JPH08512210A

JPH08512210A - ペプチドの合成及び精製のための方法

Info

Publication number: JPH08512210A
Application number: JP7528454A
Authority: JP
Inventors: タル，ロニー; ウォン，ヒン，シー; キャシピット，クレイトン; シャベイラス，ピエール・アンドル; ウィットマン，ボーガン
Original assignee: デイド、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-05-01
Publication date: 1996-12-24
Also published as: AU696349B2; EP0706574B1; DE69504795D1; AU2371195A; EP0706574A1; CA2165413A1; ATE171217T1; US5763284A; US5888775A; WO1995030016A1; DE69504795T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、注目するペプチド（標的ペプチド）の合成および単離および精製方法を提供する。特に、本発明は、penl融合ポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードする関連遺伝子融合構築体を使用することよりなるペプチド合成、単離および精製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチドの合成及び精製のための方法本出願は、1994年４月29日出願の同時係属米国出願08／235,178号の一部継続出願であり、ここに、出典明示して本明細書の一部とみなす。発明の背景１．発明の分野本発明は、ペプチドの合成、単離および精製の新規な方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、penl融合ポリペプチド、かかるpenl融合ポリペプチドを用いることよりなるペプチドの合成、単離および精製方法、ならびにかかるpenl融合ポリペプチドについてコードする関連遺伝子融合構築体に関する。２．背景組換えDNA法が種々のペプチドを生産するのに使用されている。組換えDNA技術は、注目するペプチドを得るための、合成された、もしくは単離された遺伝子の発現を含む。簡単に言えば、所望のDNA配列をプラスミドのごときクローニングベクターに連結する。イー・コリ(E．coli)のごとき宿主細胞をクローニングベクターで形質転換し、次いで、DNA配列によってコードされたペプチドの発現に適した条件下で、該形質転換した宿主を培養する。次いで、かく産生された蛋白質を培地から単離し、典型的には、精製しなければならない。例えば、発現されたペプチドはしばしば宿主細胞によって培地に分泌され、該ペプチドは培地および細胞消費生成物、他のペプチド等のその培地中の他の物質から分離しなければならない。また、ペプチドは、化学的技術によっても生産できる。尤も、多くの適用では組換え法に比して化学的合成アプローチは好ましくないが。例えば、長さが約40 または50個のアミノ酸を超えるペプチドはしばしば許容される収率で化学的に合成することができない。さらに、比較的大きい化学的に合成したペプチドの精製は、しばしば、対応する組換えペプチドよりも煩わしい。化学的合成または組換えDNA技術によって生産されたペプチドを含めた、蛋白質を単離し精製する多数の方法が報告されてきた。例えば、公知の精製方法は、遠心、カラムクロマトグラフィーおよび電気泳動を含む。これらの方法は精製されたペプチドを生産できるが、それらは各々、ペプチドの最初の精製の後に、１以上のさらなるしばしば煩わしい精製工程を必要とする。さらに、多くの現在の単離および精製方法では、かなりの量の粗ペプチドが当該方法の間に失われ、その結果収率が低下する。ある先行技術のペプチドの単離および精製スキームにおいて、ハイブリッドまたは融合ポリペプチドが使用されてきた。これらのアプローチは、一般に、注目するペプチドによって示されない特異的結合特性を示すペプチドに連結した注目するペプチドを含有するポリペプチドをコードする遺伝子融合の構築体を提供してきた。これらの先行技術融合ペプチド法は、精製した蛋白質の低収率ならびに多数工程の単離および精製プロトコルを含めた顕著な欠点を示す。例えば、EP0244147 号において、レニン切断部位を介して所望のペプチドに連結したベーターガラクトシダーゼ部位を含有する融合ポリペプチドが記載されている。所望のペプチドを単離し精製するには、融合ポリペプチドをアフィニティーマトリックス吸着させ、溶出させて他の蛋白質を除去した後に、レニンを結合複合体に添加して融合ポリペプチドを切断し、ベーターガラクトシダーゼをマトリックスに結合させたままで、注目するペプチドを放出させる。なおさらなる工程において、単離したペプチドをアニオン交換クロマトグラフィーによって単離する。かくして、ペプチド、特に組換え方法によって産生されたペプチドの合成およひ精製のための新しく簡易な方法があれば望ましいであろう。さらに、単一の工程で、特に収率が有意に低下することなく、所望のペプチドの便宜な単離および精製を可能とするかかる新しい方法があれば望ましいであろう。発明の概要本発明は、penlリプレッサー蛋白質、またはpenlリプレッサー蛋白質の沈殿有効部分に連結した標的ペプチドを含んだ融合ポリペプチドを形成することによる、実質的にいずれのペプチド（本明細書では「標的ペプチド」という）の合成方法および精製方法をも提供する。該penlリプレッサー蛋白質はバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis)によって産生され、誘導性酵素ペニシリナーゼ(penP)の合成を負に制御する。Dubnau，et al.，J．Gen．Microbiol.，41:7-21(1965)；Sheratt,e t al.，J．Gen．Microbiol.，76:217-230(1973)参照。penl遺伝子の配列、その遺伝子のイー・コリ(E．coli)における発現およびpenl蛋白質の精製は報告されている。T．Himeno，et al.，J．Bacteriol.，68:1128-1132(1986)；Wittrnan,e t al.，J．Bacteriol.，170:3206-3212(1988)参照。本発明のpenl融合ポリペプチドは、形質転換宿主細胞におけるポリペプチドの発現の後、単一工程で精製できる。特に、本発明により生産されたpenl融合ポリペプチドは、溶液のイオン強度を低下させることによって、溶液から選択的に沈殿させることができることが判明した。かくして、融合ポリペプチドを含有する粗細胞抽出物またはその上清を低イオン強度の水性溶液に接触させて、それにより、ポリペプチドを沈殿させることができることが判明した。典型的には、約20 0mM以下の塩濃度を有する溶液は融合ポリペプチドを沈殿させるのに十分であろう。沈殿の好ましい手段は、低イオン強度溶液に対する、融合ペプチドの溶液の透析である。所望ならば、再沈殿および／またはクロマトグラフィーによるごとき沈殿した物質のさらなる精製を行うことができるが、多くの適用では必要ない。また、本発明の融合ポリペプチドは、好ましくは、penl蛋白質と標的ペプチドとの間に位置する連結配列を包含する。さらに好ましいのは、連結ペプチド配列か、標的蛋白質に悪影響することなく、適当な切断剤によって認識され切断できることである。典型的には、連結配列は因子Ｘa部位のごとき酵素切断部位を含む。さらに、本発明は、penlペプチドまたはその沈殿有効部分をコードするヌクレオチド配列、および標的ペプチドをコードする配列を含んだDNA融合ベクターを包含する。好ましくは、該ベクターはpenl蛋白質と標的ペプチドとの間に位置する連結セグメントをコードするヌクレオチド配列も包含する。好ましくは、該連結セグメントは、好ましくは標的ペプチドに悪影響することなく、適当な切断剤によって認識され切断できる。また、本発明は、標的ペプチドのアミノ酸配列に融合したpenlペプチドまたはその沈殿有効部分を含んだ融合ポリペプチドを包含する。好ましくは、該ポリペプチドは、さらに、penl蛋白質と標的ペプチドとの間に位置する連結セグメントを包含する。前記したごとく、連結セグメントは、好ましくは、標的ペプチドに悪影響することなく、適当な切断剤によって認識され切断できるアミノ酸配列を包含する。また、本発明は、penlを抗原担体として用いる方法を包含する。抗原担体として作用するpenl部分を持つ、免疫化のための本発明の融合ポリペプチドの使用は、先行技術免疫化方法よりもかなり便利である。また、本発明は、選択されたペプチドのエピトープマッピング方法およびランダムペプチドライブラリーの調製および使用を包含する。