JPH09163979A - ストレプトマイセスのクローニングベクター及びマクロライド抗生物質生産におけるその用途 - Google Patents

ストレプトマイセスのクローニングベクター及びマクロライド抗生物質生産におけるその用途

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JPH09163979A JP8211823A JP21182396A JPH09163979A JP H09163979 A JPH09163979 A JP H09163979A JP 8211823 A JP8211823 A JP 8211823A JP 21182396 A JP21182396 A JP 21182396A JP H09163979 A JPH09163979 A JP H09163979A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な２−ノルエリスロマイシン抗生物質
Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤをストレプトマイセス アンチビオチ
カスからのＤＮＡを運ぶｐＮＪ１よって形質転換された
菌株ストレプトマイセスエリスレウス１３６９３−２４
０（ＮＲＲＬ Ｂ−１８０５３）細胞中で製造するこ
と。 【解決手段】 オレアンドマイシン産生ストレプトマイ
セス・アンチビオチカス（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）
のゲノムライブラリーよりなる複数のベクターを製造
し、複数のベクターによりストレプトマイセス・エリス
レウスの複数の細胞を形質転換し、そして抗生物質活性
を有し並びにストレプトマイセス・アンチビオチカス又
はストレプトマイセス・エリスレウスにおいて産生され
る抗生物質からは物理的又は科学的性質又は生物学的活
性において異なる化合物を形質転換した細胞から採取す
る工程よりなるストレプトマイセス・エリスレウスにお
いて抗生物質を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する利用分野】本発明は一般にイー・コリ及
びストレプトマイセスとともに用いられるシャトル（ｓ
ｈｕｔｔｌｅ）ベクター並びにこれらのベクターを用い
る抗生物質遺伝子のクローニングに関する。特に本発明
はベクターｐＮＪ１及びｐＡＬ７００２に関し、そして
これらのベクターを用いる２−ノルエリスロマイシン抗
生物質の製造に関する。
【０００２】イー・コリ−ストレプトマイセスシヤトル
ベクターと呼ばれるクローニングベクターは構成され、
それはイー・コリ及びストレプトマイセスの両者の抗生
物質耐性マーカー及び複製のオリジンを含む。ナカツカ
サら、米国特許第４，５１３，０８５号；フエヤーマン
（Ｆａｙｅｒｍａｎ）ら、英国特許出願第２，１０７，
７１６号；フエヤーマンら、同第２，１０７，７１７
号；そしてハーシユベルガー（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅ
ｒ）ら、同第２，１１８，９４７号。しかし、ストレプ
トマイセス菌株は多くの臨床上重要な抗生物質を生産す
るのに用いられるので、組換え増殖が比較的容易に行わ
れるときイー・コリで選択的で複製し、さらに組換え的
に増殖される遺伝子が発現されるときストレプトマイセ
スで選択されそして複製する安定なベクターを得ること
が望ましい。或るこのようなシヤトルベクターは不安定
であり即ちそれらが運ぶクローンされた遺伝子とともに
それらの宿主細胞から失われる限り、安定性は特に重要
である。例えばマツシマら「バイオ／テクノロジー（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」４，２２９〜２３２
（１９８６）参照。
【０００３】コスミドベクターは機会を組合わせて選択
マーカーを含むプラスミドベクターの多数の特徴並にフ
アージベクターの大きなクローニング能力を利用するの
で、それらは特に望ましい。イー・コリ−ストレプトマ
イセスコスミドシヤトルベクターは、これらの特徴を利
用するように構成されよう。マツシマら、同上。選択圧
力の適用により安定であるコスミドシヤトルベクターは
又望ましい。
【０００４】エリスロマイシンは、約３０工程を有する
ものと思われるストレプトマイセス・エリスレウスの生
合成系路のマクロリド抗生物質生成物である。抗生物質
生産のための遺伝子を運ぶコスミドシヤトルベクター
は、ハイブリツド抗生物質の生合成を開発するのに用い
られよう。マツシマら、同上。エリスロマイシンの生産
のためのアツセイの試みは、エリスロマイシンの生合成
でブロツクされる検出可能な抗生物質活性を有しないエ
ス・エリスレウス菌株例えばｅｒｙＡ変種（６−デオキ
シエリスロノリドＢである未修飾ラクトンの形成でブロ
ツクされる）の使用を含む。マツシマら、同上。エリス
ロマイシンの産生についてテストされる遺伝子物質を運
ぶベクターによる形質転換後のこのような菌株における
抗生物質機能の保有は、抗生物質機能がベクターにより
生ずる遺云子物質により貯えられることを示す。しか
し、このような手法が用いられて今迄未報告のエリスロ
マイシンのアナログ例えばノルエリスロマイシンを得る
ことについては、何も示唆されていない。
【０００５】［課題を解決するための手段］本発明によ
るＤＮＡクローニングベクターは、複製の官能性イー・
コリ オリジン、ストレプトマイセスにおける複製の官
能性デテルミナント、イー・コリで選択されうるマーカ
ー、ストレプトマイセスで選択されうるマーカーを有す
るプラスミドｐＡＬ７００２のフラグメントを含む。さ
らに詳しくは、このようなベクターはイー・コリＨＢ１
０１／ｐＡＬ７００２ＮＲＲＬ Ｂ−１８０５５から単
離されたプラスミドｐＡＬ７００２であり、約６．２ｋ
ｂの分子の大きさを有し、チオストレプトン耐性セグメ
ントを有し、アンピシリン耐性セグメントを有し、ユニ
ークなＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を有し、ユニークなｐｓｔ
Ｉ部位を有し、ユニークなＰｖｕＩＩ部位を有し、ユ
ニークなＥｃｏＲＩ部位を有し、ユニークなＢｇｌ Ｉ
Ｉ部位を有しそして２個のＳｍａ Ｉ部位を有する。
【０００６】本発明による他のＤＮＡクローニングベク
ターは、エス・エリスレウスの選択の下で安定であり、
そして複製の官能性イー・コリ オリジン、ストレプト
マイセスにおける複製の官能性デテルミナント、イー・
コリで選択しうるマーカー、ストレプトマイセスで選択
しうるマーカー及びＣＯＳセグメントを有するブラスミ
ドｐＮＪ１のフラグメントを含む。さらに詳しくは、こ
のようなベクターは、イー・コリＨＢ１０１／ｐＮＪ１
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０５４から単離されたプラスミド
ｐＮＪ１であり、約８．８ｋｂの分子の大きさを有し、
チオストレプトン耐性セグメントを有し、アンピシリン
耐性セグメントを有し、ユニークなＨｉｎｄ ＩＩＩ部
位を有し、ユニークなＰｓｔ Ｉ部位を有し、ユニーク
なＰｖｕＩＩ部位を有し、ユニークなＥｃｏＲ Ｉ部位
を有し、ユニークなＢｇｌ ＩＩ部位を有しそして２個
のＳｍａＩ部位を有する。本発明によるエス・エリスレ
ウスの菌株は、エス・エリスレウス１２６９３−２４０
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０５３のすべての同定する特徴を有
する。さらに詳しくは、この菌株の現在好ましい態様
は、２−ノルエリスロマイシンＡ；２−ノルエリスロマ
イシンＢ；２−ノルエリスロマイシンＣ；そして２−ノ
ルエリスロマイシンＤよりなる群からの一員又はこれら
の員の製薬上許容しうる塩を、窒素及び炭素の同化可能
な源を含む水性媒体中の培養により産生するエス・エリ
