JPH09165403A - バクテリアセルロースの凍結方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 バクテリアセルロースの諸特性を保持しなが
ら凍結・解凍する方法を提供すること。 【解決手段】 バクテリアセルロースを含有する水性懸
濁液にバクテリアセルロースと水以外の第３成分を加え
た後に凍結することを特徴とする、バクテリアセルロー
スの凍結方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、セルロース生産菌
を培養することによって製造し得るセルロース性物質
（以下、「バクテリアセルロース」又は「ＢＣ」とい
う。）の凍結方法、該方法によって得られる凍結物、及
び該凍結物の復元方法に係わるものである。

【０００２】

【従来の技術】ＢＣ（バクテリアセルロース）は可食性
であり無味無臭であるため、食品分野で利用されるほ
か、水系分散性に優れているので食品、化粧品又は塗料
等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の保持、食
品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化安定化助剤と
しての産業上利用価値がある。ＢＣは木材パルプ等から
製造されるセルロースに較べ、フィブリル（又は微細繊
維）の断面幅が２ケタ程度も小さいことを特徴とする。
従って、ＢＣの離解物はフィブリルのかかる構造的物理
的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤として
各種の産業用用途がある。このようなセルロース性離解
物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾性率
を示すのでフィブリルの構造的特徴に基づくすぐれた機
械特性が期待され、各種産業用素材としての応用があ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】さて、上で述べたよう
に、ＢＣが食品等に含有されている場合には、長期保存
等の目的でそれらに凍結（冷凍）処理が施されることが
ある。ところが、ＢＣは、非常に微細なセルロース微細
繊維からなる。この微細繊維は、幅約１００nm、厚さ数
nm程度であることが、透過型電子顕微鏡観察の結果をも
とに推察されている。さらに、走査型電子顕微鏡観察で
は、幅が２０〜５０nmであることが報告されている。周
知のようにセルロースは、グルコースの１位と４位の炭
素がβ結合してできたホモポリマーである。このグルコ
ース残基の２、３、６位には、水酸基が結合している
が、これらの水酸基とグルコースのピラノース環の中の
酸素原子との間に水素結合が形成される。微細繊維と微
細繊維の間には、水分が存在しているが、凍結の過程に
おいて時間をかけて凍結を行うと大きな氷晶の成長が起
きる。ＢＣの微細繊維間の水が凍結される際に、微細繊
維間の空隙よりも大きな氷晶の成長がおこると、ＢＣの
微細繊維同士の会合（水素結合）が発生する。従って、
この現象を防止するためには、急激に凍結を行う必要が
ある。しかしながら、急激な凍結のための冷却には大き
なエネルギーが必要とされる。このような点を考慮して
も、凍結乾燥を工業的に行うには、膨大なエネルギーが
必要となる。バクテリアセルロースのリボン状の微細繊
維は、通常のセルロース繊維、例えば、植物パルプ繊維
と比較して非常に細い分、表面積が大きいので、水素結
合に寄与する部分が多くなるので、微細繊維間の水素結
合は、通常のパルプ繊維などと比較して非常に強固なも
のとなる。

【０００４】従って、一旦ＢＣを含む組成物が凍結され
ると微細繊維間の結合が強固なために、これを単に解凍
（融解）してももとの湿潤状態には復元しない。このた
め、単に凍結後解凍させたＢＣの、溶解性、分散性、沈
降度、及び粘度などの諸特性が凍結前の状態に復元する
ことは著しく困難であった。以上述べたような理由によ
って、ＢＣの諸特性を保持しながら凍結・解凍の為の満
足すべき方法はこれまでなかった。本発明者等は、ＢＣ
の水性懸濁液にＢＣと水以外の第３の成分を加えた後、
凍結することによって、従来の問題点を解決することが
できることを見出し、本発明を完成させた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、バクテ
リアセルロースを含有する水性懸濁液にバクテリアセル
ロースと水以外の第３成分を加えた後に凍結することを
特徴とする、バクテリアセルロースの凍結方法に係わ
る。更に本発明は、かかる凍結方法によって得られるバ
クテリアセルロース凍結物にも係わる。本発明方法に於
いて、第３成分として用いる親水性液体の例として、グ
リセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、乳酸、グルコ
ン酸及びデルタグルコノラクトン並びにそれら１つ以上
の混合物を挙げることができる。更に、第３成分として
用いることができる親水性固体には、水溶性低分子及び
水溶性高分子等の水溶性物質が含まれる。