また、本発明は、特に種々のアッセイで用いるための、例えば、特定の標的ペプチドが、Ｔ細胞の増殖を誘導または増強することによって、またはＴ細胞増殖を阻害することによって示され得る免疫応答を刺激または抑制できるか否かを評価するための、in vitro系における抗原としての本発明の融合ポリペプチドの使用方法を提供する。かかるアッセイは、とりわけ、多発性硬化症、インスリン− 依存性糖尿病、慢性関節リウマチ等のごとき自己免疫疾患に悩むかまたはそれに罹患したヒトのような哺乳動物を治療するのに使用できる標的ペプチドを同定するのに有用であり、また、望まない免疫応答に悩むかまたは可能性として悩むこととなろう哺乳動物、例えば、慢性アレルギーに悩む患者または心臓、腎臓または他の器官の移植のごときあるタイプの移植外科手術を受けている患者を治療するのに有用である。また、かかるアッセイは、免疫応答を発動させまたは刺激し、また、ワクチン適用に使用できる、例えば、感染性因子又は癌、特にメラノーマ癌のような目的とする疾患、又はマラリア等の他の障害に対してヒトのごとき哺乳動物をワクチン接種するためのペプチドを同定するのに有用である。さらに、本発明の融合ポリペプチドは、特に標的ペプチド自身（すなわち、pe nl蛋白質またはその沈殿有効部分に連結していない）を得るための収率に対して、かなり良好な収率で調製できる。従って、本発明は、本発明の融合ポリペプチドの成分としてペプチドを産生することによって種々の標的ペプチドの生物学的活性または他の特性を評価するための効果的な方法を提供する。加えて、少なくともある標的ペプチドの場合には、in vitroまたはin vivoでＴ細胞増殖を誘導または増強するペプチドの能力は、該ペプチドを本発明のpenl蛋白質またはその有効部分に融合した場合に増大できると信じられる。例えば、後記する実施例 11参照。本発明の他の態様は後記する。本明細書で用いる「penl蛋白質の沈殿有効部分」なる語は、標的ペプチドに融合した場合に、低イオン強度を有する水性溶液と（後記実施例１に開示した方法によるごとくして）接触させた際に、融合ポリペプチドが沈殿されるpenl蛋白質の部分を意味すると定義される。かくして、penl蛋白質の沈殿有効部分は当業者が容易に実験的に同定できる。すなわち、penl蛋白質の部分をコードするDNA配列および標的ペプチドをコードするDNA配列を含有する遺伝子構築体を調製でき、その遺伝子構築体を発現させ、その発現されたポリペプチドを本明細書で開示する低イオン強度溶液と接触させて、融合ポリペプチドの沈殿が起こるか否かを決定できる。典型的には、penl蛋白質の沈殿有効部分の少なくとも約50パーセントのアミノ酸配列がpenl蛋白質の配列と同一であり、より典型的には、沈殿有効部分の少なくとも約70パーセントのアミノ酸配列がpenl蛋白質と同一であり、なおさらに典型的には、有効部分の少なくとも約90パーセントのアミノ酸配列がpe nl沈殿の配列と同一である。さらに、沈殿有効部分は、典型的には、penlのアミノ酸残基の合計数の少なくとも約50パーセント、より典型的には、penlの全残基の少なくとも約80パーセントを含有する。図面の簡単な記載図１は、クローニングベクターpCC51の構築および本発明によるそのベクターの使用を示す。図２は、実施例１および３の核酸配列（配列番号：１〜10）および融合ペプチドのアミノ酸配列（配列番号：11〜20）を示す。図において、融合ポリペプチドのF1.2-C9標的ペプチドの配列には下線を引き、実施例３で調製した（図でtFP01 0-tFP018という）他のpenl融合ポリペプチドの点突然変異にも下線を引く。図３は、実施例４のリアルタイムBiospeclfic Interaction Analysis(BIAcore analysis)の結果を示す。図４は、本発明により生産し精製したPenl：トロポニン融合蛋白質のウェスタンブロットおよびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。その図において、レーンA-1は誘導／合計蛋白質のSDS PAGEであり；レーンA-2は非誘導／合計蛋白質のSDS PAGEであり；レーンB-1はポスト細胞分解／ウェスタンブロット／合計蛋白質を示し；レーンB-2は精製された（35％硫酸アンモニウムカット）／ウェスタンブロットを示し；およびレーンB-3は精製された（35％硫酸アンモニウムカット）／SDS PAGEを示す。図５は実施例６の融合ペプチドの競合ELISAアッセイの結果を示す。図６および７は、実施例８に詳細に記載したPenl：C9蛋白質での免疫化の結果を示す。発明の詳細な記載本発明は、融合ポリペプチドをコードするDNA、すなわち、所望の標的ペプチドに連結したpenl蛋白質またはその沈殿有効部分をコードするDNAの構築によるポリペプチドの調製を包含し、これらのDNAは、発現に際して、標的ペプチドに融合したpenlまたはその部分を含んだポリペプチドを供する。標的ペプチドは、好ましくは、penl蛋白質またはその部分のカルボキシル末端に、直接または連結配列を介して連結している。また、標的ペプチドは、適切には、penl蛋白質またはその部分のアミノ末端に連結できる。また、標的ペプチドがpenl蛋白質の部分によって挟まれ、それにより、挟まれた標的ペプチドは低イオン強度溶液で沈殿するという融合ペプチドを使用することができる。かかる融合ポリペプチドは、penl蛋白質の２つの別々の部分を含有し、標的ペプチドはその間に位置する。好ましくは、かかる融合ポリペプチドは、２つの「挟む」penl部分から標的ペプチドを放出するための２つの切断部位を含有する。これは、標的ペプチドのいずれか側に、およびpenl蛋白質部分の間に連結セグメントを位置させることによって達成でき、ここに、連結セグメントの各々は適当な切断剤によって認識され切断できる。一般に、本発明のpenl融合ペプチドの調製は、組換えDNA技術、例えば、プラスミドDNAの調製、制限酵素でのDNAの切断、DNAの連結、宿主細胞の形質転換および培養によって達成でき、これは、一般に当業者に公知であり、例えば、 Sambrook，et al.，Molecular Cloning（第２版、1989）によって一般的に開示されている。より詳しくは、penl蛋白質またはその沈殿有効部分をコードするDNAが得られる。そのDNAの１つの源はBacillus liceniformisであり、これは、例えば、受託番号6598、6634および8480の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から公に入手可能である。かかるDNAの単離およびクローニングは記載されており、分子クローニングおよびポリメラーゼ鎖反応を包含する。Wittman，et al.，J．Bacteriol.，170:3206-3212(1988) ；およびHimeno，et al.，J．Bacteriol.，168:1128-1132(1986)参照。また、そのch.14を含めたSambrook，et al．（前掲）参照。penlまたはその部分をコードするヌクレオチド配列、または標的ペプチドまたは連結セグメントをコードする配列のごとき本発明の融合構築体の他の成分の配列は公知の方法、例えばホスフェートトリエステル法によって合成できる。Oligonucleotide Synthesis，IRL P ress(M.J.Gait版、1984)参照。また、商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて、合成オリゴヌクレオチドを調製できる。penl蛋白質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図２に示す。 penlまたはその有効部分をコードする遺伝子はポリメラーゼ鎖反応(PCR)または当該分野で公知の他の手段によって増幅できる。penl遺伝子を増幅するのに適するPCRプライマーは制限部位をPCR産物に付加することができ、例えば、の上流プライマー、およびの下流プライマーを包含できる。penl遺伝子は、かかるプライマーを用いてBaci llus liceniformis染色体DNAから標準的なPCR方法によって直接増幅できるか、あるいはpenl遺伝子を含有する適当なプラスミドをPCRのための鋳型として使用できる。後記する実施例１参照。融合ベクターを作成するには、penlまたは有効部分をコードする配列を適当なリガーゼによって標的蛋白質をコードする配列に連結する。所望により連結配列をコードするDNAに連結していてもよい標的ペプチドをコードするDNAは、天然源からDNAを単離することによって、あるいは前記した公知の合成方法によって得ることができる。penlまたはその有効部分をコードするヌクレオチド配列は、標的蛋白質をコードするDNA配列に直接連結することができるかあるいは、別法として、適当な連結配列をコードするDNA配列を、適当なリガーゼを用いて、pen lをコードする配列と標的ペプチドをコードする配列との間に位置させることができる。