JPH09173100A - ホップ潜在ウイルスの遺伝子及び該ウイルスの検出方法 - Google Patents

ホップ潜在ウイルスの遺伝子及び該ウイルスの検出方法

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JPH09173100A
JPH09173100A JP7352285A JP35228595A JPH09173100A JP H09173100 A JPH09173100 A JP H09173100A JP 7352285 A JP7352285 A JP 7352285A JP 35228595 A JP35228595 A JP 35228595A JP H09173100 A JPH09173100 A JP H09173100A
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dna
seq
sequence
synthetic dna
latent virus
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Shigeji Suda
成志 須田
Yutaka Itoga
裕 糸賀
Tatsuji Hataya
達児 畑谷
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Sapporo Breweries Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホップ潜在ウイルス感染株の効率的な遺伝子
診断法を開発すること。 【解決手段】 ホップ潜在ウイルスゲノム由来の遺伝子
で、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するホッ
プ潜在ウイルスの外被タンパク質をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ホップ潜在ウイル
スの遺伝子及び該ウイルスの検出方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】ホップ潜在ウイルス（Hop Latent Viru
s; 以下、ＨＬＶと略記する。）は、ホップの栽培地全
域のホップに広く感染が認められ（Tresh & Ormerod, R
ep.E.Malling Res.Stn for 1968: 41(1969), Probasco
& Skotland, Phytopathology 68:277(1978), Adams & B
arbara, Ann.appl.Biol.101: 483(1982), Inoue et a
l.,Ann.Phytopath.Soc.Japan 39: 229(1973)) 、特に、
ホップのウイルスフリー苗を作出するにあたっては、Ｈ
ＬＶの免疫学的診断（ＥＬＩＳＡ）が必須であり、日常
的に行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ＥＬＩＳＡに
よるＨＬＶの診断には、検体採取時期の違いによる検定
精度の低下や抗体の作製に手間がかかるなどの問題点が
あった。ところで、ＨＬＶはカルラウイルスグループに
属するひも状ウイルスであり、その遺伝子やタンパク質
の一次構造等については明らかにされておらず、未だに
遺伝子診断の手法は確立されていなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は上記の状況に鑑
み、ＨＬＶ感染株の効率的な遺伝子診断法を開発するこ
とにより、課題を解消することを目的とするものであ
る。本発明者らは、まずＨＬＶの遺伝子について解析，
検討した結果、他に先駆けてＨＬＶの外被タンパク質遺
伝子を特定し、その塩基配列を解明することに成功し、
さらにそのタンパク質の一次構造も解明した。次に、該
塩基配列の一部または相補的配列を有するＤＮＡをプラ
イマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣ
Ｒと略記する。）により、ＨＬＶ感染株に特異的なＤＮ
Ａ増幅産物が得られることを見出し、ＨＬＶの検出方法
を確立した。さらに、ＨＬＶ遺伝子の相補鎖ＤＮＡをプ
ローブとしてハイブリダイズした場合でも、ＨＬＶ感染
株が検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】請求項１記載の発明は、ホップ潜在ウイル
スゲノム由来の遺伝子で、配列表の配列番号１に記載の
塩基配列を有するホップ潜在ウイルスの外被タンパク質
をコードするＤＮＡである。請求項２記載の発明は、配
列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、５８〜９７
５番目の塩基配列から翻訳される３０６残基のアミノ酸
をコードするＤＮＡである。請求項３記載の発明は、配
列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、９８１〜１
２９２番目の塩基配列から翻訳される１０４残基のアミ
ノ酸をコードするＤＮＡである。請求項４記載の発明
は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する合成
ＤＮＡである。請求項５記載の発明は、配列表の配列番
号３に記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡである。請求
項６記載の発明は、配列表の配列番号４に記載の塩基配
列を有する合成ＤＮＡである。請求項７記載の発明は、
配列表の配列番号５に記載の塩基配列を有する合成ＤＮ
Ａである。請求項８記載の発明は、ホップより抽出した
核酸を鋳型とし、請求項４〜７のいずれかに記載の合成
ＤＮＡをプライマーに用いた逆転写ＰＣＲ法によりＤＮ
Ａの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析する
ことを特徴とするホップ潜在ウイルスの検出方法であ
る。請求項９記載の発明は、請求項４記載の合成ＤＮＡ
と請求項６記載の合成ＤＮＡを用いて逆転写ＰＣＲによ
りＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分
