードされる産物の宿主への毒性、および発現産物 の精製の容易性の考慮により選択される。 これらの因子および他の因子を考慮して、当業者は、発酵または大規模動物培 養物において本発明のDNA配列を複製および／または発現する、種々のベクター ／発現制御配列／宿主の組み合わせを構築し得る。 組換えDNA分子で細胞を形質転換する方法は、当該分野で周知である（例えば 、J.Sambrookら、Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)を参照のこと）。任意のそれら の方法が、本発明の形質転換された宿主を生成させるために用いられ得る。形質 転換された宿主の同定は、Cmh-1 DNA、Cmh-1 RNA、またはCMH-1ポリペプチドの 存在についてアッセイすることにより行われる。さらに、形質転換体は、選択培 地における培養により同定され得る。このアッセイのために、選択培地における 増殖に必要な遺伝子が、Cmh-1 DNAと同じ組換えDNA分子または異なる組換えDNA 分子のいずれかで細胞に同時トランスフェクトされ、そしてその細胞中で発現可 能である。もちろん、選択的増殖のための遺伝子は形質転換されていない細胞に は存在するべきでないことは明らかである。 本発明の形質転換された宿主は、本発明のCmh-1 DNA配列および／またはそのD NA配列によりコードされるCMH-1ポリペプチドのいずれかを大量に生産するため に使用され得る。大量のCmh-1のDNAを生産するために、宿主、好ましくは原核生 物宿主は、培地中で、そしてDNA複製および細胞分裂を促進する条件下で増殖さ せられる。細菌を増殖させるために日常的に使用される任意の完全培地がこの目 的のために適切である。培養の後に、形質転換された細胞は増殖培地から分離さ れ、次いでプラスミドDNAは標準的な周知の技術により細胞から単離される。次 いで、Cmh-1 DNAは、制限エンドヌクレアーゼの使用によりそのプラスミドから 切り出され得る。 この形質転換された宿主がCMH-1ポリペプチドを生産するために用いられる場 合、CMH-1ポリペプチドは活性または活性化可能であることが好ましい。この実 施態様において、好ましい宿主は哺乳動物細胞である。形質転換された宿主は、 宿主中に存在するCMH-1ポリペプチドをコードするDNA配列の発現を促進する培地 中で培養させられるべきである。DNA配列の発現が構成性プロモーターの制御下 にある場合は、任意の標準的な増殖培地が適切である。Cmh-1 DNAが誘導性プロ モーターの制御下にある場合は、発現を誘導する化合物を増殖培地に補充すべき であるか、または発現を誘導するように増殖条件を変化させるべきである（すな わち、増殖温度の変化）。発現の後に、形質転換された細胞は増殖培地から分離 され、溶解され、そしてCMH-1ポリペプチドが標準的な方法により精製される。 活性なCMH-1ポリペプチドの存在を決定するために、プロテアーゼ活性アッセ イが使用される。そのようなアッセイは、ポリペプチドが天然または合成の基質 を切断する能力を測定する。活性なCMH-1ポリペプチドはAsp-X結合を切断する。 これらのアッセイのための好ましい天然の基質はポリ（ADPリボース）ポリメラ ーゼ(「PARP」)である。これらのアッセイのために有用な合成基質は、Asp-X結 合を含むペプチドである。活性なCMH-1ポリペプチドを検出するための好ましい アッセイは実施例４に記載される。 CMH-1ポリペプチドに加えて、本発明はまた、CMH-1ポリペプチドに対する抗体 を提供する。抗体の生成は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両 方を産生するための当該分野における標準的な方法によって、CMH-1ポリペプチ ドまたはそのフラグメントを抗原として使用して達成され得る。そのような抗体 またはその活性なフラグメント（例えば、Fabフラグメント）は、CMH-1ポリペプ チドのインビボレベルまたはインビトロレベルをアッセイするために使用され得 る。CMH-1ポリペプチドのインビボレベルの増加は、アポトーシスの開始の指標 となり得る。 CMH-1ポリペプチドに対する抗体はまた、患者においてアポトーシスを防止す ることにおける潜在的な治療的使用を有する。あるいは、CMH-1抗体は、患者に おけるコレステロールレベルを調節するために使用され得る。以前に記載される ように、アポトーシスに関与するシステインプロテアーゼはまた、ステロール応 答性エレメント結合タンパク質を活性化し、これは次に、LDLレセプターおよび3 -ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoAシンターゼをコードする遺伝子の転写を調 節する（X．