好ましくは、連結配列は、それにより標的ペプチド供するための遺伝子構築体によって発現される融合ポリペプチドを切断する蛋白質分解剤によって認識され切断できるペプチドをコードするヌクレオチド配列である。好ましい連結配列は ATCGAGGTAGG（配列番号：23）のヌクレオチド配列を有し、ペプチドIle-Glu-Gly -Argをコードし、これは血液凝固第Ｘa因子によって切断され得る。例えば、Nag ai et al.，Nature，309:810-812(1984)参照。当業者によって認識されるごとく、種々の他の連結配列および切断剤を使用することができる。特定の適当な剤の選択は、意図する切断部位におけるアミノ酸の配列の同一性、特にpenl蛋白質またはその部分と標的ペプチドとの間に位置する連結配列の同一性に基づくであろう。例えば、適当な切断剤は、トリプシン（Arg、Lysで切断）、コラゲナーゼ（ X-Gly-Proで切断）、ヒドロキシルアミン（Asn-Glyで切断）、希酸(Asp-Proで切断）、臭化シアン、N-ブロモスクシンイミド等を包含する。好ましくは、切断剤は、標的蛋白質を切断しないが、連結配列および／またはpenl蛋白質またはその部分内に位置するもののごとき意図した切断部位とのみ反応するように選択される。かくして、望まない切断は、連結配列に存在するが標的ペプチドには存在しない部位にて切断する切断剤の使用によって最小化できる。適当な連結配列はオリゴヌクレオチド合成を含めた公知の方法によって得ることができる。他のヌクレオチド配列を遺伝子融合構築体に含めることもできる。例えば、融合ポリペプチドをコードする配列の発現を制御するプロモーター配列を構築体に含ませることができるか、あるいは該構築体を挿入する発現ベクターに存在させることができる。加熱誘導性プロモーターが特に適当である。同様に、所望ならば、発現されたポリペプチドが形質転換宿主細胞から培地に分泌できるように、シグナル配列を遺伝子構築体に含めることができる。多数の戦略を使用して融合ポリペプチドを発現させることができる。例えば、構築体の挿入用にベクター中に切断を作成する制限酵素の使用、続いての連結の使用のごとき公知の方法によって、前記したごとき遺伝子融合構築体を適当なベクターに取り入れることができる。次いで、遺伝子構築体を含有するベクターを遺伝子融合の発現用の宿主細胞に取り入れることができる。一般に、Sambrook,e t al.，前掲参照。適当なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関連する因子に基づいて経験的に作成できる。例えば、ベクターは、使用すべき宿主細胞用の適当なリプリコンと適合し、またそれを有すべきである。さらに、ベクターは、penl蛋白質またはその部分および標的ペプチドをコードするDNA配列を補償できるものでなければならない。適当な宿主細胞は実質的にいずれの真核生物または原核生物細胞も含み、好ましくは、容易に形質転換でき、培地中で迅速な増殖を示す細胞である。特に好ましい宿主細胞はイー・コリ(E．coli)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のごとき原核生物、および動物細胞および酵母株、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(S．Cerevisiae)のごときサッカロミセス属の株のような真核生物を含む。他の適当な宿主は、例えば、Sf9のごとき昆虫細胞を含む。形質転換した宿主細胞は、典型的には、選択的増殖培地、例えば、抗生物質中で増殖させる（但し、クローニングベクターは適当な耐性遺伝子を含有するものとする）。融合ベクターを含有する宿主細胞を培養し、要すれば、常法によって融合遺伝子を誘導する。１つの適当なプロトコルにおいて、penl遺伝子のPCR産物をイー・コリ・ベクターpUC19のごとき適当なベクターにクローン化する。適切に使用できる他のベクターは当該分野で知られており、前記開示のごとく選択でき、例えば、pBR322 を含む。次いで、標的ペプチドをコードする単離DNAを、penl遺伝子を含有するベクターにクローン化する。例えば、図１参照。次いで、該構築体を用いて、公知の方法によってイー・コリのごとき適当な宿主を形質転換する。前記したごとく、形質転換体は、常法によって、例えば、形質転換細胞に検出可能な表現型特性を付与するマーカー遺伝子を構築体に含ませることによって選択される。例えば、形質転換体は抗生物質（例えば、テトラサイクリン）選択によって同定でき、ここに、形質転換体は適当な耐性遺伝子を含有する。融合ベクターを含有する宿主細胞を培養し、融合した遺伝子を、必要であれば、常法技術によって誘導する。例えば、少なくともある系においては、細胞培養は適当には撹拌しつつ加熱することによってインキュベートできる。次いで、細胞を収穫し、必要であればあるいは望むならば、溶解させる。培地を所望により遠心して種々の細胞夾雑物および他の物質を除去し、次いで、融合ポリペプチドを沈殿させるのに十分なイオン強度を有する水性溶液と接触させる。本発明の１つの特別好ましい態様において、低イオン強度緩衝液、例えば、約250mMもしくは200mM以下、より好ましくは約100mM以下の塩濃度を有する溶液に対する透析によって、融合ポリペプチドを培地または他の溶液から沈殿させる。50MKCl緩衝液溶液が特に好ましい。一般に、約200mM以下の塩濃度を有する溶液、典型的には、約200mMないし50mM の塩濃度を有する溶液から融合ポリペプチドを沈殿させる。低イオン強度緩衝液との接触によってポリペプチドを接触させる他の方法を用いることもできるが、実施例１または明細書の他の箇所に記載した透析方法が、融合ポリペプチドを沈殿させる特に好ましい方法である。例えば、溶液中のpenl融合ポリペプチドをかかる低イオン強度溶液と混合することができる。ポリペプチド溶液を低イオン強度溶液と接触させる条件、例えば、緩衝液の添加速度、緩衝液およびポリペプチド溶液の温度等は、ルーチン的実験以上のことをする必要なく、最適化して、溶液中に存在し得る他の物質から所望の融合ポリペプチドを選択的に沈殿させることができる。例えば、融合ポリペプチド溶液を選択した条件下で低イオン強度溶液と接触させることができ；条件を変えて得られた沈殿ポリペプチドの収率および純度は、そのポリペプチドの沈殿のための最適パラメーターを示すであろう。同様に、penl融合ポリペプチドを沈殿させるのに十分なイオン強度を有する適当な水性溶液は容易に同定できる。例えば、溶液中の本発明の融合ポリペプチドの試料は、異なるイオン強度を有する水性溶液で処理して、それにより、その融合ポリペプチドの沈殿のための最適溶液を決定することができる。融合ポリペプチドを沈殿させるために用いる溶液は、好ましくは、少なくとも１種の塩を含有する。ハロゲン化ナトリウム、例えばNaclのごときアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を含めた、当該分野で公知の多数の塩を使用できる。一般に、カリウム塩、特にKClのようなハロゲン化カリウムを使用するのが好ましい。また、水性溶液は、典型的には、pHを所望のレベルに維持するためのトリスまたは他の公知剤のごとき緩衝液を含有する。また、溶液は、他の任意成分、例えばフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)のごときプロテアーゼ阻害剤を含むことができる。沈殿に先立って、溶液中のpenl融合ポリペプチドの初期濃度が沈殿ポリペプチドの回収および純度に影響し得ることが判明した。特に、典型的には、好ましい範囲外の濃度、特により高い濃度も適当であるが、溶液１ml当たり約0.3ないし1 .0mgの濃度で融合ポリペプチドを溶液中に存在させるのが好ましい。培地中の融合ポリペプチドのかかる好ましい濃度は、ほとんどの場合、特に後記する実施例１に記載したベクターおよび加熱誘導系を用いる場合に、容易に達成できる。そのベクターおよび誘導系により、典型的には、penl−標的ペプチド融合が合計細胞蛋白質の約≧20重量％を構成する発現となる。本発明の融合ポリペプチドは高純度で溶液から単離できることが判明した。例えば、本発明の組換えpenl融合ポリペプチドは、50パーセント以上の、約85パーセント以上でさえの純度（HPLC分析）にてイー・コリ(E．coli)細胞から単離された。また、本発明のpenl融合ポリペプチドは、高収率で、例えば発現された全ポリペプチドの約15パーセント以上の、約25パーセント以上でさえの収率にて培地から単離できることが判明した。より詳しくは、収率は、しばしば、10¹¹イー・コリ細胞当たり約３および９mgのポリペプチドである。当業者によって理解されるごとく、かかる収率は先行技術の単離および精製方法によって提供される収率よりもかなり高い。