JPH09169795A - イヌ免疫グロブリンｅペプチド断片、それをコードするｄｎａ、そのｄｎａを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体及び抗イヌ免疫グロブリンｅ抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 イヌのアレルギーの診断に利用できる抗イヌ
免疫グロブリンＥ抗体の製造に好適なイヌ免疫グロブリ
ンＥペプチド断片、イヌ免疫グロブリンＥペプチド断片
の製造に有用なＤＮＡ、組換えベクター及び形質転換体
並びにイヌのアレルギーの診断に有用な抗イヌ免疫グロ
ブリンＥ抗体の製造法を提供する。 【解決手段】 配列番号１で示されるペプチドの中の連
続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むイヌ免疫グ
ロブリンＥペプチド断片、このペプチド断片をコードす
るＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤＮＡ、このＤＮＡを
含む組換えベクター、この組換えベクターを含む形質転
換体及び前記ペプチド断片を抗原として使用することを
特徴とする、抗イヌ免疫グロブリンＥ抗体の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はイヌ免疫グロブリン
Ｅペプチド断片、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡ
を含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質
転換体及び抗イヌ免疫グロブリンＥ抗体の製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】イヌ等のペットにおいて、種々のアレル
ゲンに対するアレルギーの診断が広く行われるようにな
ってきた。現在のところ、アレルギーの診断の方法とし
ては皮内試験が広く行われている。しかしながら、この
試験方法は、判定にあたって長年の経験が必要であり、
また、試験の際にペットの刈毛が必要となる点で問題が
ある。近年、アレルギーの診断の方法として、特定のア
レルゲンに対する免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の濃度又
は総ＩｇＥの濃度を測定する方法が開発され、アレルゲ
ン特異的イヌＩｇＥを測定する酵素免疫測定法やイヌＩ
ｇＥの精製と酵素免疫測定法によるその測定が報告され
ている（ペングら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベ
テリナリー・リサーチ、54巻、2号、239〜243頁(1993
年)）(Peng et al., Am. J. Vet. Res., Vol.54, No.2
p.239-243(1993))（クレインベックら、アメリカン・ジ
ャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ、50巻、11
号、1831〜1839頁(1989年)）(Kleinbeck et al., Am.
J. Vet. Res., Vol.50, No.11 p.1831-1839(1989))。

【０００３】酵素免疫測定法ではイヌＩｇＥに対する抗
血清や抗体が必要とされる。しかしながら、イヌの血液
から取得できるイヌＩｇＥの量は極めて少なく、それゆ
え、抗イヌＩｇＥ抗体の作製は困難であった。また、イ
ヌＩｇＥのペプチド断片やそのペプチド断片を抗原とし
た抗体の作製については報告されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
は、イヌのアレルギーの診断に利用できる抗イヌ免疫グ
ロブリンＥ抗体の製造に好適なイヌ免疫グロブリンＥペ
プチド断片を提供するものである。請求項２記載の発明
は、請求項１記載の発明の効果に加え、抗原性が高いイ
ヌ免疫グロブリンＥペプチド断片を提供するものであ
る。請求項３記載の発明は、イヌ免疫グロブリンＥペプ
チド断片の製造に有用なＤＮＡを提供するものである。
請求項４記載の発明は、請求項３記載の発明の効果に加
え、抗原性が高いイヌ免疫グロブリンＥペプチド断片の
製造に好適なＤＮＡを提供するものである。請求項５記
載の発明は、イヌ免疫グロブリンＥペプチド断片の製造
に有用な組換えベクターを提供するものである。

【０００５】請求項６記載の発明は、請求項５記載の発
明の効果に加え、抗原性が高いイヌ免疫グロブリンＥペ
プチド断片の製造に好適な組換えベクターを提供するも
のである。請求項７記載の発明は、イヌ免疫グロブリン
Ｅペプチド断片の製造に有用な形質転換体を提供するも
のである。請求項８記載の発明は、請求項７記載の発明
の効果に加え、抗原性が高いイヌ免疫グロブリンＥペプ
チド断片の製造に好適な形質転換体を提供するものであ
る。請求項９記載の発明は、イヌのアレルギーの診断に
有用な抗イヌ免疫グロブリンＥ抗体の製造法を提供する
ものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１で
示されるペプチドのアミノ酸配列の中から選択される連
続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むイヌ免疫グ
ロブリンＥペプチド断片に関する。また、本発明は、配
列番号１〜１０のいずれかのアミノ酸配列で示されるペ
プチドである、上記ペプチド断片にも関する。また、本
発明は、上記のいずれかのペプチド断片をコードするＤ
ＮＡ若しくはそれに相補的なＤＮＡにも関する。また、
本発明は、配列番号１１〜２０のいずれかの塩基配列で
示されるＤＮＡである、上記ＤＮＡにも関する。また、
本発明は、上記のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクタ
ーにも関する。

【０００７】また、本発明は、プラスミドｐＤＥ３４ｅ
ｘである上記組換えベクターにも関する。また、本発明
は、上記のいずれかの組換えベクターを含む形質転換体
にも関する。また、本発明は、ＦＥＲＭ Ｐ−１５３３
９として寄託されている上記形質転換体にも関する。ま
た、本発明は、上記のいずれかのペプチド断片を抗原と
して使用することを特徴とする、抗イヌ免疫グロブリン
Ｅ抗体の製造法にも関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
なお、配列表において、アミノ酸配列は、アミノ基末端
のアミノ酸を１番とし、塩基配列は、５′末端の塩基を
１番としている。 １．イヌ免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）ペプチド断片 本発明のイヌＩｇＥペプチド断片は、ペプチドが抗原性
を有する最小の大きさの観点から、配列番号１で示され
るペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配
列を有するペプチド（以下、ペプチドＡという）からな
るものである。アミノ酸配列が長いほうが高感度の抗原
抗体反応を期待することができることから、ペプチドＡ
としては、好ましくは１４個以上、より好ましくは２０
個以上のアミノ酸配列からなるものがよい。