スレウスの生物学的に純粋な培養物である。
【０００７】本発明により２−ノルエリスロマイシンＡ
を生成する方法は、窒素及び炭素の同化可能な源の存在
下水性媒体中でエス・エリスレウス１２６９３−２４０
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０５３を培養する工程を含む。
【０００８】本発明によりエリスロマイシン抗生物質を
生成する方法は、窒素及び炭素の同化可能な源の存在下
水性媒体中でエス・エリスレウス１２６９３−２４０Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８０５３を培養する工程を含む。
【０００９】本発明は、今迄未報告の化合物２−ノルエ
リスロマイシンＡ又はその製薬上許容しうる塩（エリス
ロマイシンの製薬上許容しうる塩を得る当業者にとり周
知の手段により得られよう）を提供する。この２−ノル
エリスロマイシンＡは、好ましくは細菌の生長を阻害す
るのに有効であり、そして実質的に純粋な形で７２０の
質量スペクトル、ＦＡＢ正イオンＭＨ＋ｍ／ｚを有する
２−ノルエリスロマイシンＡである。
【００１０】本発明は、又今迄未報告の化合物２−ノル
エリスロマイシンＢ又はその製薬上許容しうる塩（エリ
スロマイシンの製薬上許容しうる塩を得る当業者に周知
の手段により得られよう）を提供する。この２−ノルエ
リスロマイシンＢは、好ましくは細菌の生長を阻害する
のに有効であり、そして実質的に純粋な形で７０４の質
量スペクトル、ＦＡＢ正イオンＭＨ＋ｍ／ｚを有するも
のである。
【００１１】本発明は、さらに従来未報告の化合物２−
ノルエリスロマイシンＣ又はその製薬上許容しうる塩を
提供し、そして好ましくは細菌の生長を阻害するのに有
効でありしかも実質的に純粋な形で表３に示された部分
スペクトルよりなる１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する２
−ノルエリスロマイシンＣである。
【００１２】さらに、本発明は従来未報告の化合物２−
ノルエリスロマイシンＤ又はその製薬上許容しうる塩を
提供する。好ましくは、この２−ノルエリスロマイシン
Ｄは、細菌の生長を阻害するのに有効でありしかも実質
的に純粋な形で表１に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを
有しさらに表２に示した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有
するものである。
【００１３】本発明による抗生物質組成物は、抗生物質
活性と両立しうる希釈剤又は担体（このような処方はエ
リスロマイシンの処方を製造する当業者により容易に得
られる）並に２−ノルエリスロマイシンＡ、２−ノルエ
リスロマイシンＢ、２−ノルエリスロマイシンＣ及び２
−ノルエリスロマイシンＤよりなる群から選ばれる抗生
物質又はこれら抗生物質の製薬上許容しうる塩を含む。
【００１４】図１は、本発明によるベクターｐＡＬ７０
０２の部分的制限マツプである。
【００１５】図２は、本発明によるベクターｐＮＪ１の
部分制限マツプである。
【００１６】図３は、２−ノルエリスロマイシンＡ，
Ｂ，Ｃ及びＤの構成の組成図である。
【００１７】図４は、エリスロマイシンＢ又はＣと２−
ノルエリスロマイシンＤの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルに
おける差の間の会合及びその構造の図である。
【００１８】本発明は、ストレプトマイセスにおける複
製のデテルミナントを含むプラスミドｐＪＶ１のフラグ
メント、ストレプトマイセスにおける抗生物質耐性の選
択をエンコーデイングするＤＮＡのフラグメント、イー
・コリにおいて官能性のプラスミドの複製の官能性オリ
ジンを含みしかも抗生物質耐性を与える制眼フラグメン
ト並にバクテリオフアージラムダから結合性末端を含む
ＣＯＳ配列よりなる選択可能なＤＮＡクローニングベク
ターを含む。本発明による他の選択可能なＤＮＡクロー
ニングベクターは、上述のすベてを含むがＣＯＳ配列を
欠く。本発明のベクターは、ストレプトマイセス・エリ
スレウス及び他の宿主菌株において官能性である。ベク
ターは小さくしかも容易に取り扱いしうるので有用であ
り、そしてストレプトマイセス・エリスレウス及びイー
・コリを含む多数の宿主菌株へ導入されよう。
【００１９】ストレプトマイセスは半分より多い臨床上
重要な抗生物質を生成するので、存在する抗生物質の収
量を増大させるため又は新しい抗生物質或いはそれらの
誘導体を生成させるために、異つた種の間又はストレプ
トマイセスの菌株間でＤＮＡの移転に用いられうるベク
ターを開発するのが望ましい。本発明によるベクター
は、これらの目的に有用である。ＣＯＳ配列を含む本発
明によるベクターは、特に有用である。それはそれらが
長さ３５キロベース以下であつてしかも２０個以上の類
似の遺伝子を含む異つた源からの大きなＤＮＡセグメン
トをクローンするのに用いられるからである。
【００２０】本発明のベクターは、生体外の種々のＤＮ
Ａフラグメントの段階的リゲーシヨン及び次の感受性の
ある宿主細胞の形質転換により構成される。ベクターの
コンポーネントを含むフラグメントは、それ自体ストレ
プトマイセス又はイー・コリのプラスミドから得ること
ができ、該プラスミドは市販されているか又は市販され
ているものから得られるかの何れかである。
【００２１】試薬及び酵素 細菌の生長用の媒体は、ミシガン州デトロイトのデイフ
コ（Ｄｉｆｃｏ）又はニユーヨーク州ロングアイランド
のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から購入した。制限酵素、仔ウ
シ小腸アルカリ性ホスフアターゼ（ＣＩＡＰ）及びＴ４
ＤＮＡリガーゼは、メリーランド州ゲイサースバーグの
ベチスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｂ
ＲＬ）、マサチユーセツツ州ビバーリイのニユー・イン
グランド・バイオラブズ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）、又はインデイアナ州インデイアナポリス
のベーリンガー・マンハイム（ＢａｅｒｉｎｇｅｒＭａ
ｎｎｈｅｉｍ）から購入された。バクテリオフアージラ
ムダＤＮＡの生体外パツケージング用の試薬を含むギガ
パツク（Ｇｉｇａｐａｃｋ）（登録商標）キツトは、カ
リホルニア州サンジエゴのベクター・クローニング・シ
ステムズ（Ｖｅｃｔｏｒ ＣｌｏｎｎｉｎｇＳｙｓｔｅ
ｍｓ）から購入された。アガロースは、カリホルニア州
リツチモンドのバイオ・ラツド（Ｂｉｏ Ｒａｄ）から
購入された。卵白リゾチーム（３×結晶化）をミズーリ
州・セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。チ
オストレプトンは、ニユー・ジヤージー州プリンストン
のイー・アール・スクイブ・アンド・サンズ（Ｅ．Ｒ．
Ｓｑｕｉｂｂ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）から得られた。
【００２２】宿主細胞培養物、ＤＮＡ源及びベクター イー・コリＫ１２菌株ＪＭ８３及びＨＢ１０１は、ＢＲ
Ｌから得られた。プラスミドを含まないか又はプラスミ
ドｐＩＪ４３を運びストレプトマイセス・リビダンス
（ｌｉｖｉｄａｎｓ）６６は、英国ノーウイチのジヨン
・イネス・インスチチユート（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から得られた。プラスミドｐＩＪ
７０４を運ぶエス・リビダンス６６は、ジヨージタウン
大学のイー・カツツ（Ｅ．Ｋａｔｚ）から得られた。プ
ラスミドｐＪＶ１を運ぶストレプトマイセス・フエオク
ロモゲネス（ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＮＲ
ＲＬＢ−３５５９は、受入れ番号ＮＲＲＬ Ｂ−３５５
９の下でイリノイ州ペオリアのアグリカルチユアル・リ
サーチ・カルチユア・コレクシヨン（Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）から得られた。イー・コリ
ベクターｐＵＣ９及びバクテリオフアージラムダは、ベ
チスダ・リサーチ・ラボラトリーズ又はウイスコンシン
州ミルウオキーのＰＬラボラトリーズから購入された。
プラスミドｐＪＢ８は、英国ロンドンのミル・ヒル・ラ
ボラトリーズ（Ｍｉｌｌ Ｈｉｌｌ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）から得られ、そして又受入れ番号第３７０７
４号の下でアメリカン・タイプ・カルチユア・コレクシ
ヨン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州ロツクビル）か
ら入手されうる。
【００２３】一般的方法 制限酵素及びＴ４ＤＮＡリガーゼは、供給者の指示によ
り用いた。イー・コリの生長及び形質転換に関する標準
手順〔マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら「モレキユラ
ー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニユアル（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｎａｌ）」ニユーヨーク州コールド・ス
プリング・ハーバー（１９８２）〕、ストレプトマイセ
ス・リビダンスの生長及び形質転換〔ビツブ（Ｂｉｂ
ｂ）ら「デベロツプメンツ・イン・ストレプトマイセス
・クローニング（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」エキスペリ
メンタル・マニプユレーシヨン・オブ・ジーン・エキス
プレツシヨン（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）イノウエ編、、アカデミツク・プレス、ニユーヨー
ク州ニユーヨーク、５３〜８７（１９８３）〕、アガロ
ースゲル上のＤＮＡの分析〔マニアチスら「モレキユラ
ー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニユアル」ニ
ユーヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８
２）〕、並にニツク翻訳によるＤＮＡのラベリング〔マ
ニアチスら「モレキユラー・クローニング、ア・ラボラ
トリー・マニユアル」ニユーヨーク州コールド・スプリ
ング・ハーバー（１９８２）〕を用いた。プラスミドを
イー・コリから単離し、そして発表された手順を用いて
精製した〔マニアチスら「モレキユラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニユアル」ニユーヨーク州コ
ールド・スプリング・ハーバー（１９８２）〕
【００２４】
【実施例】本発明は下記の実施例に詳細に記載される。
【００２５】実施例１において、チオストレプトン耐性
（ｔｓｒ）を決定する遺伝子は、プラスミドｐＩＪ７０
４からイー・コリベクター例えばｐＵＣ９へサブクロー
ンされてベクターｐＵＣ９−ｔｓｒを生じた。実施例２
において、プラスミドｐＪＶ１はストレプトマイセス・
フエオクロモゲネスから単離され、そしてストレプトマ
イセス複製機能を運ぶｐＪＶ１のフラグメントは、プラ
スミドｐＵＣ９−ｔｓｒへサブクローンされてプラスミ
ドｐＡＬ７００２を生ずる。実施例３は、プラスミドｐ
ＡＬ７００２のフラグメント（ストレプトマイセス複製
機能及びｔｓｒ遺伝子を運ぶ）をプラスミドｐＪＢ８の
フラグメント（イー・コリ複製機能、イー・コリのアン
ピシリン耐性形質転換子の選択用のａｍｐ遺伝子並にバ
クテリオフアージラムダの結合端である配列ＣＯＳを運
ぶ）へサブクローニングしてプラスミドｐＮＪ１を生成
させることを記述している。
【００２６】実施例５では、ストレプトマイセス・アン
チビオチカス菌株ＡＴＣＣ １１８９１のゲノムライブ
ラリーをｐＮＪ１に構成し、そしてイー・コリに導入す
る。実施例６において、ストレプトマイセス・アンチビ
オチカスＡＴＣＣ １１８９１のゲノムライブラリーを
運ぶイー・コリからのプラスミドＤＮＡを作り、そして
抗生物質チオストレプトンへの耐性を用いてストレプト
マイセス・エリスレウス菌株９ＥＩ４、１（抗生物を生
産せず）へ形質転換させる。チオストレプトン耐性形質
転換子は、抗生物質を生産する能力について実施例６で
テストされ、そして抗生物質生産株のエス・エリスレウ
ス菌株１２６９３−２４０を検出する。
【００２７】実施例７は、エス・エリスレウス１２６９
３−２４０の発酵、発酵液の抽出及び生成物の同定を示
す。又実施例７において、化合物２−ノルエリスロマイ
シンＡ，Ｂ，Ｃ及びＤをエス・エリスレウス１２６９３
−２４０の発酵液から同定する。
【００２８】実施例１ ｐＵＣ９−ｔｓｒの構成
【００２９】プラスミドｐＵＣ９は、標準の条件下で制
限酵素ＢａｍＨＩにより切断され、そしてＤＮＡをエタ
ノール中の沈でん後に回収した。この手順は切断された
ＤＮＡから酵素及びバツフアーを取り去る。実施例２に
記載された単離手順によりストレプトマイセス・リビダ
ンスから単離されたプラスミドｐＩＪ７０４は、酵素Ｂ
Ｃ１Ｉにより切断され、そして得られたフラグメント
は、アガロースゲル電気泳動により分離され、そしてエ
チジウムブロミドによる染色後紫外線の下で透視しうる
ことになつた。約１ｋｂの大きさのＤＮＡに相当するバ
ンドは、同定されそして電気溶離（回収されるべきＤＮ
Ａフラグメントをゲルから除去しそしてゲルバツフアー
を含む透析サツクに入れた）によりゲルから除去され
た。サツクをシールしそしてバツフアーを含む水平ゲル
装置に置き、そしてゲルスライスから回りのバツフアー
へのＵＶ螢光材料の移動を透視しうるに充分な時間電気
泳動にかけた。
【００３０】バツフアーを回収しそしてフエノール−ク
ロロホルム抽出による精製及びエタノール沈でんによる
濃縮後約２μｇの１ｋｂＢＣ１ＩフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ用の標準バツフアー中で０．５μｇのＢａ
ｍＨＩ切断ｐＵＣ９と混合し、そして２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを全容量が４０μｌを超えないように加え
た。混合物を１晩１４℃でインキユベートした。約１０
０ｎｇの混合物をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）ら「ジエ
ー・モル・バオル。（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）」１６
６、５５７〜５８０（１９８３）の手順により、さらに
１０μｇ／ｍｌのエツクスガル（Ｘｇａｌ）を含むＬＢ
アガープレートにおけるアンピシリン耐性のための選択
を用いることにより、能力のあるイー・コリＪＭ８３細
胞の形質転換に用いられた。白色のコロニー（その色は
ｐＵＣ９へのＤＮＡのそう入の存在を示した）を選択
し、採集しそしてそれらのプラスミド含量について調べ
た。酵素ＢａｍＨＩにより切断されなかつた約３．６ｋ
ｂのプラスミドを運ぶイー・コリＪＭ８３／ｐＵＣ９−
ｔｓｒと名付けた菌株を得た。プラスミドはｐＵＣ９−
ｔｓｒと名付けられた。このプラスミドの特徴をさらに
調べてそれがトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら「ジー
ン（Ｇｅｎｅ）」２０、５１〜６２（１９８２）におい
てｐＩＪ７０４のｔｓｒ遺伝子について報告されたよう
に、制限部位を含むことが分つた。
【００３１】実施例２ ベクターｐＡＬ７００２の構成