沈殿したポリペプチドはさらに精製することなく使用でき、または、所望により、さらなる精製工程に付すこともできる。例えば、ポリペプチドを比較的高イオン強度の適当な溶液に溶解し、次いで、低イオン強度の緩衝液と接触させることによって、特に低イオン強度緩衝液に対する透析によって沈殿させる。また、沈殿したポリペプチドを、クロマトグラフィーのごとき常法技術によってさらに精製することができる。特に標的ペプチドの生物学的特性がpenl蛋白質またはその部分によって、または（もし存在するば）連結配列によって有害にも阻害されない場合は、精製したポリペプチドは適当にはその融合形態で使用できる。別法として、標的ペプチドは、融合ポリペプチドを適当な切断剤で処理することによって、penl蛋白質またはその部分から放出させることができる。特に、ポリペプチドが前記した連結セグメントを含むならば、ポリペプチドを適当な切断剤で処理し、それにより、ポリペプチドを切断することができる。前記にて具体的に記載した低イオン強度緩衝液中で本発明の融合ポリペプチド（すなわち、penl蛋白質および標的ペプチドを含んだペプチド）の沈殿を標的ペプチドが妨げない限り、実質的にいずれのペプチドまたは蛋白質も本発明により精製することができる。適当な標的ペプチドは、当業者によって、例えば、１）前記した融合ベクターを発現させて、penlまたはその沈殿有効部分および注目する標的ペプチドを含んだポリペプチドを得、２）溶液中のそのポリペプチドを適当な低イオン強度緩衝液と接触させ、次いで３）ポリペプチドの沈殿について溶液を観察する一連の工程によって当業者が容易に同定できる。標的ペプチドのある特性は個々にまたは可能性として組み合わせて、本発明の融合ポリペプチドの沈殿を妨げ、あるいは少なくとも阻害し得る。特に、標的ペプチドのサイズおよびそのペプチドに存在する荷電基の数が融合ポリペプチドの沈殿に影響し得る。かくして、一般に、標的ペプチドは約200以下のアミノ酸よりなり、より好ましくは約140以下のアミノ酸よりなり、なおより好ましくは約1 20以下のアミノ酸よりなり、さらにより好ましくは約100以下のアミノ酸よりなり、最も好ましくは約70ないし80のアミノ酸よりなる。より大きな標的ペプチド部分は、融合ポリペプチドが溶液から沈殿する能力に干渉し得る。また、標的ペプチドは、低イオン強度の溶液からポリペプチドが沈殿する能力にやはり干渉し得る過剰数の荷電基、すなわち、荷電した酸性基または塩基性基を含有しないのが好ましい。従って、好ましくは、標的蛋白質のアミノ酸の合計数の約10ないし 20パーセント以下がLys、Arg、His、AspまたはGluのごとき酸性または塩基性基アミノ酸である。本発明により合成し精製できるペプチドの特別の例は、例えば、酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、抗原もしくは抗原決定基、免疫原、動物の構造要素を形成する蛋白質、DNA結合ペプチド、蛋白質／蛋白質相互作用に関与するペプチド等を包含する。さらに、本発明は天然に生じる蛋白質に限定されず、１個以上のアミノ酸が天然に生じるペプチドとは異なる前記蛋白質のアナログ、前記天然に生じるペプチドの断片、および他の合成ペプチドを含めた、合成ペプチド、すなわち天然に生じないペプチドの調製および精製も含む。本発明により生産されるポリペプチドは種々の用途を有する。例えば、融合ポリペプチドは、標的ペプチド用の抗原担体分子として作用するpenlまたはその部分での免疫化に使用することができる。例えば、後記する実施例８参照。かかる手法は、非免疫原性抗原を使用する先行技術方法よりもかなり便宜である。それらの先行技術方法は、予め調製し単離した抗原をBSAまたはKLHのごとき担体への化学的連結、続いての、１以上の精製工程を提供する。対照的に、担体としてpe nlを用いることによって、効果的な抗原を単一の工程で調製し高収率にて単離することができる。これらの抗原は、特に、本発明の融合ポリペプチドをマウスまたはウサギのような哺乳動物に投与することによって（ここに、その投与は所望の免疫応答、すなわちポリペプチドのエピトープ（類）に特異的な抗体の産生を誘導する）、ポリクローナルおよびモノクローナルを生産するのに用いることができる。収穫した抗体は、当業者に認識されるごとく、種々のアッセイおよび診断を含めた、種々の適用で用いることができる。また、本発明は、エピトープのマッピングまたは標的ペプチドのエピトープ同定を含む。一般に、ペプチドは本発明の方法によって調製され、ペプチドもしくはポリペプチドの結合ドメイン（例えば、抗体）に関するそのペプチドの結合活性が測定される。本発明の融合ペプチドの結合活性は測定できるか、あるいは別法として、融合ペプチドは適当な切断剤で切断し、標的ペプチドを単離し、次いで標識ペプチドの結合活性を評価できる。より詳しくは、関連配列を有する、例えば各々約１〜５個または１〜３個のアミノ酸のみ異なる一群のpenl融合ポリペプチドは、低イオン強度緩衝液との接触によって単離することができる。ペプチドのエピトープ（類）を同定するために、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体のごとき特定のペプチドまたはポリペプチドの結合ドメインに対する単離ペプチドの結合活性を、例えば、表面プラズモン共鳴検出、ウェスタンブロット分析、またはELISA法を用いて測定できる。例えば、後記する実施例３および４参照。また、本発明は、ランダムペプチドライブラリーの調製および使用を含む。例えば、種々のペプチドをコードするDNA配列を、penl蛋白質もしくはその沈殿有効部分をコードするDNA配列および、所望により、１個以上の切断部位を含有するペプチド配列をコードする連結配列を含む前記したもののごとき発現ベクター系にクローン化することができる。好ましくは、適当なcDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーの制限断片（Sambrook，et al.,前掲）を発現ベクターに挿入される配列源として用いる。適当には、それらの配列は、penlもしくはその部分および、もし存在すれば、連結配列をコードする遺伝子の下流にて発現ベクターに挿入する。適当な宿主細胞、例えば、イー・コリ細胞のごとき前記したものを、遺伝子融合（すなわち、penlもしくはその部分およびさらなるペプチドをコードする配列）を含有するベクターで形質転換する。形質転換体を適当な条件下で培養する。例えば、ナイロン膜のごとき固体基材上で増殖させる。次いで、得られた細胞を、標識抗体の使用によるごとき標準的な技術によって、注目する融合ポリペプチド（類）の発現についてスクリーニングする。Methods in Enzym ology，volume 152，Guide to Molecular Cloning Techniques（S.Berger et al .，1987）参照。次いで、選択されたクローンから発現されたポリペプチドは、低イオン強度溶液と接触させて前記したごとくにポリペプチドを沈殿させることによって、容易に単離し精製することができる。注目するペプチドは、もしポリペプチドが連結セグメント内に第Ｘa因子部位のごとき適当な切断部位を含むならば、該ポリペプチドのpenlセグメントから切断することができる。また、本発明は、Ｔ細胞の活性をin vitroで変調する、例えば、Ｔ細胞増殖を誘導もしくは増強し、またはＴ細胞の発生を阻害または不活化するための、本発明の１以上の融合ポリペプチドの使用よりなる方法を提供する。さらに、本発明は、自己免疫疾患を治療し、または前記した疾患のごとき望まない免疫応答を治療するために活性を示す標的ペプチドを同定し、あるいは前記したごとき望まない免疫応答を誘導するのに有用なペプチド同定するためのin vitroアッセイを提供する。典型的には、かかるin vitro方法のためのＴ細胞は、哺乳動物から、例えばＴ細胞ハイブリドーマまたはヒトもしくはマウスのごとき齧歯類から単離されたＴ細胞のような形質転換Ｔ細胞系によって提供されるであろう。適当なＴ細胞ハイブリドーマは公に入手可能であるか、あるいは公知の方法によって調製できる。Ｔ細胞は公知の方法によって、哺乳動物から単離できる。例えば、Shimonkevitz ,R．et al.，(1983)，J．Exp．Med.158:303参照。本発明の融合ポリペプチドがＴ細胞の活性を変調できるか否かを判断するための適当なアッセイは、後記する一連の工程１〜４によって、後記するごとくに行われる。Ｔ細胞は、適切にアッセイでき、Ｔ細胞の活性化、または活性化後のＴ細胞活性の変調を示すマーカーを発現する。かくして、例えば、後記する実施例 10に例示するごとく、活性化に際してインターロイキン-2(IL-2)を発現するネズミＴ細胞ハイブリドーマDO 11.10のごときＴ細胞ハイブリドーマを使用することができる。IL-2濃度を測定して、特定の提示ペプチドがＴ細胞ハイブリドーマの活性を変調できるか否かを判断できる。かかる適当なアッセイは以下の工程で行われる：１．