【０００９】また、イヌＩｇＥとしての抗原性を保って
いる限り、ペプチドＡは、配列番号１のペプチドからア
ミノ酸（例えば１〜１１９個）が欠落しているものであ
ってもよい。欠落するアミノ酸の個数が多すぎると、ペ
プチドＡのイヌＩｇＥとしての抗原性が損なわれる傾向
がある。欠落するアミノ酸の個数が多い場合（例えば５
個以上）、イヌＩｇＥとしての抗原性が低下しやすいの
で、この低下をできるだけ小さくするためには、配列番
号１のペプチドから欠落するアミノ酸は連続しているも
の（例えば５個以上）であることが好ましい。

【００１０】また、イヌＩｇＥとしての抗原性を保って
いる限り、ペプチドＡは、配列番号１のペプチドの中の
アミノ酸（例えば１〜１１９個）が他のアミノ酸で置換
されているものであってもよいし、あるいは、配列番号
１のペプチドの中にアミノ酸（例えば１〜１１９個）が
挿入されているものであってもよい。置換又は挿入され
るアミノ酸の個数が多い場合（例えば５個以上）、イヌ
ＩｇＥとしての抗原性が低下しやすいので、この低下を
できるだけ小さくするためには、配列番号１のペプチド
の中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続してい
るもの（例えば５個以上）であることが好ましい。置換
されるアミノ酸は類似の性質を有するものであることが
好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換が挙げら
れる。

【００１１】また、イヌＩｇＥとしての抗原性を保って
いる限り、ペプチドＡは、配列番号１で示されるペプチ
ドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列に、直
接又は介在アミノ酸配列を介して、アミノ酸若しくは他
のペプチドが結合したペプチドであってもよい。結合す
る他のペプチドに含まれるアミノ酸の個数が多すぎる場
合（例えば１，０００個以上）、イヌＩｇＥとしての抗
原性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さく
するためには、結合する他のペプチドは１，０００個未
満のアミノ酸配列からなるものであることが好ましく、
５００個以下のアミノ酸配列からなるものであることが
より好ましく、２００個以下のアミノ酸配列からなるも
のであることがさらに好ましい。このようなアミノ酸若
しくは他のペプチドとしては、例えば、ロイシン、ロイ
シン−メチオニン、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられ
る。介在アミノ酸配列は特に限定されるものではない
が、例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニンのアミノ
酸配列等が挙げられる。

【００１２】ペプチドＡの具体例としては、例えば、配
列番号１〜１０のペプチドが挙げられる。配列番号１の
ペプチドは、イヌＩｇＥペプチドのＣε３ドメインから
Ｃε４ドメインまでのアミノ酸配列のうち、Ｃε３ドメ
インのアミノ酸配列の中でヒト、マウス、ラット及びヒ
ツジにおいて保存されている配列番号２６のアミノ酸配
列から、Ｃε４ドメインのアミノ酸配列の中でヒト、マ
ウス、ラット及びヒツジにおいて保存されている配列番
号２７のアミノ酸配列までの１２４個のアミノ酸配列か
らなるペプチドであり、抗原性を有する。配列番号２の
ペプチドは、配列番号１のペプチドの１１〜３０番目ま
での２０個のアミノ酸配列からなるペプチドであり、抗
原性を有する。配列番号３のペプチドは、配列番号１の
ペプチドの２１〜４０番目までの２０個のアミノ酸配列
からなるペプチドであり、抗原性を有する。

【００１３】配列番号４のペプチドは、配列番号１のペ
プチドの３１〜５０番目までの２０個のアミノ酸配列か
らなるペプチドであり、抗原性を有する。配列番号５の
ペプチドは、配列番号１のペプチドの４１〜６０番目ま
での２０個のアミノ酸配列からなるペプチドであり、抗
原性を有する。配列番号６のペプチドは、配列番号１の
ペプチドの６１〜８０番目までの２０個のアミノ酸配列
からなるペプチドであり、抗原性を有する。配列番号７
のペプチドは、配列番号１のペプチドの７１〜９０番目
までの２０個のアミノ酸配列からなるペプチドであり、
抗原性を有する。配列番号８のペプチドは、配列番号１
のペプチドの８１〜１００番目までの２０個のアミノ酸
配列からなるペプチドであり、抗原性を有する。配列番
号９のペプチドは、配列番号１のペプチドの９１〜１１
０番目までの２０個のアミノ酸配列からなるペプチドで
あり、抗原性を有する。配列番号１０のペプチドは、配
列番号１のペプチドの１１１〜１２４番目までの１４個
のアミノ酸配列からなるペプチドであり、抗原性を有す
る。

【００１４】２．イヌＩｇＥペプチド断片の製造法 本発明のイヌＩｇＥペプチド断片を製造する方法として
は、化学合成法や遺伝子組換え法がある。化学合成法と
しては、例えば、マップ（Multiple Antigen Peptide、
ＭＡＰ）法があり、３０個以下のアミノ酸配列からなる
ペプチドの合成に適しており、市販のペプチド合成機を
使用して合成することができる。ペプチドはマップ法に
より繰り返す形で合成することができる。遺伝子組換え
法としては、例えば、本発明のイヌＩｇＥペプチド断片
をコードするＤＮＡをベクターに挿入して組換えベクタ
ーを構築し、それを宿主に挿入して形質転換体を作製
し、その形質転換体から目的のペプチドを精製する方法
がある。

