JPH09152433A - 固相担体に固定した核酸等の検出方法 - Google Patents
固相担体に固定した核酸等の検出方法Info
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- JPH09152433A JPH09152433A JP33803895A JP33803895A JPH09152433A JP H09152433 A JPH09152433 A JP H09152433A JP 33803895 A JP33803895 A JP 33803895A JP 33803895 A JP33803895 A JP 33803895A JP H09152433 A JPH09152433 A JP H09152433A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 検出感度が高く，多色の蛍光シグナルを発す
ることができる，固相担体に固定した核酸等の検出方法
を提供する。 【解決手段】 固相担体に固定した核酸等の被検体に，
酵素を結合させる。次いで，該酵素に，「Ｒ−Ｆ−Ｂ−
Ａ」に示す化学構造式の蛍光物質を反応させる。その
後，これらに励起光を照射して，これにより発生する蛍
光を検出する。ここに，Ｒは酵素と反応する酵素反応
基，ＦはＯＨ基を有する蛍光団，Ｂはカルボキシアミド
基，Ａはビフェニル基を意味する。以下，同様。Ｒは，
リン酸基，βガラクトピラノシド基等である。Ｆは，ア
ントラセン，ナフタレン等である。Ａは，オルトビフェ
ニル基，又はパラビフェニル基である。
ることができる，固相担体に固定した核酸等の検出方法
を提供する。 【解決手段】 固相担体に固定した核酸等の被検体に，
酵素を結合させる。次いで，該酵素に，「Ｒ−Ｆ−Ｂ−
Ａ」に示す化学構造式の蛍光物質を反応させる。その
後，これらに励起光を照射して，これにより発生する蛍
光を検出する。ここに，Ｒは酵素と反応する酵素反応
基，ＦはＯＨ基を有する蛍光団，Ｂはカルボキシアミド
基，Ａはビフェニル基を意味する。以下，同様。Ｒは，
リン酸基，βガラクトピラノシド基等である。Ｆは，ア
ントラセン，ナフタレン等である。Ａは，オルトビフェ
ニル基，又はパラビフェニル基である。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は，分子生物学等の研究分野，ウイ
ルスの検出などの臨床検査分野等において，蛍光基質と
酵素との反応を利用して，固相担体に固定した核酸等の
被検体の検出方法に関する。
ルスの検出などの臨床検査分野等において，蛍光基質と
酵素との反応を利用して，固相担体に固定した核酸等の
被検体の検出方法に関する。
【０００２】
【従来技術】酵素抗体法は，酵素反応によりシグナル物
質を増幅するため，感度の高い方法として知られてい
る。とくに蛍光物質を用いる酵素標識蛍光法は特異性・
感度ともに高い優れた方法である（Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．
Ｙｏｌｋｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｓｔｏｐａ，
Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅ Ａｓｓａｙ：Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｏ
ｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，３１７−３２１（１９７
９））。
質を増幅するため，感度の高い方法として知られてい
る。とくに蛍光物質を用いる酵素標識蛍光法は特異性・
感度ともに高い優れた方法である（Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ．
Ｙｏｌｋｅｎ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｓｔｏｐａ，
Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ
ｅ Ａｓｓａｙ：Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｏ
ｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，３１７−３２１（１９７
９））。
【０００３】かかる酵素抗体法は，マイクロタイターウ
ェルに結合させた抗体によって，被検体である抗原をト
ラップし，さらに，酵素標識抗体を結合させる。その酵
素活性を指標に抗原の存在を知る方法である。この方法
においては，酵素の基質として４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍ
ｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下，Ｍ
ＵＰともいう。）などの蛍光物質を用いることによって
高感度が達成されている。
ェルに結合させた抗体によって，被検体である抗原をト
ラップし，さらに，酵素標識抗体を結合させる。その酵
素活性を指標に抗原の存在を知る方法である。この方法
においては，酵素の基質として４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍ
ｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（以下，Ｍ
ＵＰともいう。）などの蛍光物質を用いることによって
高感度が達成されている。
【０００４】一方，ナイロン膜に固定した核酸又は蛋白
質を特異的に検出する方法としては，それぞれサザンハ
イブリダイゼーションやウェスタンブロットが知られて
いる。これらの方法の中では，特に，化学発光基質を用
いた酵素抗体法を利用することによって，従来の放射性
同位元素を用いた方法と同等の感度が得られている。
質を特異的に検出する方法としては，それぞれサザンハ
イブリダイゼーションやウェスタンブロットが知られて
いる。これらの方法の中では，特に，化学発光基質を用
いた酵素抗体法を利用することによって，従来の放射性
同位元素を用いた方法と同等の感度が得られている。
【０００５】
【解決しようとする課題】しかしながら，上記従来の酵
素抗体法においては，蛍光基質の蛍光シグナルの波長が
限られているため，同一被検体上で複数種類の情報を同
時に検出することはできない。
素抗体法においては，蛍光基質の蛍光シグナルの波長が
限られているため，同一被検体上で複数種類の情報を同
時に検出することはできない。
【０００６】そこで，同一被検体上で複数種類の情報を
同時に検出するに当たって，多色の蛍光シグナルを発す
る核酸等の検出方法には，酵素と蛍光物質とを反応さ
せ，これらに励起光を照射することにより発する蛍光を
検出する酵素標識蛍光法が有効と考えられる。しかし，
上述のＭＵＰをはじめ，これまでに知られているほとん
どの蛍光基質はナイロン膜等の固相担体に沈着しない。
そのため，上記従来の蛍光物質は，固相担体上での特定
の情報（バンド・スポット等のパターン）の検出に利用
することはできない。
同時に検出するに当たって，多色の蛍光シグナルを発す
る核酸等の検出方法には，酵素と蛍光物質とを反応さ
