JPH09173059A - マレク病ウイルスに感染した維持可能なニワトリ細胞株 - Google Patents
マレク病ウイルスに感染した維持可能なニワトリ細胞株Info
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- JPH09173059A JPH09173059A JP8282247A JP28224796A JPH09173059A JP H09173059 A JPH09173059 A JP H09173059A JP 8282247 A JP8282247 A JP 8282247A JP 28224796 A JP28224796 A JP 28224796A JP H09173059 A JPH09173059 A JP H09173059A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 マレク病ウイルスに感染した維持可能なニワ
トリ細胞株、およびこれを用いて鳥類を感染させてマレ
ク病に対する免疫を与える方法を提供する。 【構成】 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能なニワトリ細胞株は、ニワトリヘルパー因子（Ｃｈ
ｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチル−Ｎ
1 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処
理し、次にインビボで鳥類に感染することができるＭＤ
Ｖで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られ
る。このものは、免疫能を引き出すためのウイルスワク
チンとして使用できる。
トリ細胞株、およびこれを用いて鳥類を感染させてマレ
ク病に対する免疫を与える方法を提供する。 【構成】 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能なニワトリ細胞株は、ニワトリヘルパー因子（Ｃｈ
ｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチル−Ｎ
1 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処
理し、次にインビボで鳥類に感染することができるＭＤ
Ｖで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られ
る。このものは、免疫能を引き出すためのウイルスワク
チンとして使用できる。
Description
【０００１】
発明の背景 （１）発明の要約 本発明は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能なニワトリ細胞株に関する。特に本発明は、ウイル
スワクチンとして使用でき、改変したＭＤＶ株を産生す
る系として使用でき、細胞株に及ぼす種々の試薬や増殖
条件の経時的影響を測定するために使用できる細胞株に
関する。
可能なニワトリ細胞株に関する。特に本発明は、ウイル
スワクチンとして使用でき、改変したＭＤＶ株を産生す
る系として使用でき、細胞株に及ぼす種々の試薬や増殖
条件の経時的影響を測定するために使用できる細胞株に
関する。
【０００２】
（２）関連技術の説明 マレク病（ＭＤ）は、ニワトリの非常に感染しやすいリ
ンパ球増殖性の疾患であり、内蔵、筋肉、および末梢神
経中のリンパ球の浸潤を特徴とする。ＭＤの病原菌であ
る、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）と呼ばれる鳥類ヘルペ
スウイルスは、感染性が強く、細胞に結合している（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）とアール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔ
ｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビー・ダブリュ
ー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）編）、３４
２−３８５頁、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍ
ｅｓ）、アイオワ（１９９１））。ＭＤＶは、Ｂリンパ
球や組織培養で増殖している細胞中で産生制限的に複製
する。完全にエンベロープで包まれたウイルスの産生
は、感染した鳥の羽の濾胞上皮に限定される（アール・
エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｎ
ａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ４９：１１２１−
１１３０（１９７２）；ビー・ダブリュー・カルネック
（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１
４：２１９−２３３（１９７０））。ＭＤＶは、Ｔリン
パ球中で急速に潜伏感染を確立し、最終的に悪性形質転
換と新生物疾患を引き起こす（ダブリュー・アール・シ
ェック（Ｓｈｅｋ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７０：４８５−４９１（１９８
３））。しかし、ＭＤＶ感染Ｔリンパ球中の潜伏と形質
転換の間の正確な関係は不明である。ワイ・アキヤマ
（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ）ら（マレク病のリンパ腫からの
連続細胞培養、Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１６：１７７−１７９
（１９７３））は、ＭＤ感染したニワトリから、初めて
Ｔリンパ芽球細胞株の樹立に成功した。それ以来、ＭＤ
リンパ腫から８０以上の細胞株が産生されている（ワイ
・アキヤマ（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ）ら、マレク病のリン
パ腫からの２つの細胞株。Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１７：１０
５−１１６（１９７４）；ピー・シー・パウエル（Ｐｏ
ｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２５１：７９
−８０（１９７４）；ビー・ダブリュー・カルネック
（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ２１：１００−１０７（１９７８）；エル・エヌ
・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ ２８：７５７−７６６（１９８１）；ケー
・ナゼリアン（Ｎａｚｅｒｉａｎ Ｋ．）とアール・エ
ル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、Ｊ．Ｎａｔ
ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５４：４３５−４５８
（１９７５））。いくつかの研究には適しているが、こ
れらの細胞株は元々の発生から何代も継代されており、
形質転換している。
ンパ球増殖性の疾患であり、内蔵、筋肉、および末梢神
経中のリンパ球の浸潤を特徴とする。ＭＤの病原菌であ
る、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）と呼ばれる鳥類ヘルペ
スウイルスは、感染性が強く、細胞に結合している（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）とアール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔ
ｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビー・ダブリュ
ー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）編）、３４
２−３８５頁、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍ
ｅｓ）、アイオワ（１９９１））。ＭＤＶは、Ｂリンパ
球や組織培養で増殖している細胞中で産生制限的に複製
する。完全にエンベロープで包まれたウイルスの産生
は、感染した鳥の羽の濾胞上皮に限定される（アール・
エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｎ
ａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ４９：１１２１−
１１３０（１９７２）；ビー・ダブリュー・カルネック
（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．１
４：２１９−２３３（１９７０））。ＭＤＶは、Ｔリン
パ球中で急速に潜伏感染を確立し、最終的に悪性形質転
換と新生物疾患を引き起こす（ダブリュー・アール・シ
ェック（Ｓｈｅｋ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７０：４８５−４９１（１９８
３））。しかし、ＭＤＶ感染Ｔリンパ球中の潜伏と形質
転換の間の正確な関係は不明である。ワイ・アキヤマ
（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ）ら（マレク病のリンパ腫からの
連続細胞培養、Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１６：１７７−１７９
（１９７３））は、ＭＤ感染したニワトリから、初めて
Ｔリンパ芽球細胞株の樹立に成功した。それ以来、ＭＤ
リンパ腫から８０以上の細胞株が産生されている（ワイ
・アキヤマ（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ）ら、マレク病のリン
パ腫からの２つの細胞株。Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１７：１０
５−１１６（１９７４）；ピー・シー・パウエル（Ｐｏ
ｗｅｌｌ，Ｐ．Ｃ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２５１：７９
−８０（１９７４）；ビー・ダブリュー・カルネック
（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．Ｗ．）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ ２１：１００−１０７（１９７８）；エル・エヌ
・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ ２８：７５７−７６６（１９８１）；ケー
・ナゼリアン（Ｎａｚｅｒｉａｎ Ｋ．）とアール・エ
ル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、Ｊ．Ｎａｔ
ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５４：４３５−４５８
（１９７５））。いくつかの研究には適しているが、こ
れらの細胞株は元々の発生から何代も継代されており、
形質転換している。
【０００３】エピソーム型も存在するが、ＭＤリンパ芽
球様細胞株中のウイルスゲノムは主に細胞の染色体に取
り込まれていることを示唆する証拠がある（エィチ・ジ
ェイ・デレクルース（Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅ，Ｈ．−
Ｊ．）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：８２−９２（１９９
３））。形質転換されたリンパ芽球様細胞株中のウイル
スの転写を解析すると、ウイルスゲノムの約２０％に限
定されている、可変であるが限定された転写活性が明ら
かになった（ティー・マレイ（Ｍａｒａｙ，Ｔ）ら、Ｖ
ｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２：４９−６８（１９８
８））。形質転換したリンパ芽球様細胞中のＭＤＶ特異
的転写体は、主に長い領域末端反復配列と短い領域末端
反復配列（それぞれＴＲL 、およびＴＲS ）、および内
部反復配列（それぞれ、ＩＲL およびＩＲR ）から得ら
れる。長いユニーク領域（ＵL ）または短いユニーク領
域（ＳL ）には、転写活性はほとんど検出されない（ケ
ー・スガヤ（Ｓｕｇａｙａ，Ｋ．）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６４：５７７３−５７８２（１９９０））。ＭＤＶ
は、初代または第２代ニワトリおよびカモ胚繊維芽細胞
（それぞれ、ＣＥＦとＤＥＦ）と同時培養することによ
り、いくつかのリンパ芽球様細胞株からレスキュー（ｒ
ｅｓｃｕｅ）され、これがインビトロでのＭＤＶの溶菌
サイクルを支持している（ケー・エー・シャット（Ｓｃ
ｈａｔ，Ｋ．Ａ．）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４
４：１０１−１０９（１９８９））。さらにいくつかの
リンパ芽球様細胞株は、感受性のある鳥に注入するとＭ
Ｄを誘導するであろう（ワイ・アキヤマ（Ａｋｉｙａｍ
ａ，Ｙ）ら、マレク病のリンパ腫からの連続細胞培養、
Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１６：１７７−１７９（１９７３）；
ケー・ナゼリアン（Ｎａｚｅｒｉａｎ Ｋ．）ら、Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２１：６９−７６（１９７
７））。
球様細胞株中のウイルスゲノムは主に細胞の染色体に取
り込まれていることを示唆する証拠がある（エィチ・ジ
ェイ・デレクルース（Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅ，Ｈ．−
Ｊ．）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：８２−９２（１９９
３））。形質転換されたリンパ芽球様細胞株中のウイル
スの転写を解析すると、ウイルスゲノムの約２０％に限
定されている、可変であるが限定された転写活性が明ら
かになった（ティー・マレイ（Ｍａｒａｙ，Ｔ）ら、Ｖ
ｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２：４９−６８（１９８
８））。形質転換したリンパ芽球様細胞中のＭＤＶ特異
的転写体は、主に長い領域末端反復配列と短い領域末端
反復配列（それぞれＴＲL 、およびＴＲS ）、および内
部反復配列（それぞれ、ＩＲL およびＩＲR ）から得ら
れる。長いユニーク領域（ＵL ）または短いユニーク領
域（ＳL ）には、転写活性はほとんど検出されない（ケ
ー・スガヤ（Ｓｕｇａｙａ，Ｋ．）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６４：５７７３−５７８２（１９９０））。ＭＤＶ
は、初代または第２代ニワトリおよびカモ胚繊維芽細胞
（それぞれ、ＣＥＦとＤＥＦ）と同時培養することによ
り、いくつかのリンパ芽球様細胞株からレスキュー（ｒ
ｅｓｃｕｅ）され、これがインビトロでのＭＤＶの溶菌
サイクルを支持している（ケー・エー・シャット（Ｓｃ
ｈａｔ，Ｋ．Ａ．）ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４
４：１０１−１０９（１９８９））。さらにいくつかの
リンパ芽球様細胞株は、感受性のある鳥に注入するとＭ
Ｄを誘導するであろう（ワイ・アキヤマ（Ａｋｉｙａｍ
ａ，Ｙ）ら、マレク病のリンパ腫からの連続細胞培養、
Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１６：１７７−１７９（１９７３）；
ケー・ナゼリアン（Ｎａｚｅｒｉａｎ Ｋ．）ら、Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２１：６９−７６（１９７
７））。
【０００４】１９７０年代の生きたウイルスのマレク病
ウイルスワクチンの開発以来、マレク病による死亡は大
幅に低下した（カルネック（Ｃａｌｎｅｋ）とウィッタ
ー（Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）、エィチ・ジェイ・バーンズ（Ｈ．Ｊ．Ｂａｒｎ
ｅｓ）、シー・ダブリュー・ビアド（Ｃ．Ｗ．Ｂｅａｒ
ｄ）、ダブリュー・エム・レイド（Ｗ．Ｍ．Ｒｅｉ
ｄ）、およびエィチ・ダブリュー・ヨーダー・ジュニア
（Ｈ．Ｗ．Ｙｏｄｅｒ，Ｊｒ．）編）、３４２−３８５
頁、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍｅｓ）、ア
イオワ（１９９１））。最も広く使用されているマレク