【００１５】本発明のイヌＩｇＥペプチド断片をコード
するＤＮＡについては後述する。ベクターとしては、例
えば、プラスミドやファージ等がある。宿主としては、
例えば、大腸菌、枯草菌、酵母等がある。以下、形質転
換体の作製法と、その形質転換体を用いた目的のペプチ
ドの精製法について詳しく説明する。

【００１６】本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、
イヌＩｇＥペプチド断片をコードするＤＮＡ（後述）を
常法で既存のプラスミドベクターやファージベクター等
に挿入して作製することができる。その際、必要に応
じ、リンカーを使用する。挿入されたＤＮＡを発現させ
る場合は、ＤＮＡの挿入箇所はプロモーター領域の下流
であることが必要とされる。既存のプラスミドベクター
としては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＣＲＩＩ等を使用することができる。ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＲＩＩは市販されて
いる。また、ファージベクターとしてはλgt11ファー
ジ、λgt10ファージ等が利用できる。いずれも、用いた
親ベクターに対応する組換えベクターが得られる。本発
明のＤＮＡを含む組換えベクターとしては、後述するよ
うにｐＤＥ３４ｅｘ等が挙げられる。

【００１７】得られた組換えベクターを宿主に入れ、形
質転換体を作製する。大腸菌由来のプラスミドやλファ
ージを使用する場合は宿主としては大腸菌を使用するこ
とができ、例えば、大腸菌ＨＢ１０１株を使用すること
ができる。宿主は、通常、コンピテントセルとなるよう
に処理されて使用される。大腸菌ＨＢ１０１株を処理し
て得たコンピテントセルは宝酒造(株)等から販売されて
いる。大腸菌を使用して形質転換体を作製する方法とし
ては、例えば、対数増殖期前半の大腸菌を、氷冷下、２
０ｍＭ程度の塩化カルシウム溶液で洗浄し、大腸菌を２
０ｍＭ程度の塩化カルシウム溶液に懸濁し、これに組換
えベクターを添加し、４２℃、１〜２分間保温する方法
を採用することができる。

【００１８】組換えベクターの作製及び形質転換体の作
製は市販のキットを利用しても行うことができ、このよ
うなキットとしては、米国インビトロゲン社のＴＡ−ク
ローニングキットや米国キュアゲン（Qiagen）社のキュ
アゲン・プラスミド・キットがある。組換えベクターを
利用して形質転換体を作製する一般的手法は、「サムブ
ロック他編集、モレキュラー・クローニング 第２版
（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）(1
989年)」（J.Samblook et al., Molecular Cloning 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （198
9）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クローニン
グ″という）に記載されている。

【００１９】形質転換体を培養はする方法としては、例
えば、その形質転換体が成長しうる培地でイヌＩｇＥペ
プチド断片が形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で
培養器を振とうする方法を採用することができる。培地
としては、例えば、ＬＢ培地、ＴＢ培地、２×ＴＹ培地
等を使用することができる。培養温度は、例えば、宿主
として大腸菌を使用する場合、３５〜４２℃を採用する
ことができる。組換えベクターが抗生物質耐性遺伝子を
発現しうるものであれば、組換えベクターを保有しない
形質転換体の増殖を抑制する点から、培地にその抗生物
質を添加しておくことが好ましい。このような抗生物質
としては、例えば、アンピシリンがある。培養時間は、
宿主の種類、培養装置、培養温度、培養開始時における
培養液中の形質転換体の濃度等によって異なるが、ＬＢ
培地を用いて３７℃で振とう培養する場合、通常、一晩
である。ＬＢ培地、ＴＢ培地、２×ＴＹ培地等の調製方
法や培養方法の一般的手法は、文献″モレキュラー・ク
ローニング″に記載されている。

【００２０】培養した形質転換体を破砕する方法として
は、例えば、遠心分離で形質転換体を集め、これを緩衝
液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁液に物理的な衝
撃を与える方法を採用することができる。緩衝液として
は、例えば、ＴＥ緩衝液を使用することができる。上記
懸濁液に物理的な衝撃を与える方法としては、例えば、
上記懸濁液に超音波を照射する方法を使用することがで
きる。形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液に物理
的な衝撃を与える代わりに、例えば、上記懸濁液にリゾ
チームを加え、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含
むＴＥ緩衝液を加えて撹拌することよって形質転換体を
溶解させる方法を採用することもできる。

【００２１】形質転換体を破砕又は溶解した後、遠心分
離して細胞残渣を除去し、上清を取得する。なお、目的
のペプチドが、そのアミノ末端側にシグナルペプチドが
結合した融合タンパク質となっている（すなわち、目的
のペプチドを細胞外に分泌させることが可能である）場
合は、培養液を遠心分離して上清を取得する方法を使用
することができる。

【００２２】ペプチドの精製法としては、例えば、スト
レプトマイシン硫酸塩を添加する核酸の除去及び硫酸ア
ンモニウムを添加する蛋白質の取得の各工程を使用する
ことができる。ストレプトマイシン硫酸塩を添加して核
酸を除去する工程としては、例えば、上記のいずれかの
上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、しばらく撹
拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿物として
除去し、上清を取得する操作を使用することができる。
硫酸アンモニウムを添加して蛋白質を取得する工程とし
ては、例えば、この上清に硫酸アンモニウムを添加し、
撹拌し、遠心分離する操作を使用することができる。通
常、沈殿を取得するが、目的のペプチドが上清に含まれ
ていることもあり、サンプリングして、目的のペプチド
の有無を確認しておくことが好ましい。