析し、２３３塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無により、
ホップ潜在ウイルスを検出する診断方法である。請求項
１０記載の発明は、請求項５記載の合成ＤＮＡと請求項
６記載の合成ＤＮＡを用いて逆転写ＰＣＲによりＤＮＡ
の増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析し、１
８１塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無により、ホップ潜
在ウイルスを検出する診断方法である。請求項１１記載
の発明は、請求項４記載の合成ＤＮＡと請求項７記載の
合成ＤＮＡを用いて逆転写ＰＣＲによりＤＮＡの増幅を
行い、得られた増幅産物を電気泳動分析し、３７７塩基
対の特異的ＤＮＡ断片の有無により、ホップ潜在ウイル
スを検出する診断方法である。請求項１２記載の発明
は、請求項５記載の合成ＤＮＡと請求項７記載の合成Ｄ
ＮＡを用いて逆転写ＰＣＲによりＤＮＡの増幅を行い、
得られた増幅産物を電気泳動分析し、３２５塩基対の特
異的ＤＮＡ断片の有無により、ホップ潜在ウイルスを検
出する診断方法である。請求項１３記載の発明は、ホッ
プより抽出した核酸と、請求項６および７のいずれかに
記載の合成ＤＮＡあるいは該ＤＮＡをプライマーに用い
て伸長合成した相補鎖ＤＮＡをプローブとしてハイブリ
ダイズさせることを特徴とするホップ潜在ウイルスの検
出方法である。請求項１４記載の発明は、ホップより抽
出した核酸と、請求項１記載のＤＮＡの制限酵素切断フ
ラグメントをプローブとしてハイブリダイズさせること
を特徴とするホップ潜在ウイルスの検出方法である。請
求項１５記載の発明は、配列表の配列番号１に記載の塩
基配列のうち、５８〜９７５番目の塩基配列から翻訳さ
れ、配列表の配列番号６に記載の３０６残基のアミノ酸
配列を有するホップ潜在ウイルスの外被タンパク質であ
る。
【０００６】
【発明の実施の形態】ＨＬＶの遺伝子は以下の手順で解
析し、ＨＬＶの外被タンパク質遺伝子を特定し、その塩
基配列を解明する。 ＨＬＶの単離 ＨＬＶは、ＨＬＶ感染ホップから常法により単離するこ
とができ、例えばポリエチレングリコールによる濃縮、
有機溶媒や熱処理による清澄化、分画遠心、蔗糖密度勾
配遠心などによって行うことができる。 ＨＬＶからのＲＮＡ抽出 ＨＬＶからのＲＮＡ抽出は、例えば他の植物ウイルスで
主に用いられているＳＤＳ−フェノール法により行う等
の常法により実施することができる。 ｃＤＮＡのクローニング ＨＬＶ粒子から抽出したＲＮＡをもとにして Gubler-Ho
ffman 法（Gubler & Hoffman, Gene, 25, 263(1983))に
より、２本鎖ｃＤＮＡを試験管内で合成する。合成され
たｃＤＮＡを常法によりプラスミドベクターに組み込
む。プラスミドとしては、ｐＵＣ１１９，ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔII等が挙げられる。このプラスミドベクター
を大腸菌のコンピテントセルに導入した後に培養し、得
られた大腸菌から常法によりｃＤＮＡをクローニングし
たプラスミドを精製する。
【０００７】ＨＬＶゲノム由来のｃＤＮＡの塩基配列
の決定 上記の方法で得られたｃＤＮＡをクローニングしたプラ
スミドを用いて、マクサムギルバート法（Maxam & Gilb
ert, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560(1977)）もしく
はジデオキシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. S
ci., 74, 5463(1977))により塩基配列を決定することが
できる。これにより、ＨＬＶの外被タンパク質をコード
する遺伝子（以下、ＨＬＶ外被タンパク質遺伝子と略記
する。）を含有するＤＮＡの塩基配列を決定し、その配
列を配列表の配列番号１に記載した。 ＨＬＶ外被タンパク質の部分アミノ酸配列の決定 ＨＬＶ外被タンパク質の部分アミノ酸配列は、タンパク
質分解酵素によりＨＬＶ外被タンパク質を部分消化した
後、高速液体クロマトグラフィーにより分離、精製後、
プロテインシークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いて決定
する。このようにして決定されたＨＬＶ外被タンパク質
の部分アミノ酸配列を図１に示す。この部分アミノ酸配
列と配列表のＨＬＶ外被タンパク質遺伝子の塩基配列か
ら予測されるＨＬＶ外被タンパク質・アミノ酸配列を比
較検討することにより、外被タンパク質の一次構造（ア
ミノ酸配列）が明らかになった（図１参照）。
【０００８】ＨＬＶ感染ホップのウイルス遺伝子診断 （１）逆転写ＰＣＲ法による遺伝子診断 上記の方法により確定されたＨＬＶ外被タンパク質遺伝
子の塩基配列や該塩基配列の相補配列のうちの部分的塩
基配列を有する、大略２０残基のプライマーＤＮＡを常
法により合成し、ＰＣＲ法を用いて得られた増幅産物の
有無により、ＨＬＶ感染ホップのウイルス遺伝子診断が
可能となる。
【０００９】プライマーとしては、配列表の配列番号２
〜５に記載した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
利用できる。このうち、配列表の配列番号２に記載した
塩基配列は、配列番号１に記載した塩基配列中の４０５
〜４２３番目の塩基配列と同一であり、以下３Ｐと略記
する。配列表の配列番号３に記載した塩基配列は、配列
番号１に記載した塩基配列中の４５７〜４７４番目の塩
基配列と同一であり、以下４Ｐと略記する。また、配列
表の配列番号４に記載した塩基配列は、配列番号１に記
載した塩基配列中の６１８〜６３７番目の塩基配列の相
補配列であり、以下３Ｍと略記する。配列表の配列番号
５に記載した塩基配列は、配列番号１に記載した塩基配
列中の７６１〜７８１番目の塩基配列の相補配列であ
り、以下４Ｍと略記する。
【００１０】また、配列表の配列番号２〜５に示した塩
基配列の一部の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いることもできる。すなわち、ＰＣ