【００３２】ドオール（Ｄｏｕｌｌ）ら「ＦＥＭＳミク
ロビオル．レト．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ
ｔ．）」１６、３４０−３５２（１９８３）に記載され
たｐＪＶ１と命名されたプラスミドを、ストレプトマイ
セスからプラスミドを単離する本明細書に記載される下
記の手順を用いて、ストレプトマイセス・フエオクロモ
ゲネス（ＮＲＲＬＢ−３５５９）の４〜６日間の培養物
の菌糸から単離した。細胞を遠心分離により採集し一度
１０％シュクロース中で洗い、５ｍｇ／ｍｌのリゾチー
ムを含む１／５０容量の変性Ｐ媒体（ＭｇＣｌ２及びＣ
ａＣｌ２をそれぞれ０．００５Ｍへ低下させた）〔オカ
ニシら「ジエー・ゲン・ミクロバオル（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」８０、３８９−４００（１９７
４）〕に再懸濁した。製品をプロトプラストの形成が観
察されるまで３２℃でインキュベートした。２倍量の溶
解溶液（０．３Ｎ ＮａＯＨ、２％ＳＤＳ、０．０５Ｍ
ＥＤＴＡ）を製品に加えた。混合物を３０分間５０℃
でインキュベートした。２倍量の４Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．８）を製品に加えて混合物を１分間激しく振
とうした。製品を３０分間氷上に放置し次に冷凍遠心分
離機中で１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液
を回収しそして１容量のイソプロパノールの添加後の沈
でん及び１０分聞の氷上のインキュベーシヨンにより濃
縮した。沈でんをＴＥバツフアーに再懸濁しプラスミド
ＤＮＡを塩化セシウム・エチジウムブロミド密度勾配中
の製品の遠心分離後回収した。
【００３３】プラスミドｐＪＶ１を酵素Ｓｍａ Ｉによ
り切断し、そして発生したフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動、フエノール抽出及びエタノール沈でんにか
けた。約２μｇのこの製品を０．５μｇのＳｍａＩ切断
エタノール沈でんｐＵＣ９−ｔｓｒと混合し、実施例１
に記載したやり方でリゲートした。製品の半分を次に用
いて、チオストレプトン耐性用の選択を使用してビツブ
ら「デベロツプメンツ・イン・ストレプトマイセス・ク
ローニング」同上、の手順に従つてストレプトマイセス
・リビダンス６６のプロトプラストを形質転換した。出
現した多数のこれらのクローンは、それらのプラスミド
含量について調べられた。約６．２ｋｂのプラスミドを
有するストレプトマイセス・リビダンス６６／ｐＡＬ７
００２と命名された菌株を保存した。ｐＡＬ７００２と
命名されたプラスミドを単離した。プラスミドｐＡＬ７
００２は、寄託番号第ＮＲＲＬＢ−１８０５５としてイ
リノイ州ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カ
ルチュア・コレクシヨンに１９８６年３月１１日に寄託
されたイー・コリＨＢ１０１／ｐＡＬ７００２から単離
される。プラスミドの部分的な制限及び遺伝学的マツプ
は図１に示される。
【００３４】実施例３ ベクターｐＮＪ１の構成
【００３５】〜１．０５ｋｂのＢＣ１Ｉチオストレプト
ン耐性決定フラグメントがプラスミドｐＵＣ９のＢａｍ
ＨＩ部位へそう入されそしてｐＪＶ１の〜２．７ｋｂの
フラグメントが次に複合ｐＵＣ９−ｔｓｒベクターのＳ
ｍａＩ部位にそう入されるとき、ベクターｐＡＬ７００
２が生成される。ｐＡＬ７００２における複製官能性セ
グメントへのチオストレプトン耐性デテルミナントの近
接は、それらをして〜３．８ｋｂの単一のＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして他のベクターへ
サブクローンさせる。、例えば〜３．８ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩがＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏＲ
Ｉ切断ベクターｐＪＢ８へサブクローンされるとき、得
られたベクターｐＮＪ１が生成される。
【００３６】約５μｇのｐＡＬ７００２が標準の条件を
用いて制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより切断された。Ｄ
ＮＡを次に酵素仔ウシ小腸アルカリ性ホスフアターゼ
（ＣＩＡＰ）により処理して、切断されたプラスミドの
遊離の末端から末端ホスフエートを除いた。ＤＮＡを次
にフエノール抽出し、沈でんしそして再溶解し次に２時
間酵素ＥｃｏＲＩにより制限させた。処理後、ＤＮＡを
実施例１におけるようにフエノール抽出しそして沈でん
させて第一の製品を形成した。同様に、５μｇのｐＪＢ
８を先ず酵素ＥｃｏＲＩにより切断し、酵素ＣＩＡＰに
より処理し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより処理しそしてフエ
ノール抽出及び沈でん後回収して第二の製品を形成し
た。各製品の１ミクロｇを互に混合しそして記述した如
くリゲートした。得られた製品を次にアンピシリン耐性
のための選択を用いて、能力のあるイー・コリＨＢ１０
１細胞へ形質転換させた。プラスミドＤＮＡを多数のコ
ロニーから調べた。約８．８ｋｂのプラスミドを運ぶイ
ー・コリＨＢ１０１／ｐＮＪ１と命名した菌株を保存し
た。プラスミドをｐＮＪ１と命名した。プラスミドｐＮ
Ｊ１は、受入れ番号Ｂ−１８０５４の下でアグリカルチ
ュアル・リサーチ・カルチュア・コレクシヨン（ＮＲＲ
Ｌ）に１９８６年３月１１日に寄託されたイー・コリＨ
Ｂ１０１／ｐＮＪ１から単離される。プラスミドの部分
的な制限マツプは、図２に示される。
【００３７】実施例４ エス・エリスレウス／ｐＡＬ７００２及びエス・エリス
レウス／ｐＪＮ１の構成
【００３８】プラスミドｐＡＬ７００２又はｐＮＪ１
は、下記の手順によりストレプトマイセス・エリスレウ
スのプロトプラストへ形質転換された。
【００３９】ストレプトマイセスの生長及びプロトプラ
ストへの変換の一般的なやり方において、ストレプトマ
イセス・エリスレウスの胞子又は栄養菌糸は、５０ｍｌ
のＳＧＧＰ培地（０．４％トリプトン、０４％イースト
抽出物、０．０５％ＭｇＳＯ４、１％グルコース、０．
２％グリシン、０．０１Ｍりん酸カリウムバツフアー、
ｐＨ７．０）へ植え付けられ、そして４〜６日間２００
ｒｐｍで振とうしつつ２８℃でインキュベートされた。
細胞を次に遠心分離により採取し、１回Ｐ媒体〔オカニ
シら、同上〕で洗い、そして５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で
リゾチームを含むＰ媒体に再懸濁した。懸濁液を、顕微
鏡の下のサンプルの調べによりモニターされるプロトプ
ラスト形成を生じさせるのに充分な時間（一般に１５〜
６０分）３２℃でインキュベートした。プロトプラスト
を低速の遠心分離により集め、Ｐ媒体中でリゾチームが
なくなるまで洗いそして＞１０１０／ｍｌの最終密度で
再懸濁した。プロトプラストは形質転換に直接用いられ
るか又は４％の最終濃度へＤＭＳＯを添加した後−７０
℃で貯えた。
【００４０】エス・エリスレウスのプロトプラスの形質
転換において、ＴＥバツフアー〔マニアチスら「モレキ
ュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー・ヨーク
（１９８２）〕中の０．５〜５μｇのＤＮＡを１０μｇ
のヘパリンと混合し、２０分間氷上で冷却し、次に室温
とし、以下の段階のすべてを室温で行つた。約１０９／
ｍｌの濃度のプロトプラストをＤＮＡへ加え、１分後Ｐ
Ｔ媒体〔ビツブら「ネイチュア」２７４、３９８〜４０
０（１９７８）に記載された如く１０．３％シユクロー
ス、０．０２５％Ｋ２ＳＯ４、０．０２５Ｍ ＴＥＳバ