【００２３】続いて、イヌＩｇＥペプチド断片を含む画
分を取得する工程を行う。この工程としては、例えば、
上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記上清
を液体クロマトグラフィーによって分画し、各画分に含
まれるペプチドについて、イヌＩｇＥで免疫された動物
から取得した抗血清又は抗イヌＩｇＥ抗体（後述）を用
い、ウェスタン・ブロット法を行い、イヌＩｇＥペプチ
ド断片を含む画分を同定する方法を使用することができ
る。細胞膜等の残渣の除去、ストレプトマイシン硫酸塩
を添加する核酸の除去、硫酸アンモニウムを添加する蛋
白質の取得及びウェスタン・ブロット法の具体的方法
は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる。なお、形質転換体に含有されているベクターが、
挿入されたＤＮＡにコードされているペプチドを他のペ
プチドとの融合タンパク質として産生できるものである
場合は、この「他のペプチド」の性質を利用することに
よってイヌＩｇＥペプチド断片を精製することができ
る。

【００２４】３．イヌＩｇＥペプチド断片をコードする
ＤＮＡ 本発明において、配列番号１〜１０のペプチドをコード
するＤＮＡとは、配列番号１〜１０のペプチドをトリプ
レット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通
りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従って
アミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ
群（この中には、それぞれ、配列番号１１〜２０のＤＮ
Ａも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。イヌ
ＩｇＥペプチド断片をコードするＤＮＡとは、ペプチド
ＡをコードするＤＮＡであり、このＤＮＡは、ペプチド
Ａのアミノ酸配列をトリプレット暗号表に従ってアミノ
酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群から
選ばれるＤＮＡのことである。ペプチドＡとしては、前
記イヌＩｇＥペプチド断片の項で説明したものが挙げら
れ、ペプチドＡをコードするＤＮＡも、これらのペプチ
ドのアミノ酸配列に対応したヌクレオチド配列のものが
挙げられる。

【００２５】ペプチドＡをコードするＤＮＡは、化学合
成法か遺伝子組換え法で作製することができる。化学合
成法としては、例えば、ホスホアミダイド法があり、全
長が１００塩基以下の塩基配列からなるＤＮＡの合成に
適しており、市販のＤＮＡ合成機で化学合成することが
できる。全長が１００塩基よりも長いＤＮＡを作製する
ためには、後述の遺伝子組換え法を利用することもでき
るが、次のようにしても作製することができる。即ち、
塩基配列を１００個未満の塩基に区切り、それぞれの塩
基配列からなるＤＮＡ断片を上記のように化学合成し、
これらのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを
用いてこれらのＤＮＡ断片を連結する。その際、相補鎖
のＤＮＡ断片も合成し、ＤＮＡ断片同士を対合させたと
きに突出末端が生じるようにすると、突出末端が粘着末
端の役割を果たし、目的のＤＮＡが得られやすい。

【００２６】遺伝子組換え法としては、例えば、後述す
るようにイヌの肝細胞からゲノムＤＮＡを取得し、他の
生物種のＩｇＥの遺伝子で保存されている塩基配列を元
にして作製したプライマーを利用してポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を行い、イヌＩｇＥ
をコードするゲノムＤＮＡ断片を取得し、このＤＮＡの
塩基配列を求め、そのＤＮＡからイントロン部分を除去
し、イヌＩｇＥをコードするＤＮＡ断片を取得する方法
が挙げられる。遺伝子組換え法は１００塩基以上の長い
ＤＮＡの作製も可能である。ＤＮＡの塩基配列は常法に
従って決定することができる。塩基配列の決定方法とし
ては、例えば、ジデオキシターミネーション法があり、
市販のキットを使用することができる。このようなキッ
トは米国ファルマシア社等から販売されている。

【００２７】次に、イヌの肝細胞からイヌＩｇＥをコー
ドするＤＮＡ断片を取得する方法について詳しく説明す
る。イヌの肝細胞の破砕は、例えば、液体窒素中で細胞
に物理的な衝撃を与え、続いて、破砕された細胞を溶解
緩衝液に懸濁し、保温し、細胞溶解液中にＤＮＡを遊離
させる方法を使用することができる。溶解緩衝液として
は、例えば、プロテイネースＫ（２０μg/ml）、エチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、１ｍＭ）、ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ、０．５％）及びＲＮａｓｅＡ（１
０μg/ml）を含有するトリス−塩酸（１０ｍＭ、pH７．
４）が挙げられる。次に、細胞溶解液からゲノムＤＮＡ
を分離する。この分離操作には、例えば、フェノール／
クロロホルム処理とエタノール沈殿処理等を利用するこ
とができる。細胞の破砕、フェノール／クロロホルム処
理、エタノール沈殿処理の一般的手法は文献″モレキュ
ラー・クローニング″に記載されている。

【００２８】ゲノムＤＮＡの取得後、イヌＩｇＥをコー
ドするゲノムＤＮＡ断片を取得する。この取得には、上
述したＰＣＲ法を使用することができる。そして、この
ＤＮＡの塩基配列を求め、エキソン部分とイントロン部
分を決定する。続いて、取得したゲノムＤＮＡ断片から
イントロン部分を除去し、イヌＩｇＥをコードするＤＮ
Ａ断片を取得する。ゲノムＤＮＡ断片からイントロン部
分を除去する方法としては、例えば、イントロン部分の
前後に位置する制限酵素部位を捜し、ゲノムＤＮＡ断片
をその制限酵素で消化し、イントロン部分を含有するＤ
ＮＡを除去し、残存ＤＮＡを連結する方法を使用するこ
とができる。その際に一部のエキソン部分も除去された
場合は、例えば、そのエキソン部分に相当するＤＮＡを
化学合成し、前記残存ＤＮＡと連結して修復する方法を
使用することができる。