Wangら、(1995)）。 そのような抗体は、細胞特異的分子への結合を通して、それらの標的細胞に指 向され得る。そのような抗体の結合および細胞特異的標的化分子の同定は当該分 野で公知である。 最後に、CMH-1ポリペプチド抗体は、天然供給源またはCMH-1ポリペプチドを発 現する形質転換された宿主のいずれかからCMH-1ポリペプチドを精製するために 用いられ得る。例えば、抗体は、イムノアフィニティー樹脂を形成するために、 標準的な技術によって不溶性マトリックスに結合され得る。 本発明中のCmh-1 DNA配列（そのフラグメント）は、このシステインプロテア ーゼファミリーの他のメンバーを潜在的に同定するために、相同DNA配列を同定 するために使用され得る。これらのDNA配列（または、そのフラグメント）、本 発明のDNA配列は、多数の治療的および診断的応用において有用である。 １つの実施態様によれば、活性なまたは活性化可能なCHM-1ポリペプチドをコ ードするDNA配列は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける遺伝子治療 において使用され得る。この実施態様において、DNAは遺伝子治療のために適切 なビヒクル中に含まれなければならない。そのようなビヒクルは当該分野におい て公知である。例えば、標的細胞に（その細胞中で複製せずに）遺伝子物質を移 入し得る種々のウィルスが記載されている（米国特許第5,112,767号、同第5,240 ,846号および同第5,112,767号、これらの開示を本明細書中で参考として援用す る）。そのようなウィルスとしては、複製欠損アデノウィルス、アデノ随伴ウィ ルス（AAV）、および複製欠損レトロウィルス(例えば、PLJ pZip、pWeおよびpEM )が挙げられる。 ウィルス以外の遺伝子送達系もまた、本発明の方法において用いられ得る。例 えば、移入されるべき遺伝子はリポソーム中にパッケージされ得る。細胞がDNA 包膜化リポソームと共にインキュベートされると、細胞はDNAを取り込みそして それを発現する。これらのリポソームを形成するために、移入されるべき遺伝子 を発現する発現ベクターのDNAを脂質（例えば、適切な緩衝液（例えば、Hepes緩 衝化生理食塩水）中のN-[1-(2,3,ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリ-メ チルアンモニウムクロリド（DOTMA））と共に混合する。これは、本発明の方法 において使用され得る、脂質−DNA複合体（リポソーム）の自発的形成を引き起 こす[P．L．Felgnerら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，84，7413-17頁(1987)]。 本発明で利用される別の遺伝子送達系はDNA−タンパク質複合体である。これ らの複合体の形成は、米国特許第5,166,320号（その開示は、本明細書中で参考 として援用される）に記載されている。詳細には、これらの複合体は、適切なポ リマー（例えば、ポリリジン）を介して、レセプターまたは他の細胞表面タンパ ク質に対するポリペプチドリガンドに連結された移入される（プロモーター、エ ンハンサー配列および標的細胞における発現のために必要な他のDNAと一緒に） べき遺伝子を含む。リガンドが細胞表面レセプターに結合した後、この複合体は エンドサイトーシスを介して標的細胞によって取り込まれる。次いでこのDNAは 、ポリマーリンカーを切断する細胞内酵素を介して複合体の残りから切断される 。そのような複合体は、特異的細胞型を標的化することにおいて特に有用である 。例えば、ガン細胞は、腫瘍細胞表面マーカーまたはレセプターを特異的に認識 するタンパク質の使用を通して特異的に標的化され得る。 この実施態様による好ましい使用は、患者におけるガンの処置における。本明 細書中で用いられる用語「患者」は、哺乳動物、特にヒトをいう。活性なまたは 活性化可能なCMH-1ポリペプチドをコードするDNA配列で形質転換されたガン細胞 はDNAを発現させ、これは次に、細胞死を引き起こす。 不活性なCMH-1ポリペプチドをコードするDNA配列はまた、アポトーシスを抑制 するための遺伝子治療において有用である。この実施態様によれば、このDNAに よってコードされる不活性なCMH-1ポリペプチドは、天然の活性なCMH-1と基質に ついて競合的に競合する。これは細胞中でCMH-1活性を減少させ、アポトーシス を阻害する。この方法によって処置されるべき好ましい細胞は、神経細胞である 。 