ツフアー、ｐＨ７．２、それぞれ０．０２５ＭのＣａＣ
ｌ２及びＭｇＣｌ２並に微量元素〕中の２５％ポリエチ
レングリコール３３５０を加えた。２分間放置後、未希
釈の部分を、プラスチツクの棒の助けにより予め乾燥し
たＲ３Ｍアガー媒体〔ビツブら「ネイチユア」２７４、
３９８〜４００（１９７８）における如く２．２％アガ
ー、それぞれ０．４％のトリプトン、カスアミノ（Ｃａ
ｓａｍｉｎｏ）酸及びイースト・エキストラクト、０．
０２５Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．０５％ＫＨ
２ＰＯ４、それぞれ０．０ＭのＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ
２、０．００２５Ｍ ＮａＯＨ、０．０２５％Ｋ２ＳＯ
４、１％グルコース、１０．３％シュクロース及び微量
元素〕の表面に拡げた。再生が明らかになるまで、プレ
ートを１８〜３６時間２８０℃でインキュベートした。
チオストレプトン耐性（チオＲ）形質転換子の選択のた
めに、プレートを０．６％のアガー及び４０μｇ／ｍｌ
のチオストレプトンを含む半固体トリプチカーゼ・ソイ
・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔ
ｈ）５ｍｌにより覆い、そしてコロニーが現れるまで３
２℃でインキュベートした。チオストレプトンを含む培
地に生長するコロニーの能力は、それらがチオＲセグメ
ントを含む形質転換子よりなることを示した。
【００４１】実施例５ ｐＮＪ１におけるストレプトマイセス・アンチビオチカ
スＡＴＣＣ１１８９１のゲノムライブラリーの構成及び
イーコリへの導入
【００４２】ＡＴＣＣ第１１８９１号としてアメリカン
・タイプ・カルチュア・コレクシヨンから入手しうるエ
ス・アンチビオチカス菌株からのゲノムＤＮＡを、ＳＤ
Ｓ又はサルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）の溶液により溶
解した、実施例４に記載された如く製造したストレプト
マイセス・アンチビオチカスのプロトプラストから製造
した。溶解物を次にフエノール・クロロホルムによる処
理の繰返し次にエタノール沈でんによる濃縮により除た
ん白する。溶解した沈でんをリボヌクレアーゼにより処
理し、次にフエノール・クロロホルムにより再抽出す
る。エタノールによる沈でん後、溶解した材料をクロー
ニングに用いる。溶解した材料を酵素Ｓａｕ３Ａ１によ
り部分的に切断して〜１ｋｂ〜＞４０ｋｂに及ぶ大きさ
のフラグメントを得た。
【００４３】ＤＮＡフラグメントを酵素ＣＩＡＰにより
処理し、フエノールにより抽出し、そしてエタノールに
より沈でんした（製品Ａ）。プラスミドｐＮＪ１をＥｃ
ｏＲＩにより分解し、フエノールにより抽出し、ＣＩＡ
Ｐにより処理し、再びフエノールにより抽出し、制限酵
素Ｂｇ１ ＩＩにより処理し、フエノール抽出しそして
沈でんした（製品Ｂ）。同様に、ｐＮＪ１の第二のサン
プルを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩにより分解し、ＣＩＡ
Ｐにより処理し、次にＢｇ１ ＩＩにより分解した（製
品Ｃ）。０．５μｇの製品Ｂ、０．５μｇの製品Ｃ及び
５μｇの製品Ａよりなる混合物をリゲーシヨン・バツフ
アー中に作り、そして１晩１４℃でＴ４ＤＮＡリカーゼ
により処理した。材科を、次に供給者から得られるプロ
トコールを用いて、ギガパツク（登録商標）キツトを使
用してバクテリオフアージラムダに生体外でパツケージ
ングした。パツケージング完了後、製品を０．０１Ｍ
ＭｇＳＯ４中のイー・コリＨＢ１０１細胞と混合して、
細胞へフアージを吸着させそして２０分間室温で放置し
た。細胞を次にＬブロス（Ｂｒｏｔｈ）へ移し、５０μ
ｇ／ｍｌの最終濃度へ媒体へアンピシリンを加える前に
１時間生長させた。培養物を１晩インキユベートし、そ
してプラスミドＤＮＡを製品から抽出した。
【００４４】実施例６ ストレプトマイセス・エリスレウス１２６９３−２４０
の構成
【００４５】実施例５に記載された如く製造された、オ
レアンドマイシン生産菌のストレプトマイセス・アンチ
ビオチカスＡＴＣＣ１１８９１のゲノムライブラリーの
成分を運ぶｐＮＪ１の混合プラスミド製品をイー・コリ
から単離し、そして実施例４に記載された如くチオスト
レプトン耐性の選択を用いて、ｅｒｙ Ａ菌株のストレ
プトマイセス・エリスレウス菌株９ＥＩ４１のプロトプ
ラストへ形質転換した。生じた個々の形質転換子を、下
記のアガー・プラグ・テストにおいてスタヒロコツカス
・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅ
ｕｓ）のチオストレプトン耐性培養物を殺すか又はその
生長を阻害する１種以上の物質の生産についてテストさ
れた。チオストレプトンの存在下に生長した単離物を取
り上げることにより得られた形質転換子は、２−５μｇ
／ｍｌでチオストレプトンを含むＳＬＭ−３アガー培地
（１％コーンスターチ、０．５％コーンスチープリカ
ー、０．０００１２％ＦｅＳＯ４、０．３％ＣａＣ
Ｏ３、１．５％アガー、ｐＨを７．０へ調節）に生長さ
せて、３２℃で７〜１０日間チオストレプトンへの耐性
の遺伝子を含むベクターの存在に関する選択を維持し
た。缶に生長した領域から取つた小さなプラグのアガー
を次にチオストレプトン耐性スタヒロコツカス・アウレ
ス細胞の懸濁液を接種したアガー培地の表面に置いた。
培地を３７℃で１晩インキユベートした。もし抗生物質
がストレプトマイセス培養物により生成されるならば、
エス・アウレウスの抑制の帯がアガー・プラグの回りに
見られた。
【００４６】ストレプトマイセス・エリスレウス１２６
９３−２４０と命名された一つの単離物は、チオストレ
プトンの存在下生長したとき、チオストレプトン耐性ス
タヒロコツカス・アウレウス細胞を殺すか又は生長を阻
害する１種以上の物質を生産する特性を示した。エス・
アウレウス１２６９３−２４０は、受付番号ＮＲＲＬＢ
−１８０５３号としてイリノイ州ペオリアのアグリカル
チユアル・リサーチ・カルチユア・コレクシヨン（ＮＲ
ＲＬ）の永久培養物コレクシヨンの一つとされ、１９８
６年３月１１日寄託された。
【００４７】実施例７ エス・エリスレウス１２６９３−２４０からの抗生物質
【００４８】菌株１２６９３−２４０のストレプトマイ
セス細胞を、２μｇ／ｍｌでチオストレプトンを含む５
００ｍｌのＳＣＭ培地（１．５％可溶性でん粉、２％ソ
イトン（Ｓｏｙｔｏｎ）、０．５％イースト・エキスト
ラクト、０．００１％ＣａＣｌ２）へ植え付けそして３
２℃で３〜６日間生長させた。全培養物を次に発酵槽中
の２μｇ／ｍｌのチオストレプトン及び５％大豆油を含
む新しいＳＣＭ培地１０ｌへ植え付けた。発酵槽を、一
定の通気及びｐＨ７．０に保ちつつ３２℃で７日間操作
した。
【００４９】採取時に、発酵液を５ＮＫＯＨによりｐＨ
９．２に調節し、遠心分離しそして上澄み液を半量の酢
酸エチルで２回順次に抽出した。合わせた酢酸エチル抽
出物を、半量のｐＨ４．８、２％くえん酸・くえん酸ナ
トリウム含水バツフアーにより２回抽出した。合わせた
水層を５ＮＫＯＨによりｐＨ９．２へ調節し、そして半
量の酢酸エチルで２回抽出した。合わせた酢酸エチル抽
出物を濃縮して、親油性の抽出可能物の粗製濃縮物を得
た。粗製濃縮物を、溶媒例えばメタノール又は混合溶媒
例えばクロロホルム・ヘキサン１：１中の親油性ゲル排
除樹脂例えばセフアデツクスＬＨ−２０（登録商標）
（フアルマシア、ニユー・ジヤージー州ピスキヤタウエ
イ）のクロマトグラフイにより精製した。抗生物質含有
画分を、スタヒロコツカス・アウレウスのマクロライド
感受性菌株を接種したｐＨ８のアガー培地上のバイオア
ツセイにより検出する。
【００５０】同様な構造の抗生物質コンジナーの分離
は、適当な二相系を用いるイトー・コイル・プラネツト
・セントリフユージ（Ｉｔｏ Ｃｏｉｌ Ｐｌａｎｅｔ