抗原提示細胞を、標的ペプチドおよびpenl融合蛋白質もしくはその沈殿有効部分を含んだ本発明の融合ポリペプチドと接触させる。例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞およびランゲルハンス細胞を含めた種々の抗原提示細胞を使用できる。かかるアッセイで使用する特に好ましい抗原提示細胞はA20細胞を含む。他の適当な抗原提示細胞、特に例えばL10A6.2、L10A/2J、K46R、2PK3および P388D細胞は、Edwin Walker，et al.，Journal of Immunology，128(5):2164-21 69(1982)に開示されている。２．融合ポリペプチドに特異的なＴ細胞受容体を担持するＴ細胞は、注目するＴ細胞ハイブリドーマから、または哺乳動物から単離することによって得られる。Ｔ細胞を増殖が可能な条件下で培養する。３．増殖するＴ細胞を、本発明の融合ポリペプチドと予め接触させた抗原提示細胞と接触させる（前記アッセイ工程１参照）。４．一定時間の抗原提示細胞とのかかる接触の後、例えば、24時間後に、融合ポリペプチドによるＴ細胞の活性の変調を、適当には、マーカー、例えばIL-2産生のための混合物をアッセイすることによって測定する。IL-2産生の減少、例えば、24時間後のIL-2産生の40パーセント以上の減少、より典型的には24時間後の IL-2産生の50パーセント以上の減少は、融合ポリペプチドがＴ細胞の活性を変調し、免疫応答を抑制できることを示す。融合ポリペプチドを、まず、「プロフェショナル(professional)」細胞であって、融合ポリペプチドを細胞に輸送できる抗原提示細胞に適用することは認識されよう。次いで、融合ポリペプチドを「負荷」した抗原提示細胞をかかる細胞におけるＴ細胞と反応させて細胞相互作用させることができる。アッセイで使用するＴ細胞は増殖に適する条件下でインキュベートする。例えば、DO 11.10Ｔ細胞ハイブリドーマは、適当には、完全培地（10％FBS、ペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミンおよび５×10^-5M2-メルカプトエタノールを補足したRPMI1640）中、約37℃および５％CO₂にてインキュベートする。本発明の融合ポリペプチドの一連の希釈物をＴ細胞培地に添加することができる。Ｔ細胞に添加した融合ポリペプチドの適当な濃度は、典型的には、10^-12ないし10^-6Ｍの範囲となろう。Ｔ細胞の活性化シグナルは、適当な抗原性ペプチドを予め負荷した抗原提示細胞(APC)によって供される。わずかに最適下のＴ細胞活性化を与える抗原用量およびAPC数の使用は、本発明の融合ポリペプチド（類）でのＴ細胞応答の阻害を検出するのに好ましいと考えられる。融合ポリペプチドとの接触後のIL-2産生の減少は、融合複合体がＴ細胞の活性を変調し、免疫応答を抑制できることを示す。別法として、IL-2のごとき発現蛋白質の測定よりもむしろ、Ｔ細胞活性化の変調は、適当には、当該分野で認識されている放射性同位体標識技術によって測定して抗原−依存性Ｔ細胞増殖の変化によって測定できる。例えば、標識した（例えば、トリチウム化した）ヌクレオチドをアッセイ培地に導入することができる。かかるタッグドヌクレオチドをDNAに取り込むと、Ｔ細胞増殖の測定手段として働く。このアッセイは、増殖に抗原提示を必要としないＴ細胞、例えばＴ細胞ハイブリドーマでは適当でない。それは、哺乳動物から単離した未形質転換Ｔ細胞のための、Ｔ細胞活性化のpenl融合ポリペプチドによる変調の測定に適する。融合ポリペプチド（類）との接触に続いてのＴ細胞増殖のレベルの低下は、融合複合体がＴ細胞の活性を変調し、免疫応答を抑制できることを示す。これらのin vitroアッセイは、Ｔ細胞受容体の活性（Ｔ細胞発生の活性化または阻害を含む）を変調できるペプチド（類）を選択し同定するのに使用できる。特に、ランダムなペプチドまたは選択したペプチドのライブラリーのいずれかをコードするDNA配列は、penl蛋白質もしくはその沈殿有効部分をコードするDNA配列および、所望により、１以上の切断部位を含有するペプチド配列をコードする DNA配列を含有する前記したごとき発現ベクター系にクローン化できる。適当な宿主細胞の形質転換および形質転換体の発現は前記したごとくに行うことができる。適当には、ゲノムDNAラリブラリー（Sambrook，et al.,前掲）の適当なcDNA の制限断片を、発現ベクターに挿入される配列源として使用するか、あるいは、別法として、公知配列の合成オリゴヌクレオチドのごとき選択したオリゴヌクレオチドを挿入配列として使用する。哺乳動物細胞および前記した他のもののごとき適当な宿主を、遺伝子融合、例えば標的ペプチドをコードする配列に連結した penl蛋白質もしくはその沈殿有効部分をコードする配列を含有するベクターで形質転換する。形質転換体を適当な条件下で培養し、それを選択したＴ細胞と接触させることによって、注目する融合ポリペプチドの発現について細胞をスクリーニングする。前記したアッセイ、例えばIL-2産生またはＴ細胞増殖の測定を使用して、発現された融合ポリペプチドとの接触がＴ細胞活性化を変調するか否かを判断する。例えば、APC-刺激Ｔ細胞のIL-2産生の低下は、Ｔ細胞の活性を変調し、免疫応答を抑制できる融合ポリペプチドを同定する。かかるAPC-刺激Ｔ細胞の IL-2産生の増加は、Ｔ細胞応答を増加でき、ワクチン接種適用にその用途を有する融合ポリペプチドを同定する。本明細書で言及するすべての書類はここに出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす。以下の非限定的実施例は本発明を例示するものである。実施例１ penl遺伝子を含有する適当な発現ベクターを構築するために、プラスミド pCC34からの標準的技術を鋳型として用い、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)によってpe nl遺伝子を増幅した。プラスミドpCC34はpenlを含有するPUC19ベクターであった。PCRの条件は以下の通りであった：100ngのプラスミドpCC34を鋳型として使用した（100μｌの最終容量中に、10ピコモルのプライマーFX-1およびFX-2（すぐ以下に述べる）、50mM KCl、20mMトリス−HCl pH8.4、2mM MgCl₂、100μg/mlウシ血清アルブミン、50μM dNTP、2.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ(Cetus Per kin-Elmer)。95℃、55℃および72℃で反応を25サイクル行った。penl遺伝子は、これらの同一プライマーを用い、Bacillus liceniformisから直接に標準的なPCR 技術によって増幅できた。penl遺伝子を増幅するのに使用した前記PCRプライマーは：であった。該上流PCRプライマーはPCR産物の5'末端にHindIII制限部位を付加するように設計し、該下流PCRプライマーはPCR産物の3'末端にNcoＩおよびBamHＩ制限部位を付加するように設計した。PCR産物をHindIIIおよびBamHＩで消化し、イー・コリのベクターpUC19のHindIII−BamHＩ部位にクローン化した。その結果、このベクター（tET002-3）は5'末端のHindIIIおよび3'末端のNcoＩおよびKpnＩによって挟まれたpenl遺伝子構築体を含有する。クローン化penl遺伝子の配列は、ABI DNA配列決定装置およびM13(+/-)ユニバーサル配列決定用プライマーを用いて確認した。融合ペプチドがイー・コリで高レベルで発現できることを示すために、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、ABIオリゴヌクレオチド合成器によって合成した。これらのオリゴヌクレオチドを後記するごとく相互にアニールし、プラスミド tET002-3のNcoＩ-KpnＩ部位にクローン化した。100ピコモルの各オリゴヌクレオチドを、44mM EDTAおよび66mM NaClの存在下で10分間煮沸し、ゆっくりと室温まで冷却した。これらのアニールしたオリゴを、penl遺伝子の3'末端のNcoＩ-Kpn Ｉ部位にクローン化した。このプラスミドをpCC50と命名した。次いで、遺伝子構築体、すなわち、penl遺伝子の5'側のHindIII部位ないしKpnＩ部位の5'側のBa mHＩ部位を、HindIII／BamHＩ部位を介し、PLプロモーターに対して3'の向きで、発現ベクターpDG160にサブクローン化した。適切に発現されると、この遺伝子は以下の９個のアミノ酸：Asp Ser Asp Arg Ala Ileu Glu Gly Argのペプチドにインフレーム融合したpenl蛋白質をコードするであろう。