本発明のDNA配列はまた、CMH-1ポリペプチドmRNAのアンチセンスインヒビター 、および従ってアポトーシスのインヒビターとして使用され得る。この実施態様 において、一本鎖アンチセンスCmh-1 DNAは、標準的技術によって細胞中に導入 される。一旦細胞の内部に入ると、DNAはCmh-1 mRNAに結合し、そしてその翻訳 を妨害する。 別の実施態様によれば、本発明のDNA配列は、細胞中のCmh-1 mRNAレベルを決 定するための診断ツールとして使用され得る。これは、当該分野で周知である標 準的なノーザンブロットまたはドットブロッティング技術によって達成され得る 。例えば、ガン細胞中の低レベルのCmh-1 mRNAは、これらの細胞が化学療法に応 答することの指標となる。正常細胞において、高レベルのCmh-1 mRNAは、疾患（ 特に神経、および他の神経性細胞における）の前兆であり得る。 本発明の活性なまたは活性化可能なCMH-1ポリペプチドは、潜在的なアポトー シスインヒビターを同定しそして特徴付けるための有用なアッセイ試薬である。 この実施態様において、潜在的なインヒビターは、活性なまたは活性化可能なCM H-1ポリペプチドおよび基質を含む、アッセイ混合液に添加される。活性化可能 な形態が使用される場合、アッセイは活性化可能な形態から活性な形態に変換す る条件を用いられなければならない。好ましくは、CMH-1ポリペプチドの活性な 形態が使用される。化合物による、CMH-1ポリペプチドがその基質を切断する能 力の阻害は、その化合物がアポトーシスの潜在的なインヒビターであるというこ とを示唆する。 本明細書中に記載の発明がより完全に理解され得るように、以下の実施例が記 載される。これらの実施例は例示の目的のみのためであり、そしていかにしても 本発明を制限するとは解釈されないことが理解されるべきである。 実施例１ CMH-1 cDNA のクローニング 本発明者らは、最初に、Blastアルゴリズム[S．F．Altshulら、J ．Mol．Biol. , 403-10頁(1990)]を使用して、ICE様ポリペプチドをコードするcDNAクローンに ついて、National Center for Biotechnology Information（NCBI）Sequenceに よって維持されているGanBank ESTデータベースをスクリーニングした。本発明 者らは、MACAWプログラム[G．D．Schulerら、Proteins: Structure ，Function, and Genetics ，9，180-90頁(1991)]を使用して既知のICEファミリータンパク質 ペプチド配列の最初の複数配列アラインメントを生成し、そして後に、PILEUPア ルゴリズム（Genetics Computer Group，1995）および対の（pairwise）比較 の組み合わせによって洗練させた。 このスクリーニングを通じて、本発明者らは、Washington University-Merck ESTプロジェクトによって寄託された部分ヒトcDNAクローン（受託番号T50828） （これは、本発明者らのコンセンサスICE配列および3'非翻訳領域に対する制限 された類似性を有する部分オープンリーディングフレームを有した）を同定した 。本発明者らは、IMAGE Consortium（Lawrence Livermore National Laboratory ）を通じて、このEST（発現配列タグ）配列に対応する、部分ヒトcDNAクローン7 2778を入手した。 完全長cDNAクローンを生じさせるために、本発明者らは脾臓cDNAプールをDNA アダプター（Clontech，Palo Alto，CA）に連結し、そしてその後、5'アダプタ ーに対するプライマー（配列番号３:5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC）およびE ST T50828配列に対するプライマー（配列番号４:5'-GCAAACTCTGTCAATTCACCC）を 使用してPCRを行った。この技術を通じて、本発明者らは、5'コード領域を含む0 .8kbのSacI-HgiAI PCRフラグメントを生成させ得た。次いで本発明者らは、この フラグメントを3'領域を含む72778クローン由来の1.55kbのHgiAI-KpnIフラグメ ントに連結し、得られたDNAをpBluescript SK（Staratagene，La Jolla CA）にS acI/KpnIにおいてサブクローニングして、完全長cDNAを生成させた。 本発明者らは、得られたcDNA（Cmh-1(CPP32/Mch2 homolog-1)と名付けた）を 、両方の鎖でABI Prism Dye Deoxy Terminator sequencingにより、ABI 373 DNA Sequencerを用いて配列決定した。