【０００６】この中で水溶性低分子とは、例えば、糖類
（グルコース、フラクトース、ガラクトース、キシロー
ス、マンノース、アラビノース、シュクロース、ラクト
ース、セロビオース、パラチノース、マルトース、ゲン
チオビオース、トレハロース、ラムノース、オリゴ糖、
イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、フラクトオリゴ
糖、ガラクトオリゴ糖、ラクトスクロース、カップリン
グシュガー、液糖、サイクロデキストリン、、糖アルコ
ール、ソルビトール、エリスリトール、ラクチトール、
マルチトール、キシリトール、マンニット、ズルシッ
ト）、塩類（硫酸ナトリウム、硫安、食塩、塩化カルシ
ウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ロッセル
塩）、アミノ酸、アミノ酸塩、有機酸、有機酸塩、核
酸、核酸塩、アルキルケテンダイマー、スチレンーアク
リル系サイズ剤、オレフィンー無水マレイン酸系サイズ
剤、高級脂肪酸系サイズ剤、エポキシ化合物からなる耐
水性材料、蛍光増白剤、消泡剤、帯電防止剤、顔料、染
料、硫酸バンド、塩化アルミニウム、アルミン酸ソー
ダ、塩基性塩化アルミニウム、塩基性ポリ水酸化アルミ
ニウム、アルミナゾル、水溶性アルミニウム化合物、硫
酸第１鉄、塩化第２鉄、及びアルケニル無水コハク酸系
サイズ剤並びにそれら１つ以上の混合物をいう。

【０００７】また水溶性高分子とは、例えば、セルロー
ス誘導体（カルボキシメチルセルロース、メチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロー
ス）、ファイバロン、キサンタンガム、キシログルカ
ン、デキストリン、デキストラン、カラギーナン、エコ
ーガム、ローカストビーンガム、アルギン酸、アルギン
酸塩、プルラン、澱粉、かたくり粉、クズ粉、陽性澱
粉、燐酸化澱粉、コーンスターチ、アラビアガム、ロー
カストビーンガム、グアガム、ゲランガム、ポリデキス
トロース、ペクチン、キチン、水溶性キチン、キトサ
ン、カゼイン、アルブミン、大豆蛋白溶解物、ペプト
ン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ
アクリル酸ソーダ、ポリビニルピロリドン、ポリリン酸
ナトリウム、ポリ酢酸ビニル、ポリアミノ酸、ポリ乳
酸、ポリリンゴ酸、ポリグリセリン、ラテックス、ロジ
ン系サイズ剤、石油樹脂系サイズ剤、尿素樹脂、メラミ
ン樹脂、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ポリアミド・
ポリアミン樹脂、ポリエチレンイミン、ポリアミン、植
物ガム、ポリエチレンオキサイド、親水性架橋ポリマ
ー、ポリアクリル酸塩、でんぷんポリアクリル酸共重合
体、タマリンドガム、ジェランガム、ペクチン、グァー
ガム及びコロイダルシリカ並びにそれら１つ以上の混合
物をいう。この中でも、キサンタンガム及びカルボキシ
メチルセルロースが好ましい。

【０００８】以上述べた第３成分は、本発明の凍結物の
使用目的により、当該業者によって選択されるものであ
る。固体成分、低分子可溶成分、高分子成分などを組み
合わせて用いることもある。例えば、食品分野で増粘剤
として用いる場合には、キシログルカン、食塩、シュク
ロースなどを、例えば、１００：５：２０の比率で、組
み合わせて用いる場合がある。特に、食品に用いる場合
に無味、無臭、無色、無害のものが求められる場合に
は、第３成分としては、可食性可溶性の高分子が望まし
い。これら第３成分の添加量は、当業者であれば物質の
種類等に応じて適宜選択することができ、通常ＢＣの重
量に対して２〜１，０００重量％である。更に、第３成
分が含まれるバクテリアセルロース水性懸濁液の例とし
て、セルロース生産菌の培養液そのもの又はそれに上記
第３成分が含有されたものを使用することもできる。