Ｒが本来、多数の塩基配列の中から特定の遺伝子情報を
得、そのコピーを増幅するものであるから、本発明のプ
ライマーの塩基配列と近似の塩基配列を持ったオリゴヌ
クレオチドであれば、同様にプライマーとして用いるこ
とができるものと思われる。本発明に用いるプライマー
ＤＮＡは、例えばβ−シアノエチルホスホアミダイト法
やチオホスファイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装
置によって得ることができる。
【００１１】本発明に用いるホップ植物の核酸は、常法
により抽出することができ、通常の核酸抽出方法により
行うことができる。このようにして得られたホップの核
酸と上記のプライマーを用い、（逆転写）ＰＣＲにより
ＨＬＶゲノム由来のＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲは変性
工程，プライマーのアニーリング工程およびＤＮＡポリ
メラーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを
繰り返して行う工程であり、例えばSaiki ら、Science,
第230 巻, 1350-1354 頁等に通常の方法が記載されてい
る。
【００１２】本発明において行うＰＣＲとしては、合成
オリゴヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼ，４種類の塩
基（dATP, dTTP, dCTP, dGTP) およびホップのＤＮＡを
予め加えた約１．０ｍＭから約４．０ｍＭ、好ましくは
約１．５ｍＭから約３．０ｍＭの塩化マグネシウムや、
塩化カリウム，ゼラチン，牛血清アルブミン，界面活性
剤(Tween 20, NP-40, Triton X-100など（いずれも商品
名）），ジメチルスルホキシド等を含有する増幅用緩衝
液中で、約２０回から約５０回、好ましくは約２５回か
ら約４０回ＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行う方法を
示すことができる。
【００１３】さらに、ＰＣＲにおける各工程は、例えば
次のような条件等で行うことができる。変性工程は、通
常９０℃から９５℃、好ましくは約９４℃から９５℃で
約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から約２分
間加熱することにより行う。プライマーのアニーリング
工程は、通常３０℃から５０℃、好ましくは約３５℃か
ら約４２℃で約１分間から約３分間、好ましくは約１分
間から約２分間プライマーとインキュベートすることに
より行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、通常
約７０℃から約７３℃、好ましくは約７２℃から約７３
℃で約１分間から約４分間、好ましくは約２分間から約
３分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理すること等により
行う。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、PERKIN ELM
ER社製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものを挙
げることができる。
【００１４】上記のＰＣＲにより得られた増幅ＤＮＡ
は、通常のＤＮＡ分離に用いられる電気泳動法によって
分離される。一般には、約０．２％から約２％のアガロ
ースゲルを用いることができる。電気泳動に用いる緩衝
液としては、Ｔｒｉｓ−リン酸系（ｐＨ７．５〜８．
０）、Ｔｒｉｓ−酢酸系（ｐＨ７．５〜８．０）、Ｔｒ
ｉｓ−ホウ酸系（ｐＨ７．５〜８．３）等が挙げられ、
好ましくはＴｒｉｓ−ホウ酸系である。また、必要に応
じてＥＤＴＡ等を添加することもできる。電気泳動の条
件としては、例えば５０〜３００Ｖ、１０〜１２０分
間、好ましくは１５０Ｖ、３０分間であり、サイズマー
カーとしては、例えば100 Base-Pair Ladder (Pharmaci
a 社製) 等の市販のものを用いることができる。
【００１５】増幅ＤＮＡは、例えばエチジウムブロミド
等のフェナントリジン系色素で、かつ核酸と相互作用す
るような物質を用いる染色法によって、視覚的に検出す
ることができる。該染色法は、あらかじめ電気泳動用の
緩衝液に、例えば終濃度として約０．５μｇ／ｍｌのエ
チジウムブロミド等の物質を加えておくと、暗所で２５
４ｎｍまたは３６６ｎｍの紫外線をゲルに照射すること
によって、電気泳動中でもＤＮＡとエチジウムブロミド
の結合体の赤色バンドを検出できる。しかし、通常は電
気泳動終了後にゲルをエチジウムブロミド等の物質の溶
液に約１０分間から約６０分間浸してから暗所で２５４
ｎｍまたは３６６ｎｍの紫外線をゲルに照射することに
よって、ＤＮＡとエチジウムブロミドの結合体の赤色バ
ンドを検出する。
【００１６】検出された増幅ＤＮＡの存在の有無によっ
て、ウイルス感染を識別することが可能である。すなわ
ち、同一プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ウイ
ルス感染ホップ由来のものでは特異的な増幅ＤＮＡが検
出されるが、未感染ホップ由来のものでは特異的な増幅
ＤＮＡが検出されない。例えば、請求項９記載の方法で
は２３３塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無により、請求
項１０記載の方法では１８１塩基対の特異的ＤＮＡ断片
の有無により、請求項１１記載の方法では３７７塩基対
の特異的ＤＮＡ断片の有無により、また請求項１２記載
の方法では３２５塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無によ
り、それぞれホップ潜在ウイルスを検出することができ
る。
【００１７】（２）ハイブリダイゼーションによる遺伝
子診断 ＨＬＶ外被タンパク質遺伝子の相補配列を有するオリゴ
ヌクレオチドを化学合成または遺伝子操作により調製
し、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行