最初の２つのアミノ酸残基はNcoＩコドンによってコードされたPYであり、本明細書ではC9と命名する以下の９個のアミノ酸残基は、第Ｘa因子切断の血液因子プロトロンビンのカルボキシ末端と同一である。このプラスミドをpCC51と命名し、NcoＩおよびSalＩ部位の間のオリゴヌクレオチド配列を前記したごときに確認した。実施例２大量の融合ペプチドpenl：C9を発現させるために、株DG116：pCC51の500ml培養を、30℃にて、M9培地（１リットル容量当たり、Na₂HPO₄ 二塩基性リン酸ナトリウム６g、KH₂PO₄ ３g、NaCl 0.5g、NH₄Cl １gを添加し、オートクレーブ処理する。以下の滅菌添加：10mlの20％グルコース、10mlの0.01M CaCl₂、１mlの１M MgSO₄・７H₂O、20mgのBl（20μg/mlの最終濃度）、５ｇのカザミノ酸（Norit処理、最終濃度0.5％）および50μg/mlアンピシリンをなす）中で0.5ないし0.8のO Dまで増殖させた。42℃で５〜15分間インキュベートすることによって、培養を加熱ショックに付して、プラスミドのPLプロモーターからの発現を誘導した。次いで、培養を39℃で振盪しつつさらに１〜２時間インキュベートした。細胞を収穫し、10mlの溶解緩衝液(LB)（200ml容量当たり、20mlの1Mトリス緩衝液［pH8.0 ］、20mlの2M KCl、0.8mlの0.25 EDTA、0.4mlの1M CaCl₂、１mlの2M MgCl₂、20 μlの0.1M DTT、12.5mlの80％グリセロールおよび145.28mlの水を添加）に再懸濁した。次いで、1500PSIの圧力にて、細胞をフレンチ・プレスで破壊した。該フレンチ・プレスを10mlのSB緩衝液（500ml当たり、 50mlの1Mトリス［ｐＨ8.0］、10mlの1M CaCl₂、0.5mlの1M DTT、259mlの80％グリセロールおよび189.5mlの水）+200mM KClを添加）中で洗浄した。ポリエチレンイミンの10％溶液をゆっくり添加して0.6％の最終濃度とした。試料をBeckmam J2-HSローターJA-20中、４℃にて6000RPMで遠心した。上清を取り出し、貯蔵した。ペレット(DNA)関連蛋白質を抽出するために、該ペレットを５mlのSB緩衝液＋600mM KClに再懸濁し、４℃で１時間振盪した。次いで、試料を遠心し、上清を貯蔵したものに添加した。混合して上清を氷浴中で撹拌し、硫酸アンモニウムをゆっくりと添加して35％W/vの最終濃度とした。試料を４℃、6000RPMで１時間遠心し、ペレットを保持した。該ペレットを10mlのSB緩衝液+50mM KClに再懸濁し、透析バッグに負荷し、400mlの緩衝液を２回交換して一晩、４℃で透析した。沈殿した物質を穏やかに遠心することによって収集し、SB+50mM KClで洗浄した。ペレットを300μlの2M KClに再溶解し、100μlの10×SB緩衝液を添加し、60 0μｌの水をゆっくりと添加した（最終濃度はSB＋600mM HClであった）。penl： C9の純度を評価するために、20μlの試料を12.5〜15％SDS-PAGEで解像した。実施例３ペプチドC9における９個の各アミノ酸残基の効果を調べるために、セリンで置換した５位のアラニンを除き、各々をアラニンで別々に置換した。各突然変異蛋白質（標識tFP010-tFP018）のDNAおよびアミノ酸配列が同定される図２参照。これらのPenl：C9突然変異蛋白質を発現するベクターを構築するために、C9ペプチドの各位置においてアラニンについてのコドンを含有する以下の相補的オリゴヌクレオチド対を設計した：オリゴヌクレオチド対を前記したごとくに相互にアニールし、ベクターpCC50 のNcoＩ-BamHＩ部位にクローン化し、前記したごとくにDNA配列を確認し、全Pen l：C9構築体を前記したごとくにpDG160発現ベクターにサブクローン化した。これらのプラスミドの各々を前記したごとくにイー・コリ株DG116に導入し、同族体penl：C9ペプチドを発現させ、前記したごとくに精製した。精製したPenl：C9 突然変異蛋白質のTA1抗体(TA1)への結合は、いくつかの方法：１．ウェスタンブロット分析、２．ELSA法、および３．BIACore分析によって調べた。実施例４異なるPenl：C9突然変異蛋白質のTA1抗体（TA1は標準的な手法によってF1.2-C 9KLHで免疫化したマウスから生起させ；F1-2-C9はプロトロンビンの精製第Ｘa因子切断産物である）への異なる結合を分析するために、表面プラズモン共鳴検出 (BIAcore，Pharmacia-Biosensor)を用いるバイオセンサー系を用いた。この系はリアルタイムで固定化TA1への抗原の結合を記録する。 TA1は、製造業者(Pharmacia Biosensor)によって供されるアミンカップリングキットおよび方法を用いて、センサーチップ(CM5)のカルボキシメチル化デキストランマトリックスに化学的に固定化されている。この目的のため、TA1を10mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH4）中、57μg/mLに希釈した。11.5mg/mL N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)および75mg/mlN-エチル-N'-（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDC)の１：１混合物30μLでのセンサーチップの活性化の後、TA 1溶液５μLを３μL/分の液速で注入した。残存するデキストラン結合部位を、1M エタノールアミン(pH8.5)37μLでのチップ表面の処理によって不活化した。この結果、TA1の4541共鳴ユニット(RU)が固定された。モノ-Sクロマトグラフィー精製Penl：C9突然変異蛋白質、Penl：C9野生型（前記実施例１および３および図２で確認される）および天然Penl単独を、バイオセンサー系のP20を含有する溶出緩衝液（10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0 .005％P20界面活性剤、pH7.4）中、30μg/mLに希釈した。BIAcoreプログラムを以下のごとくに設定した：液速：５μl/分、25μLのPenl−ペプチド注入、Penl ：C9ペプチドをストリップすることによってTA1を再生する５μLの25mMNaOH注入。報告した地点は、１．試料注入10秒前（ベースライン）、２．NaOH 注入10秒前および３．NaOH注入100秒後（再生）に設定した。このプログラムに従って、各Penl：C9および天然Penl蛋白質を注入し、結合したpenl：C9突然変異蛋白質の量を表すＲＵにおける相対的応答を、１．報告地点から報告地点のRUを差し引くことによって計算し、２．次いで、結合パーセントを、野生型の相対的応答を100％に設定することによって計算した。C9融合ペプチドを含有しない天然PenlはTA1に対する有意な結合（＜５％）を示さなかった。７つのPenl：C9突然変異蛋白質は、野生型Penl：C9と比較して、TA1に対する6 5〜35％低い結合を示した。結合の結果を図３に詳細に示す。結合の最も劇的な減少が、C9ペプチドにおいてイソロイシンをアラニンで置換した場合に観察され；この場合、結合は野生型Penl：C9と比較して10％に過ぎなかった。また、カルボキシ末端アルギニンのアラニンへの置換の結果、TA1への結合が野生型と比較して20％まで有意に低下したにすぎなかった。実施例５ Penl：トロポニン１およびPenl：SH融合の発現さらなるpenl融合ポリペプチドを発現させ、単離し、第１のものは、35個のアミノ酸のトロポニン１エピトープ（成熟ヒト・トロポニン１の、アミノ酸26〜60 、Tn135、モノクローナル抗体(mAB)2F6.6および2B1.9によって認識される）を含有するペプチドを含むものであり、第２の融合は、GAP-NのSH2ドメインの標的ペプチド部分を含有するものであった。 Tn135をコードするDNA断片を、標準的なPCR技術によって、以下のプライマーにて、Tn1遺伝子を含有するプラスミドから増幅した。 PCR産物をNcoＩおよびBamHＩで消化し、前記実施例１に記載したごとくにベクターpCC51にクローン化した。得られたプラスミドpCC51：Penl-Tnl35をイー・コリ株DG116に導入し、得られた株を前記実施例１に記載したごとくに融合蛋白質の発現のために誘導した。これらの細胞の可溶性画分を前記したごとくに加工し、精製した融合ペプチドをSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析によって分析した。図４参照。結果は、この融合ペプチドは全細胞蛋白質の20％まで発現されることを示す。融合ペプチドを、精製プロセスを通じて10mMPMSFを使用緩衝液に添加した以外は前記実施例１に記載したごとくに精製した。