せ，これらに励起光を照射することにより発する蛍光を
検出する酵素標識蛍光法が有効と考えられる。しかし，
上述のＭＵＰをはじめ，これまでに知られているほとん
どの蛍光基質はナイロン膜等の固相担体に沈着しない。
そのため，上記従来の蛍光物質は，固相担体上での特定
の情報（バンド・スポット等のパターン）の検出に利用
することはできない。
【０００７】そこで，発明者らは，鋭利研究して，先に
固相担体に沈着し得る蛍光物質を出願した（特開平４─
９１７９９号公報）。しかし，この蛍光物質であって
も，検出感度が不十分であった。また，１種類の蛍光シ
グナルを発することができるに留まるため，同一被検体
で複数種類の情報の検出を行うことができなかった。
固相担体に沈着し得る蛍光物質を出願した（特開平４─
９１７９９号公報）。しかし，この蛍光物質であって
も，検出感度が不十分であった。また，１種類の蛍光シ
グナルを発することができるに留まるため，同一被検体
で複数種類の情報の検出を行うことができなかった。
【０００８】本発明はかかる従来の問題点に鑑み，検出
感度が高く，多色の蛍光シグナルを発することができ
る，固相担体に固定した核酸等の検出方法を提供しよう
とするものである。
感度が高く，多色の蛍光シグナルを発することができ
る，固相担体に固定した核酸等の検出方法を提供しよう
とするものである。
【０００９】
【課題の解決手段】請求項１に記載の発明は，固相担体
に固定した核酸等の被検体に，酵素を結合させ，次い
で，該酵素に下記に示す化学構造式の蛍光物質を反応さ
せると共に該蛍光物質を固相担体に沈着させ，その後，
これらに励起光を照射して，これにより発生する蛍光を
検出することを特徴とする核酸等の検出方法である。 Ｒ−Ｆ−Ｂ−Ａ ここに，Ｒは酵素と反応する酵素反応基，ＦはＯＨ基を
有する蛍光団，Ｂはカルボキシアミド基，Ａはビフェニ
ル基を意味する。
に固定した核酸等の被検体に，酵素を結合させ，次い
で，該酵素に下記に示す化学構造式の蛍光物質を反応さ
せると共に該蛍光物質を固相担体に沈着させ，その後，
これらに励起光を照射して，これにより発生する蛍光を
検出することを特徴とする核酸等の検出方法である。 Ｒ−Ｆ−Ｂ−Ａ ここに，Ｒは酵素と反応する酵素反応基，ＦはＯＨ基を
有する蛍光団，Ｂはカルボキシアミド基，Ａはビフェニ
ル基を意味する。
【００１０】上記検出方法において最も注目すべきこと
は，固相担体上の被検体に結合させた酵素を，一般式Ｒ
−Ｆ−Ｂ−Ａに示す蛍光物質と反応させることである。
上記酵素と反応した上記蛍光物質は，固相担体への沈着
能が高い。また，上記蛍光物質は，励起光の照射により
強い蛍光を発する。そのため，固相担体に固定した被検
体に対して優れた検出感度を発揮することができる。こ
れによって，固相担体を用いた酵素蛍光法が，分子生物
学的解析法に広く利用できるようになったばかりか，臨
床検査においても利用できる。
は，固相担体上の被検体に結合させた酵素を，一般式Ｒ
−Ｆ−Ｂ−Ａに示す蛍光物質と反応させることである。
上記酵素と反応した上記蛍光物質は，固相担体への沈着
能が高い。また，上記蛍光物質は，励起光の照射により
強い蛍光を発する。そのため，固相担体に固定した被検
体に対して優れた検出感度を発揮することができる。こ
れによって，固相担体を用いた酵素蛍光法が，分子生物
学的解析法に広く利用できるようになったばかりか，臨
床検査においても利用できる。
【００１１】上記の蛍光物質としては以下に示すように
種々の物質を用いることができる。これらの蛍光物質
は，互いには蛍光波長が異なるものが多い（表２参
照）。そのため，蛍光波長の異なる複数の蛍光物質を用
いることにより，従来の化学発光法では不可能であった
蛍光シグナルの多色化が可能となった。それ故，上記の
検出方法によれば，１つの被検体の中に存在する複数種
類の情報を同時に検出することができる。
種々の物質を用いることができる。これらの蛍光物質
は，互いには蛍光波長が異なるものが多い（表２参
照）。そのため，蛍光波長の異なる複数の蛍光物質を用
いることにより，従来の化学発光法では不可能であった
蛍光シグナルの多色化が可能となった。それ故，上記の
検出方法によれば，１つの被検体の中に存在する複数種
類の情報を同時に検出することができる。
【００１２】即ち，被検体が核酸である場合，核酸には
多数の情報が塩基配列によって蓄積されている。これら
の情報の有無を検出する場合，図１に示すごとく，蛍光
波長の異なる複数の蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 を選択し
て用いる。そして，蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 のそれぞ
れと特異的に反応する酵素Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｅ3 によりそれ
ぞれ標識した核酸プローブＰ1 ，Ｐ2 ，Ｐ3 を，１つの
被検体に結合させる。そして，酵素Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｅ3 と
蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 とを反応させ，次いで励起光
を照射することにより，蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 が互
いに異なる蛍光を発する。従って，上記の検出方法によ
れば，１つの核酸に存在する複数の塩基配列の有無を，
複数種類の情報として同時に検出することができる。
多数の情報が塩基配列によって蓄積されている。これら
の情報の有無を検出する場合，図１に示すごとく，蛍光
波長の異なる複数の蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 を選択し
て用いる。そして，蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 のそれぞ
れと特異的に反応する酵素Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｅ3 によりそれ
ぞれ標識した核酸プローブＰ1 ，Ｐ2 ，Ｐ3 を，１つの
被検体に結合させる。そして，酵素Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｅ3 と
蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 とを反応させ，次いで励起光
を照射することにより，蛍光物質Ｆ1 ，Ｆ2 ，Ｆ3 が互
いに異なる蛍光を発する。従って，上記の検出方法によ
れば，１つの核酸に存在する複数の塩基配列の有無を，
複数種類の情報として同時に検出することができる。
【００１３】また，被検体が血液の場合には，多数の種
類の血中成分等の情報を同時に検出することができる。
被検体が生物体である場合には，各種の生物の代謝物，
生合成物等の情報を同時に検出することができる。
類の血中成分等の情報を同時に検出することができる。
被検体が生物体である場合には，各種の生物の代謝物，
生合成物等の情報を同時に検出することができる。
【００１４】このように，本発明の検出方法によれば，
核酸，血液，尿，生物体，蛋白，唾液，汗，涙等の被検