病ワクチンは、生きた七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ
すなわち血清型３ＭＤＶ）、またはＨＶＴとＭＤＶの非
病原性血清型２株（ＭＤＶ−２）の２価混合物である。
ＨＶＴとＭＤＶの非病原性血清型２株の２価混合物は、
ＨＶＴが充分に有効でない場合に特に、マレク病に対し
て相乗的防御作用を示す（アール・エル・ウィッター
（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）ら、マレク病ウイルスの毒性
の強い株に対する弱毒化ワクチンおよび多価ワクチンに
よる防御。Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．１１：４９−６２
（１９８２）；アール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗ
ｉｔｔｅｒ）とエル・エフ・リー（Ｌ．Ｆ．Ｌｅｅ）、
多価マレク病ワクチン：母体からの抗体を有するニワト
リにおける安全性、有効性および防御相乗作用。Ａｖｉ
ａｎ Ｐａｔｈ．１３：７５−９２（１９８４）；アー
ル・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、予防
接種の原理。「マレク病：制御の科学的基礎と方
法」（”Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏ
ｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ”）中。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐ
ａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、２０３−２５０頁、マリヌ
スニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐ
ｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州（１９８
５））。マレク病ワクチンは、家禽産業の分野で最も広
く使用されているワクチンである。現在のマレク病ワク
チンは、感染したニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の懸
濁物、またはマレク病ウイルス（ＭＤＶ）の種々の株で
感染させた超音波処理したＣＥＦから作成した、細胞を
含まないウイルス懸濁物のいずれかである。
ウイルスワクチンの開発以来、マレク病による死亡は大
幅に低下した（カルネック（Ｃａｌｎｅｋ）とウィッタ
ー（Ｗｉｔｔｅｒ）、「家禽類の疾患：マレク病」（ビ
ー・ダブリュー・カルネック（Ｃａｌｎｅｋ，Ｂ．
Ｗ．）、エィチ・ジェイ・バーンズ（Ｈ．Ｊ．Ｂａｒｎ
ｅｓ）、シー・ダブリュー・ビアド（Ｃ．Ｗ．Ｂｅａｒ
ｄ）、ダブリュー・エム・レイド（Ｗ．Ｍ．Ｒｅｉ
ｄ）、およびエィチ・ダブリュー・ヨーダー・ジュニア
（Ｈ．Ｗ．Ｙｏｄｅｒ，Ｊｒ．）編）、３４２−３８５
頁、アイオワ州立大学出版、エームス（Ａｍｅｓ）、ア
イオワ（１９９１））。最も広く使用されているマレク
病ワクチンは、生きた七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ
すなわち血清型３ＭＤＶ）、またはＨＶＴとＭＤＶの非
病原性血清型２株（ＭＤＶ−２）の２価混合物である。
ＨＶＴとＭＤＶの非病原性血清型２株の２価混合物は、
ＨＶＴが充分に有効でない場合に特に、マレク病に対し
て相乗的防御作用を示す（アール・エル・ウィッター
（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）ら、マレク病ウイルスの毒性
の強い株に対する弱毒化ワクチンおよび多価ワクチンに
よる防御。Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．１１：４９−６２
（１９８２）；アール・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗ
ｉｔｔｅｒ）とエル・エフ・リー（Ｌ．Ｆ．Ｌｅｅ）、
多価マレク病ワクチン：母体からの抗体を有するニワト
リにおける安全性、有効性および防御相乗作用。Ａｖｉ
ａｎ Ｐａｔｈ．１３：７５−９２（１９８４）；アー
ル・エル・ウィッター（Ｒ．Ｌ．Ｗｉｔｔｅｒ）、予防
接種の原理。「マレク病：制御の科学的基礎と方
法」（”Ｍａｒｅｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏ
ｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ”）中。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐ
ａｙｎｅ，Ｌ．Ｎ．）編）、２０３−２５０頁、マリヌ
スニジョフ出版（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐ
ｕｂ．）、ボストン、マサチューセッツ州（１９８
５））。マレク病ワクチンは、家禽産業の分野で最も広
く使用されているワクチンである。現在のマレク病ワク
チンは、感染したニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の懸
濁物、またはマレク病ウイルス（ＭＤＶ）の種々の株で
感染させた超音波処理したＣＥＦから作成した、細胞を
含まないウイルス懸濁物のいずれかである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＭＤＶを扱う場合の２
つの大きな問題点は、ウイルスが細胞に強く結合してい
ることと、ウイルス産生性（溶菌性）感染を受ける維持
可能な細胞培養系がないことである。初代ＣＥＦおよび
ＤＥＦは、ＭＤＶ複製に対して許容性（ｐｅｒｍｉｓｓ
ｉｖｅ）である。しかし、これらの培養物は寿命が限ら
れており（約３週間）、従って感染した初代細胞を未感
染細胞の単層に継代してＭＤＶを増殖させ、扱うことが
できる充分な量のウイルスを得る必要がある。このよう
な条件はまた、有効な一時的制御研究のための１工程増
殖実験の樹立を不可能にする。ＣＥＦとＤＥＦの短い寿
命はまた、突然変異研究における正の選択を困難にす
る。
つの大きな問題点は、ウイルスが細胞に強く結合してい
ることと、ウイルス産生性（溶菌性）感染を受ける維持
可能な細胞培養系がないことである。初代ＣＥＦおよび
ＤＥＦは、ＭＤＶ複製に対して許容性（ｐｅｒｍｉｓｓ
ｉｖｅ）である。しかし、これらの培養物は寿命が限ら
れており（約３週間）、従って感染した初代細胞を未感
染細胞の単層に継代してＭＤＶを増殖させ、扱うことが
できる充分な量のウイルスを得る必要がある。このよう
な条件はまた、有効な一時的制御研究のための１工程増
殖実験の樹立を不可能にする。ＣＥＦとＤＥＦの短い寿
命はまた、突然変異研究における正の選択を困難にす
る。
【０００６】家禽産業では、マレク病ワクチンの製造に
使用でき、多価ワクチンのための組換えＭＤＶベクター
の開発を簡便にできる継続性のある鳥類細胞株を必要と
してきた。多くの鳥類細胞株が開発されている（ケー・
ナザリアン（Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｋ．）、鳥類細胞株と
移植可能な癌の最新のリスト。Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．
１２：５２７−５４４（１９８７））が、これらはいず
れもワクチン製造においてＣＥＦ細胞を代替することが
できない。従来の細胞株は、ウイルスで形質転換した細
胞に由来するか、または、化学的に形質転換した細胞に
由来する場合は、ニワトリに接種すると癌を産生したた
め、うまくいかなかった。ＭＤＶの増殖に適した維持可
能な細胞株は存在しないため、ＭＤＶワクチン産業では
ワクチンウイルスの製造に初代ニワトリ胚繊維芽細胞
（ＣＥＦ）を使用している（エー・イー・チャーチル
（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、ワクチンの製造。
「マレク病：制御の科学的基礎と方法」（”Ｍａｒｅ
ｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａ
ｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ”）中。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６５頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。初代ＣＥＦ
の寿命は限られているため、毎週製造する必要があり、
これがＭＤＶワクチン製造のコストを引き上げる。例え
ば、米国のある主要なＭＤＶワクチン製造業者は、毎週
２５，０００個のニワトリ胚を使用している。ニワトリ
胚の購入と製造に関連した費用は、ＭＤＶワクチン製造
の総費用の４０〜４５％を占める。ワクチン製造に適し
た継続性のある細胞株が樹立できれば、ＭＤＶワクチン
製造費用の大幅な低下が可能であろう。そのような細胞
株は、１）細胞株がウイルスで形質転換できないこと、
２）化学的に形質転換した細胞は、予防接種したニワト
リに癌を誘導できないこと、３）このような細胞株によ
り産生されるウイルスの力価は、初代細胞の感染により
得られる力価と同じ（または、ほとんど同じ）であるこ
と、が必要である。
使用でき、多価ワクチンのための組換えＭＤＶベクター
の開発を簡便にできる継続性のある鳥類細胞株を必要と
してきた。多くの鳥類細胞株が開発されている（ケー・
ナザリアン（Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｋ．）、鳥類細胞株と
移植可能な癌の最新のリスト。Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．
１２：５２７−５４４（１９８７））が、これらはいず
れもワクチン製造においてＣＥＦ細胞を代替することが
できない。従来の細胞株は、ウイルスで形質転換した細
胞に由来するか、または、化学的に形質転換した細胞に
由来する場合は、ニワトリに接種すると癌を産生したた
め、うまくいかなかった。ＭＤＶの増殖に適した維持可
能な細胞株は存在しないため、ＭＤＶワクチン産業では
ワクチンウイルスの製造に初代ニワトリ胚繊維芽細胞
（ＣＥＦ）を使用している（エー・イー・チャーチル
（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ａ．Ｅ．）、ワクチンの製造。
「マレク病：制御の科学的基礎と方法」（”Ｍａｒｅ
ｋ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａ
ｓｉｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ”）中。（エル・エヌ・ペイネ（Ｐａｙｎｅ，Ｌ．
Ｎ．）編）、２５１−２６５頁、マリヌスニジョフ出版
（Ｍａｒｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂ．）、ボス
トン、マサチューセッツ州（１９８５））。初代ＣＥＦ
の寿命は限られているため、毎週製造する必要があり、
これがＭＤＶワクチン製造のコストを引き上げる。例え
ば、米国のある主要なＭＤＶワクチン製造業者は、毎週
２５，０００個のニワトリ胚を使用している。ニワトリ
胚の購入と製造に関連した費用は、ＭＤＶワクチン製造
の総費用の４０〜４５％を占める。ワクチン製造に適し
た継続性のある細胞株が樹立できれば、ＭＤＶワクチン
製造費用の大幅な低下が可能であろう。そのような細胞
株は、１）細胞株がウイルスで形質転換できないこと、
２）化学的に形質転換した細胞は、予防接種したニワト
リに癌を誘導できないこと、３）このような細胞株によ
り産生されるウイルスの力価は、初代細胞の感染により
得られる力価と同じ（または、ほとんど同じ）であるこ
と、が必要である。
【０００７】ＭＤＶ複製を支持する連続性のある細胞株
の開発は、ＭＤＶ実験とワクチン製造に関連した多くの
困難を緩和するであろう。
の開発は、ＭＤＶ実験とワクチン製造に関連した多くの
困難を緩和するであろう。
【０００８】
目的 従って、本発明の目的は、ＭＤＶの維持可能な細胞株を
提供することである。さらに本発明の目的は、維持可能
なＭＤＶ細胞株を産生する方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、鳥類を感染させてマレク病に対
する免疫を与える方法を提供することである。さらに本
発明の目的は、経済的なＭＤＶ細胞株を産生する方法、
および有効な細胞株を使用する方法を提供することであ
る。これらおよび他の目的は、以下の説明および図面に
より明らかになるであろう。
提供することである。さらに本発明の目的は、維持可能
なＭＤＶ細胞株を産生する方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、鳥類を感染させてマレク病に対
する免疫を与える方法を提供することである。さらに本
発明の目的は、経済的なＭＤＶ細胞株を産生する方法、
および有効な細胞株を使用する方法を提供することであ
る。これらおよび他の目的は、以下の説明および図面に
より明らかになるであろう。
【０００９】図面の簡単な説明 図１Ａと１Ｂは、未感染および感染細胞の光学顕微鏡写
真である。未感染のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の単層は、丸
石様の外観を示し（図１Ａ）、初代ＣＥＦとＤＥＦで見
られるものと似ている。感染の４週間後（例１に示すよ
うに）、ＭＤＶ感染に一致する多くのプラークが、Ｍｄ
１１ｐ１５／ＯＵ２細胞上に観察された（図１Ｂ）。
真である。未感染のＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の単層は、丸
石様の外観を示し（図１Ａ）、初代ＣＥＦとＤＥＦで見
られるものと似ている。感染の４週間後（例１に示すよ
うに）、ＭＤＶ感染に一致する多くのプラークが、Ｍｄ
１１ｐ１５／ＯＵ２細胞上に観察された（図１Ｂ）。
【００１０】図２は、ＭＤＶ特異的配列のＰＣＲ増幅か
らのＤＮＡを示す電気泳動ゲルである。ＰＣＲ増幅は、
Ｍｄ１１感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞から単離されたＤＮ
Ａについて行なった（レーン２〜６）。表１に示すよう
に特定のＭＤＶ配列を増幅するために、ＭＤＶ特異的オ
リゴヌクレオチドプライマー（表１）を使用した。
らのＤＮＡを示す電気泳動ゲルである。ＰＣＲ増幅は、
Ｍｄ１１感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞から単離されたＤＮ
Ａについて行なった（レーン２〜６）。表１に示すよう
に特定のＭＤＶ配列を増幅するために、ＭＤＶ特異的オ
リゴヌクレオチドプライマー（表１）を使用した。
【００１１】陰性対照（レーン１）、ＩＣＰ４遺伝子プ
ロモーター配列（レーン２）、ＩＣＰ４コード配列の９
００塩基対領域（レーン３）、ＢａｍＨＩ Ｌ 断片の
１２００塩基対（レーン４）、ｇＣ遺伝子プロモーター
配列（レーン５）、ＵＳ３遺伝子プロモーター配列（レ
ーン６）、およびＵＬ５４遺伝子配列（レーン７）。選
択されたバンドの位置は、１ｋｂのラダー（ｌａｄｄｅ
ｒ）マーカー（これは示していない（ライフテクノロジ
ー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）、ゲイサーズバイーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州））から得られた。
ロモーター配列（レーン２）、ＩＣＰ４コード配列の９
００塩基対領域（レーン３）、ＢａｍＨＩ Ｌ 断片の
１２００塩基対（レーン４）、ｇＣ遺伝子プロモーター
配列（レーン５）、ＵＳ３遺伝子プロモーター配列（レ
ーン６）、およびＵＬ５４遺伝子配列（レーン７）。選
択されたバンドの位置は、１ｋｂのラダー（ｌａｄｄｅ
ｒ）マーカー（これは示していない（ライフテクノロジ
ー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ）、ゲイサーズバイーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）、メリーランド州））から得られた。
【００１２】図３は、感染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中
のウイルスＤＮＡの検出を示す電気泳動ゲルである。Ｄ
ＮＡを細胞から抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、０．８％
アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンド−Ｎ−ナイロ
ン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ−Ｎｙｌｏｎ）膜に移し、高厳密
度条件下で非放射性プローブとハイブリダイズさせ、オ