【０００９】本発明方法に於ける凍結方法としては、従
来公知のものであれば良く、例えば、約０℃以下の雰囲
気中で放置する等を挙げることができる。凍結速度は一
般に早い方が好ましいが、当業者が諸条件を考慮して適
宜設定することができる。凍結温度も目的等に応じて適
当に選ぶことができるが、一般に、約０℃以下の範囲で
ある。本発明方法で具体的に用いる凍結装置の例として
は、冷凍庫のようなものがある。

【００１０】本発明方法に於いてセルロース性物質は離
解処理を受けたものであることが好ましい。バクテリア
セルロースの離解現象は、機械的外力等によってセルロ
ース内部に発生した応力が、これを変形・破壊すること
による現象と考えられる。従って、バクテリアセルロー
スの離解処理は、バクテリアセルロースに機械的外力を
与えることにより行なえる。更に酸加水分解、酵素を用
いた加水分解及び漂白剤によっても離解処理を行なうこ
とができる。ここでいう機械的外力とは、例えば、引っ
張り、曲げ、圧縮、ねじり、衝撃及び剪断等の応力が挙
げられるが、一般的には圧縮、衝撃及び剪断応力が主体
である。実際にこれら機械的外力をバクテリアセルロー
スに与える場合は、例えば、ミキサー、ポリトロン又は
超音波発振機等を使用することで達成できる。

【００１１】ミキサーによる離解処理においては、機械
的外力は攪拌羽根とバクテリアセルロースが衝突するこ
とによる衝撃力と、媒体の速度差によるズレ現象によっ
て発生する剪断力が主体となる。ポリトロンによる離解
処理においては、機械的外力はバクテリアセルロースが
外歯と内歯に挟まることによる圧縮力、高速に回転する
歯とバクテリアセルロースが衝突することによる衝撃
力、静止している外歯と高速に回転する内歯の隙間に存
在する媒体に発生する剪断応力が主体となる。超音波粉
砕機による離解においては、機械的外力は超音波発振部
の発振により媒体中にキャビテーション（空洞現象）が
連続的に発生し、局部的に生じる著しい剪断応力が主体
となる。本発明の離解処理は、バクテリアセルロースに
一定の負荷（機械的外力）を与えることができれば、上
記具体例以外のいかなる方法でも行ない得る。その他の
離解処理条件は当業者が適宜選択することが出来る。

【００１２】以上、離解処理について説明したが、本発
明でいう離解処理が、セルロース生産菌の攪拌培養後、
培養液から分離・精製されたバクテリアセルロースに対
して行なう、独立した二次的な操作のみに限定されない
ことは、当業者には自明のことである。即ち、攪拌操作
にはバクテリアセルロースを離解する作用があり、攪拌
培養においては、培養を目的とした攪拌作用によっても
バクテリアセルロースを離解処理することが十分に可能
であるからである。更に、攪拌培養により得たバクテリ
アセルロースを分離、洗浄、精製及び輸送する操作にお
いても同様のことが言え、これらの操作において付加的
に離解処理を行なうことも本発明の離解処理に包含され
ることに留意されたい。

【００１３】本発明でいう攪拌培養とは、培養液を攪拌
しながら行なう培養法であり、当該攪拌培養中に受ける
攪拌作用によって、バクテリアセルロースの構造が、例
えば、結晶化指数が低下して非晶部が増すように変化す
る。攪拌手段としては、例えばインペラー、エアーリフ
ト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、及びこれら手
段の組合せ等を使用することができる。培養操作法とし
ては、いわゆる回分発酵法、流加回分発酵法、反復回分
発酵法及び連続発酵法等がある。更に、本出願人名義の
特願平６−１９２２８７号に記載された培養装置と分離
装置の間で菌体を含む培養液を循環させるセルロース性
物質の製造方法であって、該分離装置に於いて、生産物
であるセルロース性物質を菌体及び培養液から分離する
ことを特徴とする前記方法や、同じく、本出願人名義の
特願平６−１９２２８８号に記載されたセルロース生産
菌を培養してセルロース性物質を製造する方法であっ
て、培養期間中、培養系からの培養液の引き抜き及び該
引き抜き量とほぼ等容量の新たな培養液の供給を連続的
に行なうことによって、培養中の培養液に於けるセルロ
ース性物質の濃度を低く維持することを特徴とする前記
製造方法がある。