【００２９】なお、取得したゲノムＤＮＡ断片が完全長
の遺伝子を含んでいない場合は、ゲノムウォーキングに
よって完全長の遺伝子を含むＤＮＡを取得することがで
きる。ゲノムウォーキングは市販のキットを利用するこ
ともできる。一旦、イヌＩｇＥをコードするＤＮＡ断片
が取得されると、遺伝子組換え法や前述したＰＣＲ法を
利用することによって、そのＤＮＡを複製させることが
できるので、イヌの肝細胞からイヌＩｇＥをコードする
ＤＮＡ断片を再度取得する操作は不要である。

【００３０】遺伝子組換え法を用いる方法は、例えば、
次のようにして行うことができる。まず、取得されたイ
ヌＩｇＥをコードするＤＮＡ断片を上述したように既存
のプラスミドベクターやファージベクター等に挿入して
組換えベクターを作製し、その組換えベクターを宿主に
入れて形質転換体を作製し、その形質転換体を培養す
る。この培養により形質転換体内で組換えベクターが増
幅されるので、その形質転換体から増幅された組換えベ
クターを取得し、制限酵素を用いてイヌＩｇＥをコード
するＤＮＡ断片を切り出す。形質転換体から増幅された
組換えベクターを取得する操作は、例えば、次のように
して行うことができる。組換えベクターがプラスミドで
ある場合、その形質転換体を破砕し、フェノール／クロ
ロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを取
得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用い、取得
したＤＮＡを超遠心分離し、組換えベクターをプラスミ
ドＤＮＡとして取得する。一方、組換えベクターがファ
ージである場合、その形質転換体を破砕し、ファージ粒
子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベクターを
ファージＤＮＡとして取得する。

【００３１】ＰＣＲ法を利用する方法としては、例え
ば、増幅させようとするＤＮＡの両末端の塩基配列を基
にして化学合成法によりプライマーＤＮＡを作製し、イ
ヌＩｇＥをコードするＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ
を行う方法を使用することができる。遺伝子組換え法や
ＰＣＲ法を用いてＤＮＡを複製させる方法の一般的手法
は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されてい
る。

【００３２】４．抗イヌＩｇＥ抗体の製造法 本発明に係る抗イヌＩｇＥ抗体は、例えば、本発明のイ
ヌＩｇＥペプチド断片を抗原として得られる抗血清及び
単離された抗イヌＩｇＥ抗体として得ることができる。
抗血清を製造する方法としては、例えば、本発明のイヌ
ＩｇＥペプチド断片を抗原としてウサギやマウス等の動
物を免疫し、その血清を取得する方法が使用できる。ま
た、抗イヌＩｇＥ抗体を単離製造する方法としては、例
えば、本発明のイヌＩｇＥペプチド断片を抗原としてウ
サギやマウスを免疫し、その脾臓細胞を骨髄腫細胞と融
合させてハイブリドーマを作製し、その中から前述した
イヌＩｇＥペプチド断片を認識するハイブリドーマを選
択し、これを培養し、その培養上清を取得する方法が使
用できる。抗原性を高めるため、必要に応じ、本発明の
イヌＩｇＥペプチド断片に適当なキャリアタンパク質を
結合させて免疫原としてもよい。

【００３３】免疫時に使用するアジュバントは種々のも
のが利用できるが、フロイントの完全アジュバント（Ｆ
ＣＡ）やフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）が
好ましい。骨髄腫細胞としては、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８．６５３（ＡＴＣＣ（American Type Culture Coll
ection） ＣＲＬ−１５８０）やＰ３／ＮＳＩ／１−Ａ
ｇ４−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）を使用することが
できる。

【００３４】抗原を免疫する動物としては、ウサギ、マ
ウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が使用
できるが、ここに例示された動物種に限定されるもので
はない。抗原として本発明のイヌＩｇＥペプチド断片を
使用すること以外は、動物を免疫して抗体を得る公知の
一般的手法に従い、抗イヌＩｇＥ抗体を製造することが
できる。抗体としてはポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体がある。抗血清及び単離された抗イヌＩｇＥ
抗体は、血中、体液、尿中などのイヌＩｇＥの濃度を測
定するのに使用でき、それによりイヌのアレルギーの診
断をすることができる。製造された抗血清や抗イヌＩｇ
Ｅ抗体は、各種酵素、コロイド等で修飾されてもよい。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ イヌ肝細胞のゲノムＤＮＡの取得 アレルギーを煩ったイヌの肝細胞を液体窒素中で破砕
し、破砕された細胞を溶解緩衝液（プロテイネースＫ
（２０μg/ml）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、
１ｍＭ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、０．５
％）及びＲＮａｓｅＡ（１０μg/ml）を含有するトリス
−塩酸（１０ｍＭ、pH７．４））に懸濁し、３７℃で保
温し、細胞溶解液を取得した。この細胞溶解液に、フェ
ノールとクロロホルムの等量混合液を添加して撹拌し、
遠心分離して水層を取得した。この水層にエタノールを
添加し、遠心分離し、ゲノムＤＮＡを沈殿として取得し
た。このゲノムＤＮＡを、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含むト
リス−塩酸（１０ｍＭ、pH７．４））緩衝液に溶解し
た。

【００３６】実施例２ ＰＣＲ法によるイヌ免疫グロブ
リンＥのゲノムＤＮＡの増幅及び塩基配列の解析 ＤＮＡ合成機（アプライド バイオシステムズ社製、商
品名：model 391 PCR-MATE EP DNA synthesizer）を用
い、配列番号２１の塩基配列を有するＤＮＡを合成し、
ＣＨ３Ｓと命名した。同様に、配列番号２２及び２３の
塩基配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、混合し、こ
れをＣＨ４Ｒと命名した。配列番号２１の塩基配列は、
ヒト、マウス、ラット及びヒツジのＣε３ドメインのア
ミノ酸配列の中で、これらの哺乳動物で保存されている
領域（８個のアミノ酸配列）に対応する塩基配列であ
り、配列番号２２及び２３の塩基配列は、ヒト、マウ
ス、ラット及びヒツジのＣε４ドメインのアミノ酸配列
の中で、これらの哺乳動物で保存されている領域（８個
のアミノ酸配列）に対応する塩基配列（２種類）に相補
的な塩基配列である。