CMH-1配列はSequence Listingにおいて配列 番号１として明らかにされる。 完全長cDNA配列の分析は、34 kDaのタンパク質をコードする303アミノ酸の単 一のオープンリーディングフレームを同定し、この34 kDaのタンパク質を、本発 明者らはCMH-1と名付けた。コードされるタンパク質を、配列表において配列番 号２として記載する。本発明者らは、触媒性残基を、配列番号２中のHis144およ びCys186と同定した。 CMH-1は、T．Fernandes-Alnemriら（1994）によって同定されたCPP32に、52％ の同一性を有することが見出された。さらに、ICE/Ced3遺伝子ファミリーの全て のメンバーとの配列類似性が存在した。全体に、 このポリペプチドは、お おまかにICEのP15、P20、およびP10サブドメインに対応する３つのドメインに分 割され得る。CMH-1において、これらのドメインは、それぞれ２、21、および11k Dである。 CMH-1と、ICE構造のコアを含む配列およびICE結晶構造において活性部位Cys28 5およびHis237を囲んでいる多数の残基[K．P．Wilsonら、Nature，（1994）；N ．P．C．Walkerら、Cell，(1994)]との間には、強い類似性が存在する。このICE 構造上へのCMH-1の重ね合わせは、プロテアーゼ活性部位の周囲に位置する多数 の他の残基の同定を可能にした（図１）。 興味深いことに、P1位で基質結合ポケットを裏打ちする残基の全ては、ICEに おいて見出される残基と同一である（ICE Arg179およびArg341に対応するArg87 およびArg233を含む）。このことは、このファミリーの他のメンバーにおいてみ られるように、CMH-1がこの位置におけるAspに対する基質特異性を有することを 強く示唆する。 CMH-1とその最も近いホモログCPP32との間にはP3-P4残基に対応する結合ポケ ットにおいてずっと少ない配列保存が存在し、このことはCMH-1が異なる基質（ 単数または複数）を有することを示唆する。 実施例２ COS 細胞におけるCMH-1の発現およびプロセシング 本発明者らは、CMH-1が予期されるシステインプロテアーゼ活性を有するかど うかを決定するために、COS細胞におけるCMH-1の一過性発現を用いた。CPP32前 駆体からのプロドメインの除去はAsp28とSer29との間で生じる[D．W．Nicholson ら、Nature，(1995)]。CMH-1について、本発明者らはプロドメインの除去が生じ 得る位置をAsp23-Ala24として推定した。 それゆえ本発明者らは、以下のプライマーを使用するPCRにより、最初の23ア ミノ酸残基を欠くＮ末端T7タグ化CMH-1をコードするcDNAフラグメントを生じさ せた：配列番号５:5'-GCTGCAGTCTAGAGCTCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTG CTAAGCCAGACCGGTCCTCG-3'および配列番号６:5'-GAATTCTAGATTCTATTGACTGAAGTAGA GTTC-3'。本発明者らは得られた増幅されたDNAをXbaIで消化し、そしてSRαプ ロモーターの制御下でXbaI切断したSV40に基づく発現ベクター（pcDLSRα）［Y. Takebeら、Mol ．Cell．Biol.，8，466-72頁(1988)]中にサブクローニングした。 本発明者らは、対応するCys186→Ser、Trp232→AlaおよびArg233→Glu変異を 含む不活性な変異体CMH-1（C186S/W232A/R233E）を、オリゴヌクレオチド（配列 番号７:5'-CATTCAGGCTAGCCGAGGGACおよび配列番号８:5'-GCTATTACTCAGCTGAGAGCC CAGGAを用い、そして周知の技術[T．A．Kunkel，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA, 82，488-92頁（1985）；Y．Guら、EMBO J.，（1995）（これらの開示を本明細書 中において参考として援用する）］に従う、部位特異的変異により生じさせた。 これらの置換は、触媒作用およびP1アスパラギン酸結合のための保存された残基 においてであった。 本発明者らは、Y．Guら、EMBO J.，(1995)に記載のDEAE-Dextran法を用いて、 COS細胞を一過性にトランスフェクトした。COS細胞を６ウェル培養プレート中で 増殖させ、そして活性なCMH-1をコードする配列または不活性なCMH-1をコードす る配列のいずれかを含むプラスミドDNA ３μgを用いてトランスフェクトした。 