うことにより、従来の免疫学的方法と異なる診断を行う
ことができる。プローブとしては、通常の鎖長２０〜数
千塩基のものが用いられ、例えば配列表の配列番号６お
よび７に記載した塩基配列を有するものや、ＨＬＶ外被
タンパク質遺伝子をクローニングしたプラスミドから調
製したｃＤＮＡを制限酵素で切断したＤＮＡフラグメン
ト等が挙げられる。これらのプローブはアイソトープや
ビオチン，蛍光物質等で常法により標識した後にハイブ
リダイゼーションに用いる。
【００１８】ハイブリダイゼーションに用いるホップ植
物の核酸は、常法により抽出することができ、例えばMu
rray & Thompson, Nucl. Acid Res., 8, 4321-4325(198
0)等に記載された通常の核酸抽出方法により行うことが
できる。得られた核酸は変性処理した後にメンブランフ
ィルターにスポットする。メンブランフィルターとして
は、ニトロセルロースフィルター，ナイロンフィルター
等が用いられ、例えばHybond-N+ （アマシャム社製）が
好ましい。
【００１９】核酸の変性処理は、核酸をホルムアミド，
ホルムアルデヒド，ＭＯＰＳ，酢酸ナトリウム，ＥＤＴ
Ａ等を含有する変性溶液中にて６０〜７０℃、好ましく
は６５℃で５〜２０分間、好ましくは１５分間処理した
後急冷して行う。この変性処理後、２０× ＳＳＣを加
えて混合し、メンブランフィルターにスポットする。
【００２０】こうして得られたメンブランフィルター
（ホップの核酸）と上記のプローブを用い、ハイブリダ
イゼーション溶液中で４２〜６５℃、好ましくは４６℃
で１２〜２０時間、好ましくは１６時間ハイブリダイゼ
ーションを行う。その後、メンブランフィルターを洗
浄，乾燥し、オートラジオグラフィー等の検出手段によ
りスポットのシグナルの有無を観察する。すなわち、ウ
イルス感染ホップ由来のものはハイブリダイズするため
シグナルが検出されるが、未感染ホップ由来のものはハ
イブリダイズしないためシグナルが検出されない。
【００２１】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。 実施例１ ＨＬＶの単離 ＨＬＶ感染ホップの萌芽茎１ｋｇを３倍容の０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０、０．２％ アスコルビン
酸，０．２％ ニコチン，０．２％ ＰＶＰを含む）で
磨砕し、室温で１時間放置後、ガーゼで濾過し、粗汁液
を得た。これを熱処理（５５℃，８分間）した後、直に
氷水中で急冷し、３０００×ｇで３０分間遠心して上清
を得た。上清に５％ ポリエチレングリコール，０．１
５Ｍ 塩化ナトリウムになるように試薬を加え、１時間
攪拌後、３０００×ｇで３０分間遠心し、沈澱を０．０
５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．０２Ｍ ＥＤＴ
Ａを含む。）に懸濁した。
【００２２】さらに、高速遠心（１５０００×ｇ，１０
分間）で上清を得た後、超遠心（１０００００×ｇ，１
２０分間）で沈澱を回収する操作を２回繰り返すことに
よりウイルスと夾雑物を分離した。得られた沈澱を２ｍ
ｌ ０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁
後、２０〜４０％のショ糖密度勾配遠心（１５００００
×ｇ，１２０分間）を行い、ウイルス画分を回収した。
最後に、１８００００×ｇ，１５０分間遠心し、ウイル
ス粒子を沈澱として得、０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に再懸濁して精製ウイルス標品として保存し
た。なお、上記の操作は、特に断らない限りすべて４℃
条件下で行った。
【００２３】実施例２ ＨＬＶからのＲＮＡ抽出 ＨＬＶ粒子からのＲＮＡ抽出は、ＳＤＳ−フェノール法
（Proll et al., Potato Research 24, 1-10(1981)）に
より行った。実施例１と同様の方法で得られたＨＬＶ精
製標品（１μｇ／μｌ）８４μｌに２０％ ＳＤＳ ５
μｌ，２０× ＳＳＣ １μｌ，プロテアーゼ（商品
名：プロテアーゼＫ）（１０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを加
えて混合し、３７℃で３０分間保温した。次いで、０．
５％ ベントナイト懸濁液 ５０μｌとＴＥ飽和フェノ
ール １５０μｌを加えてフェノール抽出を行った。そ
の後、フェノール：クロロホルム混合液（１：１）を用
いて再びフェノール抽出を行った。水層をクロロホルム
抽出した後、水層に３Ｍ 酢酸ナトリウム １０μｌ，
冷エタノール ２５０μｌを加えて混合し、−８０℃で
３０分間静置した。その後、１５０００×ｇで５分間遠
心して沈澱を得た。次いで、７０％ エタノールで遠心
洗浄し、エタノールを乾燥除去した後、沈澱に蒸留水
５０μｌを加えて溶解し、４Ｍ 塩化リチウム ５０μ
ｌを加えて混合後、氷中で１晩静置した。その後、１５
０００×ｇで５分間遠心して沈澱を得、再び７０％ エ
タノールで遠心洗浄し、エタノールを乾燥除去後、沈澱
に蒸留水８μｌを加えて溶解し、ＲＮＡ試料として保存
した。
【００２４】実施例３ ｃＤＮＡのクローニング 実施例２で調製したＲＮＡ試料からｃＤＮＡ合成キット
（アマシャム社製）を用い、アマシャム社のプロトコー
ルに従ってｃＤＮＡを合成し、ＴＥ緩衝液 １０μｌに
溶解した。次に、プラスミドｐＵＣ１１９（５０ｎｇ／
μｌ）をＳｍａＩ消化後、脱リン酸化処理したもの２μ
ｌに、前記の合成したｃＤＮＡ １μｌ，１０ｍＭ Ａ
ＴＰ，１０× ライゲーション緩衝液（ベーリンガー社
製），Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μｌ，ベーリンガー
社製），蒸留水 １３μｌを加えて混合後、２２℃で一
晩保温し、ライゲーション反応を行った。
【００２５】大腸菌ＭＶ１１８４のコンピテントセルを
作製し、このコンピテントセル １００μｌと上記のラ
イゲーション反応液を混合し、氷上で３０分間静置し
た。次に、４２℃で６０秒間保温後、直に氷中で急冷
し、ＳＯＣ培地 ５００μｌを加え、３７℃で１時間保
温した。２％ Ｘ−ｇａｌと１００ｍＭ ＩＰＴＧを５