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）（登録商標）〔Ｐ．Ｃ．イン
コーポレテツド、メリーランド州ポトマツク〕を用いて
向流クロマトグラフイにより達成される。マルチプルク
ロマトグラフイ分離が、単一の発酵からすべての生物活
性コンジナーを分離するのに要求される。
【００５１】菌株１２６９３−２４０の１０ｌの発酵
は、粗製の抽出可能な基本画分として油（２６４ｍｇ）
を生じた。これを二相系（下方の相を静置相とする、そ
れぞれ５：１０：３：２：５の比のｎ−ヘプタン、ベン
ゼン、イソプロパノール、アセトン、０．０５Ｍ ｐＨ
７．０りん酸カリウムバツフアー）を用いるイトー・コ
イル・プラネツト・セントリフユージの向流クロマトグ
ラフイにかけた。約４ｍｌ／分の流速及び約８００ｒｐ
ｍのコイルスピン速度を保つた。サンプルを、レオダイ
ン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）（登録商標）注入ループを用い
て１０ｍｌの上相にカラムに注入した。約８ｍｌの画分
を集めた。各画分を、オートクレーブ前にｐＨ８に調節
されたストレプトマイシンアツセイアガープレート（デ
イフコ）のデイスク拡散アツセイにおける２０μｌのデ
イスクを用いて、スタヒロコツカス・アウレウス６５３
８Ｐについてバイオアツセイした。画分を、生物活性プ
ロフイルに基いて３個の生物活性プールに集めた。これ
らのそれぞれから、溶媒を除きそして得られた残渣をク
ロロホルムと希含水水酸化アンモニウムとの間に分配し
た。クロロホルム層を除き、水洗し、次に濃縮して残渣
を得た。これらを１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析によりＣ
ＤＣｌ３で調べた。
【００５２】抗生物質の特徴は、高出力ＦＴ ＮＭＲス
ペクトル分析を用いてスペクトル分析上調べられた。種
々の一次元及び二次元のパルス技術が、１Ｈ及び１３Ｃ
核の同核及び異核の観察とともに用いられた。これらの
データは、高速原子衝撃及び電子衝撃源の両方を用いて
高分解質量分析により補強された。
【００５３】クロマトグラムから溶離された第一の活性
の帯は、密接に関連のあるマクロライドの混合物である
ことが示され、そして再びクロマトグラフイにかけた。
【００５４】第二の活性帯は、２−ノルエリスロマイシ
ンＤであることが示された（図５）。それは、表１及び
表２にそれぞれ示される如く、広範囲な１Ｈ−ＮＭＲ脱
カツプリング実験及びＣＭＲスペクトルを特徴とする。
エリスロマイシンＤについての発表されたスペクトルが
ないので、表２におけるエリスロマイシンＡ及びＢの比
較データは、テルイら「テトラヘドロン・レタ（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）」１９７５、２５８３
〜２５８６（１９７５）に発表されたものであるが、た
だし２ＣＨ３及び８ＣＨ３に対するアサインメントは、
互に交換されている（テルイら、同上、において恐らく
適当な指定として示唆されていた）。エリスロマイシン
Ｃに関するデータは、アボツト・ラボラトリーズで得ら
れた。
【００５５】表１において、ＴＭＳはテトラメチルシラ
ンの略であり、ｓはシングレツトの略であり、ｄはダブ
レツトの略であり、ｔはトリプレツトの略であり、ｑは
カルテツトの略でありそしてｍはマルチプレツトの略で
ある。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
【表３】
【００５９】
【表４】
【００６０】表１において、Ｈ−３のトリプレツトのダ
ブレツトの分裂パターンは、Ｈ−３がＣ−２又はＣ−４
のプロトンでなければならない３個の他のプロトンにカ
ツプリングして、メチル基が第二の活性帯の材料から失
われていることを示す。Ｈ−５の分裂パターンは鋭いダ
ブレツトで、Ｃ−４に余分のプロトンが存在しないこと
を示す。その上、表２に示されるように、Ｃ−２におけ
るメチル置換がないことは、それがエリスロマイシン
Ａ，Ｂ及びＣについて占めている位置からのピークの位
置の１３Ｃスペクトルの変化と一致する。
【００６１】第三の活性帯は、表３で示されるように１
Ｈ−ＮＭＲスペクトルによりそして高分解質量スペクト
ルにより、図３に示されるように、２−ノルエリスロマ
イシンＣであることが示された。第三の活性帯は、７０
６のＦＡＢ正イオンＭＨ＋ｍ／ｚを示した。
【００６２】表３において、ＴＭＳはテトラメチルシラ
ンの略であり、Ｓはシングレツトの略であり、ｄはダブ
レツトの略であり、ｔはトリプレツトの略であり、ｑは
カルテツトの略であり、そしてｍはマルチプレツトの略
である。
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
【００６５】表３において、容易にＨ−３ヘアサインし
うる、４．２２のシグナルの分裂パターンの位置は、メ
チル基がＣ−２位置から失われていることをこの分子で
示されている。Ｈ−１３プロトンヘアサインされた５．
１０のダブレツツのプロトンシグナルのカツプリングパ
ターンは、エリスロマイシンＡ及びＣにおけるように、
マクロライド構造のＣ−１２のヒドロキシル化を示す。
これは、質量スペクトルのデータとともに、２−ノルエ
リスロマイシンＣの如き第三の活性帯のアサインメント
を支持する。
【００６６】第一の活性帯は、下相を静置相として用い
る、１：１：１：１の比の四塩化炭素、クロロホルム、
メタノール、０．０１Ｍ ｐＨ５含水酢酸ナトリウム・
酢酸バツフアーを二相系として用いるイトー・コイル・
プラネツト・セントリフユージで再クロマトグラフイに
かけられた。流速は約４ｍｌ／分であり、コイル・スピ
ン速度は８００ｒｐｍでありそして注入容量は２ｍｌで
あつた。３本の活性帯を溶離した。カラムから溶離した
第一の活性帯を、図３に示される如く２−ノルエリスロ
マイシンＡとして１Ｈ−ＮＭＲにより同定した。質量ス
ペクトル、ＦＡＢ正イオンＭＨ＋ｍ／ｚは７２０であつ
た。
【００６７】第二の活性帯は、エリスロマイシンＡとし
て１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにより同定された（真正のサ
ンプルのスペクトルと同一）。
【００６８】第三の活性帯は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
並に７０４のに示されるように、２−ノルエリスロマイ
シンＢとして同定された。
【００６９】質量スペクトルは、前述の如く、再クロマ
トグラフされた材料の第一及び第三の活性帯の高速原子
衝撃（ＦＡＢ）正イオンモードでランされた。ｍ／ｚ７
２０及びｍ／ｚ７０４で観察されるプロトン化分子状イ
オン（ＭＨ＋）種に帰せられるピークは、それぞれ２−
ノルエリスロマイシンＡ及び２−ノルエリスロマイシン
Ｂについて予想される質量／荷電（ｍ／ｚ）比と一致し
た。それぞれの場合において、対応する親化合物からの
中性糖の損失により生ずるプロトン化基本画分に帰せら
れる主な劣化イオンピークが、観察された。このピーク
は、２−ノルエリスロマイシンＡに対してｍ／ｚ５６２
そして２−ノルエリスロマイシンＢに対してｍ／ｚ５４
６であつた。これらの質量スペクトルのピーク及び生物
活性帯とのそれらの結びつきは、充分に特徴ずけられた
２−ノルエリスロマイシンＣ及びＤとともに生成し、２
−ノルエリスロマイシンＡ及び２−ノルエリスロマイシ
ンＢであるとの生物活性の同定に強い周辺の証拠を提供
した。
【００７０】その製薬上有用な形のエリスロマイシンＡ
が酸性劣化をうけて、８，９−アンヒドロエリスロマイ
シンＡ−６，９−ヘミケタール及びエリスロマイシンＡ
−６，９，１２スピロケタールとなることは周知であ
る。これらの生成物は、ともに殆んど抗菌性活性を欠い
ている。これらの不活性生成物の形成中の中間体は、６
又は１２ヒドロキシル基及び９−ケトン官能基を含む種
々の可能なエピマー性ヘミケタールである。これらの４