【００１４】前記攪拌培養を行なうための槽としては、
例えば、ジャーファーメンター及びタンク等の攪拌槽、
並びにバッフル付きフラスコ、坂口フラスコ及びエアー
リフト型の攪拌槽が使用可能であるがこの限りではな
い。本発明でいう攪拌培養においては、攪拌と同時に、
必要に応じて、通気を行なっても良い。ここでいう通気
とは、例えば空気等の酸素を含有するガス、並びに例え
ばアルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれ
を通気しても良く、これらガスは培養系の条件に合わせ
て当業者により適宜、選択されよう。例えば、嫌気性の
微生物の場合は、不活性ガスを通気をすれば、その気泡
によって培養液を攪拌することができる。好気性の微生
物の場合には、酸素を含有するガスを通気することで微
生物の成育に必要な酸素を供給すると同時に、培養液を
攪拌することができる。

【００１５】尚、本発明で用いるＢＣを生産するセルロ
ース生産菌は、例えば、ＢＰＲ２００１株に代表される
アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュ
クロファーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp. s
ucrofermentans）、アセトバクター・キシリナム（Acet
obacter xylinum ）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクタ
ー・キシリナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・
パスツリアヌス（A. pasteurianus ）ＡＴＣＣ１０２４
５、アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、
アセトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びア
セトバクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸
菌（アセトバクター属）、その他に、アグロバクテリウ
ム属、リゾビウム属、サルシナ属、シュードモナス属、
アクロモバクター属、アルカリゲネス属、アエロバクタ
ー属、アゾトバクター属及びズーグレア属並びにそれら
をＮＴＧ（ニトロソグアニジン）等を用いる公知の方法
によって変異処理することにより創製される各種変異株
である。尚、ＢＰＲ２００１株は、平成５年２月２４日
に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微
生物寄託センターに寄託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１３４６６）、その後１９９４年２月７日付で特許手続
上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく
寄託（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４５）に移管され
ている。

【００１６】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. l, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。上述の方法によって創製されるセルロー
ス生産菌の中でも、通気攪拌培養することによって、ポ
リスチレン換算の重量平均重合度が１．６×１０⁴ 以
上、好ましくは１．７×１０⁴ 以上である高重合度のバ
クテリアセルロースを製造するか、又は、静置培養する
ことによって、ポリスチレン換算の重量平均重合度が
２．０×１０⁴ 以上である高重合度のバクテリアセルロ
ースを製造する菌株が好ましい。本発明で使用し得る高
重合度のバクテリアセルロースの生産菌のうち、ＢＰＲ
３００１Ａは、平成７年６月１２日付で通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター
に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８２を付さ
れている。一般的に、高分子材料の強度や弾性率は、高
分子の重合度が高いほど、高いものとなることが知られ
ている。バクテリアセルロースの場合にも同様で、高重
合度のバクテリアセルロースを原料として得られた各種
製品は、相対的に低い重合度のバクテリアセルロースを
原料として得られたものと比較して、その強度や弾性率
が高い。従って、高強度や弾性率のものを製造したい場
合には、先に述べたような高重合度のバクテリアセルロ
ースを用いた方が高い効果が得られる。

【００１７】本発明におけるＢＣ等の各種セルロースの
重量平均重合度は、検出器としてＲＩを内蔵したＧＰＣ
システム（Tosoh ＨＬＣ−８０２０）を用いて以下のよ
うにして測定する。各種セルロース試料を発煙硝酸−五
酸化リン溶液で W.J. Alexander, R.L. Mitchell, Anal
ytical chemistry 21, 12, 1497-1500 (1949) の方法に
よりニトロ化する。コントロールとして同時にニトロ化
したコットンリンターを用いる。セルロースニトロ化物
はＴＨＦ（和光純薬 １級）に０．０５％濃度で溶かし
たのち、１．０μｍポアサイズのフィルターで濾過す
る。ＧＰＣの溶離液にもＴＨＦを用いる。流速は０．５
ml／min 、圧力は１０〜１３kg f／cm² 、サンプル注入
量は１００μl とする。カラムはＴＳＫｇｅｌ ＧＭＨ
−ＨＲ（Ｓ）（７．５ＩＤ×３００mm×２本）とガード
カラム（ＨＨＲ（Ｓ））(Tosoh Co., Ltd.) を用い３５
℃で測定する。分子量算出のためにスタンダードポリス
チレン(Tosoh) を用いポリスチレン換算の相対分子量を
求める。２×１０⁷ から２６３０の分子量のポリスチレ
ンを用い、溶出時間（ｔ）と分子量の対数（ｌｏｇＭ）
について、３次式：（ｌｏｇＭ＝Ａｔ³ ＋Ｂｔ² ＋Ｃｔ
＋Ｄ）による近似を行いスタンダード曲線を作製する。
分子量はTosoh のデータ処理専用機（ＳＣ−８０２０）
に内蔵されたプログラムにより重量平均分子量を計算す
る。これらの分子量の値からニトロ化後の置換度を考慮
して重量平均重合度を計算する。