回収したペプチドのほぼ40％を、精製プロセスの間にそのカルボキシ末端から加工し、これは、その融合ペプチドが細胞内では安定であるが、これらの条件下では不安定であり得ることを示す。同様に、GAP-NのSH2ドメイン（長さが92個のアミノ酸）をPenl遺伝子に融合させた。SH2ドメインをコードするDNA断片を以下のごとくにクローン化した。重複 (overlap)PCRを以下のプライマーを用いて行った。 CLC 107およびCLC 108を、Penl遺伝子を含有するDNA鋳型でのPCR反応で用いた。CLC 107はPenlの5'末端にHindIII部位を位置させ、CLC 108は3'末端に15個のアミノ酸リンカーを位置させる。CLC 109およびCLC 119は、GAP-N SH2遺伝子を含有するDND鋳型でのPCR反応で用いた。CLC 109はGAP-N SH2の5'末端に15個のアミノ酸リンカーを位置させ、CLC 119は3'末端にBamHI部位を位置させる。次いで、各反応からの得られたPCR産物を、CLC 107およびCLC 119での新しいＰＣＲ反応において、一緒に添加した。Penl−リンカー-SH2を含有する得られた断片をHi ndIIIおよびBamHIで消化し、次いで、pDG160発現ベクターに連結し、およびイー・コリTrpプロモーターから下流のベクターpTR3に連結した。この融合ペプチドをイー・コリで発現させ、前記実施例１で記載したごとくに精製した。結果は、Penl：Tn 135融合ペプチドと同様に、精製の間にそれが加工されることを示す。pDG160ベクターからの全長融合ポリペプチドの回収を最大化するために、分解前に１〜10mm PMSFを細胞に添加した。pTRP3構築体からの回収を最大化するため、培養を30℃で増殖させた。実施例６競合ELISA法によるPenl：C9突然変異蛋白質−対−Penl：C9野生型の比較 HPLCモノＳ精製Penl：C9突然変異蛋白質および野生型(wt)（前記実施例１および３ならびに図３で確認される）を、競合ELISA法にて、抗−C9特異的プロテインＡ精製mAbTA1に対するその相対的結合についてテストした。該アッセイは、受動的技術によって（10mng蛋白質／ウェル）、Penl：C9(wt)で予め被覆したマイクロタイタープレートを用いて行った。Penl：C9(wt)およびPenl：C9突然変異蛋白質の希釈物を、濃度271ng/mlのmAbTAlと共に室温で１時間プレインキュベートした。プレートを洗浄し、各試料100μl/ウェルを適用し、室温で1/2時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、ヤギ抗−マウスIgGHRPコンジュゲートの１：20 00希釈物の100μl/ウェルを添加した。プレートを室温でさらに1/2時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質(ABTS)100μl/ウェルを添加し、室温で８分間反応させた。各ウェルを１％SDS停止溶液100μｌでクエンチした。Biot ec Plate readerを用いて、405nmにてELISA法シグナルを読み取った。収集したデータをEXCEL 4.0ソウトウェアを用いて解析した。前記したごとくTA1と反応させたpenl欠損C9の希釈物で観察された値の平均として、最大（100％）ELISA法シグナルを決定した。競合するPenl：C9融合蛋白質の0.2μMの濃度で測定したELIS A法シグナルを用いることによって、TA1結合の阻害をすべてのPenl：C9突然変異蛋白質およびPenl：C9(wt)について比較した。これは、Penl：C9(wt)がこのELIS A法で生じた最大シグナルと比較して50％シグナルを生じた濃度であった。図５は、棒グラフにおいてTA1に対するパーセント結合として表したこのデータを示す。結果し、すべての９個のアミノ酸残基が結合に必要なのではないことを明らかに示す。ペプチドDSDRAIEGRのアミノ末端はペプチドのカルボキシ末端に対してTA1への結合に重要ではないことが示される。より詳しくは、結果は、ペプチドの配列RAIXGRがペプチドの結合のほとんどに寄与することを示す。実施例７ Penl：Tnl融合ポリペプチドからのトロポニンｌ35アミノ酸ペプチドの切断および精製融合蛋白質Penl：Tnl135からTnl35ペプチドを精製するために、精製Penl：Tnl 35の23.7μgを、37℃にて、0.004ユニットの第Ｘa因子（Sigma Diagnostics 870 -10）で30分間消化した。次いで、試料を0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)に移し、水中の0.1％TFA（溶媒Ａ）で平衡化し、かつWaters 625液体クロマトグラフィー系に連結した、予め充填したPharmacia PepRPC C2/C18逆相カラム（0.5×６cm、５μm粒子サイズ）に負荷した。カラムを、１ml/分の液速にて、０〜100％溶媒Ｂ（アセトニトリル中0.1％TFA）の直線グラジエントで溶出させた。214nmの吸光度をモニターして、溶出したペプチドをモニターした。Tnl35切断ペプチドについての保持時間は12.2分であった。保持時間は対照としての同一の合成ペプチドの実験と同一であった。実施例８ Penl：C9でのマウスの免疫化パート１免疫化のための担体としての融合ペプチドPenl：C9の効率を示すために、図６に示した表に各々記載したフロイントの完全もしくは不完全アジュバント中、腹腔内または皮下注射いずれかによって、Balb/cマウスを、本発明のKLHもしくはF 1.2-C9penl融合ポリペプチドに結合したF1.2-C9（実施例１および３ならびに図２参照）で免疫化した。その表において、表示「CFA」とはフロイントの完全アジュバントをいい、「IFA」とはフロイントの不完全アジュバントをいい、「i.P .」とは腹腔内投与をいい、「subcut.」とは皮下投与をいう。注射日は、感作の日（第１日）を参照して与える。パート２免疫化マウスから採血し、一般に図７に示した表に記載したごとくC9ペプチドに対する特異的抗体応答についてアッセイした。特に、マウスは、F1.2-C9 KLH#3での感作の後第70日（第１ブースト）および第101日（第２ブースト）に、また、融合ポリペプチドF1.2-C9penl#1での感作後３２日に免疫化し、抗原（KLH またはOvaに結合したF2またはF1.2-C9合成ペプチド）被覆マイクロタイタープレートウェルでのサンドイッチELISAアッセイによって、F1.2-C9ペプチドおよびF2 （切形F1.2蛋白質）に対する特異的抗体応答につきアッセイした。対照はF1.2.- C9コンジュゲートで予め免疫化したマウスの血清およびTA1モノクローナル抗体（TA1は、標準的方法によってF1.2-C9KLHで免疫化したマウスから生起させたものである）を含むものであった。力価は、バックグラウンドの２倍と同等またはそれよりも大きいELISA法シグナルを生じる最高希釈として決定された。図７の表に示す結果は、マウスが、合成ペプチドKLHコンジュゲートで、免疫化したマウスのものと匹敵する力価にて、Penl：C9ペプチドに応答することを示した。実施例９本発明の組換え融合ポリペプチド（Penl：Ova融合蛋白質）の構築および発現組換えpenl:Ova蛋白質を発現するプラスミドを構築するために、以下の相補的オリゴヌクレオチドを設計し、ABIオリゴヌクレオチド合成器によって合成した。 100ピコモルの各オリゴヌクレオチドを前記実施例１に記載したごとくにアニールし、penl遺伝子の3'末端のプラスミドpCC51のNcoＩ-BamHＩ部位にクローン化した。かくして、この遺伝子は、カルボキシ末端における以下の２１個のアミノ酸：IEGRISQAVHAAHAEINEAGR（配列番号：54）のアミノ酸にイン−フレーム融合したpenl蛋白質をコードする。第１の４個のアミノ酸残基は第Ｘa因子切断部位を表し、以下の17個のアミノ酸残基はOvaペプチドと同一である（A.Sette et al.，Nature 328:395(1987)）。得られたプラスミドをpMB01と命名し、 NcoＩおよびBamHＩ部位の間のオリゴヌクレオチドを確認した。このプラスミドをイー・コリ株DG116に移し、融合蛋白質Penl：Ovaを発現させ、前記実施例２に記載したごとくに精製した。モノ−Ｓクロマトグラフィー精製の後、1.4mgの高度に精製したPenl：Ovaを回収した。実施例10 抗原提示細胞の活性化およびＴ細胞の刺激本発明の融合ポリペプチドがAPCを負荷しＴ細胞を活性化する効率をテストした。penl：Ova融合ポリペプチド（すなわち、Ova標的ペプチドに連結したpenl蛋白質を含有する融合ペプチド）を他の物質と同様に使用した。A20 APCおよびDO1 1T細胞ミエローマ細胞系を利用して３つの独立した実験を行った。DO11細胞は、 A20 APCによって提示されたOva負荷主要組織適合性遺伝子複合体クラスII（MHCI I）分子に特異的に応答する。