【００３７】実施例１で取得したゲノムＤＮＡに、ＣＨ
３Ｓ １μｇ、ＣＨ４Ｒ １μｇ、タックポリメラーゼ
０．７５ユニット及びデオキシリボヌクレオチド類を
加え、５０μｌの液量でＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行
った。増幅操作としては、加熱（９４℃、１分）による
変性、冷却（５５℃、２分）によるアニーリング、及び
保温（７２℃、２分）によるポリメライゼーション、の
各工程のサイクルを３０回繰り返した。増幅操作後、反
応液を臭化エチジウム含有３％アガロース電気泳動にか
け、反応液中のＤＮＡを分子量の差で分離し、増幅され
たＤＮＡが含まれる画分を取得した。

【００３８】ＴＡ−クローニングキット（TA-Cloning K
it）（インビトロゲン社（アメリカ）商品名）を用い、
取得したＤＮＡをキットに同封されているプラスミドベ
クターｐＣＲＩＩと連結し、連結混合物を得た。大腸菌
（ＤＨ５α（ＢＲＬ社（アメリカ）商品名））を宿主と
し、この大腸菌の懸濁液と前記連結混合物を混合した。
この混合液を、アンピシリン（５０μg/ml）、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（３６μg/ml）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシド（４０μg/ml）を含む２×ＴＹアガープレート
に播種し、培養した。そして、ＤＮＡの挿入のある組換
えベクターが含有されている大腸菌を白色のコロニーと
して選別し、コロニーを取得し、さらに、キュアゲン・
プラスミド・キット（キュアゲン社（アメリカ）商品
名）を用いてプラスミドＤＮＡを取得した。オート・リ
ード・シークエンシング・キット（ファルマシア社（ス
ウェーデン）商品名）及びＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエ
ンサー（ファルマシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジー社
（スウェーデン）商品名）を用い、組換えベクターに挿
入されたＤＮＡの塩基配列を解析した。

【００３９】実施例３ イントロン部分を除去したＤＮ
Ａの取得 実施例２で得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化し、約５５０ｂｐのＤＮＡ断
片を取得した。このＤＮＡ断片と、予め制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｌＩで消化しておいたプラスミドベクタ
ーｐＵＣ１９をＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
組換えベクターｐＤＥ３４Ｓを作製した。この組換えベ
クターを制限酵素ＢｓｔＰＩ及びＰｍａＣＩで消化し、
約２１０ｂｐのＤＮＡ断片を除去し、残存ＤＮＡを取得
した。一方、ＤＮＡ合成機とＴ４−ＤＮＡリガーゼを用
い、配列番号２４の塩基配列を有するＤＮＡと配列番号
２５の塩基配列を有するＤＮＡが対合した二本鎖ＤＮＡ
を作製した。Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用い、この二本鎖
ＤＮＡと前記残存ＤＮＡを連結し、組換えベクターｐＤ
Ｅ３４ｅｘを作製した。

【００４０】組換えベクターｐＤＥ３４ｅｘには、イヌ
ＩｇＥペプチド断片をコードするＤＮＡが含有されてお
り、このコード部分は配列番号１１の塩基配列を有して
いた。配列番号１１の塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は配列番号１の配列となっていた。この組換えプラ
スミドベクターを大腸菌ＨＢ１０１株に入れ、形質転換
体を作製した。得られた形質転換体は、受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５３３９として、工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている。

【００４１】実施例４ イヌ免疫グロブリンＥペプチド
断片の合成及び該ペプチド断片を抗原とする抗血清の調
製 配列番号１のアミノ酸配列の中でイヌ免疫グロブリンＥ
としての抗原性を有する箇所を探索するため、配列番号
１のアミノ酸配列のアミノ基末端から順に、連続した２
０個又は１４個のアミノ酸配列を定め、配列番号２〜１
０のアミノ酸配列を得た。ペプチド合成機（島津製作所
(株)製、商品名：ＰＳＳＭ−８）を使用したマップ法に
よりこれらのアミノ酸配列からなるペプチドを合成し
た。合成された各ペプチドについて、以下のようにして
抗血清を調製した。まず、ペプチドを生理食塩液に溶解
し、等量のフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）と
混合し、エマルジョンを調製した。

【００４２】次にウサギ（日本白色種メス）一羽に対
し、ペプチド１ｍｇを含むエマルジョンを皮下投与した
（初回免疫）。さらに、フロイントの不完全アジュバン
ト（ＦＩＡ）とペプチドを用い、上記と同様にエマルジ
ョンを調製し、初回免疫から２週間後、４週間後、６週
間後に、このエマルジョンを皮下投与した。一つのペプ
チドあたり二羽のウサギに免疫を行った。最後の免疫か
ら１週間後に全採血を行い、各ペプチドに対して約１０
０mlの抗血清（全９種類）を得た。

【００４３】実施例５ ウエスタンブロット法による抗
血清の評価 アレルギーを煩ったイヌの血清を、１０−２０％グラジ
エントゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、血清中のタンパク質を
分子量の違いによってゲル中で分離した。泳動バッファ
としては、グリシン（１９２ｍＭ）及びＳＤＳ（０．１
％）を含むトリス緩衝液（２５ｍＭ）を、サンプルバッ
ファとしては、グリセロール（２．５％）、ＳＤＳ
（０．２％）及びブロモフェノールブルー（０．０１
％）を含むトリス−塩酸緩衝液（１２ｍＭ、pH６．８）
を、それぞれ用い、２０ｍＡの電流を流して泳動した。