【００１８】本発明の攪拌培養に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリ
コール、エタノール等を単独或いは併用して使用するこ
とができる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解
物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、
サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロ
ースに加えて使用することもできる。 また、窒素源と
しては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或
いは無機の窒素源を使用することができ、或いは Bacto
-Peptone、 Bacto-Soytone、 Yeast-Extract、豆濃など
の含窒素天然栄養源を使用してもよい。有機微量栄養素
としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、２，７，９
−トリカルボキシ−１Ｈピロロ〔２，３，５〕−キノリ
ン−４，５−ジオン、亜硫酸パルプ廃液、リグニンスル
ホン酸等を添加してもよい。

【００１９】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、イノシトール、フィチン酸、ピロロキノ
リンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公報；高
井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２
４４頁）、カルボン酸又はその塩（特願平５−１９１４
６７号）、インベルターゼ（特願平５−３３１４９１
号）及びメチオニン（特願平５−３３５７６４号）等の
セルロース生成促進因子を適宜培地中に添加することも
できる。例えば、酢酸菌を生産菌として用いる場合に
は、培養のｐＨは３ないし７に、好ましくは５付近に制
御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２５〜３
５℃の範囲で行う。培養装置に供給する酸素濃度は１〜
１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良い。これ
ら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する菌体の接
種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得るもので
ある。

【００２０】本発明のバクテリアセルロースは、例えば
次の方法で製造することができる。通気攪拌培養により
得たバクテリアセルロースを遠心分離法又は濾過法等に
より培養液から分離する。本発明の方法によって製造さ
れるバクテリアセルロースは菌体はそのまま回収しても
よく、さらに本物質中に含まれる菌体を含むセルロース
性物質以外の不純物を取り除く処理を施すことが出来
る。不純物を取り除くためには、水洗、加圧脱水、希酸
洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素
などの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵
素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸
などの界面活性剤による処理、常温から２００℃の範囲
の加熱洗浄などを単独及び併用して行い、セルロース性
物質から不純物をほぼ完全に除去することができる。こ
のようにして得られた本発明でいうセルロース性物質と
は、セルロース及び、セルロースを主鎖としたヘテロ多
糖を含むもの及びβ−１，３、β−１，２等のグルカン
を含むものである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外
の構成成分はマンノース、フラクトース、ガラクトー
ス、キシロース、アラビノース、ラムノース、グルクロ
ン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等である。なおこれ
等の多糖が単一物質である場合もあるし２種以上の多糖
が水素結合等により混在してもよい。