本発明者らは、細胞を、トランスフェクションの24時間後に回収した。 COS細胞における発現プラスミドのトランスフェクションは、短縮型CMH-1タン パク質の高発現および高プロセシングを生じる。抗T7抗体でのCOS細胞溶解物の イムノブロッティングは、34 kDの見かけの分子量を有するプロセシングされて いない前駆体および22 kDの見かけの分子量を有するプロセシングされた産物を 検出した（図２、パネルＡ）。 本発明者らが、T7-CMH-1をT7タグ化PARPの43 kDの短縮化形態と同時発現させ た場合、PARPはT7タグ化31-kDフラグメントに切断され、これはCPP32、ICE、Tx 、およびNedd-2によるPARPの切断[Y．Guら、J ．Biol．Chem.，270，18715-18頁( 1995)]と同様であった。不活性な変異体（C186S/W232A/R233E）は、自己プロセ シングおよびPARP切断の両方が欠損していた。 他のICE様のシステインプロテアーゼと同様に、本発明者らは、CMH-1タンパク 質の過剰発現が、トランスフェクトした細胞における細胞収縮の存在およびDNA フラグメント化によって実証される細胞アポトーシスを誘導することを見出した （図２、パネルＢ）。アポトーシスの誘導が、システインプロテアーゼの存在 に依存したことは明白であった。なぜなら、活性部位変異体の発現は、トランス フェクトしたCOS細胞のアポトーシスを生じなかったからである（図２、パネル Ｂ）。 実施例３ E.coli における組換えCMH-1の発現および精製 さらにCMH-1タンパク質の活性を特徴付けるために、本発明者らは、E.coli中 で、Ｎ末端(HiS)₆タグ化CMH-1(Ala24-Gln303)を発現させた。本発明者らは、以 下のプライマーを用いるPCRを用いて、インフレームでXhoI部位をCMH-1 cDNAの5 'および3'末端に導入することにより、Ｎ末端(HiS)₆タグ化CMH-1(Ala24-Gln303) のための発現プラスミドを構築した：配列番号９:5'CGGCTCGAGGCTAAGCCAGACCGGT CCTCGおよび配列番号10:5'GGGCTCGAGCTATTGACTGAAGTAGAGTTC。得られたXhoIフラ グメントを、XhoI切断したpET-15b誘導性E.coli発現ベクター（Novagen，Madiso n，WI）に連結した。得られたプラスミドは、23残基のペプチド配列番号11:MGSSHHHHHH SSGLVPRGSHMLEを伴う303アミノ酸のポリペプチドをコードする。ここで、 LVPRGS(配列番号11のアミノ酸14〜19)は、インフレーム中でAla24で開始するCMH -1のＮ末端に融合された、トロビン切断部位を表す（DNA配列決定および発現さ れたタンパク質のＮ末端配列決定よって確認した）。 このプラスミドを有するE.coliBL21(DE3)株を、0.8 mM IPTGで誘導し、回収し 、そして20 mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、300 mM NaCl、２mM DTT、10％グリセ ロール、0.4 mM PMSF、2.5μg/mlロイペプチンを含有する緩衝液中でミクロフル イダイザー（microfluidizor）において溶解した。本発明者らは、溶解物を、10 0,000×g、30分間の遠心分離によって澄明化した。 可溶性CMH-1を含有する上清を、0.5 mlニッケル-NTAカラム（Qiagen）にロー ドし、そして同一の緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを、同一の緩衝液中の漸 増濃度のイミダゾールで溶出し、そしてCMH-1タンパク質は100〜200 mMで溶出さ れて、１リットルの培養物当たり約５mgのタンパク質の収率を与えた。次いで、 イミダゾールを、透析によって除去した。 精製タンパク質画分は、約34 kDa、22 kDa、および12 kDaの３つの主要なポリ ペプチドを含んでいた（図３）。11 kDaのポリペプチドはまた、いくつかの調製 物中に存在した。 抗(His)₆タグ抗体でのE.coliで発現した(His)₆タグ化CMH-1タンパク質のイム ノブロッティングを、Guら、J ．Biol．Chem．(1995)に記載のように行った。こ れらのペプチドの各々のＮ末端を、ABI 477A Protein Sequencer（Applied Bios ystems，Inc.，Foster City，CA）を用いて分析した。 