種の可能なヘミケタールは、通常ジヒドロキシケトンの
形と互変異性平衡にある。図４に示されるように、２−
ノルエリスロマイシンＤの炭素とエリスロマイシンＢ及
びエリスロマイシンＣの入手しうる参考スぺクトルから
の適切な炭素との間の化学上のシフトの差の調査は、主
な差の３種の特定の領域を示すことは興味のあることで
ある。図４において、２−ノルエリスロマイシンＤのス
ペクトル値と示された参考エリスロマイシンのそれとの
間の差は、それらが対応するエリスロマイシン構造にお
ける位置の隣りである。その位置における変化又は置換
が予想されうるように、最大の差はＣ−２の領域で生ず
る。主な差は、又糖のアノマー炭素の近くで生ずる。こ
れは、恐らく親の抗生物質に比べて、２−ノル化合物に
おけるこれらの糖の配座の剛さの程度が低いことを示し
ている。主な差の他の位置は、Ｃ−９の近くにあり、こ
れは恐らく２−メチル親化合物のそれらと比べて、２−
ノル化合物のヘミケタール形の相対的互変異性体数を反
映している。この差は、確かに２−ノルエリスロマイシ
ンと現在入手しうるエリスロマイシンとの間の、８，９
−アンヒドロ−６，９ヘミケタール及び６，９，１２ス
ピロケタール誘導体（適用しうるとき）への転換速度の
差をもたらし、そして現在入手しうるエリスロマイシン
抗生物質に比べて２−ノルエリスロマイシンの安定性の
増大をもたらすだろう。
【００７１】さらに、前述のデイスクアツセイにおける
デイスクの回わの帯の大きさをアツセイする材料の量
は、２−ノルエリスロマイシンＡ及び２−ノルエリスロ
マイシンＢが可能性のある抗生物質であり、少くとも能
力において対応するエリスロマイシンＡ及びＢと匹敵し
うることを示している。同様に、２−ノルエリスロマイ
シンＣ及び２−ノルエリスロマイシンＤが２−ノルエリ
スロマイシンＡ及びＢよりも比較的弱い抗生物質である
ことが示唆されているが、この相対的な能力は、エリス
ロマイシンＡ及びＢよりも比較的弱い抗生物質である対
応するエリスロマイシンＣ及びＤの相対的な能力と一致
している。
【００７２】本発明は好ましい態様について記述された
が、変化及び修正は当業者にとり生ずることは理解され
よう。例えば、プラスミドｐＡＬ７００２及びｐＮＪ１
はストレプトマイセスの官能性複製セグメントとしてｐ
ＪＶ１の〜２．７ｋｂＳｍａＩ制限フラグメントを用い
ているが、〜４．７ｋｂＫｐｎＩフラグメント又は〜
４．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを含むｐＪＶＩの他
のセグメントも用いられうる。これらのフラグメント
は、ストレプトマイセスのチオストレプトン耐性の遺伝
学的デテルミナントを含むＤＮＡのセグメントへリゲー
トされる。さらに本発明では、記載されたチオストレプ
トン耐性を決定するＤＮＡのセグメントは〜１．０５ｋ
ｂＢＣ１Ｉフラグメント（プラスミドｐＩＪ７０４から
得られる）であつたが、チオストレプトン耐性遺伝子を
含む他のフラグメントは、又用いられ、それらは例えば
プラスミドｐＩＪ３５０、ｐＩ７０２、ｐＩ７０３、ｐ
Ｉ７０４、ｐＩ７０５又はｐＩＪ６１のすべて又は一部
を含み、これらのすべては英国ノーウイチのジヨン・イ
ネス・インスチチユート（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ）のコレクシヨンから得られよう。受入
れ番号第３５２８７号の下でメリーランド州ロツクビル
のアメリカン・タイプ・カルチユア・コレクシヨンから
入手しうるプラスミドｐＩＪ７０２は、本発明のｐＩＪ
７０４を用いる手順で直接置換されよう。又、チオスト
レプトン耐性遺伝子は、元の源即ち菌株ストレプトマイ
セス・アズレウスのゲノムから単離され、そしてｐＮＪ
１又はｐＡＬ７００２の官能性複製セグメントへリカー
トされよう。
【００７３】同様に、チオストレプトンへの耐性を有す
るＤＮＡセグメントが本明細書で例示されたが、エリス
ロマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフエニコー
ル、ヒグロマイシン、ネオマイシン、タイロシン、ピク
ロマイシンなどを含む同一又は異る抗生物質に対して耐
性を有する他のＤＮＡセグメントは、本発明の範囲内に
ある官能性クローニングベクターをもたらす、ｐＡＬ７
００２又はｐＮＪ１の複製決定セグメントへのリゲーシ
ヨンにより、本明細書に記載された薬剤耐性セグメント
の代りに又はそれに加えて当業者により用いられうる。
【００７４】種々の制限フラグメントはともにリゲート
されてプラスミドｐＡＬ７００２及び本発明の他のベク
ターを形成するが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド結合体を
フラグメントに付着するか、又は種々の手法（非同族末
端を互にリゲートさせるか、又はｐＡＬ７００２又はそ
の誘導体又は本発明に存在する他のベクターの新規な制
限部位の構成を行わせて次のクローニング実験を助け
る）によりフラグメントに不活性な末端を形成すること
により、リゲーシヨンを助けるようにフラグメントを修
飾することが出来ることは、当業者は理解しよう。その
上、本発明のベクターは、本発明について示された制限
マツプにより証明される或るＤＮＡ配列を生ずる、種々
の制限フラグメントのリゲーシヨンの生成物を示すが、
同族性制限切断末端を有する２種のフラグメントのリゲ
ーシヨンは、２種の可能な配向を有するが本発明につい
て記載されたベクターのすべての性質を有する生成物を
生成することは、当業者は理解しよう。それ故本発明は
その範囲内に、本明細書に記載されたのと同じ制限フラ
グメントから構成されるがすべての可能な配向の任意の
もののベクター内に整理されるすべての官能性ベクター
を含む。
【００７５】本発明で存在するクローニングベクター
は、ストレプトマイセスの単一の種又は菌株で用いられ
るのに限定されず、広範囲の種及び菌株、特に抗生物質
又は化学的或いは生物学的手段により抗生物質へ変換さ
れる他の化合物を生成するものへ適用されうる。マクロ
ライドの型の抗生物質を生成する種又は菌株は、それら
に制限されないが、例えばエス・エリスレウス、エス・
アンチビオチカス、エス・ベネズエラエ（Ｓ．ｖｅｎｅ
ｚｕｅｌａｅ）、エス・フラジエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａ
ｅ）及びエス・ナルボネンシス（Ｓ．ｎａｒｂｏｎｅｎ
ｓｉｓ）を含む。アミノグリコシド型の抗生物質を生成
する種又は菌株は、それらに限定されないが、例えばエ
ス・カナミセチカス（Ｓ．ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕ
ｓ）、エス・テンネブラリウス（Ｓ．ｔｅｎｎｅｂｒａ
ｒｉｕｓ）、エス・ヒグロスコビカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏ
ｓｃｏｐｉｃｕｓ）、エス．カスガエシス（Ｓ．ｋａｓ
ｕｇａｅｎｓｉｓ）及びエス・ビキニエンシス（Ｓ．ｂ
ｉｋｉｎｉｅｎｓｉｓ）を含む。β−ラクタム型の抗生
物質を生成する種又は菌株は、それに限定されないが例
えばエス・クラバリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒ
ｕｓ）、エス・ラクタムデユランス（Ｓ．ｌａｃｔａｍ
ｄｕｒａｎｓ）、エス・ビリドクロモゲネス（Ｓ．ｖｉ
ｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓｅ）、エス・ロチエイ
（Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ）及びエス・フラバス（Ｓ．ｆｌａ
ｖｕｓ）を含む。ポリエーテル型の抗生物質を生成する
菌株又は種は、それらに限定されないが例えばエス・ア
ルバス（Ｓ．ａｌｂｎｓ）、エス・グリセウス（Ｓ．ｇ
ｒｉｓｅｕｓ）、エス・オウレオフアシエンス（Ｓ．ａ