【００２１】尚、本発明方法で得られるバクテリアセル
ロース凍結物は、流水等により解凍させた後、攪拌混合
することで元の離解物などの湿潤状態に復元することが
できる。本発明方法で得られるバクテリアセルロースの
凍結物を解凍して、元の離解物の状態に復元した場合に
は、ＢＣを構成するセルロース微細繊維は、相互に強固
に結着していない状態になる。先に述べたように、ＢＣ
は、非常に微細なセルロース微細繊維からなる。本発明
に述べられているように、元の離解物の状態に復元した
場合には、このような微細繊維の表面、あるいは、微細
繊維で構成される網目状構造の空隙に大量（セルロース
微細繊維の重量の数倍〜数１００倍）の液体成分を含ん
だ状態になる。このように大量の液体成分を含んだ状態
になるために、分散性、沈降性、液体の粘度などの点で
良好のものがえられる。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明をより
詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでは
ない。尚、各実施例に於いて、諸特性値は以下のように
測定した。懸濁液の沈降度 沈降度の測定方法は、バクテリアセルロース（ＢＣ）濃
度０．２％の懸濁液１０mlをFalcon製の１５mlのチュー
ブにいれたものを３０００回転で１５分間遠心分離した
後に沈降部分の体積の全体に対する比率で表した。沈降
度の値が大きいほど沈降しにくく、分散していることに
なる。また、沈降度復元率として（乾燥後復水後の離解
物の沈降度／乾燥前の離解物の沈降度）の値を用いた。粘度 本発明での粘度とは、ＢＣ含量０．１％の水性懸濁液を
動的液体粘弾性測定法により測定したときの、３０℃に
おける角速度１０rad/sec での動的粘性率（以下、単に
粘度という）をいう。より具体的には、動的液体粘度測
定装置（Rheometrics 社製の「FLUIDS SPECTROMETER RF
S II」を使用し、直径５cmの平行回転円盤の間に濃度
０．１％のＢＣ離解物の水性懸濁液を２mlはさんで、温
度３０℃で角速度１０rad/sec ひずみ１０％において測
定された粘度である。

【００２３】

【実施例】 実施例１バクテリアセルロースの製造及び離解処理 （１） シード菌液の調製（菌体の増殖） セルロース生産菌をフラスコ培養法によって菌体を増殖
させた。フラクトース４０ｇ／Ｌ、リン酸−カリウム
１．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌ、硫酸ア
ンモニウム３ｇ／Ｌ、バクト−ペプトン５ｇ／Ｌ、乳酸
１．４ml／Ｌ、初発ｐＨ５．０の組成の基本培地１００
mlを張り込んだ７５０ml容Ｒｏｕｘフラスコに、ＢＰＲ
２００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４５）の凍結保存菌
液１mlを植菌し、定温培養器内で２８℃で３日間静置培
養を行なった。このシード培養後、前記Ｒｏｕｘフラス
コをよく振盪した後、無菌条件下で内容物をガーゼ濾過
し、シード菌液を得た。

【００２４】（２） 攪拌培養によるバクテリアセルロ
ースの製造 上記シード菌液６０mlを滅菌済みの後述する攪拌培養用
の培地５４０mlを張り込んだ小型ジャーファーメンター
（全容量１０００ml）に無菌的に植菌し、３０℃で２０
時間又は３０時間、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ Ｈ
₂ ＳＯ₄ で５．０にコントロールしながら、また、攪拌
回転数を初発４００rpm で、溶存酸素量（ＤＯ）が３．
０〜２１．０％内に入るように回転数を自動制御しなが
らジャーファーメンターで攪拌培養を行なった。攪拌培
養には、以下の組成の培地を用いた。 フラクトース ４０ｇ／Ｌ、 ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ／Ｌ、 ＭｇＳＯ₄ ０．３ｇ／Ｌ、 （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ３ｇ／Ｌ、 Bacto-Soytone (Difco社製） ５ｇ／Ｌ 及び 豆濃（大豆蛋白質の酸加水分解濃縮液） ５ｇ／Ｌ 初発ｐＨ ５．０ 培養終了後、ジャーファーメンター内の固形物を集積
し、水洗して培地成分を除去した後、１％ＮａＯＨ水溶
液中で１１０℃、２０分間処理して菌体を除去した。さ
らに、洗浄液が中性付近になるまで生成セルロースを水
洗してバクテリアセルロースを得た。

【００２５】（３） カルボキシメチルセルロースを添
加した攪拌培養 （２）に記載した攪拌培養において、培地成分として、
さらに、カルボキシメチルセルロースを５ｇ／ｌ添加し
て培養を行った。得られた培養物は、（２）で得られた
培養物よりも粘性の高いものであった。 （４） 静置培養によるバクテリアセルロース（比較
例）の製造 （２）に記載した組成の培地６００mlを３０mlずつ無菌
シャーレに分取し、３０℃の条件下に静置し、７日間静
置培養した。培養終了後、シャーレ表面に形成されたバ
クテリアセルロースを水洗し、培地成分を除去した。