ートラジオグラフィーを作成した。クローン化したＭＤ
Ｖ ＤＮＡ ＢａｍＨＩ断片Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、およびＩ
2 をプローブとして使用した。各断片の位置は、ＤＮＡ
サイズ標準物質（ＨｉｎｄIII で消化したラムダＤＮ
Ａ）と比較して決定し、左に矢じりで示した。
のウイルスＤＮＡの検出を示す電気泳動ゲルである。Ｄ
ＮＡを細胞から抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、０．８％
アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンド−Ｎ−ナイロ
ン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ−Ｎｙｌｏｎ）膜に移し、高厳密
度条件下で非放射性プローブとハイブリダイズさせ、オ
ートラジオグラフィーを作成した。クローン化したＭＤ
Ｖ ＤＮＡ ＢａｍＨＩ断片Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、およびＩ
2 をプローブとして使用した。各断片の位置は、ＤＮＡ
サイズ標準物質（ＨｉｎｄIII で消化したラムダＤＮ
Ａ）と比較して決定し、左に矢じりで示した。
【００１３】図４Ａ〜４Ｃは、特異的ＭＤＶ蛋白の検出
のためのウェスタンブロットである。未感染ＣＥＦ（Ｃ
ＥＦ）、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ（Ｍｄ１１ｐ１
５）、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（ＣＨＣＣ−ＯＵ
２）、およびＭｄ１１ｐ１５感染ＯＵ２細胞（ＭＤＶ
ＯＵ２．２）を、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、材料と
方法に記載した特異的抗血清を用いて免疫検出を行なっ
た。図４Ａと４Ｂでは、分子サイズマーカー（キロダル
トンで示す）の位置を示してある。図４Ａは、モノクロ
ーナル抗体（ルーシー・リー博士（Ｄｒ．Ｌｕｃｙ Ｌ
ｅｅ）から供与された、イーストランシング（Ｅａｓｔ
Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガン州）を用いたＭＤＶ特異
的蛋白ｐｐ３８の検出を示す。図４Ｂは、ｐｐ１４蛋白
融合蛋白（ワイ・ホング（Ｈｏｎｇ，Ｙ）、およびピー
・エム・クセンス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６８：３５９３−３６０３（１９９４））
に対して作成したポリクローナル抗血清を用いたＭＤＶ
特異的蛋白ｐｐ１４の検出を示す。図４Ｃの各レーンの
蛋白負荷は、市販の抗血清（サンタクルツ・バイオテク
ノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）、サンタクルツ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、
カリホルニア州）を用いてα−アクチンの検出により証
明した。
のためのウェスタンブロットである。未感染ＣＥＦ（Ｃ
ＥＦ）、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ（Ｍｄ１１ｐ１
５）、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（ＣＨＣＣ−ＯＵ
２）、およびＭｄ１１ｐ１５感染ＯＵ２細胞（ＭＤＶ
ＯＵ２．２）を、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、材料と
方法に記載した特異的抗血清を用いて免疫検出を行なっ
た。図４Ａと４Ｂでは、分子サイズマーカー（キロダル
トンで示す）の位置を示してある。図４Ａは、モノクロ
ーナル抗体（ルーシー・リー博士（Ｄｒ．Ｌｕｃｙ Ｌ
ｅｅ）から供与された、イーストランシング（Ｅａｓｔ
Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガン州）を用いたＭＤＶ特異
的蛋白ｐｐ３８の検出を示す。図４Ｂは、ｐｐ１４蛋白
融合蛋白（ワイ・ホング（Ｈｏｎｇ，Ｙ）、およびピー
・エム・クセンス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６８：３５９３−３６０３（１９９４））
に対して作成したポリクローナル抗血清を用いたＭＤＶ
特異的蛋白ｐｐ１４の検出を示す。図４Ｃの各レーンの
蛋白負荷は、市販の抗血清（サンタクルツ・バイオテク
ノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）、サンタクルツ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、
カリホルニア州）を用いてα−アクチンの検出により証
明した。
【００１４】図５は、８５０塩基対のｐｐ３８遺伝子部
分のＰＣＲ増幅からのＤＮＡを示す電気泳動ゲルであ
る。ＰＣＲ増幅は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２（レーン２とレー
ン３）、ＭＤＶ ＯＵ２．２（レーン４〜６）、および
Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦ（レーン７と８）を注入した
鳥の腎臓から単離したＤＮＡについて行なった。陰性対
照（レーン１）には、鋳型ＤＮＡ以外のすべての成分を
含めた。別の対照には、未感染ＣＥＦ（レーン９）から
単離したＤＮＡ、および陽性対照（レーン１０）として
Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦから単離したＤＮＡを含め
た。各場合に（陰性対照を除く）、ｐｐ３８特異的プラ
イマーを用いるＰＣＲ増幅の鋳型として３００ｎｇのＤ
ＮＡを使用した（表１）。ＰＣＲ産物を、１０μｇ／ｍ
ｌの臭化エチジウムを含有する１２％アガロースゲルで
解析した。断片のサイズは、ＤＮＡサイズ標準物質（こ
れは示していない）と比較して決定した（１ｋｂラダー
（Ｌａｄｄｅｒ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバイ
ーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）。
分のＰＣＲ増幅からのＤＮＡを示す電気泳動ゲルであ
る。ＰＣＲ増幅は、ＣＨＣＣ−ＯＵ２（レーン２とレー
ン３）、ＭＤＶ ＯＵ２．２（レーン４〜６）、および
Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦ（レーン７と８）を注入した
鳥の腎臓から単離したＤＮＡについて行なった。陰性対
照（レーン１）には、鋳型ＤＮＡ以外のすべての成分を
含めた。別の対照には、未感染ＣＥＦ（レーン９）から
単離したＤＮＡ、および陽性対照（レーン１０）として
Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦから単離したＤＮＡを含め
た。各場合に（陰性対照を除く）、ｐｐ３８特異的プラ
イマーを用いるＰＣＲ増幅の鋳型として３００ｎｇのＤ
ＮＡを使用した（表１）。ＰＣＲ産物を、１０μｇ／ｍ
ｌの臭化エチジウムを含有する１２％アガロースゲルで
解析した。断片のサイズは、ＤＮＡサイズ標準物質（こ
れは示していない）と比較して決定した（１ｋｂラダー
（Ｌａｄｄｅｒ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバイ
ーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド
州）。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明は、ニワトリヘルパー因子
（Ｃｈｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチ
ル−Ｎ1 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮ
Ｇ）で処理し、次にインビボで鳥類に感染することがで
きるＭＤＶで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から
得られた、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能なニワトリ細胞株に関する。
（Ｃｈｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチ
ル−Ｎ1 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮ
Ｇ）で処理し、次にインビボで鳥類に感染することがで
きるＭＤＶで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から
得られた、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能なニワトリ細胞株に関する。
【００１６】さらに本発明は、鳥類をマレク病ウイルス
（ＭＤＶ）により感染させる方法に関し：ニワトリヘル
パー因子（Ｃｈｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＧ）で処理し、次にインビボで鳥類に感染すること
ができるＭＤＶで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）
から得られた、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した
維持可能なニワトリ細胞株により産生されるワクチンを
提供し；そして、鳥類にこのワクチンを接種する、こと
を含んでなる。
（ＭＤＶ）により感染させる方法に関し：ニワトリヘル
パー因子（Ｃｈｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｍ
ＮＮＧ）で処理し、次にインビボで鳥類に感染すること
ができるＭＤＶで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）
から得られた、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した
維持可能なニワトリ細胞株により産生されるワクチンを
提供し；そして、鳥類にこのワクチンを接種する、こと
を含んでなる。
【００１７】最後に、本発明は、ニワトリヘルパー因子
（Ｃｈｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチ
ル−Ｎ1 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮ
Ｇ）で処理し、次にインビボで鳥類に感染することがで
きるＭＤＶで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から
得られた、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能な繊維芽細胞株を含有する、投薬単位型の鳥類ワク
チンに関する。
（Ｃｈｆ）陰性であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチ
ル−Ｎ1 −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮ
Ｇ）で処理し、次にインビボで鳥類に感染することがで
きるＭＤＶで感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から
得られた、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持
可能な繊維芽細胞株を含有する、投薬単位型の鳥類ワク
チンに関する。
【００１８】この新規のＭＤＶ感染細胞株が「維持可
能」であるとは、継代を必要とせずに長期間（少なくと
も１９ヶ月）培養して維持できることを意味する。これ
は、先行技術ではＣＥＣ細胞で何回も継代が必要である
ことと比較して大きな改良である。
能」であるとは、継代を必要とせずに長期間（少なくと
も１９ヶ月）培養して維持できることを意味する。これ
は、先行技術ではＣＥＣ細胞で何回も継代が必要である
ことと比較して大きな改良である。
【００１９】このウイルスを含まない細胞株ＣＨＣＣ−
ＯＵ２は、ミシガン州立大学および米国農務省（ＵＳＤ
Ａ）の保管場所で維持され、公知の細胞株であり、依頼
すれば自由に入手できる。同様に、ＭＤＶが感染したＣ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ブダペスト条約に従い、１９９
５年９月２８日にＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１９８５（ＭＤ
Ｖ ＯＵ２．２）として寄託され、名称と番号で依頼す
ることにより入手可能である。
ＯＵ２は、ミシガン州立大学および米国農務省（ＵＳＤ
Ａ）の保管場所で維持され、公知の細胞株であり、依頼
すれば自由に入手できる。同様に、ＭＤＶが感染したＣ
ＨＣＣ−ＯＵ２細胞は、ブダペスト条約に従い、１９９
５年９月２８日にＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１９８５（ＭＤ
Ｖ ＯＵ２．２）として寄託され、名称と番号で依頼す
ることにより入手可能である。
【００２０】ＭＤＶ感染細胞株は、ウイルスが非発癌性
である限り、ワクチンの製造に使用することができる。
ＭＤＶ感染細胞株はまた、細胞応答（例えば、癌産生の
抑制）を抑制または増強する種々の薬剤または条件を試
験するのに使用することができる。
である限り、ワクチンの製造に使用することができる。
ＭＤＶ感染細胞株はまた、細胞応答（例えば、癌産生の
抑制）を抑制または増強する種々の薬剤または条件を試
験するのに使用することができる。
【００２１】好適なＭＤＶは、血清型１、２または３か
ら選択されるウイルスである。血清型３はまた、七面鳥
ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）とも呼ばれる。ＭＤＶは、
ワクチンとしてまたは他の目的に使用する組換えまたは
欠失突然変異体でもよい。
ら選択されるウイルスである。血清型３はまた、七面鳥
ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）とも呼ばれる。ＭＤＶは、
ワクチンとしてまたは他の目的に使用する組換えまたは
欠失突然変異体でもよい。
【００２２】本発明は特に、継代レベル１５でＭＤＶ株
Ｍｄ１１で安定に感染した、継続性のあるニワトリ繊維
芽細胞株（ＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．
２）に関する。ＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ
２．２は、培養物中で継続的に増殖し、コンフルエンス
になると、ＭＤＶ感染に特徴的なプラークを示す。ＭＤ
Ｖ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は、ＣＥ
Ｆに感染を移し、感受性のある鳥でＭＤの古典的な症状
を生み出すのに使用することができる。凍結保存および
１９ヶ月以上連続培養した後、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞
は、生存活性を維持しＭＤＶを産生し続けた。
Ｍｄ１１で安定に感染した、継続性のあるニワトリ繊維
芽細胞株（ＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．
２）に関する。ＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ
２．２は、培養物中で継続的に増殖し、コンフルエンス
になると、ＭＤＶ感染に特徴的なプラークを示す。ＭＤ
Ｖ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は、ＣＥ
Ｆに感染を移し、感受性のある鳥でＭＤの古典的な症状
を生み出すのに使用することができる。凍結保存および
１９ヶ月以上連続培養した後、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞
は、生存活性を維持しＭＤＶを産生し続けた。
【００２３】以下の例１に示すように、サザンブロット
解析とＰＣＲ解析は、これらの細胞株がＭＤＶ ＤＮＡ
を有することを証明している。ウェスタンブロット解析
は、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は、ＭＤＶリンパ芽球様細
胞中で見られたものと同様に、少なくとも限定されたセ
ットのウイルス蛋白（ｐｐ３８とｐｐ１４）を発現する
ことを示している。コンフルエンスなＭＤＶ ＯＵ２．
２細胞単層中の明確なプラークの存在は、初代ＣＥＦで
観察されたものと同様に、細胞溶解性、半ウイルス産生