【００４４】泳動終了後、ゲル上にニトロセルロースフ
ィルターを重ね、さらにこれらの両側にろ紙を重ね、こ
れを緩衝液に浸し、電圧をかけ、ゲル中のタンパク質を
フィルターに移動させた。この操作は、市販のキット
（バイオラッド社製、商品名：ミニトランスブロット）
を用い、緩衝液としては、リン酸緩衝液（日水製薬(株)
製、商品名：ダルベッコＰＢＳ（−）粉末「ニッス
イ」、の水溶液（以下、ＰＢＳ（−）と略す））に粉ミ
ルク（５％）及びＴｗｅｅｎ−２０（０．０５％）を添
加した溶液を使用し、１００Ｖの電圧を１時間かけて行
った。続いて、このフィルターを、グリシン（１９２ｍ
Ｍ）及びメタノール（２０％）を含むトリス緩衝液（２
５ｍＭ）に浸し、４℃で一晩放置した。

【００４５】実施例４で取得した抗血清を緩衝液（リン
酸緩衝液（ＰＢＳ（−））に粉ミルク（５％）を添加し
た水溶液）で希釈した液を調製し、これに上記フィルタ
ーを浸し、室温で１時間放置した。そして、フィルター
を洗浄液（リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））にＴｗｅｅｎ
−２０（０．０５％）を添加した溶液）で洗浄した。さ
らに、パーオキシダーゼ標識抗ウサギIｇ抗体（カペル
社製商品名）を希釈液（リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））
に粉ミルク（５％）及びＴｗｅｅｎ−２０（０．０５
％）を添加した溶液）で希釈した液を調製し、この液に
フィルターを浸し、室温で４時間放置し、フィルターを
洗浄液で洗浄した。このフィルターを発色液（４−クロ
ロ−１−ナフトールのメタノール溶液（３mg/ml）及び
３０％過酸化水素水を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ
（−）））に浸し、室温で１５分間放置し、フィルター
上の青色のバンドの有無を観察した。

【００４６】一方、実施例４で取得した抗血清とパーオ
キシダーゼ標識抗ウサギIｇ抗体を使用する代わりに、
抗イヌ免疫グロブリンＭ抗体、抗イヌ免疫グロブリンＧ
抗体、又は抗イヌ免疫グロブリンＡ抗体（いずれもベッ
チル社商品名）を用い、上記と同様の操作を行った。そ
の結果、実施例４で取得した抗血清を用いた場合、いず
れのフィルターにも、分子量約２３０，０００のバンド
が見られた。これらのバンドは、いずれも、抗イヌ免疫
グロブリンＭ抗体、抗イヌ免疫グロブリンＧ抗体、又は
抗イヌ免疫グロブリンＡ抗体を用いた場合に見られるバ
ンドとは異なった位置にあった。このことから、実施例
４で取得した９種類の抗血清には、いずれもイヌ免疫グ
ロブリンＥと免疫反応する抗体（抗イヌ免疫グロブリン
Ｅ抗体）が含まれていることがわかった。

【００４７】

【発明の効果】請求項１記載のイヌ免疫グロブリンＥペ
プチド断片は、イヌのアレルギーの診断に利用できる抗
イヌ免疫グロブリンＥ抗体の製造に好適である。請求項
２記載のイヌ免疫グロブリンＥペプチド断片は、請求項
１記載のイヌ免疫グロブリンＥペプチド断片の効果を奏
し、さらに、抗原性が高い。請求項３記載のＤＮＡは、
イヌ免疫グロブリンＥペプチド断片の製造に有用であ
る。請求項４記載のＤＮＡは、請求項３記載のＤＮＡの
効果を奏し、さらに、抗原性が高いイヌ免疫グロブリン
Ｅペプチド断片の製造に好適である。請求項５記載の組
換えベクターは、イヌ免疫グロブリンＥペプチド断片の
製造に有用である。

【００４８】請求項６記載の組換えベクターは、請求項
５記載の組換えベクターの効果を奏し、さらに、抗原性
が高いイヌ免疫グロブリンＥペプチド断片の製造に好適
である。請求項７記載の形質転換体は、イヌ免疫グロブ
リンＥペプチド断片の製造に有用である。請求項８記載
の形質転換体は、請求項７記載の形質転換体の効果を奏
し、さらに、抗原性が高いイヌ免疫グロブリンＥペプチ
ド断片の製造に好適である。請求項９記載の抗イヌ免疫
グロブリンＥ抗体の製造法は、イヌのアレルギーの診断
に有用な抗イヌ免疫グロブリンＥ抗体の製造に好適であ
る。

【００４９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：124 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Thr Met Glu Gly Met Asn Leu 1 5 10 15 Thr Trp Tyr Arg Glu Ser Lys Glu Pro Val Asn Pro Gly Pro Leu Asn 20 25 30 Lys Lys Asp His Phe Asn Gly Thr Ile Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro 35 40 45 Val Asn Thr Asn Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Tyr Cys Arg Val 50 55 60 Thr His Pro His Leu Pro Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Arg Ala Pro Pro Asp Val Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Glu 85 90 95 Glu Glu Gln Gly Thr Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Gln 100 105 110 Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu 115 120 124

【００５０】配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Gly Met Asn Leu Thr Trp Tyr Arg Glu Ser Lys Glu Pro Val 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20

【００５１】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Ser Lys Glu Pro Val Asn Pro Gly Pro Leu Asn Lys Lys Asp His 1 5 10 15 Phe Asn Gly Thr 20

【００５２】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Asn Lys Lys Asp His Phe Asn Gly Thr Ile Thr Val Thr Ser Thr 1 5 10 15 Leu Pro Val Asn 20