A20細胞に、５μgの精製penl：Ova融合ポリペプチドまたは５μgの合成Ovaペプチド（Mimetics，Chiron Corp.によって合成された陽性対照）を１時間負荷した。１×10⁵DO11細胞を添加し、負荷したA20細胞と共に24時間インキュベートした。DO11細胞の活性化の程度は、インターロイキン２ (IL-2)の培地への放出によって測定した。インキュベーションの24時間後、上清を収集し、（Pharmaciaからの２の抗IL2抗体を用いて）IL-2についてELISAフォーマットで分析した。以下の表は３つの実験の結果をまとめ、いくつかの陰性対照を含む。これらの対照のうち１つは、第Ｘa因子切断認識部位IEGRNLCNIPCSALLSS（配列番号：55）が先行するニワトリ卵リゾチウム(HEL)を含有するPenl：Ova融合蛋白質であり、従って、D001細胞を刺激しない。以下のオリゴヌクレオチド対を用いる以外は、Penl：HEL融合蛋白質はPenl：O vaのごとくに正確に構築した。前記表に記載の結果は、Ovaペプチドおよびpenl：Ova融合ペプチドはDO11細胞を刺激するが、陰性対照は刺激しないことを示す。表に記載した結果は、penl： OvaペプチドはDO11細胞を刺激するにおいてOvaペプチド自体と同程度効果的であることを示す。また、結果は、penl：Ova融合ペプチドは輸送され、A20 APCによって加工され、MHCII分子との関係でDO11TCR（Ｔ細胞受容体）に適当に提示されることを示す。実施例１１ Ovaペプチドと比較したPenl：Ovaの効率 penl：Ova蛋白質融合ポリペプチドが、DO11細胞を刺激するにおいてモルベースでOvaペプチドと同程度効果的であることを示すために、３つの力価測定実験を行い、以下の表ＡおよびＢ中、実験１、実験２および実験３と示す。等モル量のpenl：OvaおよびOvaペプチドをA20/DO11活性化アッセイで用い、これは、前記実施例10に記載したごとくに行った。結果は、以下の表Ａおよび表Ｂにまとめる。実験１においてPenl:OvaおよびOvaペプチドの相対的活性を計算するために、P enl：Ova(1624pg/ml)の6.0×10^-11モル／ウェルについて放出されたIL-2レベルをOva単独についてのIL-2曲線と逆適合させて、1.9×10^-10モルOva／ウェルを得た。逆適合値（1.9×10^-10）をウェル当たりのOvaの現実のモル（６×10^-11）で除して３を得る。よって、Penl：Ovaは、DO11細胞を刺激するにおいて、Ovaペプチド単独よりもモルベースで３倍効果的である。この実験を２回反復し（実験２および３）、結果は、実験２および３において、Penl：Ovaは、各々、Ovaペプチドよりもモルベースで16倍および８倍効果的であることを示す。好ましい具体例を参照して本発明を詳細に記載してきた。しかしながら、当業者ならば、この開示を考慮すると、本発明の精神および範囲の中で修飾および改良をなせることを認識するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/531 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者キャシピット，クレイトンアメリカ合衆国33015―5459フロリダ、ハイアリー、ノースウェスト179ストリート 7110 (72)発明者シャベイラス，ピエール・アンドルアメリカ合衆国33026フロリダ、クーパーシティー、メイルセイルドライブ 10939 (72)発明者ウィットマン，ボーガンアメリカ合衆国33332フロリダ、フォートローダーデイル、ウェストブルック 2967

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）標的ペプチドおよびpenl蛋白質もしくはその沈殿有効部分を含む融合ポリペプチドを溶液中に供し；次いで、（ｂ）該ポリペプチドを、該融合ポリペプチドを沈殿させるのに十分なイオン強度を有する水性溶液と接触させることを含む、標的ペプチドの製造方法。２．該ポリペプチドを、約200mM以下の塩濃度を有する緩衝液と接触させるものである、請求項１の方法、３．該塩がKClである請求項２の方法。４．該融合ポリペプチドが粗細胞抽出物中の溶液中にあるものである、請求項１の方法。５．連結配列をpenl蛋白質もしくはその部分と標的ペプチドとの間に位置させるものである、請求項１の方法。６．該連結配列が蛋白質分解切断部位を含むものである、請求項５の方法。７．該切断部位が第Ｘa因子部位である、請求項６の方法。８．該標的ペプチドが約250以下のアミノ酸を含有するものである、請求項１の方法。９．該標的ペプチドが約140以下のアミノ酸を含有するものである、請求項１の方法。 10．該標的ペプチドが約70以下のアミノ酸を含有するものである、請求項１の方法。 11．該ポリペプチドを透析工程の間に該溶液と接触させるものである、請求項１の方法。 12．該ポリペプチドを、約100mM以下の塩濃度を有する水性溶液に対して透析するものである、請求項11の方法。 13．該融合ポリペプチドを、（ｉ）該融合ポリペプチドを形質転換宿主細胞中で発現するクローニングベクターを供し；（ii）適当な宿主細胞を該クローニングベクターで形質転換し、次いで、（iii）融合ポリペプチドの発現に適した条件下で形質転換宿主細胞を培養することによって供するものである、請求項１の方法。 14．該融合ポリペプチドから該標的ペプチドを切断することを更に含むものである、請求項１の方法。 15．沈殿させた該融合ポリペプチドを水性溶液に溶解させ、次いで、該ポリペプチドを、該融合ポリペプチドを沈殿させるのに十分なイオン強度を有するさらなる水性溶液と接触させるものである、請求項１の方法。 16．該接触が約85パーセント以上の純度のポリペプチドを提供するものである、請求項１の方法。 17．Penl蛋白質もしくはその沈殿有効部分をコードするDNA配列と；そして標的ペプチドをコードするDNA配列と；を含む、標的ペプチドに融合したpenlペプチドもしくはその有効部分を発現できるDNA融合ベクター。 18．penl蛋白質もしくはその部分をコードする該DNA配列と標的ペプチドをコードする該DNA配列との間に配置された、連結配列をコードするDNA断片を更に含むものである、請求項17のDNA融合ベクター。 19．連結配列をコードする該DNA断片が１以上の切断部位を更に含むものである、請求項18のDNA融合ベクター。 20．標的ペプチドに融合したpenl蛋白質もしくはその沈殿有効部分を含むものである、融合ポリペプチド。 21．連結セグメントがpenl蛋白質もしくはその有効部分と標的ペプチドとの間に挿入されているものである、請求項20のポリペプチド。 22．該連結セグメントが１以上の切断部位を含むものである、請求項21のポリペプチド。 23．標的ペプチドに融合したpenl蛋白質もしくはその部分を含む融合ポリペプチドを哺乳動物に投与することを含み、それにより該投与が哺乳動物による所望の免疫応答を誘導するものである、哺乳動物の免疫化方法。 24．請求項１に従って標的ペプチドおよびpenl蛋白質もしくはその沈殿有効部分を含む融合ポリペプチドを生産し、そして、選択したペプチドの結合ドメインに対する、該融合ポリペプチドまたは該融合ポリペプチドの単離した標的ペプチドの結合活性を測定することを含む、ペプチドの１以上のエピトープを同定する方法。 25．該選択したペプチドが抗体である請求項24記載の方法。 26．標的ペプチドおよびpenl蛋白質もしくはその沈殿有効部分を含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築体を各々が含有するものであるクローニングベクターで宿主細胞を形質転換し；該融合ポリペプチドの発現に適した条件下で該形質転換宿主細胞を培養し；そして、該標的ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択することを含む、特徴とする標的ポリペプチドの選択方法。 27．該標的ポリペプチドがゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーからのDNA断片によってコードされたものである、請求項26の方法。 28．該選択された標的ポリペプチドが、該ポリペプチドを沈殿させるのに十分なイオン強度を有する溶液と該ポリペプチドを接触させることによって単離されるものである、請求項26の方法。 29．Ｔ細胞の活性を変調できるペプチドを同定するための方法であって、１）抗原提示細胞を、標的ペプチドおよびpenl蛋白質もしくはその沈殿有効部分よりなる融合ポリペプチドと接触させ；そして、２）該抗原提示細胞をＴ細胞と接触させることを含む方法。 30．該抗原提示細胞を該融合ポリペプチドおよびＴ細胞とin vitroで接触させるものである、請求項29の方法。