性感染に一致する。ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は、初代Ｃ
ＥＦ培養物にＭＤＶ感染を移すことができ、感受性のあ
る鳥にマレク病（ＭＤ）を誘発することができる。ＭＤ
Ｖ ＯＵ２．２細胞は、１９ヶ月以上の活性培養の間、
ＭＤ陽性表現型を維持した。
解析とＰＣＲ解析は、これらの細胞株がＭＤＶ ＤＮＡ
を有することを証明している。ウェスタンブロット解析
は、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は、ＭＤＶリンパ芽球様細
胞中で見られたものと同様に、少なくとも限定されたセ
ットのウイルス蛋白（ｐｐ３８とｐｐ１４）を発現する
ことを示している。コンフルエンスなＭＤＶ ＯＵ２．
２細胞単層中の明確なプラークの存在は、初代ＣＥＦで
観察されたものと同様に、細胞溶解性、半ウイルス産生
性感染に一致する。ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は、初代Ｃ
ＥＦ培養物にＭＤＶ感染を移すことができ、感受性のあ
る鳥にマレク病（ＭＤ）を誘発することができる。ＭＤ
Ｖ ＯＵ２．２細胞は、１９ヶ月以上の活性培養の間、
ＭＤ陽性表現型を維持した。
【００２４】
例１ 材料と方法 細胞とウイルス
【００２５】ＣＥＦ細胞の調製、増殖、およびＭＤＶに
よる感染はすでに記載されているように行なった（シー
・グラウビガー（Ｇｌａｕｂｉｇｅｒ，Ｃ）ら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．４５：１２２８−１２３４（１９８３）；ピ
ー・エム・クセンス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）とエ
ル・エフ・ベリサー（Ｌ．Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒ）、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６２：２３７３−２３７９（１９８
８））。非常に毒性のＭＤＶ株Ｍｄ１１を、継代レベル
１５の細胞培養（Ｍｄ１１ｐ１５）で本試験に使用し
た。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（エィチ・オグラ（Ｏｇｕｒ
ａ，Ｈ．）ら、ＡｃｔａＭｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４
１：１４１−１４３（１９８７））は、ドナルド・サル
ター博士（Ｄｒ．Ｄｏｎａｌｄ Ｓａｌｔｅｒ）（鳥類
疾患および腫瘍学研究所（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ
ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）（ＡＤＯＬ）、米国農務省（ＵＳＤＡ）、イースト
ランシング（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガン
州）から得て、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）と２％トリ
プトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）を補足したライボビッ
ツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５−マコイ（ＭｃＣｏ
ｙ）５Ａ（ＬＭ）（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎ
ｃ．）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ）、ニューヨーク州）培地で、３７℃で５％ＣＯ2 含
有加湿雰囲気中で培養した。
よる感染はすでに記載されているように行なった（シー
・グラウビガー（Ｇｌａｕｂｉｇｅｒ，Ｃ）ら、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．４５：１２２８−１２３４（１９８３）；ピ
ー・エム・クセンス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）とエ
ル・エフ・ベリサー（Ｌ．Ｆ．Ｖｅｌｉｃｅｒ）、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６２：２３７３−２３７９（１９８
８））。非常に毒性のＭＤＶ株Ｍｄ１１を、継代レベル
１５の細胞培養（Ｍｄ１１ｐ１５）で本試験に使用し
た。ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞（エィチ・オグラ（Ｏｇｕｒ
ａ，Ｈ．）ら、ＡｃｔａＭｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４
１：１４１−１４３（１９８７））は、ドナルド・サル
ター博士（Ｄｒ．Ｄｏｎａｌｄ Ｓａｌｔｅｒ）（鳥類
疾患および腫瘍学研究所（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ
ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）（ＡＤＯＬ）、米国農務省（ＵＳＤＡ）、イースト
ランシング（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガン
州）から得て、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ）と２％トリ
プトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）を補足したライボビッ
ツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５−マコイ（ＭｃＣｏ
ｙ）５Ａ（ＬＭ）（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎ
ｃ．）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ）、ニューヨーク州）培地で、３７℃で５％ＣＯ2 含
有加湿雰囲気中で培養した。
【００２６】５．０×１０7 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を
２．０×１０7 Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦと一緒にし
た後、４％ウシ血清（ＣＳ）を補足したＬＭ培地で１５
０ｍｍの培養プレートに蒔いて、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
をＭＤＶ株Ｍｄ１１ｐ１５で感染させた。ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞とＭｄ１１感染ＣＥＦ細胞の同時培養を４継代
続けた。各継代の細胞を、２０％ＣＳと１０％ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）を補足した凍結培地（ＬＭ培
地（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバイーグ（Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州、マコイ（ＭｃＣ
ｏｙ’ｓ）５Ａ培地）中で、−１３５℃で保存した。感
染後４継代目に、ＣＥＦ細胞中にＭＤＶ感染に特徴的な
多くのプラーク（１５０ｍｍの培養プレート当たり約１
００プラーク）が観察された。これらのプラークのうち
２つを、無菌クローニングシリンダーを用いて単離し
た。シリンダーを各プラークの上に置き、細胞をトリプ
シン処理し、クローニングシリンダーから吸引した。吸
引した細胞を拡張させるために、４％ＣＳを補足したＬ
Ｍ培地を含有する３５ｍｍの培養プレートに移した。拡
張させている間、細胞をコンフルエンスにならないよう
にして、４８〜７２時間毎に培地を交換した。拡張した
クローンをＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．
２と名付けた。
２．０×１０7 Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦと一緒にし
た後、４％ウシ血清（ＣＳ）を補足したＬＭ培地で１５
０ｍｍの培養プレートに蒔いて、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞
をＭＤＶ株Ｍｄ１１ｐ１５で感染させた。ＣＨＣＣ−Ｏ
Ｕ２細胞とＭｄ１１感染ＣＥＦ細胞の同時培養を４継代
続けた。各継代の細胞を、２０％ＣＳと１０％ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）を補足した凍結培地（ＬＭ培
地（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、ゲイサーズバイーグ（Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州、マコイ（ＭｃＣ
ｏｙ’ｓ）５Ａ培地）中で、−１３５℃で保存した。感
染後４継代目に、ＣＥＦ細胞中にＭＤＶ感染に特徴的な
多くのプラーク（１５０ｍｍの培養プレート当たり約１
００プラーク）が観察された。これらのプラークのうち
２つを、無菌クローニングシリンダーを用いて単離し
た。シリンダーを各プラークの上に置き、細胞をトリプ
シン処理し、クローニングシリンダーから吸引した。吸
引した細胞を拡張させるために、４％ＣＳを補足したＬ
Ｍ培地を含有する３５ｍｍの培養プレートに移した。拡
張させている間、細胞をコンフルエンスにならないよう
にして、４８〜７２時間毎に培地を交換した。拡張した
クローンをＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ ＯＵ２．
２と名付けた。
【００２７】細胞ＤＮＡの調製、サザンブロット解析、
およびＰＣＲ 総細胞性ＤＮＡを、標準的方法を用いて未感染およびＭ
ＤＶ感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞から抽出した（サムブル
ーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら、分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）
（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨ
ーク州（１９８９））。制限酵素（ベーリンガイー・マ
ンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イン
ディアナポリス、インディアナ州）を、製造業者の薦め
に従って使用した。ＤＮＡを消化し、０．８％アガロー
スゲルで電気泳動し、サザンブロット解析（イー・エム
・サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．）、ゲル電気泳
動で分離したＤＮＡ断片中の特異的配列の検出。Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））により、
ハイボンド−Ｎ−ナイロン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ−Ｎｙｌ
ｏｎ）膜（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒ
ｐ．）、アーリントンハイツ、イリノイ州）に移した。
ランダムプライマー標識キット（ベーリンガイー・マン
ハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インデ
ィアナポリス、インディアナ州）を用いて、プローブに
非放射性標識（ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ）を行
なった。
およびＰＣＲ 総細胞性ＤＮＡを、標準的方法を用いて未感染およびＭ
ＤＶ感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞から抽出した（サムブル
ーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら、分子クローニン
グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）
（第２版）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨ
ーク州（１９８９））。制限酵素（ベーリンガイー・マ
ンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イン
ディアナポリス、インディアナ州）を、製造業者の薦め
に従って使用した。ＤＮＡを消化し、０．８％アガロー
スゲルで電気泳動し、サザンブロット解析（イー・エム
・サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．）、ゲル電気泳
動で分離したＤＮＡ断片中の特異的配列の検出。Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））により、
ハイボンド−Ｎ−ナイロン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ−Ｎｙｌ
ｏｎ）膜（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒ
ｐ．）、アーリントンハイツ、イリノイ州）に移した。
ランダムプライマー標識キット（ベーリンガイー・マン
ハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インデ
ィアナポリス、インディアナ州）を用いて、プローブに
非放射性標識（ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ）を行
なった。
【００２８】総細胞性ＤＮＡはまた、ＭＤＶ特異的配列
のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。使用したプ
ライマーと予測された断片のサイズを表１に示す。
のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。使用したプ
ライマーと予測された断片のサイズを表１に示す。
【００２９】
【表１】 プライマー配列は、５’から３’として左から右に記載
されている。各場合に、上のプライマーは、上流の配列
を示し、下のプライマーは下流の配列を示す。これらは
付録１〜１４に示してある。
されている。各場合に、上のプライマーは、上流の配列
を示し、下のプライマーは下流の配列を示す。これらは
付録１〜１４に示してある。
【００３０】簡単に説明すると、総細胞性ＤＮＡ３００
ｎｇを、２５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、２０ｍＭの各適当なプラ
イマー対、１０μｌの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（パーキ
ンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカッ
ト州）、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）、ノーワーク（Ｎｏ
ｒｗａｌｋ）、コネチカット州）と一緒にした。以下の
ようにジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００サーマ
ルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット
州）を用いて、ＰＣＲ反応を行なった：９５℃で２０
秒、５６℃で２０秒、そして７２℃で３０秒を３５サイ
クル。２つの対照（１つはＤＮＡなしで、１つは未感染
ＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡを含む）を、各実験に含め
た。未感染ＣＥＦおよびＭｄ１１ｐ１６で感染したＣＥ
Ｆから単離した高分子量ＤＮＡを、特異的増幅の対照と
して使用した。ＰＣＲ産物は、ウィザードＰＣＲプレッ
プ（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ）キット（プロメ
ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）
を用いて精製し、１２％アガロースゲルで分析した。
ｎｇを、２５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、
ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、２０ｍＭの各適当なプラ
イマー対、１０μｌの１０×ＰＣＲ反応緩衝液（パーキ
ンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカッ
ト州）、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅ
ｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）、ノーワーク（Ｎｏ
ｒｗａｌｋ）、コネチカット州）と一緒にした。以下の
ようにジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００サーマ
ルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ）、ノーワーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット
州）を用いて、ＰＣＲ反応を行なった：９５℃で２０
秒、５６℃で２０秒、そして７２℃で３０秒を３５サイ
クル。２つの対照（１つはＤＮＡなしで、１つは未感染
ＣＨＣＣ−ＯＵ２ ＤＮＡを含む）を、各実験に含め
た。未感染ＣＥＦおよびＭｄ１１ｐ１６で感染したＣＥ
Ｆから単離した高分子量ＤＮＡを、特異的増幅の対照と
して使用した。ＰＣＲ産物は、ウィザードＰＣＲプレッ
プ（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ）キット（プロメ
ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）
を用いて精製し、１２％アガロースゲルで分析した。
【００３１】ウェスタン免疫ブロット解析 培養細胞を集め、ソニファイアー（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）
細胞破砕器モデル３５０（ブランソン・ウルトラソニッ
ク社（Ｂｒａｎｓｏｎ ＵｌｔｒａｓｏｎｉｃＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）、ダンベリー（Ｄａｎｂｕｒｙ）、コ
ネチカット州）を用いて超音波処理した。各タイプの細
胞から蛋白（２０μｇ）を、１２．５％ポリアクリルア
ミド／１％ＳＤＳゲルで分離した。分離した蛋白を電気
泳動的に、ニトロセルロース膜に移した。膜を５％脱脂
肪乳でブロックし、ＭＤＶ蛋白に対する抗体（ｐｐ１４
（ワイ・ホング（Ｈｏｎｇ，Ｙ）およびピー・エム・ク
センス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６８：３５９３−３６０３（１９９４）、およびｐ
ｐ３８（ゼット・クイ（Ｃｕｉ，Ｚ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６５：６５０９−３５１５（１９９１））とプロー
ブ結合させた。免疫複合体は、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合したロバの抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロ
ブリンとインキュベートさせて検出した。検出は、イー
シーエル（ＥＣＬ）ウェスタンブロットキット（アマシ
ャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）、アーリント
ンハイツ、イリノイ州）を用いて、製造業者の薦めに従
って行い、Ｘ線フィルムに露光させた。蛋白サイズは、
同じゲルで電気泳動して、あらかじめ染色した蛋白分子
量標準物質（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、リッチ
モンド、カリホルニア州）と比較して推定した。
細胞破砕器モデル３５０（ブランソン・ウルトラソニッ
ク社（Ｂｒａｎｓｏｎ ＵｌｔｒａｓｏｎｉｃＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）、ダンベリー（Ｄａｎｂｕｒｙ）、コ
ネチカット州）を用いて超音波処理した。各タイプの細
胞から蛋白（２０μｇ）を、１２．５％ポリアクリルア
ミド／１％ＳＤＳゲルで分離した。分離した蛋白を電気
泳動的に、ニトロセルロース膜に移した。膜を５％脱脂
肪乳でブロックし、ＭＤＶ蛋白に対する抗体（ｐｐ１４
（ワイ・ホング（Ｈｏｎｇ，Ｙ）およびピー・エム・ク
センス（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６８：３５９３−３６０３（１９９４）、およびｐ
ｐ３８（ゼット・クイ（Ｃｕｉ，Ｚ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６５：６５０９−３５１５（１９９１））とプロー
ブ結合させた。免疫複合体は、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに結合したロバの抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロ
ブリンとインキュベートさせて検出した。検出は、イー
シーエル（ＥＣＬ）ウェスタンブロットキット（アマシ
ャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）、アーリント
ンハイツ、イリノイ州）を用いて、製造業者の薦めに従
って行い、Ｘ線フィルムに露光させた。蛋白サイズは、
同じゲルで電気泳動して、あらかじめ染色した蛋白分子
量標準物質（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、リッチ
モンド、カリホルニア州）と比較して推定した。
【００３２】ニワトリへの細胞とウイルスの接種 鳥類疾患および腫瘍学研究所（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａ
ｓｅ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）（ＡＤＯＬ）、米国農務省（ＵＳＤＡ）、イー
ストランシング（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガ
ン州）から得られた、特異的病原体を含まないニワトリ
（１５Ｉ5 Ｘ７1 ）を用いてインビボ実験を行なった。
各１日齢の３群のヒヨコに、（１）未感染のＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞、（２）ＣＥＦ中の１０００プラーク形成単
位（ＰＦＵ）のＭｄ１１ｐ１６、そして（３）１０００
ＰＦＵのＭＤＶを感染させたＯＵ２細胞（ＭＤＶ ＯＵ
２．２）を、腹腔内投与した。第１および第２の群は対
照とした（それぞれ、陰性と陽性対照）。
ｓｅ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）（ＡＤＯＬ）、米国農務省（ＵＳＤＡ）、イー
ストランシング（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ）、ミシガ
ン州）から得られた、特異的病原体を含まないニワトリ
（１５Ｉ5 Ｘ７1 ）を用いてインビボ実験を行なった。
各１日齢の３群のヒヨコに、（１）未感染のＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞、（２）ＣＥＦ中の１０００プラーク形成単
位（ＰＦＵ）のＭｄ１１ｐ１６、そして（３）１０００
ＰＦＵのＭＤＶを感染させたＯＵ２細胞（ＭＤＶ ＯＵ
２．２）を、腹腔内投与した。第１および第２の群は対
照とした（それぞれ、陰性と陽性対照）。
【００３３】鳥を安楽死させ、罹病の症状が出た後剖検
を行なった。血液を採取して、末梢血リンパ球を単離
し、生存（ｖｉａｂｌｅ）ウイルスの試験としてＣＥＦ
と同時培養を行なった。腎臓、脾臓、肝臓を採取して、
ＤＮＡを単離し、組織学的評価を行なった。総組織特異
的ＤＮＡを単離し、表１に詳述したプライマーセットを
用いて、ＭＤＶ配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使
用した。
を行なった。血液を採取して、末梢血リンパ球を単離
し、生存（ｖｉａｂｌｅ）ウイルスの試験としてＣＥＦ
と同時培養を行なった。腎臓、脾臓、肝臓を採取して、
ＤＮＡを単離し、組織学的評価を行なった。総組織特異
的ＤＮＡを単離し、表１に詳述したプライマーセットを
用いて、ＭＤＶ配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使
用した。
【００３４】結果 Ｍｄ１１ｐ１５によるＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の感染 ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞は化学的に不死化しているが、こ
れらは悪性形質転換しておらず、接触阻害を示し、正常
なヒヨコ繊維芽細胞の多くの形態学的特徴を示す。ＣＨ
ＣＣ−ＯＵ２細胞は、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ細胞と
同時培養した。培養基板にゆるく結合した球形の細胞の
形成を特徴とする細胞変性作用（ＣＰＥ）は、感染後２
週間目の同時培養細胞単層で最初に観察された。これら
の領域の大部分は、丸い細胞の比較的小さい塊よりな
る、「微小プラーク」が特徴である。ＣＰＥは、出現も
拡大もゆるやかであった。融合細胞（ｓｙｎｃｔｉａ）
と丸くゆるく結合した細胞の拡大した領域よりなる十分
に進展したプラークは、感染後４週間まで見られなかっ
た（図１）。感染後１４日目の見えるプラークの出現、
コンフルエンスに達した細胞へのプラーク形成の依存お
よび接触阻害は予測されなかった。比較すると、ＭＤＶ
株Ｍｄ１１に感染した典型的ＣＥＦ単層は、感染後５〜
７日に容易に見えるプラークを出現し、１０〜１４日以
内に単層の完全な破壊が起きる。ＣＥＦにおけるプラー
ク形成は、細胞単層のコンフルエンスには依存しない。
４週間同時培養後、−１３５℃で２週間凍結保存した。
細胞培養物は、感染細胞（Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２）と
未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を組合せて、凍結細胞から
再樹立した。ＭＤＶ感染に一致するプラークは、細胞が
コンフルエンスに達する（蒔いてから約１４日後）まで
観察されなかった。
れらは悪性形質転換しておらず、接触阻害を示し、正常
なヒヨコ繊維芽細胞の多くの形態学的特徴を示す。ＣＨ
ＣＣ−ＯＵ２細胞は、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ細胞と
同時培養した。培養基板にゆるく結合した球形の細胞の
形成を特徴とする細胞変性作用（ＣＰＥ）は、感染後２
週間目の同時培養細胞単層で最初に観察された。これら
の領域の大部分は、丸い細胞の比較的小さい塊よりな
る、「微小プラーク」が特徴である。ＣＰＥは、出現も
拡大もゆるやかであった。融合細胞（ｓｙｎｃｔｉａ）
と丸くゆるく結合した細胞の拡大した領域よりなる十分
に進展したプラークは、感染後４週間まで見られなかっ
た（図１）。感染後１４日目の見えるプラークの出現、
コンフルエンスに達した細胞へのプラーク形成の依存お
よび接触阻害は予測されなかった。比較すると、ＭＤＶ
株Ｍｄ１１に感染した典型的ＣＥＦ単層は、感染後５〜
７日に容易に見えるプラークを出現し、１０〜１４日以
内に単層の完全な破壊が起きる。ＣＥＦにおけるプラー
ク形成は、細胞単層のコンフルエンスには依存しない。
４週間同時培養後、−１３５℃で２週間凍結保存した。
細胞培養物は、感染細胞（Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２）と
未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を組合せて、凍結細胞から
再樹立した。ＭＤＶ感染に一致するプラークは、細胞が
コンフルエンスに達する（蒔いてから約１４日後）まで
観察されなかった。
【００３５】感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中のＭＤＶ Ｄ
ＮＡの検出 感染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中のＭＤＶ ＤＮＡの存
在を測定するための最初の測定法として、ポリメラーゼ
チェイン反応（ＰＣＲ）を使用した。材料と方法に記載
のように、種々のＭＤＶ遺伝子に対応するいくつかのプ
ライマー対を用いて、Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２および未
感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の３００ηｇの総ＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅のための鋳型として使用した。Ｍｄ１１ｐ１５
／ＯＵ２ＤＮＡとの反応により適当なサイズのバンド
（表１）が得られたが、未感染ＯＵ２ ＤＮＡ鋳型から
は得られなかった（図２）。未感染ＣＥＦおよびＭＤＶ
が感染したＣＥＦから単離されたＤＮＡを含有する反応
物を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した
（データは示していない）。
ＮＡの検出 感染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中のＭＤＶ ＤＮＡの存
在を測定するための最初の測定法として、ポリメラーゼ
チェイン反応（ＰＣＲ）を使用した。材料と方法に記載
のように、種々のＭＤＶ遺伝子に対応するいくつかのプ
ライマー対を用いて、Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２および未
感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞の３００ηｇの総ＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅のための鋳型として使用した。Ｍｄ１１ｐ１５
／ＯＵ２ＤＮＡとの反応により適当なサイズのバンド
（表１）が得られたが、未感染ＯＵ２ ＤＮＡ鋳型から
は得られなかった（図２）。未感染ＣＥＦおよびＭＤＶ
が感染したＣＥＦから単離されたＤＮＡを含有する反応
物を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した
（データは示していない）。
【００３６】ＰＲＣ解析の結果は、感染されたＣＨＣＣ
−ＯＵ２培養物中にＭＤＶ ＤＮＡが存在することを示
していた。可能性は少ないが、我々の延長培養条件で
は、ＰＣＲ解析により、残存するＭＤＶが感染したＣＥ
Ｆ細胞からＭＤＶ ＤＮＡが検出されたのかも知れな
い。さらにＰＣＲ解析からは、Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２
細胞中のＭＤＶ ＤＮＡが無傷であるか否かについては
重要な情報が得られない。この問題を調べるために、感
染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中のＭＤＶ ＤＮＡを、Ｍ
ＤＶ ＢａｍＨＩ断片（Ｂ、Ｆ、Ｈ、およびＩ2 ）のカ
クテルをプローブとして用いて、サザンブロットハイブ
リダイゼーションにより解析した。Ｍｄ１１ｐ１６感染
ＣＥＦおよびＭｄ１１ｐ１５／ＯＵ２細胞から単離した
総ゲノムＤＮＡは、ＢａｍＨＩ断片Ｂ、Ｆ、Ｈ、および
Ｉ2 に対応するＭＤＶ特異的断片を含有していた。予想
されたように、未感染ＣＥＦまたはＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞から単離したＤＮＡ中には類似の断片は、検出されな
かった（図３）。
−ＯＵ２培養物中にＭＤＶ ＤＮＡが存在することを示
していた。可能性は少ないが、我々の延長培養条件で
は、ＰＣＲ解析により、残存するＭＤＶが感染したＣＥ
Ｆ細胞からＭＤＶ ＤＮＡが検出されたのかも知れな
い。さらにＰＣＲ解析からは、Ｍｄ１１ｐ１５／ＯＵ２
細胞中のＭＤＶ ＤＮＡが無傷であるか否かについては
重要な情報が得られない。この問題を調べるために、感
染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中のＭＤＶ ＤＮＡを、Ｍ
ＤＶ ＢａｍＨＩ断片（Ｂ、Ｆ、Ｈ、およびＩ2 ）のカ
クテルをプローブとして用いて、サザンブロットハイブ
リダイゼーションにより解析した。Ｍｄ１１ｐ１６感染
ＣＥＦおよびＭｄ１１ｐ１５／ＯＵ２細胞から単離した
総ゲノムＤＮＡは、ＢａｍＨＩ断片Ｂ、Ｆ、Ｈ、および
Ｉ2 に対応するＭＤＶ特異的断片を含有していた。予想
されたように、未感染ＣＥＦまたはＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞から単離したＤＮＡ中には類似の断片は、検出されな
かった（図３）。
【００３７】感染細胞株の樹立 培養条件および凍結−融解サイクルは、感染を樹立する
のに使用された元々のＣＥＦ細胞のほとんどを排除した