これらの研究は、34 kDaおよび22 kDaのポリペプチドが、(HiS)₆タグおよびAl a24で始まる短縮型CMH-1の予想されるＮ末端配列を含むことを示している。12 k Dおよび11 kDaのポリペプチドのＮ末端はそれぞれSer199およびAla207において 開始し、その両方はAsp残基によって先行される。このことは、CMH-1（Ala24-Gl n303）タンパク質の自己プロセシングはAsp198-Ser199部位で優勢に、そしてAsp 206-Ala207部位でより低い程度に生じることを示唆する。22 kDaおよび12 kDaタ ンパク質は、完全長34 kDaタンパク質の自己プロセシング産物である。それらは CMH-1タンパク質の２つのサブユニットを表す。 実施例４ CMH-1 によるPARPのインビトロ切断 精製したCMH-1の活性を決定するために、本発明者らは、このタンパク質が³⁵[ S]標識したプロIL-1bおよびPARPを切断し得るかどうか決定し、そして精製したI CEに対してその切断活性を比較した。本発明者らは、インビトロ転写および翻訳 によって、³⁵[S]標識したPARPおよびIL-1b前駆体（プロIL-1b）を調製した。切 断実験を、以前に記載のように行った[Y．Guら、J ．Biol．Chem．(1995)]。切断 産物を、その参考文献に記載のように、SDS-PAGEおよびフルオログラフィーによ って分析した。 結果は、CMH-1がプロIL-1bではなくPARPを切断することを実証した。30分以内 にPARPを完全にプロセシングするために、３nM未満のCMH-1が必要とされた（図 ４、パネルＡ）。この効率は、同一の条件下での同一の基質の切断において、IC Eの効率より顕著に高く、そしてPARPに対するCPP32の活性（結果は示さず）また はプロIL-1bに対するICEの活性[Y．Guら、J ．Biol．Chem．(1995)]に類似して いた。 CMH-1の切断活性は、テトラペプチドインヒビターDEVD-CH0[D．W．Nicholson ら、Nature，(1995); X．Wangら、J ．Biol．Chem．(1995)]およびシステイン− アルキル化試薬N-エチルマレイミドおよびヨードアセトアミドによって阻害され たが、ICEインヒビターYVAD-CHO[N．A．Thornberryら、Nature，(1993); Y．Gu ら、J ．Biol．Chem．(1995)]またはcrmA（ICEインヒビターに特異的なウィルス 性タンパク質）またはセリンプロテアーゼもしくは金属プロテアーゼのインヒビ ターによっては阻害されなかった（図４、パネルＢ）。これらの結果は、CMH-1 が、ICEよりもCPP32に近い性質を有するシステインプロテアーゼであるというこ とを実証する。これは、CPP32とCMH-1との間の相対的な配列同一性と一致した。 実施例５ CMH-1 mRNA のノーザンブロット分析 本発明者らは、成人ヒト組織中のCmh-1 mRNAの発現を、Cmh-1特異的cDNAプロ ーブを用いるノーザンブロッティングによって研究した。２μg／レーンのポリ( A)⁺RNAを含むヒト複数組織RNAブロット（MTNブロット、Clontech）を、完全長Cm h-1の³²[P]標識プローブに、50％ホルムアミド、10×Denhardts、２％SDS、5×S SPE、および100μg/mlの剪断および変性したssDNA中で42℃で16時間ハイブリダ イズさせた。ブロットを、２×SSC、0.1％SDS中で室温で40分間洗浄し、そして0 .1×SSC、0.1％SDSで42℃で20分間洗浄し、そしてKodak XAR-5フィルムに18時間 曝露した。 2.5 kbのmRNAが、膵臓、肺、胎盤、腎臓、筋肉および心臓を含む組織において 検出された。留意すべきことに、Cmh-1の発現は肝臓中で低く、そして脳におい てはほとんど検出されなかった（図５）。種々の組織におけるCmh-1のこの遍在 性の発現は、CPP32の発現と同様である（データは示さず）。 本発明者は本発明の多数の実施態様を上記で示したが、本発明者の基本的構成 が、本発明の方法を利用する他の実施態様を提供するために変更し得ることは明 らかである。それゆえ、本発明の範囲は、例として上記に示された具体的な実施 態様ではなく、本明細書に添付の請求の範囲によって定義されるべきであるとい うことが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／５５８，７３３ (32)優先日 1995年11月16日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単離されたDNAであって、以下： ａ．配列番号１に記載のDNA配列； ｂ．