０μｌずつ加え、５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含む
２× ＹＴ寒天培地２枚にプレートアウトし、３７℃で
１晩培養した。得られた白色コロニーの大腸菌から常法
によりプラスミドＤＮＡを抽出し、長いｃＤＮＡ断片が
挿入されたプラスミドを持つ大腸菌を選抜し、保存し
た。
【００２６】次に、ＨＬＶゲノム由来のｃＤＮＡである
ことを確認するために、精製したＨＬＶ−ＲＮＡ試料を
アルカリ部分分解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで
〔γ 32Ｐ〕ＡＴＰを５’末端ラベルしたプローブを用
い、選抜したｃＤＮＡに対してサザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行った。その結果、０．７Ｋｂ，１．
２Ｋｂ，１．３５Ｋｂ，３．５Ｋｂ，５．０ＫｂのＨＬ
Ｖゲノム由来のｃＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを
持つ大腸菌株が得られた。
【００２７】実施例４ ＨＬＶゲノム由来のｃＤＮＡの塩基配列の決定 実施例３で得られたＨＬＶゲノム由来のｃＤＮＡ断片が
挿入されたプラスミドを持つ大腸菌を２× ＹＴ培地で
３７℃にて一晩振盪培養し、常法によりプラスミドを精
製した。このプラスミドから常法によりＨＬＶゲノム由
来のｃＤＮＡ断片を調製し、これを鋳型として用い、ジ
デオキシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
74, 5463(1977))によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ
社製）およびシークエンスキット（ＵＳＢ社製、商品
名：SEQUENASE)で塩基配列を解読して１３７５塩基の配
列を決定した。その結果、該塩基配列のうち、外被タン
パク質遺伝子（３０６アミノ酸；分子量約３４．４ｋ
Ｄ）をコードすると予想される翻訳領域（配列表の配列
番号１に記載した５８〜９７５番目の塩基配列）と、分
子量約１２．０ｋＤのタンパク質（１０４アミノ酸）を
コードする翻訳領域（配列表の配列番号１に記載した９
８１〜１２９２番目の塩基配列）が確認された。なお、
各塩基配列から翻訳されるものと予想されるアミノ酸配
列を配列表の配列番号６および７に示した。また、配列
番号６に示すアミノ酸配列は、前記したように、図１に
示すＨＬＶ外被タンパク質の部分アミノ酸配列の存在が
確認され、該部分アミノ酸配列との比較でその存在が証
明された。
【００２８】実施例５ ＨＬＶ外被タンパク質の部分アミノ酸配列の決定 実施例１で調製したＨＬＶ精製標品（１μｇ／μｌ）１
２０μｌを、タンパク質分解酵素（Lysyl Endopeptidas
e,和光純薬社製) により常温（２５℃）で１６時間の条
件で限定分解し、得られた断片ペプチドを逆相ＨＰＬＣ
（PepRPC HR5/5カラム:Pharmacia社製）により分離精製
後、プロテインシークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いて
断片ペプチドのＮ末端アミノ酸配列を分析したところ、
３つの断片ペプチドのＮ末端アミノ酸配列が、ＨＬＶ外
被タンパク質のアミノ酸配列中の配列と完全に一致し
た。これら３つの断片ペプチドのＮ末端アミノ酸配列と
ＨＬＶ外被タンパク質のアミノ酸配列中の位置は図１に
示した。
【００２９】実施例６ ＨＬＶ感染ホップの逆転写ＰＣＲによるウイルス遺伝子
診断 ＨＬＶ感染ホップ葉（品種：信州早生）及びウイルスフ
リーホップ葉（品種：信州早生）０．１ｇを１ｍｌ
０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で磨砕し、ク
ロロホルム抽出後の上清にフェノール処理と３回のエー
テル処理を行った後、エタノールで核酸を沈澱させた。
次に、沈澱を７０％ エタノールで遠心洗浄し、余分な
エタノールを乾燥除去後、ＴＥ緩衝液 １００μｌに溶
解し、そのうち２μｌを逆転写ＰＣＲに供試した。
【００３０】ＰＣＲ用のプライマーは、本塩基配列を基
にしてＡＢＩ社製のＤＮＡシンセサイザー（Model 380
B）を用いて常法により設計、合成した４種類のもの
で、配列表の配列番号２〜５に記載した塩基配列（それ
ぞれ３Ｐ，４Ｐ，３Ｍ，４Ｍと略記する。）を有する。
各プライマーは、３Ｐ／３Ｍ，４Ｐ／３Ｍ，３Ｐ／４
Ｍ，４Ｐ／４Ｍの４種類の組合せで逆転写ＰＣＲに使用
した。逆転写反応は、相補鎖プライマー２５ピコモル
（ｐＭ）、５ユニットの逆転写酵素(AMV-RTase XL 、宝
酒造（株）社製）及び前記で調製した２μｇのホップ核
酸を加えた。７５ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ ＭｇＣｌ2,１
０ｍＭ ＤＴＴ，０．５ｍＭ ｄＮＴＰを含有する５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）中で５５
℃、３０分間行った。その後、逆転写産物に０．５ユニ
ットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー社製）
と２５ｐＭの増幅用プライマーを加え、ＰＣＲを行っ
た。反応液量は１０μｌとし、反応液の蒸発を防ぐため
に、約２０μｌのミネラルオイルを添加した。ＰＣＲに
おける各工程は下記の条件で行った。はじめに９４℃で
３分間保持した後、変性工程は９４℃で１分間、プライ
マーのアニーリング工程は５５℃で１分間、ＤＮＡの伸
長工程は７２℃で２分間行うサイクルを３０回行い、７
２℃で５分間保持後、４℃で保存した。
【００３１】上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られ
た増幅ゲノムＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動法によ
り分析した。２％のアガロースゲルを用いて、２ｍＭ
ＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）中で、１００Ｖ，３０分間電気泳動して分離した。
その際に、サイズマーカーとしてはλＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩで分解したＤＮＡ分子量マ
ーカー（ニッポンジーン社製）を用いた。電気泳動終了
後にゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶
液に１０分間浸漬してから暗所で２５４ｎｍの紫外線を
ゲルに照射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロ
ミドの結合体の赤色バンドを検出した。電気泳動分析
（２反復実施）によって得られた結果を図２に示した。
図中のＤＷは滅菌水を意味する。アガロースゲル電気泳
動の結果、感染ホップでは用いたプライマーに応じて特
異的なＤＮＡ増幅断片が得られるが、未感染ホップでは
このようなＤＮＡ増幅断片が得られず、両者を区別する
ことができた。なお、プライマーに応じた特異的なＤＮ
Ａ増幅断片は、３Ｐ／３Ｍ：２３３塩基対、４Ｐ／３
Ｍ：１８１塩基対、３Ｐ／４Ｍ：３７７塩基対、４Ｐ／
４Ｍ：３２５塩基対であった。
【００３２】実施例７ ドットブロットハイブリダイゼーションによる遺伝子診
断 ＨＬＶ感染ホップ葉（品種：信州早生）及びウイルスフ
リーホップ葉（品種：信州早生）０．１ｇを１ｍｌ
０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で磨砕し、ク
ロロホルムで抽出後の上清にフェノール処理と３回のエ
ーテル処理を行った後、エタノールで核酸を沈澱させ
た。次に、この沈澱を７０％ エタノールで遠心洗浄
し、余分なエタノールを乾燥除去後、ＴＥ緩衝液 １０
０μｌに溶解した。そのうち２μｌを３倍容の核酸変性
溶液（６５％ ホルムアミド，２０％ホルムアルデヒ
ド，１．５４Ｍ ＭＯＰＳ，６．５ｍＭ 酢酸ナトリウ
ム，１．３ｍＭ ＥＤＴＡ）に加え、６５℃で１５分間
保温したのち急冷した。次いで、８μｌの２０× ＳＳ
Ｃ（０．１５Ｍ 塩化ナトリウム，０．０１５Ｍ クエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を加えて混合した後、そ
のうち１０μｌをメンブランフィルター（アマシャム社
製、商品名：Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+ ）にスポットし、ドッ
トブロットハイブリダイゼーションに供試した。
【００３３】プローブは、実施例４で調製した大腸菌由
来のプラスミド（約１．３５ＫｂのＨＬＶゲノム由来の
ｃＤＮＡ断片を含有するもの）を、制限酵素ＢａｍＨＩ
とＥｃｏＲＩにより消化した後、フラグメントをアガロ
ースゲル電気泳動により分離し、カラム（宝酒造（株）
社製、商品名：Ｓｕｐｒｅｃ−０１カラム）でＨＬＶゲ
ノム由来のｃＤＮＡを溶出、精製した。次いで、精製し
たｃＤＮＡはランダムラベリングキット（宝酒造（株）
社製）により〔α32Ｐ〕ｄＣＴＰでラベル後、Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０カラムで精製して使用した。ハイブ
リダイゼーションは、５× ＳＳＣ，１００μｇ／ｍｌ
酵母ｔＲＮＡ（ベーリンガー社製），０．５％ ＳＤ
Ｓ，０．１％ フィコール，０．１％ＰＶＰ，０．１％
ＢＳＡ溶液中で４６℃，１６時間の条件で行った。オ
ートラジオグラムの結果、ＨＬＶ感染ホップ由来のスポ
ットでシグナルが観察されたが、ウイルスフリーホップ
由来のスポットはシグナルが観察されなかった。このこ
とからシグナルの有無によって、ＨＬＶ感染ホップとウ
イルスフリーホップを区別できることが確認された。
【００３４】
【発明の効果】本発明によりＨＬＶ外被タンパク質遺伝
子の構造が明らかにされ、ＨＬＶ遺伝子診断法が開発さ
れたことにより、従来行われていたＨＬＶの単離，抗血
清の作製，抗体の精製などの煩雑な作業が不要になると
共に、ＥＬＩＳＡ法よりも簡便、かつ高感度にＨＬＶ感
染ホップのウイルス診断が可能となる。さらに、この遺
伝子を利用することにより、本ウイルス抵抗性ホップの
作出に貢献できる。
【００３５】
【配列表】
【００３６】配列番号：１ 配列の長さ：１３７５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ホップ潜在ウイルスの外被タンパク質遺伝
子を含有するＤＮＡ 配列 TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAATG 60 GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120 GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180 TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240 AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300 CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360 CCGTACAATA AACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420 AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480 CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540 AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600 GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCGT CTGCAGGTTG 660 TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720 GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780 AATGCTGCGG CTGTGCAACC ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840 ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900 GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960 TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020 TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080 ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAGAAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140 GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGATA 1200 ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260 GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320 TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCACC 1375
【００３７】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＡＧＧＴＣＧＴＧＴＣＡＡＡＣＡＡＣ
【００３８】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧ
【００３９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＴ
【００４０】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＴＣＡＡＣＧＴＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴ
【００４１】配列番号：６ 配列の長さ：３０６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Asp Lys Gln Gly Gln Met Thr Glu Gln Gln Lys Val Asp Ser Gln Lys 1 10 Leu Gln Gly Glu Ala Lys Asn Lys Glu Lys Ala Glu Ser Ser Lys Arg Lys Asp 20 30 Glu Leu Leu Lys Lys Tyr Ile Asp Pro Gly Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu 40 50 Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lys Leu Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg 60 70 Ala Ala Ile Arg Val Thr Asn Ala Gly Leu Glu Thr Gly Arg Pro Ala Leu Lys 80 90 Pro Thr Pro Asp Met Leu Pro Asp Pro Thr Asn Pro Tyr Asn Lys Pro Ser Leu 100 Asp Ala Leu Leu Met Ile Lys Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Thr Ser 110 120 Glu Asp Met Met Lys Ile Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu 130 140 His Val Gln Ser Val Ile Leu Gln Ala Val Phe Tyr Cys Lys Asp Ser Ser Ser 150 160 Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Trp Arg Gly Gly Ala Ile Ser 170 180 Ala Asp Ser Val Leu Ala Ile Ile Lys Lys Asp Ala Glu Thr Leu Arg Arg Val 190 Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Thr Trp Asn Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro 200 210 Pro Ser Asp Trp Ser Glu Met Gly Phe Gln Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe 220 230 Asp Cys Leu Asp Tyr Val Glu Asn Ala Ala Ala Val Gln Pro Leu Glu Gly Leu 240 250 Ile Arg Val Pro Thr Ala Arg Glu Lys Ile Ala Asn Lys Thr His Lys Asp Leu 260 270 Ala Leu Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gln Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu Ile 280 Thr Gly Gly Lys Asn Gly Pro Glu Leu Gln Arg Asp Tyr Ser Lys Ser Asn Asn 290 300 306