はずであるが、我々のＭｄ１１ｐ１５／ＯＵ２培養物中
で検出されたＭＤＶ特異的ＤＮＡに、残存するＣＥＦ細
胞が寄与している可能性があった。この問題を調べるた
めに、感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２培養物の各プラークの単離
と拡大を開始した。材料と方法に記載のように、プラー
ク単離と拡大により２つの細胞株（ＭＤＶ ＯＵ２．１
とＭＤＶ ＯＵ２．２）を樹立した。明確なプラークか
ら出発したにもかかわらず、両方の細胞株ともに、未感
染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と区別できない初期増殖特性を
示した。ＭＤＶ感染に特徴的なプラークは、蒔いてから
１０〜１４日後にコンフルエンスに達した後ＭＤＶＯＵ
２．１とＭＤＶ ＯＵ２．２細胞培養物中にのみ観察さ
れた。
のに使用された元々のＣＥＦ細胞のほとんどを排除した
はずであるが、我々のＭｄ１１ｐ１５／ＯＵ２培養物中
で検出されたＭＤＶ特異的ＤＮＡに、残存するＣＥＦ細
胞が寄与している可能性があった。この問題を調べるた
めに、感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２培養物の各プラークの単離
と拡大を開始した。材料と方法に記載のように、プラー
ク単離と拡大により２つの細胞株（ＭＤＶ ＯＵ２．１
とＭＤＶ ＯＵ２．２）を樹立した。明確なプラークか
ら出発したにもかかわらず、両方の細胞株ともに、未感
染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と区別できない初期増殖特性を
示した。ＭＤＶ感染に特徴的なプラークは、蒔いてから
１０〜１４日後にコンフルエンスに達した後ＭＤＶＯＵ
２．１とＭＤＶ ＯＵ２．２細胞培養物中にのみ観察さ
れた。
【００３８】感染性ウイルスがＭＤＶ ＯＵ２．１とＭ
ＤＶ ＯＵ２．２培養物からレスキューされることを確
認するために、１×１０6 個のＭＤＶ ＯＵ２．１また
はＭＤＶ ＯＵ２．２を５×１０7 個の第２代ＣＥＦと
組合せて各単離物からの細胞を接種物として用いてＣＥ
Ｆ細胞を感染させた。ＣＥＦ細胞のＭＤＶ感染に一致す
るプラークは、感染後５日以内に見えた。これに対し
て、１×１０6 個の未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と５×
１０7 個のＣＥＦ細胞を含有する対照プレートではプラ
ークは見られなかった。
ＤＶ ＯＵ２．２培養物からレスキューされることを確
認するために、１×１０6 個のＭＤＶ ＯＵ２．１また
はＭＤＶ ＯＵ２．２を５×１０7 個の第２代ＣＥＦと
組合せて各単離物からの細胞を接種物として用いてＣＥ
Ｆ細胞を感染させた。ＣＥＦ細胞のＭＤＶ感染に一致す
るプラークは、感染後５日以内に見えた。これに対し
て、１×１０6 個の未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞と５×
１０7 個のＣＥＦ細胞を含有する対照プレートではプラ
ークは見られなかった。
【００３９】ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞中に発現されるウ
イルス蛋白の検出 ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞がＭＤＶの複製と増殖を支持し
たことを証明するために、ＭＤＶ蛋白の検出を開始し
た。ｐｐ３８に対するモノクローナル抗体（ルーシー・
リー博士（Ｄｒ．Ｌｕｃｙ Ｌｅｅ）から供与された、
米国農務省−鳥類疾患および腫瘍学研究所（ＵＳＤＡ−
ＡＤＯＬ）、イーストランシング（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓ
ｉｎｇ）、ミシガン州）により、コンフルエンスなＭＤ
Ｖ ＯＵ２．２細胞とＭｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦの抽出
物中に、約３８ｋＤａのバンドが検出されたが、未感染
ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞またはＣＥＦ細胞では検出されな
かった（図４Ａ）。ＭＤＶ特異的な前初期ホスホ蛋白で
あるｐｐ１４に対するポリクローナル抗体（ワイ・ホン
グ（Ｈｏｎｇ，Ｙ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３５９３
−３６０３（１９９４））はまた、コンフルエンスなＭ
ＤＶ ＯＵ２．２細胞およびＭｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦ
細胞の抽出物中の適当なサイズのポリペプチドと反応し
たが、未感染細胞抽出物中のものとは反応しなかった
（図４Ｂ）。α−アクチンに対するポリクローナル抗血
清を用いて、各レーンで同程度の量の蛋白が解析される
ことを確認した（図４Ｃ）。これをまとめると、ＰＣＲ
増幅、サザンハイブリダイゼーション、およびウェスタ
ンブロット解析の結果は、ＭＤＶＯＵ２．２細胞が、Ｍ
ＤＶを有する継続性のある足場依存性の細胞株であり、
半ウイルス産生性感染に許容性であることを示した。
イルス蛋白の検出 ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞がＭＤＶの複製と増殖を支持し
たことを証明するために、ＭＤＶ蛋白の検出を開始し
た。ｐｐ３８に対するモノクローナル抗体（ルーシー・
リー博士（Ｄｒ．Ｌｕｃｙ Ｌｅｅ）から供与された、
米国農務省−鳥類疾患および腫瘍学研究所（ＵＳＤＡ−
ＡＤＯＬ）、イーストランシング（Ｅａｓｔ Ｌａｎｓ
ｉｎｇ）、ミシガン州）により、コンフルエンスなＭＤ
Ｖ ＯＵ２．２細胞とＭｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦの抽出
物中に、約３８ｋＤａのバンドが検出されたが、未感染
ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞またはＣＥＦ細胞では検出されな
かった（図４Ａ）。ＭＤＶ特異的な前初期ホスホ蛋白で
あるｐｐ１４に対するポリクローナル抗体（ワイ・ホン
グ（Ｈｏｎｇ，Ｙ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３５９３
−３６０３（１９９４））はまた、コンフルエンスなＭ
ＤＶ ＯＵ２．２細胞およびＭｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦ
細胞の抽出物中の適当なサイズのポリペプチドと反応し
たが、未感染細胞抽出物中のものとは反応しなかった
（図４Ｂ）。α−アクチンに対するポリクローナル抗血
清を用いて、各レーンで同程度の量の蛋白が解析される
ことを確認した（図４Ｃ）。これをまとめると、ＰＣＲ
増幅、サザンハイブリダイゼーション、およびウェスタ
ンブロット解析の結果は、ＭＤＶＯＵ２．２細胞が、Ｍ
ＤＶを有する継続性のある足場依存性の細胞株であり、
半ウイルス産生性感染に許容性であることを示した。
【００４０】ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞は感受性のあるニ
ワトリでＭＤを誘発した マレク病は、感受性のある鳥にＭＤＶが感染した細胞を
注入することにより、実験的に誘導することができた。
ＭＳＢ−１のようなＭＤＶリンパ芽球様細胞株はまた、
腹腔内投与により感受性のある鳥にＭＤＶを誘発するこ
とができる。また、ほとんどの市販のＭＤＶワクチン
は、ＭＤＶのワクチン株で感染させたＣＥＦ細胞よりな
る。感染性であるが非病原性のＭＤＶのワクチン株は、
鳥に移して複製させると、液性および細胞性応答を誘導
する。同様にＭＤＶ ＯＵ２．２細胞が鳥にＭＤＶを移
すことができるか否かを調べるために、１日齢の１５Ｉ
5 ×７I 系統ニワトリに、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞、またはＭｄ１１ｐ１６細
胞で感染したＣＥＦ細胞を接種した。Ｍｄ１１ｐ１６感
染ＣＥＦ細胞またはＭＤＶ ＯＵ２．２細胞を注入した
ニワトリは、感染後早くも１０日目にＭＤの古典的な症
状（発育の低下と、首、羽、および足の痺痲）を発現し
た。これに対して、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を注入
した陰性対照ニワトリは、１２週齢になってもＭＤの臨
床症状を示さなかった。
ワトリでＭＤを誘発した マレク病は、感受性のある鳥にＭＤＶが感染した細胞を
注入することにより、実験的に誘導することができた。
ＭＳＢ−１のようなＭＤＶリンパ芽球様細胞株はまた、
腹腔内投与により感受性のある鳥にＭＤＶを誘発するこ
とができる。また、ほとんどの市販のＭＤＶワクチン
は、ＭＤＶのワクチン株で感染させたＣＥＦ細胞よりな
る。感染性であるが非病原性のＭＤＶのワクチン株は、
鳥に移して複製させると、液性および細胞性応答を誘導
する。同様にＭＤＶ ＯＵ２．２細胞が鳥にＭＤＶを移
すことができるか否かを調べるために、１日齢の１５Ｉ
5 ×７I 系統ニワトリに、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細
胞、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞、またはＭｄ１１ｐ１６細
胞で感染したＣＥＦ細胞を接種した。Ｍｄ１１ｐ１６感
染ＣＥＦ細胞またはＭＤＶ ＯＵ２．２細胞を注入した
ニワトリは、感染後早くも１０日目にＭＤの古典的な症
状（発育の低下と、首、羽、および足の痺痲）を発現し
た。これに対して、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を注入
した陰性対照ニワトリは、１２週齢になってもＭＤの臨
床症状を示さなかった。
【００４１】感染した鳥におけるＭＤＶの存在を確認す
るために、感染後種々の時間で採取した血液から末梢血
リンパ球（ＰＢＬ）を単離し、第２代ＣＥＦに接種し
た。Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦ細胞またはＭＤＶ ＯＵ
２．２細胞を注入した鳥から単離したＰＢＬを接種した
プレートでは、培養４日後にＣＥＦ単層上に、ＭＤＶ感
染に一致するプラークが観察された。未感染ＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞を注入した対照の鳥から得られたＰＢＬと混
合したＣＥＦ細胞のプレートでは、プラークは観察され
なかった。
るために、感染後種々の時間で採取した血液から末梢血
リンパ球（ＰＢＬ）を単離し、第２代ＣＥＦに接種し
た。Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦ細胞またはＭＤＶ ＯＵ
２．２細胞を注入した鳥から単離したＰＢＬを接種した
プレートでは、培養４日後にＣＥＦ単層上に、ＭＤＶ感
染に一致するプラークが観察された。未感染ＣＨＣＣ−
ＯＵ２細胞を注入した対照の鳥から得られたＰＢＬと混
合したＣＥＦ細胞のプレートでは、プラークは観察され
なかった。
【００４２】感染した鳥のＭＤＶの複製をさらに確認す
るために、感染した鳥の腎臓から単離した総細胞性ＤＮ
Ａを、ＭＤＶｐｐ３８遺伝子に特異的なプライマーを用
いるＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＭＤＶ ＤＮＡ
の存在に一致して、Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦまたはＭ
ＤＶ ＯＵ２．２細胞を注入した鳥の腎臓から単離した
ＤＮＡを用いて８５０塩基対断片が増幅された。これに
対して、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を注入した鳥から単離し
たＤＮＡを鋳型として用いた時、同様のバンドは観察さ
れなかった（図５）。
るために、感染した鳥の腎臓から単離した総細胞性ＤＮ
Ａを、ＭＤＶｐｐ３８遺伝子に特異的なプライマーを用
いるＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＭＤＶ ＤＮＡ
の存在に一致して、Ｍｄ１１ｐ１６感染ＣＥＦまたはＭ
ＤＶ ＯＵ２．２細胞を注入した鳥の腎臓から単離した
ＤＮＡを用いて８５０塩基対断片が増幅された。これに
対して、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を注入した鳥から単離し
たＤＮＡを鋳型として用いた時、同様のバンドは観察さ
れなかった（図５）。
【００４３】組織学的評価により、ＣＥＦ／Ｍｄ１１ｐ
１６およびＭＤＶ ＯＵ２．２を注入した鳥の種々の組
織中には、リンパ球の浸潤と初期の活性なリンパ腫が観
察されたが、ＣＨＣＣ−ＯＵ２を接種した鳥では顕微鏡
レベルでＭＤの症状は観察されなかった。これをまとめ
ると、これらの結果は、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞がＭＤ
Ｖを含有し、ウイルスは腹腔内注射により鳥に移すこと
ができることを明確に示している。
１６およびＭＤＶ ＯＵ２．２を注入した鳥の種々の組
織中には、リンパ球の浸潤と初期の活性なリンパ腫が観
察されたが、ＣＨＣＣ−ＯＵ２を接種した鳥では顕微鏡
レベルでＭＤの症状は観察されなかった。これをまとめ
ると、これらの結果は、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞がＭＤ
Ｖを含有し、ウイルスは腹腔内注射により鳥に移すこと
ができることを明確に示している。
【００４４】ＭＤＶを扱う場合の１つの大きな問題点
は、ウイルスの増殖と選択のための維持可能な細胞培養
系がないことである。初代ＣＥＦおよびＤＥＦは、ＭＤ
Ｖ複製に対して許容性（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）であ
り、初代培養物は増殖が遅いことと寿命が限定されてい
ることが特徴である。従って感染した細胞を未感染細胞
に継代して、扱うことができる充分な量のウイルスを得
る必要がある。さらに１０または１１日齢のニワトリ胚
から、ＣＥＦおよびＤＥＦを定期的に製造する必要があ
り、ＭＤＶの培養を高価かつ困難にしている。
は、ウイルスの増殖と選択のための維持可能な細胞培養
系がないことである。初代ＣＥＦおよびＤＥＦは、ＭＤ
Ｖ複製に対して許容性（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）であ
り、初代培養物は増殖が遅いことと寿命が限定されてい
ることが特徴である。従って感染した細胞を未感染細胞
に継代して、扱うことができる充分な量のウイルスを得
る必要がある。さらに１０または１１日齢のニワトリ胚
から、ＣＥＦおよびＤＥＦを定期的に製造する必要があ
り、ＭＤＶの培養を高価かつ困難にしている。
【００４５】ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞株は、ニワトリ胚細
胞由来の不死化された繊維芽細胞株である（エィチ・オ
グラ（Ｏｇｕｒａ，Ｈ．）ら、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋ
ａｙａｍａ ４１：１４１−１４３（１９８７））。Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２は同系のニワトリに注入した時、癌を誘
発しないため、発ガン性はない（オグラ（Ｏｇｕｒａ，
Ｈ．）ら、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４１：
１４１−１４３（１９８７））。さらにＣＨＣＣ−ＯＵ
２はウイルスが存在せず、鳥類レトロウイルス感染に対
して感受性である（亜型Ａ、Ｂ、およびＣの鳥類肉腫ウ
イルス）。ニューカッスル病ウイルスはまた、ＣＨＣＣ
−ＯＵ２細胞培養物中でよく複製する（オグラ（Ｏｇｕ
ｒａ，Ｈ．）ら、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ
４１：１４１−１４３（１９８７））。
胞由来の不死化された繊維芽細胞株である（エィチ・オ
グラ（Ｏｇｕｒａ，Ｈ．）ら、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋ
ａｙａｍａ ４１：１４１−１４３（１９８７））。Ｃ
ＨＣＣ−ＯＵ２は同系のニワトリに注入した時、癌を誘
発しないため、発ガン性はない（オグラ（Ｏｇｕｒａ，
Ｈ．）ら、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ ４１：
１４１−１４３（１９８７））。さらにＣＨＣＣ−ＯＵ
２はウイルスが存在せず、鳥類レトロウイルス感染に対
して感受性である（亜型Ａ、Ｂ、およびＣの鳥類肉腫ウ
イルス）。ニューカッスル病ウイルスはまた、ＣＨＣＣ
−ＯＵ２細胞培養物中でよく複製する（オグラ（Ｏｇｕ
ｒａ，Ｈ．）ら、Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ
４１：１４１−１４３（１９８７））。
【００４６】例１から明らかなように、ＣＨＣＣ−ＯＵ
２細胞は、ＭＤＶの複製と研究のための維持可能な細胞
培養系として適している。ＭＤＶによるＣＨＣＣ−ＯＵ
２感染の初期はゆっくりであり、目に見えるプラーク数
が少ないことが特徴である。充分に進展したプラーク
は、感染後４週目に初めて観察された。この時、プラー
クは明らかに見え、量が多かった（１５０ｍｍ組織培養
プレート当たり約１００プラーク）。以後の継代で、プ
ラークは、培養の１０〜１４日毎に見えた。
２細胞は、ＭＤＶの複製と研究のための維持可能な細胞
培養系として適している。ＭＤＶによるＣＨＣＣ−ＯＵ
２感染の初期はゆっくりであり、目に見えるプラーク数
が少ないことが特徴である。充分に進展したプラーク
は、感染後４週目に初めて観察された。この時、プラー
クは明らかに見え、量が多かった（１５０ｍｍ組織培養
プレート当たり約１００プラーク）。以後の継代で、プ
ラークは、培養の１０〜１４日毎に見えた。
【００４７】サザンブロット解析とＰＣＲ解析により、
半クローン性細胞株（ＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ
ＯＵ２．２）は、確かにＭＤＶ ＤＮＡを有すること
が確認された。サザンブロットハイブリダイゼーション
により検出される断片は、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ中
に検出されるものとサイズが同じであり、大きな構造の
再配置は起きていないことを示している。さらにＭＤＶ
ＯＵ２．２細胞ＤＮＡ中に検出される断片は、ＭＤＶ
ゲノムのユニークな長い（ＢａｍＨＩＢおよびＦ）部
分、末端反復配列（ＢａｍＨＩ Ｄ）部分、および内部
反復長い（ＢａｍＨＩ ＨおよびＩ2 ）部分などの多様
な領域である。観察された量のＤＮＡが、初期感染を確
立するために使用した残存ＣＥＦ細胞から得られる可能
性は低いため、これらの断片の強度は、ＭＤＶ ＯＵ
２．２細胞がＭＤＶ ＤＮＡ複製を可能にすることを示
唆する。
半クローン性細胞株（ＭＤＶ ＯＵ２．１およびＭＤＶ
ＯＵ２．２）は、確かにＭＤＶ ＤＮＡを有すること
が確認された。サザンブロットハイブリダイゼーション
により検出される断片は、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ中
に検出されるものとサイズが同じであり、大きな構造の
再配置は起きていないことを示している。さらにＭＤＶ
ＯＵ２．２細胞ＤＮＡ中に検出される断片は、ＭＤＶ
ゲノムのユニークな長い（ＢａｍＨＩＢおよびＦ）部
分、末端反復配列（ＢａｍＨＩ Ｄ）部分、および内部
反復長い（ＢａｍＨＩ ＨおよびＩ2 ）部分などの多様
な領域である。観察された量のＤＮＡが、初期感染を確
立するために使用した残存ＣＥＦ細胞から得られる可能
性は低いため、これらの断片の強度は、ＭＤＶ ＯＵ
２．２細胞がＭＤＶ ＤＮＡ複製を可能にすることを示
唆する。
【００４８】ウェスタンブロット解析は、ＭＤＶ ＯＵ
２．２細胞が、少なくとも限定されたセットのウイルス
蛋白（ｐｐ３８とｐｐ１４）を発現することを証明し
た。何回も試みたが、我々はウェスタンブロット解析に
より、ＭＤＶ糖蛋白であるｇＣ、ｇＢ、ｇＥ、およびｇ
Ｉを検出することはできなかった。使用した特定の抗血
清の各々は、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ細胞抽出物中に
各蛋白を検出することができた。従って、ウェスタンブ
ロット解析の結果は、ＭＤＶリンパ芽球様細胞中に見ら
れるものと同様に、潜伏感染としてＭＤＶ ＯＵ２．２
細胞中に存在するＭＤＶに一致する。しかし、ＭＤＶ
ＯＵ２．２細胞単層中の明瞭なプラークの存在は、ＭＤ
Ｖ感染に関連した細胞溶解活性を意味するため、潜伏感
染に一致しない。しかし、コンフルエンスなＭＤＶ Ｏ
Ｕ２．２細胞単層中の明瞭なプラークの存在は、ＭＤＶ
感染に関連した細胞溶解活性は接触阻害に依存すること
を意味する。
２．２細胞が、少なくとも限定されたセットのウイルス
蛋白（ｐｐ３８とｐｐ１４）を発現することを証明し
た。何回も試みたが、我々はウェスタンブロット解析に
より、ＭＤＶ糖蛋白であるｇＣ、ｇＢ、ｇＥ、およびｇ
Ｉを検出することはできなかった。使用した特定の抗血
清の各々は、Ｍｄ１１ｐ１５感染ＣＥＦ細胞抽出物中に
各蛋白を検出することができた。従って、ウェスタンブ
ロット解析の結果は、ＭＤＶリンパ芽球様細胞中に見ら
れるものと同様に、潜伏感染としてＭＤＶ ＯＵ２．２
細胞中に存在するＭＤＶに一致する。しかし、ＭＤＶ
ＯＵ２．２細胞単層中の明瞭なプラークの存在は、ＭＤ
Ｖ感染に関連した細胞溶解活性を意味するため、潜伏感
染に一致しない。しかし、コンフルエンスなＭＤＶ Ｏ
Ｕ２．２細胞単層中の明瞭なプラークの存在は、ＭＤＶ
感染に関連した細胞溶解活性は接触阻害に依存すること
を意味する。
【００４９】インビボおよびインビトロの実験は、ＯＵ
２細胞中で増殖したＭＤＶはすべての意味で、ＣＥＦ中
で増殖したＭＤＶから構造的および生物学的に区別でき
ないことを証明した。ワクチンウイルス（ＳＢ１とＦＣ
１２６）による予備実験は、これらのウイルスがＯＵ２
細胞中のＭｄ１１ｐ１５と同じ方法で複製することを示
している。これらの実験はまた、これらの感染ＯＵ２細
胞は、Ｍｄ１１ｐ１５で感染させたＯＵ２細胞のよう
に、感染性がありウイルスをＣＥＦに移すことができる
ことを示している。ＭＤＶのワクチン株による予備デー
タ、およびＭｄ１１ｐ１５のインビボのデータは、ＭＤ
Ｖのワクチン株で感染させたＯＵ２細胞よりなるワクチ
ンは、ＭＤＶのワクチン株で感染させたＣＥＦよりなる
現在のワクチンと同じく有効であることを、示唆する。
２細胞中で増殖したＭＤＶはすべての意味で、ＣＥＦ中
で増殖したＭＤＶから構造的および生物学的に区別でき
ないことを証明した。ワクチンウイルス（ＳＢ１とＦＣ
１２６）による予備実験は、これらのウイルスがＯＵ２
細胞中のＭｄ１１ｐ１５と同じ方法で複製することを示
している。これらの実験はまた、これらの感染ＯＵ２細
胞は、Ｍｄ１１ｐ１５で感染させたＯＵ２細胞のよう
に、感染性がありウイルスをＣＥＦに移すことができる
ことを示している。ＭＤＶのワクチン株による予備デー
タ、およびＭｄ１１ｐ１５のインビボのデータは、ＭＤ
Ｖのワクチン株で感染させたＯＵ２細胞よりなるワクチ
ンは、ＭＤＶのワクチン株で感染させたＣＥＦよりなる
現在のワクチンと同じく有効であることを、示唆する。
【００５０】例２１００ｍｍ培養プレート中の４×１０
6 細胞よりなるＣＨＣＣ−ＯＵ２単層を、３．１×１０
6 ＳＢ１感染ＣＥＦで感染することにより、ＭＤＶ血清
型−２ワクチン株ＳＢ１で感染させた。４回の継代の
間、同時培養を続けた。各継代で、ＭＤＶ感染に特徴的
な、増加していくプラークが観察された。
6 細胞よりなるＣＨＣＣ−ＯＵ２単層を、３．１×１０
6 ＳＢ１感染ＣＥＦで感染することにより、ＭＤＶ血清
型−２ワクチン株ＳＢ１で感染させた。４回の継代の
間、同時培養を続けた。各継代で、ＭＤＶ感染に特徴的
な、増加していくプラークが観察された。
【００５１】例３ １００ｍｍ培養プレート中の４×１０6 細胞よりなるＣ
ＨＣＣ−ＯＵ２単層を、３．３×１０6 ＨＶＴ感染ＣＥ
Ｆで感染することにより、ＭＤＶ血清型−３（ＨＶＴ）
ワクチン株Ｆｃ１２６で感染させた。４回の継代の間、
同時培養を続けた。継代３で、ＭＤＶ感染に特徴的なプ
ラークが観察された。
ＨＣＣ−ＯＵ２単層を、３．３×１０6 ＨＶＴ感染ＣＥ
Ｆで感染することにより、ＭＤＶ血清型−３（ＨＶＴ）
ワクチン株Ｆｃ１２６で感染させた。４回の継代の間、
同時培養を続けた。継代３で、ＭＤＶ感染に特徴的なプ
ラークが観察された。
【００５２】インビボ実験は、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞
がＭＤＶ感染をＣＥＦ単層培養物に移すことができ、そ
して感受性のある鳥でＭＤの臨床症状を誘発することが
できることを、明らかに示している。ＭＤＶ ＯＵ２．
２またはＭｄ１１ｐ１６を注入した鳥は、増殖速度の顕
著な低下、足、羽および首の痺痲を特徴とする、ＭＤの
臨床症状を発現した。組織（肝臓および脾臓を含む）の
ＰＣＲ解析は、ＭＤＶＯＵ２．２細胞を注入した鳥の離
れた組織中にＭＤＶが存在することを証明した。さら
に、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞を注入した鳥から単離され
たＰＢＬは、感染をＣＥＦ単層に移すことができた。こ
れに対して、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を接種した鳥
では、癌形成またはウイルス血症の証拠は観察されなか
った。
がＭＤＶ感染をＣＥＦ単層培養物に移すことができ、そ
して感受性のある鳥でＭＤの臨床症状を誘発することが
できることを、明らかに示している。ＭＤＶ ＯＵ２．
２またはＭｄ１１ｐ１６を注入した鳥は、増殖速度の顕
著な低下、足、羽および首の痺痲を特徴とする、ＭＤの
臨床症状を発現した。組織（肝臓および脾臓を含む）の
ＰＣＲ解析は、ＭＤＶＯＵ２．２細胞を注入した鳥の離
れた組織中にＭＤＶが存在することを証明した。さら
に、ＭＤＶ ＯＵ２．２細胞を注入した鳥から単離され
たＰＢＬは、感染をＣＥＦ単層に移すことができた。こ
れに対して、未感染ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞を接種した鳥
では、癌形成またはウイルス血症の証拠は観察されなか
った。
【００５３】インビボ実験は、ＭＤＶが感染したＣＨＣ
Ｃ−ＯＵ２細胞は、感受性のある鳥で感染を確立するた
めに使用することができることを、明らかに証明してい
る。これは、ＭＤＶワクチン開発と陽性選択によるＭＤ
Ｖ突然変異体の産生のために非常に重要な性質である。
Ｃ−ＯＵ２細胞は、感受性のある鳥で感染を確立するた
めに使用することができることを、明らかに証明してい
る。これは、ＭＤＶワクチン開発と陽性選択によるＭＤ
Ｖ突然変異体の産生のために非常に重要な性質である。
【００５４】前述の説明は本発明を例示するためであ
り、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定さ
れる。
り、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定さ
れる。
【００５５】例４ 本発明の有用性は、血清型１の細胞株を作成することが
でき、これらの血清型１細胞株は、複製可能なウイルス
を宿主に移すことができることを示す、米国とヨーロッ
パにおける血清型１ＭＤＶ細胞株が最近出現したことに
関する。米国農務省の認可を得ている血清型１ワクチン
の例は、Ｍｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２３、ＣＶＩ−９８
８／Ｃ、およびＣＶＩ−９８８Ｃ／Ｒ６（リスペンス
（Ｒｉｓｐｅｎｓ））である。本発明の血清型１ＭＤＶ
は、Ｍｄ１１であり、Ｍｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２３ワ
クチンと同じ親を有する。前記または他の血清型１ワク
チンウイルスの任意のものを含有する細胞株を作成する
ことができ、免疫能を与えるであろう。
でき、これらの血清型１細胞株は、複製可能なウイルス
を宿主に移すことができることを示す、米国とヨーロッ
パにおける血清型１ＭＤＶ細胞株が最近出現したことに
関する。米国農務省の認可を得ている血清型１ワクチン
の例は、Ｍｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２３、ＣＶＩ−９８
８／Ｃ、およびＣＶＩ−９８８Ｃ／Ｒ６（リスペンス
（Ｒｉｓｐｅｎｓ））である。本発明の血清型１ＭＤＶ
は、Ｍｄ１１であり、Ｍｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２３ワ
クチンと同じ親を有する。前記または他の血清型１ワク
チンウイルスの任意のものを含有する細胞株を作成する
ことができ、免疫能を与えるであろう。
【００５６】本発明の予測された性質は、細胞株の連続
継代の間の血清型１の安定性である。これは、ニワトリ
胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）で血清型１ＭＤＶを連続継代す
ると減弱化され、宿主中で複製する能力を喪失すること
とは対照的である。通常ＣＥＦ上の約３０回の継代。Ｃ
ＥＦ上で血清型１ＭＤＶワクチンウイルスを連続継代す
ると、最終的にワクチンウイルスがワクチンとしての効
力を失う（過剰減弱化）ため、本発明の血清型１ＭＤＶ
の安定性は、ワクチン製造業者には特に興味深い。従っ
て、血清型１ワクチンウイルスストックは最終的に枯渇
するであろう。本発明の方法で作成した血清型１ワクチ
ンウイルスを有する細胞株は、ワクチンウイルスを無期
限に増殖することを可能にするであろう。
継代の間の血清型１の安定性である。これは、ニワトリ
胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）で血清型１ＭＤＶを連続継代す
ると減弱化され、宿主中で複製する能力を喪失すること
とは対照的である。通常ＣＥＦ上の約３０回の継代。Ｃ
ＥＦ上で血清型１ＭＤＶワクチンウイルスを連続継代す
ると、最終的にワクチンウイルスがワクチンとしての効
力を失う（過剰減弱化）ため、本発明の血清型１ＭＤＶ
の安定性は、ワクチン製造業者には特に興味深い。従っ
て、血清型１ワクチンウイルスストックは最終的に枯渇
するであろう。本発明の方法で作成した血清型１ワクチ
ンウイルスを有する細胞株は、ワクチンウイルスを無期
限に増殖することを可能にするであろう。
【００５７】本発明はまた、組換えウイルスの精製操作
の間、過剰に減弱化したウイルスを産生することなく、
遺伝子操作により作成した血清型１ＭＤＶワクチンを作
成することができることを証明している。これは、他の
病原体の複数の遺伝子を含有する、遺伝子操作により作
成したＭＤＶワクチンウイルスにとって特に重要であ
る。このような遺伝子操作により作成したＭＤＶは、ウ
イルスの連続継代がワクチン種菌ストックを産生し始め
るまでに、精製の間４０回以上の連続的継代が必要なこ
とがある。
の間、過剰に減弱化したウイルスを産生することなく、
遺伝子操作により作成した血清型１ＭＤＶワクチンを作
成することができることを証明している。これは、他の
病原体の複数の遺伝子を含有する、遺伝子操作により作
成したＭＤＶワクチンウイルスにとって特に重要であ
る。このような遺伝子操作により作成したＭＤＶは、ウ
イルスの連続継代がワクチン種菌ストックを産生し始め
るまでに、精製の間４０回以上の連続的継代が必要なこ
とがある。
【００５８】
付録Ｉ （１）一般情報： （i)出願人：ポール・エム・クセンス（Ｐａｕｌ Ｍ．
Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）とアミン・アブジョウブ（Ａｍｉｎ
Ａｂｕｊｏｕｂ） （ii）発明の名称：マレク病ウイルスに感染した維持可
能なニワトリ細胞株 （iii)配列の数：１４ （iv）連絡住所： （Ａ）宛名：イアン・シー・マクレオド（Ｉａｎ Ｃ．
ＭｃＬｅｏｄ） （Ｂ）通り：２１９０コモンズパークウェイ（Ｃｏｍｍ
ｏｎｓ Ｐａｒｋｗａｙ） （Ｃ）市：オケモス（Ｏｋｅｍｏｓ） （Ｄ）州：ミシガン （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：４８８６４ （v)コンピューターで読める形式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク５．２５インチ
３６０ｋｂ容量 （Ｂ）コンピューター：エーサー（Ａｃｅｒ） （Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ（バ
ージョン３．３） （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト５．１ （vi）現行出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii)先行出願のデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：イアン・シー・マクレオド（Ｉａｎ Ｃ．