体より，複数種類の情報を同時に得ることができる。こ
のため，検出回数の削減化，検出時間の短縮化を図るこ
とができ，研究者の労力軽減となる。また，被検体の使
用量を減少させることができ，微量の被検体から多くの
情報を検出することができる。従って，本発明の検出方
法は，生物学，医学の分野，臨床検査等において，多大
な貢献を果たすことができる。
核酸，血液，尿，生物体，蛋白，唾液，汗，涙等の被検
体より，複数種類の情報を同時に得ることができる。こ
のため，検出回数の削減化，検出時間の短縮化を図るこ
とができ，研究者の労力軽減となる。また，被検体の使
用量を減少させることができ，微量の被検体から多くの
情報を検出することができる。従って，本発明の検出方
法は，生物学，医学の分野，臨床検査等において，多大
な貢献を果たすことができる。
【００１５】そして，上記Ｒは，請求項２に記載の発明
のように，リン酸基，βガラクトピラノシド基，アセチ
ル基，又はプロピル基のいずれかであることが好まし
い。これにより，蛍光物質の固相担体への沈着能力が高
くなる。
のように，リン酸基，βガラクトピラノシド基，アセチ
ル基，又はプロピル基のいずれかであることが好まし
い。これにより，蛍光物質の固相担体への沈着能力が高
くなる。
【００１６】上記Ｆは，請求項３に記載の発明のよう
に，アントラセン，ナフタレン，クマリン，フルオレセ
イン，ペリレン，ピレン，又はローダミンのいずれかで
あることが好ましい。これにより，優れた検出感度を発
揮することができる。
に，アントラセン，ナフタレン，クマリン，フルオレセ
イン，ペリレン，ピレン，又はローダミンのいずれかで
あることが好ましい。これにより，優れた検出感度を発
揮することができる。
【００１７】上記Ａは，オルトビフェニル基，パラビフ
ェニル基，又はメタビフェニル基のいずれでもよいが，
この中で特に，請求項４に記載の発明のように，上記Ａ
は，オルトビフェニル基，又はパラビフェニル基のいず
れかが好ましい。これにより，蛍光物質の蛍光強度及び
固相担体への沈着能力がより一層高くなる。上記ＦとＡ
とを結合するＢは，カルボキシアミド基であって，請求
項５に記載の発明のように，（Ｆ）─ＣＯＮＨ−
（Ａ），又は（Ｆ）─ＮＨＣＯ−（Ａ）のいずれでもよ
い。
ェニル基，又はメタビフェニル基のいずれでもよいが，
この中で特に，請求項４に記載の発明のように，上記Ａ
は，オルトビフェニル基，又はパラビフェニル基のいず
れかが好ましい。これにより，蛍光物質の蛍光強度及び
固相担体への沈着能力がより一層高くなる。上記ＦとＡ
とを結合するＢは，カルボキシアミド基であって，請求
項５に記載の発明のように，（Ｆ）─ＣＯＮＨ−
（Ａ），又は（Ｆ）─ＮＨＣＯ−（Ａ）のいずれでもよ
い。
【００１８】上記蛍光物質としては，請求項５に記載の
発明のように，下記の「化１」〜「化５」に示す化学構
造式により表されるもののいずれかであることが好まし
い。これにより，蛍光物質の蛍光強度及び固相担体への
沈着能力がより一層高くなる。
発明のように，下記の「化１」〜「化５」に示す化学構
造式により表されるもののいずれかであることが好まし
い。これにより，蛍光物質の蛍光強度及び固相担体への
沈着能力がより一層高くなる。
【００１９】
【化１】
【００２０】
【化２】
【００２１】
【化３】
【００２２】
【化４】
【００２３】
【化５】
【００２４】上記の蛍光物質は，１種類だけを用いても
よいが，２種類以上を用いることが好ましい。これによ
り，上記のごとく，１つの被検体において多色の蛍光シ
グナルを得ることができ，同時に複数種類の情報の検出
を行なうことができる。上記の蛍光物質の中でも，特に
「化２」，「化３」，「化４」に示す蛍光物質は感度が
高い（表１参照）。そして，これらの主蛍光波長の差
は，４０ｎｍ以上あり（表２参照），光学フィルターに
よって容易に分光することができる。従って，多色の蛍
光シグナルを検出するに当たっては，上記の「化２」，
「化３」，及び「化４」に示される蛍光物質の中の２種
又は３種を用いることが望ましい。これにより，多色の
蛍光シグナルを容易に検出することができる。
よいが，２種類以上を用いることが好ましい。これによ
り，上記のごとく，１つの被検体において多色の蛍光シ
グナルを得ることができ，同時に複数種類の情報の検出
を行なうことができる。上記の蛍光物質の中でも，特に
「化２」，「化３」，「化４」に示す蛍光物質は感度が
高い（表１参照）。そして，これらの主蛍光波長の差
は，４０ｎｍ以上あり（表２参照），光学フィルターに
よって容易に分光することができる。従って，多色の蛍
光シグナルを検出するに当たっては，上記の「化２」，
「化３」，及び「化４」に示される蛍光物質の中の２種
又は３種を用いることが望ましい。これにより，多色の
蛍光シグナルを容易に検出することができる。
【００２５】次に，上記酵素としては，例えば，請求項
６に記載の発明のように，アルカリ性ホスファターゼ，
酸性ホスファターゼ，βガラクトシダーゼ，エステラー
ゼ，パーオキシダーゼ，及び糖鎖切断酵素のいずれかを
用いる。糖鎖切断酵素としては，例えば，α−グルコシ
ダーゼ，β−グルコシダーゼ，α−グルクロニダーゼ，
β−グルクロニダーゼがある。
６に記載の発明のように，アルカリ性ホスファターゼ，
酸性ホスファターゼ，βガラクトシダーゼ，エステラー
ゼ，パーオキシダーゼ，及び糖鎖切断酵素のいずれかを
用いる。糖鎖切断酵素としては，例えば，α−グルコシ
ダーゼ，β−グルコシダーゼ，α−グルクロニダーゼ，
β−グルクロニダーゼがある。
【００２６】次に，上記固相担体としては，例えば，請
求項７に記載の発明のように，ナイロン膜，ニトロセル
ロース膜，ポリビニリデン・ジフルオライド膜，アガロ
ースゲル，又はアクリルアミドゲルのいずれかを用いる
ことが好ましい。これにより，蛍光物質の沈着能力が一
層高くなる。
求項７に記載の発明のように，ナイロン膜，ニトロセル
ロース膜，ポリビニリデン・ジフルオライド膜，アガロ
ースゲル，又はアクリルアミドゲルのいずれかを用いる
ことが好ましい。これにより，蛍光物質の沈着能力が一
層高くなる。
【００２７】また，上記固相担体は，例えば，請求項８
に記載の発明のように，生体組織，細胞，又は染色体の
いずれかであってもよい。これらの固相担体には，例え
ば，８０℃に加熱した真空オーブン中で被検体を吸引さ
せる等の手段により人工的に被検体を固定することがで
きる。尚，上記被検体は，上記固相担体に予め固定され
ている場合もある。例えば，細胞が固相担体である場
合，その中には予め代謝産物，核酸等の被検体が存在し
ている。
に記載の発明のように，生体組織，細胞，又は染色体の
いずれかであってもよい。これらの固相担体には，例え
ば，８０℃に加熱した真空オーブン中で被検体を吸引さ
せる等の手段により人工的に被検体を固定することがで
きる。尚，上記被検体は，上記固相担体に予め固定され
ている場合もある。例えば，細胞が固相担体である場
合，その中には予め代謝産物，核酸等の被検体が存在し
ている。
【００２８】次に，請求項９に記載の発明のように，上
記被検体に酵素を結合させるに当たっては，被検体に結
合させたハプテンと，酵素に結合した抗ハプテン抗体と
を，抗原抗体反応により結合させる方法がある。
記被検体に酵素を結合させるに当たっては，被検体に結
合させたハプテンと，酵素に結合した抗ハプテン抗体と
を，抗原抗体反応により結合させる方法がある。
【００２９】上記ハプテンとしては，例えば，ビオチ