配列番号１にハイブリダイズし、そして配列番号１と少なくとも80％の相 同性を共有するDNA配列であって、ここで、発現に際して、該DNA配列はCMH-1ポ リペプチドをコードする、DNA配列、；および ｃ．配列番号１に80％未満相同であるが、発現に際して、ａ）またはｂ）のDN A配列によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプ チドをコードするDNA配列、 からなる群より選択される、DNA配列。 ２．発現に際して、システインプロテアーゼ活性を有する活性なCMH-1ポリペプ チドをコードする、請求項１に記載のDNA配列。 ３．発現に際して、システインプロテアーゼ活性を欠く活性化可能なCMH-1ポリ ペプチドをコードするDNA配列であって、ここで該活性化可能なCMH-1ポリペプチ ドは、切断に際して、システインプロテアーゼ活性を有する活性化CMH-1ポリペ プチドに変換される、請求項１に記載のDNA配列。 ４．単離されたDNA配列であって、以下： ａ．配列番号１のヌクレオチド123〜962を含むDNA配列； ｂ．配列番号１のヌクレオチド138〜962を含むDNA配列； ｃ．ａ）またはｂ）において定義されるDNA配列にハイブリダイズし、そして ａ）およびｂ）において定義されるDNA配列と少なくとも80％の相同性を共有す るDNA配列であって、ここで、発現に際して、該DNA配列は活性なポリペプチドを コードする、DNA配列 ｄ．ａ）またはｂ）において同定されるDNA配列に80％未満相同であるが、発 現に際してａ）、ｂ）、またはｃ）のDNA配列によってコードされるポリペプチ ドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列、 からなる群より選択される、DNA配列。 ５．配列番号２のアミノ酸24〜303をコードするDNA配列、および配列番号２のア ミノ酸29〜303をコードするDNA配列から選択される、請求項４に記載のDNA配列 。 ６．単離されたDNA配列であって，以下： ａ．配列番号１にハイブリダイズし、そして配列番号１と少なくとも80％の相 同性を共有するDNA配列であって、ここで、発現に際して、該DNA配列はシステイ ンプロテアーゼ活性を欠く不活性なCMH-1をコードする、DNA配列；および ｂ．配列番号１に80％未満相同であるが、発現に際して、ａ）のDNA配列によ ってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ドするDNA配列であって、該DNA配列はシステインプロテアーゼ活性を欠くポリペ プチドをコードする、DNA配列、 からなる群より選択される、DNA配列。 ７．請求項１〜６のいずれかに記載のDNA配列を含む、組換えDNA分子。 ８．前記DNA配列が、発現制御配列に作動可能に連結されており、該DNA配列が前 記組換えDNA分子で形質転換された宿主細胞中で発現され得る、請求項７に記載 の組換えDNA分子。 ９．請求項７に記載の組換えDNA分子で形質転換された、原核生物または真核生 物宿主細胞。 １０．請求項８に記載の組換えDNA分子で形質転換された、原核生物または真核 生物宿主細胞。 １１．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項９または１０に記載の宿主 細胞。 １２．前記宿主細胞がE.coliである、請求項９または１０に記載の宿主細胞。 １３．１〜６の請求項いずれかに記載のCMH-1ポリペプチドをコードするDNA配列 を産生する方法であって、該方法は以下の工程： ａ．請求項９または１０に記載の宿主細胞を増殖培地中でインキュベートする 工程； ｂ．該培地から該細胞を分離する工程；および ｃ．該細胞から該DNA配列を単離する工程、 を包含する、方法。 １４．CMH-1ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は以下の工程 ： ａ．請求項１０に記載の宿主細胞を、該CMH-1ポリペプチドの発現を促進する 条件下で増殖培地中でインキュベートする工程； ｂ．該培地から該細胞を分離する工程；および ｃ．該細胞から該ポリペプチドを単離する工程、 を包含する、方法。 １５．請求項１〜６のいずれかに記載のDNA配列によってコードされる、CMH-1ポ リペプチド。 １６．CMH-1ポリペプチドに対する抗体であって、請求項１から６にいずれかに 記載のDNA配列によってコードされるCMH-1ポリペプチドに結合し得る、ポリクロ ーナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体フラグメントから選択される、抗 体。