【００５３】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Asn Thr Asn Asp Trp Ile Glu 1 5 10 15 Gly Glu Thr Tyr 20

【００５４】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys Asp Ile Val Arg Ser 1 5 10 15 Ile Ala Lys Ala 20

【００５５】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Ala Pro Gly Lys Arg Ala Pro 1 5 10 15 Pro Asp Val Tyr 20

【００５６】配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Gly Lys Arg Ala Pro Pro Asp Val Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Glu 1 5 10 15 Glu Glu Gln Gly 20

【００５７】配列番号：9 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Phe Leu Pro Pro Glu Glu Glu Gln Gly Thr Lys Asp Arg Val Thr 1 5 10 15 Leu Thr Cys Leu 20

【００５８】配列番号：10 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu 1 5 10 14

【００５９】配列番号：11 配列の長さ：372 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 ATCACCTGTC TGGTTGTGGA TCTGGCCACC ATGGAAGGCA TGAACCTGAC CTGGTACCGG 60 GAGAGCAAAG AACCCGTGAA CCCGGGCCCT TTGAACAAGA AGGATCACTT CAATGGGACG 120 ATCACAGTCA CGTCTACCCT GCCAGTGAAC ACCAATGACT GGATCGAGGG CGAGACCTAC 180 TATTGCAGGG TGACCCACCC GCACCTGCCC AAGGACATCG TGCGCTCCAT TGCCAAGGCC 240 CCTGGCAAGC GTGCCCCCCC GGATGTGTAC TTGTTCCTGC CACCGGAGGA GGAGCAGGGG 300 ACCAAGGACA GAGTCACCCT CACGTGCCTG ATCCAGAACT TCTTCCCCGA GGACATTTCT 360 GTGCAGTGGC TG 372

【００６０】配列番号：12 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 ATGGAAGGCA TGAACCTGAC CTGGTACCGG GAGAGCAAAG AACCCGTGAA CCCGGGCCCT 60

【００６１】配列番号：13 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 GAGAGCAAAG AACCCGTGAA CCCGGGCCCT TTGAACAAGA AGGATCACTT CAATGGGACG 60

【００６２】配列番号：14 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 TTGAACAAGA AGGATCACTT CAATGGGACG ATCACAGTCA CGTCTACCCT GCCAGTGAAC 60

【００６３】配列番号：15 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 ATCACAGTCA CGTCTACCCT GCCAGTGAAC ACCAATGACT GGATCGAGGG CGAGACCTAC 60

【００６４】配列番号：16 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 TATTGCAGGG TGACCCACCC GCACCTGCCC AAGGACATCG TGCGCTCCAT TGCCAAGGCC 60

【００６５】配列番号：17 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 AAGGACATCG TGCGCTCCAT TGCCAAGGCC CCTGGCAAGC GTGCCCCCCC GGATGTGTAC 60

【００６６】配列番号：18 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 CCTGGCAAGC GTGCCCCCCC GGATGTGTAC TTGTTCCTGC CACCGGAGGA GGAGCAGGGG 60

【００６７】配列番号：19 配列の長さ：60 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 TTGTTCCTGC CACCGGAGGA GGAGCAGGGG ACCAAGGACA GAGTCACCCT CACGTGCCTG 60

【００６８】配列番号：20 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：cDNA 配列 ATCCAGAACT TCTTCCCCGA GGACATTTCT GTGCAGTGGC TG 42

【００６９】配列番号：21 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCACCTGTC TGGTTGTGGA TCTG 24

【００７０】配列番号：22 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCCACTGC ACCGAGATGT CCTC 24

【００７１】配列番号：23 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCCACTGC ACCGAGATAT CCTC 24

【００７２】配列番号：24 配列の長さ：134 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGACCCACC CGCACCTGCC CAAGGACATC GTGCGCTCCA TTGCCAAGGC CCCTGGCAAG 60 CGTGCCCCCC CGGATGTGTA CTTGTTCCTG CCACCGGAGG AGGAGCAGGG GACCAAGGAC 120 AGAGTCACCC TCAC 134

【００７３】配列番号：25 配列の長さ：129 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGAGGGTGA CTCTGTCCTT GGTCCCCTGC TCCTCCTCCG GTGGCAGGAA CAAGTACACA 60 TCCGGGGGGG CACGCTTGCC AGGGGCCTTG GCAATGGAGC GCACGATGTC CTTGGGCAGG 120 TGCGGGTGG 129

【００７４】配列番号：26 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド

【００７５】配列番号：27 配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 吾妻 亮侍 東京都新宿区西新宿二丁目１番１号 日立 化成工業株式会社内 (72)発明者 小原 和彦 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者 長谷川 篤彦 東京都武蔵野市吉祥寺北町４−７−16 (72)発明者 辻本 元 東京都杉並区成田東５−４−24

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるペプチドの中の連
   続した少なくとも５個のアミノ酸配列を含むイヌ免疫グ
   ロブリンＥペプチド断片。
2. 【請求項２】 配列番号１〜１０のいずれかのアミノ酸
   配列で示されるペプチドである、請求項１記載のペプチ
   ド断片。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のペプチド断片を
   コードするＤＮＡ若しくはそれに相補的なＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１１〜２０のいずれかの塩基配
   列で示されるＤＮＡである、請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載のＤＮＡを含む組
   換えベクター。
6. 【請求項６】 プラスミドｐＤＥ３４ｅｘである請求項
   ５記載の組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項５又は６に記載の組換えベクター
   を含む形質転換体。
8. 【請求項８】 ＦＥＲＭ Ｐ−１５３３９として寄託さ
   れている請求項７記載の形質転換体。
9. 【請求項９】 請求項１又は２に記載のペプチド断片を
   抗原として使用することを特徴とする、抗イヌ免疫グロ
   ブリンＥ抗体の製造法。