ン，ディゴキシゲニン，ジニトロフェノール，トリニト
ロフェノール，フルオレセイン，テトラメチルローダミ
ン Ｂイソチオシアネート，ローダミン，テキサスレッ
ド，ルシフェル イエロー，４，４−ジフルオロ−５，
７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−プロピオニル，７−ニトロベンズ−２−
オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル，ダンシル，又
はクマリンのいずれかを用いる。
ン，ディゴキシゲニン，ジニトロフェノール，トリニト
ロフェノール，フルオレセイン，テトラメチルローダミ
ン Ｂイソチオシアネート，ローダミン，テキサスレッ
ド，ルシフェル イエロー，４，４−ジフルオロ−５，
７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−プロピオニル，７−ニトロベンズ−２−
オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル，ダンシル，又
はクマリンのいずれかを用いる。
【００３０】酵素に上記の蛍光物質を反応させた後，こ
れらに照射する励起光は，例えば，上記反応により生成
する蛍光物質の光エネルギーを励起して，蛍光を発生さ
せることができる光である。かかる励起光としては，例
えば，３００〜３５０ｎｍ，４００〜４５０ｎｍ，４５
０〜４９０ｎｍの波長を有する光等を用いることができ
る。上記の蛍光は，目視，蛍光分光光度計，カメラ（Ｃ
ＣＤ，ポラロイド）等により，検出することができる。
れらに照射する励起光は，例えば，上記反応により生成
する蛍光物質の光エネルギーを励起して，蛍光を発生さ
せることができる光である。かかる励起光としては，例
えば，３００〜３５０ｎｍ，４００〜４５０ｎｍ，４５
０〜４９０ｎｍの波長を有する光等を用いることができ
る。上記の蛍光は，目視，蛍光分光光度計，カメラ（Ｃ
ＣＤ，ポラロイド）等により，検出することができる。
【００３１】
実施形態例１ 本発明の実施形態例にかかる核酸等の検出方法につい
て，図１を用いて説明する。本例は，蛍光物質と酵素と
の反応により，固相担体であるナイロン膜に固定したλ
ＤＮＡ（被検体）を検出する方法である。蛍光物質は，
７─ヒドロキシ─Ｎ−（２─ビフェニル）─３─クマリ
ンカルボキシアミドホスフェート（７─Ｈｙｄｒｏｘｙ
−Ｎ−（２─ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−３−ｃｏｕｍａｒｉ
ｎｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であ
り，その化学構造式は下記の「化１」に示した。
て，図１を用いて説明する。本例は，蛍光物質と酵素と
の反応により，固相担体であるナイロン膜に固定したλ
ＤＮＡ（被検体）を検出する方法である。蛍光物質は，
７─ヒドロキシ─Ｎ−（２─ビフェニル）─３─クマリ
ンカルボキシアミドホスフェート（７─Ｈｙｄｒｏｘｙ
−Ｎ−（２─ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−３−ｃｏｕｍａｒｉ
ｎｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であ
り，その化学構造式は下記の「化１」に示した。
【００３２】
【化１】
【００３３】以下，λＤＮＡの検出方法について詳細に
説明する。まず，上記蛍光物質を以下の手順に従って合
成する。即ち，下記の「化６」に示す市販の４─メチル
ウンベリフェリルホスフェート（４─Ｍｅｔｈｙｌｕｍ
ｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のクマリ
ン骨格を基本として，アミド結合を介してビフェニル基
を付加することにより，上記「化１」に示す蛍光物質を
得た。
説明する。まず，上記蛍光物質を以下の手順に従って合
成する。即ち，下記の「化６」に示す市販の４─メチル
ウンベリフェリルホスフェート（４─Ｍｅｔｈｙｌｕｍ
ｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のクマリ
ン骨格を基本として，アミド結合を介してビフェニル基
を付加することにより，上記「化１」に示す蛍光物質を
得た。
【００３４】
【化６】
【００３５】次に，上記蛍光物質を用いて，λＤＮＡを
検出した。検出限界量は，以下に示すスポットテストに
より決定した。まず，ＤＮＡラベリング＆ディテクショ
ンキット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて，
λＤＮＡをランダムプライム法によりＤＩＧ（ディゴキ
シゲニンを意味する。以下，同様。）により標識した。
検出した。検出限界量は，以下に示すスポットテストに
より決定した。まず，ＤＮＡラベリング＆ディテクショ
ンキット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いて，
λＤＮＡをランダムプライム法によりＤＩＧ（ディゴキ
シゲニンを意味する。以下，同様。）により標識した。
【００３６】標識されたλＤＮＡは，トリスバッファー
（１０ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ８），１ｍＭ ＥＤＴＡ）
により適宜希釈して，０ｆｇ／μＬ，５ｆｇ／μＬ，１
０ｆｇ／μＬ，２０ｆｇ／μＬ，４０ｆｇ／μＬ，８０
ｆｇ／μＬ，１６０ｆｇ／μＬ，３２０ｆｇ／μＬ，１
ｐｇ／μＬの濃度のＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。
（１０ｍＭ ｔｒｉｓ（ｐＨ８），１ｍＭ ＥＤＴＡ）
により適宜希釈して，０ｆｇ／μＬ，５ｆｇ／μＬ，１
０ｆｇ／μＬ，２０ｆｇ／μＬ，４０ｆｇ／μＬ，８０
ｆｇ／μＬ，１６０ｆｇ／μＬ，３２０ｆｇ／μＬ，１
ｐｇ／μＬの濃度のＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。
【００３７】標識λＤＮＡを均一に希釈させるために，
トリスバッファーの中には，非特異的ＤＮＡとしてニシ
ン精子ＤＮＡを加えておいた。このニシン精子ＤＮＡの
量は，後述するナイロン膜への１スポットに１００ｎｇ
のニシン精子ＤＮＡが存在するように調製した。
トリスバッファーの中には，非特異的ＤＮＡとしてニシ
ン精子ＤＮＡを加えておいた。このニシン精子ＤＮＡの
量は，後述するナイロン膜への１スポットに１００ｎｇ
のニシン精子ＤＮＡが存在するように調製した。
【００３８】次に，図２に示すごとく，このＤＮＡ溶液
を１μＬずつ，固相担体としてのナイロン膜９（３ｃｍ
×７ｃｍ，Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ，０．４５μＭ，Ｐａｌ
ｌ社製）にスポットした。これにより，１スポットに
は，被検体のλＤＮＡが，それぞれ０ｆｇ（フェムトグ
ラム），５ｆｇ，１０ｆｇ，２０ｆｇ，４０ｆｇ，８０
ｆｇ，１６０ｆｇ，３２０ｆｇ，１ｐｇ（ピコグラム）
存在することとなる。０ｆｇは，ブランクテストであ
る。図１において，符号１は，ＤＮＡ溶液のスポット部
分を示す。
を１μＬずつ，固相担体としてのナイロン膜９（３ｃｍ