【００２６】（５） バクテリアセルロースの離解処理 （２）の攪拌培養法により得られた洗浄バクテリアセル
ロースに水を加え、約０．２重量％の離解処理濃度（バ
クテリアセルロース乾燥重量／容量）の懸濁液を調製し
た。同様にして、（４）の静置培養により得られたバク
テリアセルロースに水を加え、約０．２重量％の離解処
理濃度（バクテリアセルロース乾燥重量／容量）の懸濁
液を調製した。次いで、これらの懸濁液を攪拌機（オー
スター社製ブレンダー）により２５℃で３分間離解し
た。攪拌機の回転数は最高レベルに設定した。この離解
処理により、攪拌培養からＢＣ離解物（Ａ）、静置培養
からＢＣ離解物（Ｂ）を得た。（２）および（３）の攪
拌培養終了後のバクテリアセルロースを含有するジャー
ファーメンター内の培養液に水を加え、バクテリアセル
ロースの含有量を０．２％に調製した。次いでこれを攪
拌機（オースター社製ブレンダー）を用いて２５℃で３
分間離解した。攪拌機の回転数は、最高レベルに設定し
た。この離解処理により、それぞれの培養液の希釈液か
ら、ＢＣ離解物（Ｃ）および（Ｄ）を調製した。なお、
上記におけるＢＣの濃度は、培養液から遠心分離で湿潤
状態の固形分を取りだした後に、この固形分の２０倍量
の０．２規定の水酸化ナトリウム溶液中で１００℃で１
時間浸漬することで、バクテリアセルロース以外の菌体
や培地成分を取り除いた後に、十分水洗乾燥して測定し
た乾燥重量から計算した。

【００２７】実施例２ 実施例１で調製した離解物（Ａ）に本発明における第３
成分として、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、
エコーガム、ファイバロン、デキストリン、及びポリリ
ン酸ナトリウムをＢＣの重量に対して５０％及び１００
％の量で加え、−２０℃まで約６０分かけて凍結した。
凍結状態で約１時間保持した後、室温雰囲気中に放置す
ることによって解凍して元の懸濁状態に戻した。凍結
前、及び解凍後の夫々の時点で上記の方法に従って、沈
降度を測定した。

【００２８】

【表１】

【００２９】第３成分を添加した場合(No.１〜 No.１
０）に、無添加の場合(No.１１）と比較して、沈降度復
元率が高くなることが示された。実施例１で調製した離
解物（Ｃ）及び（Ｄ）を離解物（Ａ）の代わりに用い
て、更に同様の試験を行った。その結果、離解物（Ａ）
と同様の効果が得られた。

【００３０】実施例３ 高重合度セルロース生産菌の静
置培養とセルロース（ＢＣ）の調製 ＢＰＲ３００１Ａをグリセロールストックより培地１０
０mlを仕込んだ７５０ml容のルーフラスコに１％濃度で
植菌し２８℃で３日間静置培養した。培養後ルーフラス
コをよく振り菌体をセルロース膜よりはがした後、菌液
３mlをＣＳＬ−Ｆｒｕ培地２７mlを入れたシャーレ（直
径９０mm）に植菌し、２８℃、１０日間培養した。培養
終了後、各菌のセルロース膜を流水で洗浄後、それぞれ
約５００mlの水中で８０℃、２０分間加熱した。加熱後
各セルロース膜をさらに流水で洗浄しその後、約５００
mlの０．１ＮのＮａＯＨ中で８０℃、２０分間加熱する
ことにより溶菌させた。溶菌後、各セルロース膜を約５
００mlの蒸留水中で８０℃、２０分間加熱することによ
り洗浄した。同様の洗浄を蒸留水を交換しつつ３〜５回
行うことにより精製ＢＣを得た。