【００４２】配列番号：７ 配列の長さ：１０４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lys Phe Leu Glu Gln Cys 1 10 Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met Ile Ser Leu Gln Val His Arg Pro 20 30 Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg Arg Ala Lys Leu Val Gly 40 50 Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Trp Pro Pro Thr Ala Phe Thr Thr Arg Cys 60 70 Asp Asn Lys Thr Cys Phe Pro Gly Leu Thr Tyr Asn Ala Ser Ile Ala Arg Phe 80 90 Ile Arg Asp Gly Val Thr Glu Val Ile Pro Ser Ala Pro Asn 100 104
【図面の簡単な説明】
【図１】 プロテインシークエンサーにより解析された
ホップ潜在ウイルスの外被タンパク質のアミノ酸配列を
示した図である。
【図２】 ホップ潜在ウイルスのＰＣＲ法を用いた遺伝
子診断の結果を示した電気泳動写真である。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ホップ潜在ウイルスゲノム由来の遺伝子
    で、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するホッ
    プ潜在ウイルスの外被タンパク質をコードするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列の
    うち、５８〜９７５番目の塩基配列から翻訳される３０
    ６残基のアミノ酸をコードするＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列の
    うち、９８１〜１２９２番目の塩基配列から翻訳される
    １０４残基のアミノ酸をコードするＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列を
    有する合成ＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 配列表の配列番号３に記載の塩基配列を
    有する合成ＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 配列表の配列番号４に記載の塩基配列を
    有する合成ＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 配列表の配列番号５に記載の塩基配列を
    有する合成ＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 ホップより抽出した核酸を鋳型とし、請
    求項４〜７のいずれかに記載の合成ＤＮＡをプライマー
    に用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりＤＮＡの増
    幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動分析することを
    特徴とするホップ潜在ウイルスの検出方法。
  9. 【請求項９】 請求項４記載の合成ＤＮＡと請求項６記
    載の合成ＤＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に
    よりＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳動
    分析し、２３３塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無によ
    り、ホップ潜在ウイルスを検出する診断方法。
  10. 【請求項１０】 請求項５記載の合成ＤＮＡと請求項６
    記載の合成ＤＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
    によりＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳
    動分析し、１８１塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無によ
    り、ホップ潜在ウイルスを検出する診断方法。
  11. 【請求項１１】 請求項４記載の合成ＤＮＡと請求項７
    記載の合成ＤＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
    によりＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳
    動分析し、３７７塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無によ
    り、ホップ潜在ウイルスを検出する診断方法。
  12. 【請求項１２】 請求項５記載の合成ＤＮＡと請求項７
    記載の合成ＤＮＡを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
    によりＤＮＡの増幅を行い、得られた増幅産物を電気泳
    動分析し、３２５塩基対の特異的ＤＮＡ断片の有無によ
    り、ホップ潜在ウイルスを検出する診断方法。
  13. 【請求項１３】 ホップより抽出した核酸と、請求項６
    および７のいずれかに記載の合成ＤＮＡあるいは該ＤＮ
    Ａをプライマーに用いて伸長合成した相補鎖ＤＮＡをプ
    ローブとしてハイブリダイズさせることを特徴とするホ
    ップ潜在ウイルスの検出方法。
  14. 【請求項１４】 ホップより抽出した核酸と、請求項１
    記載のＤＮＡの制限酵素切断フラグメントをプローブと
    してハイブリダイズさせることを特徴とするホップ潜在
    ウイルスの検出方法。
  15. 【請求項１５】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列
    のうち、５８〜９７５番目の塩基配列から翻訳され、配
    列表の配列番号６に記載の３０６残基のアミノ酸配列を
    有するホップ潜在ウイルスの外被タンパク質。
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