×７ｃｍ，Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ，０．４５μＭ，Ｐａｌ
ｌ社製）にスポットした。これにより，１スポットに
は，被検体のλＤＮＡが，それぞれ０ｆｇ（フェムトグ
ラム），５ｆｇ，１０ｆｇ，２０ｆｇ，４０ｆｇ，８０
ｆｇ，１６０ｆｇ，３２０ｆｇ，１ｐｇ（ピコグラム）
存在することとなる。０ｆｇは，ブランクテストであ
る。図１において，符号１は，ＤＮＡ溶液のスポット部
分を示す。
【００３９】次に，上記ナイロン膜をｉｎ ｖａｃｕｏ
（真空オーブン中）で８０℃の温度で３０分間加熱し
た。これにより，このナイロン膜を乾燥させて，ＤＩＧ
標識λＤＮＡを固定した。次に，上記ナイロン膜を０．
１％カゼイン溶液に３０分間浸漬して，ブロッキング処
理を行った。
（真空オーブン中）で８０℃の温度で３０分間加熱し
た。これにより，このナイロン膜を乾燥させて，ＤＩＧ
標識λＤＮＡを固定した。次に，上記ナイロン膜を０．
１％カゼイン溶液に３０分間浸漬して，ブロッキング処
理を行った。
【００４０】次に，上記ナイロン膜を，アルカリ性ホス
ファターゼにより標識した抗ＤＩＧ抗体（ベーリンガー
・マンハイム社製）を含む反応液に室温で３０分間浸漬
して，上記ＤＩＧ標識λＤＮＡにアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識抗ＤＩＧ抗体を結合させた。次に，上記ナイロ
ン膜を，バッファー（０．１Ｍ ｔｒｉｓ，ｐＨ７．
５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で１０分間ずつ３回洗浄し
て，未結合の上記抗ＤＩＧ抗体を除去した。
ファターゼにより標識した抗ＤＩＧ抗体（ベーリンガー
・マンハイム社製）を含む反応液に室温で３０分間浸漬
して，上記ＤＩＧ標識λＤＮＡにアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識抗ＤＩＧ抗体を結合させた。次に，上記ナイロ
ン膜を，バッファー（０．１Ｍ ｔｒｉｓ，ｐＨ７．
５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で１０分間ずつ３回洗浄し
て，未結合の上記抗ＤＩＧ抗体を除去した。
【００４１】次に，合成した上記蛍光物質の１００μｇ
／ｍｌ基質溶液（１００ｍＭ ｔｒｉｓ，ｐＨ８，１０
ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）を，上記のナ
イロン膜に全表面を覆うように滴下した。ナイロン膜を
パラフィルムにより被覆して，３７℃の温度で１時間暗
室で静置した。これにより，上記の蛍光物質とホスファ
ターゼとを反応させた。その後，パラフィルムを取り除
き，ナイロン膜に０．５Ｎ ＮａＯＨを滴下して，反応
を終了させた。
／ｍｌ基質溶液（１００ｍＭ ｔｒｉｓ，ｐＨ８，１０
ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）を，上記のナ
イロン膜に全表面を覆うように滴下した。ナイロン膜を
パラフィルムにより被覆して，３７℃の温度で１時間暗
室で静置した。これにより，上記の蛍光物質とホスファ
ターゼとを反応させた。その後，パラフィルムを取り除
き，ナイロン膜に０．５Ｎ ＮａＯＨを滴下して，反応
を終了させた。
【００４２】次に，ナイロン膜に紫外線（３０２ｎｍ，
２ｍＷ／ｃｍ2 ）を照射して，反応生成物を励起させ
た。これにより反応生成物から発生する蛍光を，ＣＣＤ
カメラ（ソニー製，商品名ＸＣ−５７）に取り込み，ビ
デオプリンター（精工舎製，商品名ＶＰ−１５００）で
プリントアウトした。そして，目視で見えるスポットを
検出可能であるとした。また，目視で見えないスポット
を検出不可能であるとした。その結果，１ｐｇ以上のλ
ＤＮＡを検出することができた。
２ｍＷ／ｃｍ2 ）を照射して，反応生成物を励起させ
た。これにより反応生成物から発生する蛍光を，ＣＣＤ
カメラ（ソニー製，商品名ＸＣ−５７）に取り込み，ビ
デオプリンター（精工舎製，商品名ＶＰ−１５００）で
プリントアウトした。そして，目視で見えるスポットを
検出可能であるとした。また，目視で見えないスポット
を検出不可能であるとした。その結果，１ｐｇ以上のλ
ＤＮＡを検出することができた。
【００４３】（比較例１）比較のために，上記の「化
６」に示す市販の４─メチルウンベリフェリルホスフェ
ートを蛍光物質として用いてλＤＮＡを検出することを
試みた。本例の検出方法は，「化１」に示す蛍光物質を
用いる代わりに，「化６」に示す蛍光物質を用いた点を
除いては，実施形態例１と同様である。その結果，λＤ
ＮＡは，全く検出されなかった。その理由は，４─メチ
ルウンベリフェリルホスフェートがナイロン膜に沈着し
なかったためであると考えられる。
６」に示す市販の４─メチルウンベリフェリルホスフェ
ートを蛍光物質として用いてλＤＮＡを検出することを
試みた。本例の検出方法は，「化１」に示す蛍光物質を
用いる代わりに，「化６」に示す蛍光物質を用いた点を
除いては，実施形態例１と同様である。その結果，λＤ
ＮＡは，全く検出されなかった。その理由は，４─メチ
ルウンベリフェリルホスフェートがナイロン膜に沈着し
なかったためであると考えられる。
【００４４】実施形態例２ 本例のＤＮＡの検出方法は，蛍光物質として，下記の
「化２」に示す３，６−ジヒドロキシ−５′−（４−ビ
フェニルカルボキシアミド）フルオレセインジホスフェ
ート（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５′−（４−ｂｉ
ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｉｎ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いた。
「化２」に示す３，６−ジヒドロキシ−５′−（４−ビ
フェニルカルボキシアミド）フルオレセインジホスフェ
ート（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−５′−（４−ｂｉ
ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｉｎ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いた。
【００４５】
【化２】
【００４６】以下，λＤＮＡの検出方法について説明す
る。まず，市販のフルオレセインをリン酸化して，下記
の「化７」に示すフルオレセインジホスフェート（Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を得
た。
る。まず，市販のフルオレセインをリン酸化して，下記
の「化７」に示すフルオレセインジホスフェート（Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を得
た。
【００４７】
【化７】
【００４８】次に，フルオレセインジホスフェートのフ
ルオレセイン骨格にアミド結合を介してビフェニル基を
付加することにより，上記「化２」に示す蛍光物質を得
た。
ルオレセイン骨格にアミド結合を介してビフェニル基を
付加することにより，上記「化２」に示す蛍光物質を得
た。
【００４９】次に，上記蛍光物質を用いて，λＤＮＡを