ＭｃＬｅｏｄ） （Ｂ）登録番号：２０，９３１ （Ｃ）参照／整理番号：ＭＳＵ４．１−２７０ （ix）電話連絡先情報： （Ａ）電話：（５１７）３４７−４１００ （Ｂ）ファックス：（５１７）３４７−４１０３ （２）配列番号：１の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１： （３）配列番号：２の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：２： （４）配列番号：３の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：３： （５）配列番号：４の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：４： （６）配列番号：５の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：５： （７）配列番号：６の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：６： （８）配列番号：７の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：７： （９）配列番号：８の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：８： （１０）配列番号：９の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：９： （１１）配列番号：１０の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１０： （１２）配列番号：１１の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１１： （１３）配列番号：１２の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１２： （１４）配列番号：１３の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１３： （１５）配列番号：１４の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１４：
Ｃｏｕｓｓｅｎｓ）とアミン・アブジョウブ（Ａｍｉｎ
Ａｂｕｊｏｕｂ） （ii）発明の名称：マレク病ウイルスに感染した維持可
能なニワトリ細胞株 （iii)配列の数：１４ （iv）連絡住所： （Ａ）宛名：イアン・シー・マクレオド（Ｉａｎ Ｃ．
ＭｃＬｅｏｄ） （Ｂ）通り：２１９０コモンズパークウェイ（Ｃｏｍｍ
ｏｎｓ Ｐａｒｋｗａｙ） （Ｃ）市：オケモス（Ｏｋｅｍｏｓ） （Ｄ）州：ミシガン （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：４８８６４ （v)コンピューターで読める形式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク５．２５インチ
３６０ｋｂ容量 （Ｂ）コンピューター：エーサー（Ａｃｅｒ） （Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ（バ
ージョン３．３） （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト５．１ （vi）現行出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii)先行出願のデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：イアン・シー・マクレオド（Ｉａｎ Ｃ．
ＭｃＬｅｏｄ） （Ｂ）登録番号：２０，９３１ （Ｃ）参照／整理番号：ＭＳＵ４．１−２７０ （ix）電話連絡先情報： （Ａ）電話：（５１７）３４７−４１００ （Ｂ）ファックス：（５１７）３４７−４１０３ （２）配列番号：１の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１： （３）配列番号：２の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：２： （４）配列番号：３の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：３： （５）配列番号：４の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：４： （６）配列番号：５の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：１６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：５： （７）配列番号：６の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：６： （８）配列番号：７の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：７： （９）配列番号：８の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：８： （１０）配列番号：９の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：９： （１１）配列番号：１０の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１０： （１２）配列番号：１１の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１１： （１３）配列番号：１２の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：１９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１２： （１４）配列番号：１３の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１３： （１５）配列番号：１４の情報： （i)配列の特色： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型： （Ａ）型：合成ＤＮＡ （iii)ハイポセティカル配列：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （vi）起源： （Ａ）生物名：マレク病ウイルス （vii)直接の起源： （Ａ）ライブラリー： （xi）配列：配列番号：１４：
【図１】Ａは未感染および感染細胞の光学顕微鏡写真を
示す。Ｂは未感染および感染細胞の光学顕微鏡写真を示
す。
示す。Ｂは未感染および感染細胞の光学顕微鏡写真を示
す。
【図２】ＭＤＶ特異的配列のＰＣＲ増幅からのＤＮＡを
示す電気泳動ゲルを示す。
示す電気泳動ゲルを示す。
【図３】感染したＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞中のウイルスＤ
ＮＡの検出を示す電気泳動ゲルを示す。
ＮＡの検出を示す電気泳動ゲルを示す。
【図４】Ａは特異的ＭＤＶ蛋白の検出のためのウェスタ
ンブロットを示す。Ｂは特異的ＭＤＶ蛋白の検出のため
のウェスタンブロットを示す。Ｃは特異的ＭＤＶ蛋白の
検出のためのウェスタンブロットを示す。
ンブロットを示す。Ｂは特異的ＭＤＶ蛋白の検出のため
のウェスタンブロットを示す。Ｃは特異的ＭＤＶ蛋白の
検出のためのウェスタンブロットを示す。
【図５】８５０塩基対のｐｐ３８遺伝子部分のＰＣＲ増
幅からのＤＮＡを示す電気泳動ゲルを示す。
幅からのＤＮＡを示す電気泳動ゲルを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (31)
- 【請求項１】 ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性で
あり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチル−Ｎ1 −ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処理し、次に
インビボで鳥類に感染することができるマレク病ウイル
ス（ＭＤＶ）で感染させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）か
ら得られる、ＭＤＶに感染した維持可能なニワトリ細胞
株。 - 【請求項２】 ＭＤＶは、免疫能を引き出すためのウイ
ルスワクチンの製造に使用されるウイルスである、請求
項１に記載の細胞株。 - 【請求項３】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、または
血清型３ＭＤＶ、ここで、血清型３は七面鳥ヘルペスウ
イルス（ＨＶＴ）である、よりなる群から選択されるウ
イルスである、請求項１に記載の細胞株。 - 【請求項４】 ＭＤＶは、ＭＤＶ内の部位に挿入された
１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、遺伝子
操作により作成されたＭＤＶである、請求項１に記載の
細胞株。 - 【請求項５】 ＭＤＶは、１つまたはそれ以上の外来遺
伝子が欠失された、請求項１に記載の細胞株。 - 【請求項６】 マレク病Ｍｄ１１株を含有する、ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ １１９８５として寄託された、不死化され
たマレク病ヘルペスウイルス細胞株。 - 【請求項７】 ＣＥＣ繊維芽細胞はＣＨＣＣ−ＯＵ２で
ある、請求項１に記載の細胞株。 - 【請求項８】 マレク病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した
維持可能なニワトリ細胞株を産生する方法であって： （ａ）ニワトリヘルパー因子が存在せず、ウイルスが存
在せず、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（ＭＮＮＧ）で処理したニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）
を、培地中でＭＤＶウイルスと合わせて、ＣＥＣをＭＤ
Ｖで感染させ； （ｂ）ＭＤＶが感染したＣＥＣを未感染ＣＥＣから精製
し、そして （ｃ）ＭＤＶが感染したＣＥＣを増殖させて細胞株を産
生する、ことを含んでなる、上記方法。 - 【請求項９】 ＭＤＶウイルスは、初代胚繊維芽細胞か
ら得られる細胞関連ＭＤＶウイルス、細胞のないＭＤ
Ｖ、またはＣＥＣにトランスフェクションされたＭＤＶ
ＤＮＡよりなる群から選択される、請求項８に記載の
方法。 - 【請求項１０】 ＭＤＶは、免疫能を引き出すためのウ
イルスワクチンの製造に使用されるウイルスである、請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、また
は血清型３ＭＤＶ、ここで、血清型３は七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）である、よりなる群から選択される
ウイルスである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 ＭＤＶは、ＭＤＶ内の部位に挿入され
た１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、遺伝
子操作により作成されたＭＤＶである、請求項８に記載
の方法。 - 【請求項１３】 ＭＤＶは、１つまたはそれ以上の外来
遺伝子が欠失された、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１４】 マレク病Ｍｄ１１株を含有する、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ−１１９８５として寄託された、不死化さ
れたマレク病ヘルペスウイルス細胞株である、請求項８
に記載の方法。 - 【請求項１５】 ＣＥＣ繊維芽細胞はＣＨＣＣ−ＯＵ２
である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１６】 鳥をマレク病ウイルス（ＭＤＶ）によ
り感染させる方法であって： （ａ）ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性であり、ウ
イルスが存在せず、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処理し、次にインビボで
鳥類に感染することができるＭＤＶで感染させたニワト
リ胚細胞（ＣＥＣ）から得られる、マレク病ウイルス
（ＭＤＶ）に感染した維持可能なニワトリ細胞株により
産生されるワクチンを提供し、そして （ｂ）鳥にこのワクチンを接種する、ことを含んでな
る、上記方法。 - 【請求項１７】 接種は注射により行われる、請求項１
６に記載の方法。 - 【請求項１８】 ＭＤＶは、免疫能を引き出すためのウ
イルスワクチンの製造に使用されるウイルスである、請
求項１６に記載の方法。 - 【請求項１９】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、また
は血清型３ＭＤＶ、ここで、血清型３は七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）である、よりなる群から選択される
ウイルスである、請求項１６に記載の方法。 - 【請求項２０】 ＭＤＶは、ＭＤＶ内の部位に挿入され
た１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、遺伝
子操作により作成されたＭＤＶである、請求項１２に記
載の方法。 - 【請求項２１】 ＭＤＶは、１つまたはそれ以上の外来
遺伝子が欠失された、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項２２】 マレク病Ｍｄ１１株を含有する、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ−１１９８５として寄託された、不死化さ
れたマレク病ヘルペスウイルス細胞株である、請求項１
６に記載の方法。 - 【請求項２３】 ＣＥＣ繊維芽細胞はＣＨＣＣ−ＯＵ２
である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項２４】 ワクチンは、維持可能なＭＤＶ細胞株
を含有する、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項２５】 ニワトリヘルパー因子（Ｃｈｆ）陰性
であり、ウイルスが存在せず、Ｎ−メチル−Ｎ1 −ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）で処理し、次
にインビボで鳥類に感染することができるＭＤＶで感染
させたニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）から得られる、マレク
病ウイルス（ＭＤＶ）に感染した維持可能な繊維芽細胞
株を含有する、投薬単位型の鳥類ワクチン。 - 【請求項２６】 ＭＤＶは、免疫能を引き出すためのウ
イルスワクチンの製造に使用されるウイルスである、請
求項２５に記載のワクチン。 - 【請求項２７】 ＭＤＶは、血清型１、血清型２、また
は血清型３ＭＤＶ、ここで、血清型３は七面鳥ヘルペス
ウイルス（ＨＶＴ）である、よりなる群から選択される
ウイルスである、請求項２５に記載のワクチン。 - 【請求項２８】 ＭＤＶは、ＭＤＶ内の部位に挿入され
た１つまたはそれ以上の外来遺伝子を含んでなる、遺伝
子操作により作成されたＭＤＶである、請求項２５に記
載のワクチン。 - 【請求項２９】 ＭＤＶは、１つまたはそれ以上の外来
遺伝子が欠失された、請求項２５に記載のワクチン。 - 【請求項３０】 マレク病Ｍｄ１１株を含有する、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ−１１９８５として寄託された、不死化さ
れたマレク病ヘルペスウイルス細胞株である、請求項２
５に記載のワクチン。 - 【請求項３１】 ＣＥＣ繊維芽細胞はＣＨＣＣ−ＯＵ２
である、請求項２５に記載のワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US549045 | 1995-10-27 | ||
| US08/549,045 US5827738A (en) | 1995-10-27 | 1995-10-27 | Sustainable chick cell line infected with Marek's disease virus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173059A true JPH09173059A (ja) | 1997-07-08 |
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ID=24191442
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8282247A Pending JPH09173059A (ja) | 1995-10-27 | 1996-10-24 | マレク病ウイルスに感染した維持可能なニワトリ細胞株 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0775743A3 (ja) |
| JP (1) | JPH09173059A (ja) |
| BR (1) | BR9605244A (ja) |
| CA (1) | CA2185407A1 (ja) |
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Cited By (1)
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