ｕｒｅｏｆａｓｃｉｅｎｓ）、エス・リボシデイフイカ
ス（Ｓ．ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）及びエス．ビオ
ラアセオニガー（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）を
含む。グリコペプチド型の抗生物質を生成する種又は菌
株は、それに限定されないが例えばエス・オリエンタリ
ス（Ｓ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）及びエス・カンデダス
（Ｓ．ｃａｎｄｉｄｕｓ）を含む。本発明のベクター
は、又前記のカテゴリーに含まれない、それらに限定さ
れないが例えばエス．リビダンス６６、エス・ケリコロ
ール（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）及びエス・パルバラ
ス（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）を含むストレプトマイセス
の他の宿主に特に有用である。
【００７６】エス・リビダンス及びエス・エリスレウス
のプロトプラストの形質転換の方法が本発明において記
述されたが、再生培地の使用及びベクターで運ばれる抗
生物質耐性の選択を含む、ストレプトマイセスのプロト
プラストの発生及び本発明のベクターによる該プロトプ
ラストの形質転換に用いられる方法は、他の菌株の形質
転換へ適用されよう。
【００７７】従つて、すべてのこのような等しい修飾及
び変化は本発明の範囲内に入ることを目的としている。
【００７８】
【図面の簡単な説明】
【図１】は本発明によるベクターｐＡＬ７００２の部分
的制限マップである。
【図２】は本発明によるベクターｐＮＪ１の部分的制限
マップである。
【図３】は２−ノルエリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ
の構造の複合図である。
【図４】はエリスロマイシンＢ又はＣと２−ノルエリス
ロマイシンＤとの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける差
の組合せ及びその構造を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 ジェームス タン アメリカ合衆国イリノイ州 60085 ウォ ークガン リッジランド アベニュー 2632 (72)発明者 ジェームス ブルース マクアルペイン アメリカ合衆国イリノイ州 60048 リバ テイビル ダブリュー ロックランド 211

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ２−ノルエリスロマイシンＡ、 ２−ノルエリスロマイシンＢ、 ２−ノルエリスロマイシンＣ、及び２−ノルエリスロマ
    イシンＤよりなる群からの一つを、窒素及び炭素の同化
    しうる源を含む水性媒体中で培養して生成するエス・エ
    リスレウスの生物学的に純粋な培養物。
  2. 【請求項２】 エス・エリスレウス（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒ
    ｅｕｓ）がエス・エリスレウス１２６９３−２４０ Ｎ
    ＲＲＬＢ−１８０５３のすべての同定特徴を有するエス
    ・エリスレウスである生物学的に純粋な培養物。
  3. 【請求項３】 窒素及び炭素の同化しうる源の存在下水
    性媒体中でエス・エリスレウス１２６９３−２４０ Ｎ
    ＲＲＬＢ−１８０５３を培養する工程よりなる２−ノル
    エリスロマイシン抗生物質を生成する方法。
  4. 【請求項４】 窒素及び炭素の同化しうる源の存在下水
    性媒体中でエス・エリスレウス１２６９３−２４０ Ｎ
    ＲＲＬＢ−１８０５３を培養する工程よりなるエリスロ
    マイシンＡ抗生物質を生成する方法。
  5. 【請求項５】 ２−ノルエリスロマイシンＡ又はその製
    薬上許容しうるえ塩。
  6. 【請求項６】 該２−ノルエリスロマイシンＡが細菌の
    成長を阻害するのに有効であり、そして実質的に純粋な
    形で７２０の質量スペクトル、ＦＡＢ正イオンＭＨ＋ｍ
    ／ｚを有する請求項５記載の２−ノルエリスロマイシン
    Ａ。
  7. 【請求項７】 ２−ノルエリスロマイシンＢ又はその製
    薬上許容しうるえ塩。
  8. 【請求項８】 該２−ノルエリスロマイシンＢが細菌の
    成長を阻害するのに有効であり、そして実質的に純粋な
    形で７０４の質量スペクトル、ＦＡＢ正イオンＭＨ＋ｍ
    ／ｚを有する請求項７記載の２−ノルエリスロマイシン
    Ｂ。
  9. 【請求項９】 ２−ノルエリスロマイシンＣ又はその製
    薬上許容しうるえ塩。
  10. 【請求項１０】 該２−ノルエリスロマイシンＣが細菌
    の成長を阻害するのに有効であり、そして実質的に純粋
    な形で７０６の質量スペクトル、ＦＡＢ正イオンＭＨ＋
    ｍ／ｚを有し、さらに第３表に示された部分スペクトル
    よりなる１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する請求項９記載
    の２−ノルエリスロマイシンＣ。
  11. 【請求項１１】 ２−ノルエリスロマイシンＤ又はその
    製薬上許容しうるえ塩。
  12. 【請求項１２】 該２−ノルエリスロマイシンＤが細菌
    の成長を阻害するのに有効であり、そして実質的に純粋
    な形で表１に示された１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有し、
    さらに表１に示された１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有す
    る請求項１１記載の２−ノルエリスロマイシンＤ。
  13. 【請求項１３】 抗生物質の活性と両立しうる希釈剤又
    は担体、及び２−ノルエリスロマイシンＡ又はその製薬
    上許容しうるえ塩、２−ノルエリスロマイシンＢ又はそ
    の製薬上許容しうるえ塩、２−ノルエリスロマイシンＣ
    又はその製薬上許容しうるえ塩、２−ノルエリスロマイ
    シンＤ又はその製薬上許容しうるえ塩よりなる群から選
    ばれる抗生物質。
  14. 【請求項１４】 オレアンドマイシン産生ストレプトマ
    イセス・アンチビオチカス（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
    ｓ）のゲノムライブラリーよりなる複数のベクターを製
    造し、複数のベクターによりストレプトマイセス・エリ
    スレウスの複数の細胞を形質転換し、そして抗生物質活
    性を有し並びにストレプトマイセス・アンチビオチカス
    又はストレプトマイセス・エリスレウスにおいて産生さ
    れる抗生物質からは物理的又は科学的性質又は生物学的
    活性において異なる化合物を形質転換した細胞かた採取
    する工程よりなるストレプトマイセス・エリスレウスに
    おいて抗生物質を製造する方法。
  15. 【請求項１５】 該形質転換工程はエリスロマイシンの
    合成経路においてブロックされるストレプトマイセス・
    エリスレウスを用いる工程よりなり、そしてさらに抗生
    物質産生形質転換細胞を選ぶ工程よりなる請求項１４記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】 該使用工程はｅｒｙ Ａ変種菌株のス
    トレプトマイセス・エリスレウス細胞を提供する工程よ
    りなる請求項１５記載の方法。
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