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化２」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，４０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化２」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，４０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
【００５０】（比較例２）比較のために，上記の「化
７」に示すフルオレセインジホスフェートを蛍光物質と
して用いてλＤＮＡを検出することを試みた。本例の検
出方法は，「化１」に示す蛍光物質の代わりに「化７」
に示す蛍光物質を用いた点を除いては，実施形態例１と
同様である。その結果，λＤＮＡは，全く検出されなか
った。その理由は，フルオレセインジホスフェートがナ
イロン膜に沈着しなかったためであると考えられる。
７」に示すフルオレセインジホスフェートを蛍光物質と
して用いてλＤＮＡを検出することを試みた。本例の検
出方法は，「化１」に示す蛍光物質の代わりに「化７」
に示す蛍光物質を用いた点を除いては，実施形態例１と
同様である。その結果，λＤＮＡは，全く検出されなか
った。その理由は，フルオレセインジホスフェートがナ
イロン膜に沈着しなかったためであると考えられる。
【００５１】実施形態例３ 本例のＤＮＡの検出方法は，蛍光物質として，下記の
「化３」に示す３─ヒドロキシ─Ｎ−２─ビフェニル─
２─ナフタレンカルボキシアミドホスフェート（３─Ｈ
ｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐ
ｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）（以下，ＨＮＰＰともいう。）を用いた。
「化３」に示す３─ヒドロキシ─Ｎ−２─ビフェニル─
２─ナフタレンカルボキシアミドホスフェート（３─Ｈ
ｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｎａｐ
ｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）（以下，ＨＮＰＰともいう。）を用いた。
【００５２】
【化３】
【００５３】以下，λＤＮＡの検出方法について説明す
る。まず，下記の「化８」に示す市販の３─ヒドロキシ
─Ｎ−（２，４─ジメチルフェニル）─２─ナフタレン
カルボキシアミドホスフェート（３─Ｈｙｄｒｏｘｙ−
Ｎ−（２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ）（以下，ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸
ともいう。）のナフトール骨格に，アミド結合を介して
ビフェニル基を付加して，上記「化３」に示す蛍光物質
を得た。
る。まず，下記の「化８」に示す市販の３─ヒドロキシ
─Ｎ−（２，４─ジメチルフェニル）─２─ナフタレン
カルボキシアミドホスフェート（３─Ｈｙｄｒｏｘｙ−
Ｎ−（２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−
ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ）（以下，ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸
ともいう。）のナフトール骨格に，アミド結合を介して
ビフェニル基を付加して，上記「化３」に示す蛍光物質
を得た。
【００５４】
【化８】
【００５５】次に，上記蛍光物質を用いて，λＤＮＡを
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化３」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，５ｆｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化３」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，５ｆｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
【００５６】（比較例３）比較のために，上記の「化
８」に示すナフトールＡＳ−ＭＸリン酸を蛍光物質とし
て用いてλＤＮＡを検出することを試みた。本例の検出
方法は，「化１」に示す蛍光物質の代わりに「化８」に
示す蛍光物質を用いた点を除いては，実施形態例１と同
様である。その結果，４０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出す
ることができた。
８」に示すナフトールＡＳ−ＭＸリン酸を蛍光物質とし
て用いてλＤＮＡを検出することを試みた。本例の検出
方法は，「化１」に示す蛍光物質の代わりに「化８」に
示す蛍光物質を用いた点を除いては，実施形態例１と同
様である。その結果，４０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出す
ることができた。
【００５７】実施形態例４ 本例のＤＮＡの検出方法は，蛍光物質として，下記の
「化４」に示す３−ヒドロキシ─Ｎ−（２─ビフェニ
ル）─２─アントラセンカルボキシアミドホスフェート
（３─Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−（２−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）
−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いた。
「化４」に示す３−ヒドロキシ─Ｎ−（２─ビフェニ
ル）─２─アントラセンカルボキシアミドホスフェート
（３─Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−（２−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）
−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いた。
【００５８】
【化４】
【００５９】以下，λＤＮＡの検出方法について説明す
る。まず，下記の「化９」に示す３─ヒドロキシ─Ｎ−
２’−メチルフェニル─２─アントラセンカルボキシア
ミドホスフェート（３─Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’−ｍ
ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃ
ａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（以下，
ナフトールＡＳ−ＧＲリン酸ともいう。）のアントラセ
ン骨格に，アミド結合を介してビフェニル基を付加し
て，上記「化４」に示す蛍光物質を得た。
る。まず，下記の「化９」に示す３─ヒドロキシ─Ｎ−
２’−メチルフェニル─２─アントラセンカルボキシア