【００３１】実施例４ 高重合度セルロース生産菌の通
気攪拌培養とセルロース（ＢＣ）の調製 ＢＰＲ３００１ＡをグリセロールストックよりＣＳＬ−
Ｆｒｕ培地１００mlを仕込んだ７５０ml容ルーフラスコ
に１％植菌し２８℃で３日間静置培養した。培養後ルー
フラスコをよく振って菌体をセルロース膜よりはがした
後、菌液１２．５mlを１１２．５mlの培地を含む５００
mlフラスコに植菌し、２８℃、１８０rpm 、３日間培養
した。培養物をブレンダーにより無菌的に離解し、その
６０mlを５４０mlのＣＳＬ−Ｆｒｕ培地を仕込んだ１１
ジャーに植菌し、ｐＨをＮＨ₃ ガスおよび１規定Ｈ₂ Ｓ
Ｏ₄ で４．９〜５．１に制御しながら、溶存酸素量（Ｄ
Ｏ）が３．０％以上になるように回転数を自動制御しな
がら、メイン培養を行った。終了後、得られた培養液を
酢酸緩衝液で約５倍に希釈した後、遠心分離し沈殿物を
回収した。沈殿を蒸留水で最初の培養液量の約８倍に希
釈後、８０℃、２０分間加熱し、加熱後遠心分離により
沈殿物を回収した。沈殿物を同じく８倍量の０．１Ｎ
ＮａＯＨに懸濁し８０℃、２０分間加熱することにより
溶菌し、溶菌後遠心分離により沈殿物を回収した。この
後、さらに８倍量の蒸留水に沈殿を懸濁し８０℃、２０
分間加熱し、加熱後遠心分離し沈殿物を回収することに
よりセルロースの洗浄を行った。同様の洗浄を３回行う
ことにより精製ＢＣを得た。

【００３２】尚、以上の実施例で用いたＣＳＬ−Ｆｒｕ
の組成は以下に示すとおりである。

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】 ビタミン混合液 化合物 ｍｇ／ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００３５】

【表４】塩類混合液 クエン酸鉄アンモニウム １．５ｇ／ｌ 塩化カルシウム １．５ｇ／ｌ モリブデン酸アンモニウム ０．１ｇ／ｌ 硫酸亜鉛７水塩 ０．２ｇ／ｌ 硫酸マンガン４水塩 ０．１ｇ／ｌ 硫酸銅５水塩 ２ｍｇ／ｌ

【００３６】実施例５ 実施例３及び４で得られた精製ＢＣを実施例１記載の離
解物（Ａ）の場合と同様に離解することによって離解物
を得た。これを夫々、離解物（Ｅ）及び（Ｆ）と称す。
この離解物（Ｅ）及び（Ｆ）を用いて、実施例２の表１
に述べたのと同様の試験を行った結果、離解物（Ａ）と
同様に表１のような結果を得た。 実施例６ 離解物（Ａ）、離解物（Ｂ）、離解物（Ｅ）及び離解物
（Ｆ）を８０℃で１２時間減圧乾燥することにより分子
量分析用の試料を調製した。これらの試料についてすで
に記載した方法に従って、ニトロ化後に、重量平均分子
量を測定し、重量平均重合度を計算した。その結果、重
量平均重合度は、ポリスチレン換算で夫々、１０，６０
０、１４，９００、２２，５００および１７，４００で
あった。

【００３７】

【効果】本発明の凍結方法により得られたバクテリアセ
ルロース凍結物は、それを解凍させた後にも、約６０〜
１００％の沈降度復元率を示し、本発明方法の凍結過程
によってはバクテリアセルロース繊維の物理的形態が実
質的に損なわれないことが判った。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バクテリアセルロースを含有する水性懸
   濁液にバクテリアセルロースと水以外の第３成分を加え
   た後に凍結することを特徴とする、バクテリアセルロー
   スの凍結方法。
2. 【請求項２】 バクテリアセルロースが離解処理を受け
   たものである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 バクテリアセルロースが攪拌培養で得ら
   れたバクテリアセルロースである請求項１又は２記載の
   方法。
4. 【請求項４】 離解処理の方法が機械的剪断力、超音
   波、高圧処理、酸加水分解、酵素を用いた加水分解若し
   くは漂白剤を用いる方法又はそれらの組合せである請求
   項２記載の方法。
5. 【請求項５】 第３成分が親水性液体である請求項１な
   いし４のいずれか一項に記載の方法。
6. 【請求項６】 第３成分が親水性固体である請求項１な
   いし４のいずれか一項に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１ないし６のいずれか一項に記載
   の方法によりバクテリアセルロースを凍結させた後、水
   を加え分散液とし、該分散液を攪拌混合し、更に必要に
   応じて、該攪拌混合の前又は後に熱処理することから成
   るバクテリアセルロース凍結物の復元方法。