ミドホスフェート（３─Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’−ｍ
ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃ
ａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（以下，
ナフトールＡＳ−ＧＲリン酸ともいう。）のアントラセ
ン骨格に，アミド結合を介してビフェニル基を付加し
て，上記「化４」に示す蛍光物質を得た。
【００６０】
【化９】
【００６１】次に，上記蛍光物質を用いて，λＤＮＡを
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化４」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，１０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化４」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，１０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
【００６２】（比較例４）比較のために，上記の「化
９」に示すナフトールＡＳ−ＧＲリン酸を蛍光物質とし
て用いてλＤＮＡを検出することを試みた。本例の検出
方法は，「化１」に示す蛍光物質の代わりに「化９」に
示す蛍光物質を用いた点を除いては，実施形態例１と同
様である。その結果，８０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出す
ることができた。
９」に示すナフトールＡＳ−ＧＲリン酸を蛍光物質とし
て用いてλＤＮＡを検出することを試みた。本例の検出
方法は，「化１」に示す蛍光物質の代わりに「化９」に
示す蛍光物質を用いた点を除いては，実施形態例１と同
様である。その結果，８０ｆｇ以上のλＤＮＡを検出す
ることができた。
【００６３】実施形態例５ 本例のＤＮＡの検出方法は，蛍光物質として，下記の
「化５」に示すＮ−（４−ビフェニルカルボニル）−５
−アミノナフトフルオレセインジホスフェート（Ｎ−
（４−ｂｉｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）−５−ａｍ
ｉｎｏｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いた。
「化５」に示すＮ−（４−ビフェニルカルボニル）−５
−アミノナフトフルオレセインジホスフェート（Ｎ−
（４−ｂｉｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）−５−ａｍ
ｉｎｏｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いた。
【００６４】
【化５】
【００６５】以下，λＤＮＡの検出方法について説明す
る。まず，下記の「化１０」に示すナフトフルオレセイ
ンジホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｉｎ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に，アミド結合を介し
てビフェニル基を付加して，上記「化５」に示す蛍光物
質を得た。
る。まず，下記の「化１０」に示すナフトフルオレセイ
ンジホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｉｎ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に，アミド結合を介し
てビフェニル基を付加して，上記「化５」に示す蛍光物
質を得た。
【００６６】
【化１０】
【００６７】次に，上記蛍光物質を用いて，λＤＮＡを
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化５」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，１ｐｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
検出することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に
示す蛍光物質の代わりに「化５」に示す蛍光物質を用い
た点を除いては，実施形態例１と同様である。その結
果，１ｐｇ以上のλＤＮＡを検出することができた。
【００６８】（比較例５）比較のために，上記の「化１
０」に示す物質を蛍光物質として用いてλＤＮＡを検出
することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に示す
蛍光物質の代わりに「化１０」に示す蛍光物質を用いた
点を除いては，実施形態例１と同様である。その結果，
λＤＮＡは全く検出されなかった。その理由は，ナフト
フルオレセインジホスフェートがナイロン膜に沈着しな
かったためであると考えられる。
０」に示す物質を蛍光物質として用いてλＤＮＡを検出
することを試みた。本例の検出方法は，「化１」に示す
蛍光物質の代わりに「化１０」に示す蛍光物質を用いた
点を除いては，実施形態例１と同様である。その結果，
λＤＮＡは全く検出されなかった。その理由は，ナフト
フルオレセインジホスフェートがナイロン膜に沈着しな
かったためであると考えられる。
【００６９】以上の実施形態例１〜５及び比較例１〜５
におけるλＤＮＡの検出結果を，表１にまとめて示し
た。同表において，「＋」はλＤＮＡの検出ができたこ
とを示し，「─」はλＤＮＡの検出がされなかったこと
を示す。また，同表における「化１」〜「化５」は，実
施形態例１〜５において用いた蛍光物質を示す。また，
「化６」〜「化１０」は，比較例１〜５において用いた
蛍光物質を示す。表１より，本発明の核酸等の検出方法
によれば，５ｆｇ〜１ｐｇの微量のλＤＮＡを検出する
ことができることがわかる。
におけるλＤＮＡの検出結果を，表１にまとめて示し
た。同表において，「＋」はλＤＮＡの検出ができたこ
とを示し，「─」はλＤＮＡの検出がされなかったこと
を示す。また，同表における「化１」〜「化５」は，実
施形態例１〜５において用いた蛍光物質を示す。また，
「化６」〜「化１０」は，比較例１〜５において用いた
蛍光物質を示す。表１より，本発明の核酸等の検出方法
によれば，５ｆｇ〜１ｐｇの微量のλＤＮＡを検出する
ことができることがわかる。
【００７０】また，上記「化１」〜「化５」に示した蛍
光物質の化学名と主蛍光波長とを，表２に示した。同表
より，各蛍光物質は，それぞれ主蛍光波長が異なること
がわかる。そのため，主蛍光波長に差がある蛍光物質を
複数種類用いることにより，多種類の検出項目を同時に
測定することができる。
光物質の化学名と主蛍光波長とを，表２に示した。同表
より，各蛍光物質は，それぞれ主蛍光波長が異なること
がわかる。そのため，主蛍光波長に差がある蛍光物質を
複数種類用いることにより，多種類の検出項目を同時に
測定することができる。
【００７１】例えば，蛍光物質の反応基Ｒとして，リン
酸基だけでなくアセチル基又はβガラクトピラノシド基
等の種々の基を用い，各反応基と反応する複数種の酵素
を同一被検体に結合させることにより，同一被検体の中
の複数種類の情報を，同時に検出することができる。従
って，主蛍光波長の異なる複数の蛍光基質を同時に用い
て被検体の検出を行うことにより，被検体の量がわずか
でも，多くの情報を得ることができる。
酸基だけでなくアセチル基又はβガラクトピラノシド基
等の種々の基を用い，各反応基と反応する複数種の酵素
を同一被検体に結合させることにより，同一被検体の中
の複数種類の情報を，同時に検出することができる。従
って，主蛍光波長の異なる複数の蛍光基質を同時に用い
て被検体の検出を行うことにより，被検体の量がわずか
でも，多くの情報を得ることができる。
【００７２】
【表１】
【００７３】
【表２】
【００７４】
【発明の効果】本発明によれば，蛍光感度が高く，多色
の蛍光シグナルを発することができる，固相担体に固定
した核酸等の検出方法を提供することができる。
の蛍光シグナルを発することができる，固相担体に固定
した核酸等の検出方法を提供することができる。
【図１】本発明における，核酸の検出方法の効果を示す
説明図。
説明図。
【図２】実施形態例１における，λＤＮＡの検出方法
（スポットテスト）を示す説明図。
（スポットテスト）を示す説明図。
１．．．スポット部分， ９．．．ナイロン膜，
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｚ 33/53 33/53 Ｊ Ｍ 33/534 33/534 (72)発明者 近藤 恭光 愛知県刈谷市八軒町５丁目50番地 株式会 社アイシンコスモス研究所内 (72)発明者 西谷内 美穂 愛知県刈谷市八軒町５丁目50番地 株式会 社アイシンコスモス研究所内
Claims (9)
- 【請求項１】 固相担体に固定した核酸等の被検体に，
酵素を結合させ，次いで，該酵素に下記に示す化学構造
式の蛍光物質を反応させると共に該蛍光物質を固相担体
に沈着させ，その後，これらに励起光を照射して，これ
により発生する蛍光を検出することを特徴とする核酸等
の検出方法。 Ｒ−Ｆ−Ｂ−Ａ ここに，Ｒは酵素と反応する酵素反応基，ＦはＯＨ基を
有する蛍光団，Ｂはカルボキシアミド基，Ａはビフェニ
ル基を意味する。 - 【請求項２】 請求項１において，上記Ｒは，リン酸
基，βガラクトピラノシド基，アセチル基，又はプロピ
ル基のいずれかであることを特徴とする核酸等の検出方
法。 - 【請求項３】 請求項１又は２において，上記Ｆは，ア
ントラセン，ナフタレン，クマリン，フルオレセイン，
ペリレン，ピレン，又はローダミンのいずれかであるこ
とを特徴とする核酸等の検出方法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項において，
上記Ａは，オルトビフェニル基，又はパラビフェニル基
であることを特徴とする核酸等の検出方法。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項において，
上記蛍光物質は，下記の「化１」〜「化５」に示す化学
構造式により表されるもののいずれかであることを特徴
とする核酸等の検出方法。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項において，
上記酵素は，アルカリ性ホスファターゼ，酸性ホスファ
ターゼ，βガラクトシダーゼ，エステラーゼ，パーオキ
シダーゼ，及び糖鎖切断酵素のいずれかであることを特
徴とする核酸等の検出方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項において，
上記固相担体は，ナイロン膜，ニトロセルロース膜，ポ
リビニリデン・ジフルオライド膜，アガロースゲル，又
はアクリルアミドゲルのいずれかであることを特徴とす
る核酸等の検出方法。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項において，
上記固相担体は，生体組織，細胞，又は染色体のいずれ
かであることを特徴とする核酸等の検出方法。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一項において，
上記被検体に酵素を結合させるに当たり，被検体に結合
させたハプテンと，酵素に結合した抗ハプテン抗体と
を，抗原抗体反応により結合させることを特徴とする核
酸等の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33803895A JPH09152433A (ja) | 1995-11-30 | 1995-11-30 | 固相担体に固定した核酸等の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33803895A JPH09152433A (ja) | 1995-11-30 | 1995-11-30 | 固相担体に固定した核酸等の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09152433A true JPH09152433A (ja) | 1997-06-10 |
Family
ID=18314348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33803895A Pending JPH09152433A (ja) | 1995-11-30 | 1995-11-30 | 固相担体に固定した核酸等の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09152433A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011254816A (ja) * | 2002-09-20 | 2011-12-22 | Queen's Univ At Kingston | 酵素基質および酵素生成物の分配差による生体分子の検出 |
| CN112480052A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-12 | 山西大学 | 一种检测pH的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用 |
-
1995
- 1995-11-30 JP JP33803895A patent/JPH09152433A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011254816A (ja) * | 2002-09-20 | 2011-12-22 | Queen's Univ At Kingston | 酵素基質および酵素生成物の分配差による生体分子の検出 |
| CN112480052A (zh) * | 2020-12-08 | 2021-03-12 | 山西大学 | 一种检测pH的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用 |
| CN112480052B (zh) * | 2020-12-08 | 2022-05-31 | 山西大学 | 一种检测pH的比率型近红外荧光探针及制备方法和应用 |
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