JPH09182596A - ヒトインヒビンβ▲Ｂ▼鎖の合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトインヒビンβ_B鎖の合成方法を提供す
る。 【解決手段】 ブタ及び／又はヒトインヒビンのα鎖及
び／又はβ鎖をコードしている核酸を含有するベクター
を用いて形質転換された真核性宿主細胞を培養すること
によりα鎖及び／又はβ鎖を合成することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明は、組換え細胞培養法による、ヒ
トインヒビンβ_B鎖を含有するタンパク質の製造方法に
関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトインヒビンを
コードしているＤＮＡを得る方法、並びに、それを用い
る方法、さらにはヒトの天然のインヒビンあるいは自然
界に存在するそれらのアレルのアミノ酸配列を出発物質
としてインヒビン変異体を製造する方法に関するもので
ある。

【０００２】インヒビンは性腺(生殖腺)で産生され、下
垂体レベルにおいて、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)の分泌
を特異的に阻害するよう作用するタンパク質である。イ
ンヒビンの存在については、最初、マックラーフ(ＭcＣ
ullagh)により仮説が出された[１９３２、「サイエンス
(Ｓcience)」７６: １９−２０]。その様なゴナドトロピ
ン(性腺刺激ホルモン)分泌に対する優先的な制御作用に
大きな関心が寄せられ、過去５０年間に、多数の研究者
達が、精巣抽出液、精子、精巣網液、精液血漿および卵
胞液からこの物質を単離し、様々なバイオアッセイを用
いて特性化することを試みた。多くの文献において、
５,０００〜１００,０００ダルトンの分子量を有するイ
ンヒビン様物質を精製したと報告されているが、継続研
究において、これらの物質はホモジーニアス(均質)でな
かったり、真のインヒビンに予測される高度の特異活性
を持たず、そして／または本明細書に記載したインヒビ
ンの分子特性を示さない物質であることが分かった[ド
ウ・ジョン(de Ｊong)、インヒビン・ファクター・ア
ーティファクト(Ｉnhibin−Ｆactor Ａrtifact)「モレ
キュラー・アンド・セルラー・エンドクリン(Ｍolecula
r ＆ Ｃellular Ｅndocrin)」１３: １−１０(１９７
９); シエスら(Ｓheth)１９８４「Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．」１
６５(１): １１−１５; セイダーら(Ｓeidah)、１９８
４「Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．」１７５(２): ３４９−３５５; リ
ルジャら(Ｌilja)、１９８５年３月、「Ｆ．Ｅ．Ｂ．
Ｓ．」１９８２(１): １８１−１８４; リら(Ｌi)１９８
５年６月「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミィ・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎat．Ａ
cd．Ｓci．)ＵＳＡ」８２: ４０４１−４０４４: セイダ
ーら(Ｓeidah)「Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．」１６７(１): ９８−
１０２; およびベクサックら(Ｂeksac)１９８４、「イン
ター・ジェイ・アンドロロジィ(Ｉntern．Ｊ．Ａndrolo
gy)」７: ３８９−３９７]。

【０００３】インヒビン活性を有するポリペプチドが、
ウシまたはヒツジの卵胞液から精製された(ＰＣＴ８６
／０００７８、１９８６年１月３日公開)。このタンパ
ク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく分子量５６,０００±
１,０００を有しており、見掛け上の分子量４４,０００
±３,０００および１４,０００±２,０００を有する２
つのサブユニットに解離し得ることが報告されている。
各サブユニットのアミノ末端配列が記載されている。

【０００４】いずれも約３２,０００ダルトンの分子量
の、インヒビン活性を有する２種のタンパク質をブタの
卵胞液から単離することに成功した。ヘパリン−セファ
ロース・アフィニティ・クロマトグラフィー、ゲル濾過
および逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ)等のタンパク質分離法を組み合わせて、実質上均質
(総タンパク質重量の９０％)に、ブタインヒビンを精製
した。

【０００５】これらのタンパク質はブタから得た物質か
ら実質上、均質な状態で単離され、プロテインＡ(Ｐrot
ein Ａ)およびプロテインＢ(Ｐrotein Ｂ)と命名され
た。各タンパク質は分子量３２,０００ダルトン(３２
Ｋ)であり、これらは分子量が１８,０００ダルトンおよ
び１４,０００ダルトンであって、タンパク質内でジス
ルフィド結合を介して結合し、ホルモン活性を示す２本
のポリペプチド鎖からなっている。両タンパク質の１
８,０００ダルトン(１８Ｋ)鎖またはアルファ(α)鎖の
アミノ末端アミノ酸残基配列は、式:

【化４】Ｓer−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｌeu−Ｐro−Ｔrp−
Ｐro−Ｔrp−Ｓer−Ｐro−Ａla−Ａla−Ｌeu−Ａrg−Ｌ
eu−Ｌeu−Ｇln−Ａrg−Ｐro−Ｐro−Ｇlu−Ｇlu−Ｐro
−Ａla−Ｖal で示される。また、プロテインＡの１４,０００ダルト
ン(１４Ｋ)鎖またはベーター(β)鎖のアミノ末端アミノ
酸残基配列は、式:

【化５】Ｇly−Ｌeu−Ｇlu−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ｌys−Ｖ
al−Ａsn−Ｉle−Ｘ−Ｘ−Ｌys−Ｌys−Ｇln−Ｐhe−Ｐ
he−Ｖal−Ｓer−Ｐhe−Ｌys−Ａsp−Ｉle−Ｇly−Ｔrp
−Ａsn−Ａsp−Ｔrp−Ｉle−Ｉle−Ａla で示され、プロテインＢのそれは、式:

【化６】Ｇly−Ｌeu−Ｇlu−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｔ
hr−Ａsn−Ｌeu−Ｘ−Ｘ−Ａrg-Gln−Ｇln−Ｐhe−Ｐhe
−Ｉle−Ａsp−Ｐhe−Ａrg−Ｌeu で示される。プロテインＡおよびプロテインＢは完全に
特性化されている。各３２Ｋタンパク質はいずれもイン
ヒビン活性を示し、ＦＳＨの基礎的な分泌を特異的に阻
害するが、黄体形成ホルモン(ＬＨ)の分泌を阻害するこ
とはない。各ポリペプチド鎖はホルモン活性を示さなか
った。これに関する元の(親)出願を行った後、インヒビ
ンβ鎖二量体(ダイマー)が、卵胞液中に天然の存在物
(アクティビンと称される)として存在しており、それ
が、ラット脳下垂体前葉細胞によるＦＳＨ分泌を刺激す
る作用を有することが示された[バレら(Ｖale)、１９８
６ネイチャー「Ｎature」３２１: ７７６−７７９および
リングら(Ｌing)１９８６「ネイチャー」３２１: ７７９
−７８２]。

【０００６】ヒト由来のインヒビンのα鎖およびβ鎖の
アミノ酸配列は、本発明より以前には知られていなかっ
た。動物のインヒビンに関して行なわれた研究に匹敵す
る研究を行うために必要な大量のヒト卵胞液の入手が容
易でないばかりか、ヒトのインヒビンと動物のインヒビ
ンとが、同様の精製方法が有効な程度に、充分類似して
いるという保証もない。従って、ヒトインヒビンのアミ
ノ酸配列の特徴を決定する方法が必要とされている。

【０００７】また、インヒビンのα鎖またはβ鎖を、好
ましくは、懸案の(questioned)インヒビンにとってホモ
ローガス(homologous)な種のタンパク質を殆んど、ある
いは全く含有しない状態で、好ましくは生物学的に活性
なインヒビンのα鎖またはβ鎖を製造するための経済的
な方法が必要とされている。これらの、並びに他の目的
は本発明の全貌から明らかとなるであろう。

【０００８】要約 ブタおよびヒトの成熟インヒビンのα鎖およびβ鎖、お
よびそれらのプレプロ形並びにプロ形の前駆体をコード
している核酸を単離し、複製可能なベクターにクローン
した。インヒビンをコードしているcＤＮＡの配列決定
により、成熟インヒビン鎖のＮ末端に位置し、一緒にな
って生物活性なポリペプチドを発現するプロドメイン(p
rodomain)領域が同定された。このプロドメイン領域、
あるいはプロドメイン・イムノゲン(免疫原)は、形質転
換細胞におけるプレプロインヒビンのプロセッシングの
監視(モニター)、または動物における臨床条件の変化あ
るいは生殖生理学上の変調に関する実験に有用である。
本発明においてはα鎖の核酸またはβ鎖の核酸を用いて
宿主を形質転換し、成熟インヒビンα鎖および／または
β鎖を組換え発現させ、診断学的検定に用いるために、
前駆体インヒビン鎖のプロドメイン配列を調製した。さ
らに詳しくは、該領域をコードしている核酸をプロモー
ターのコントロール下において、複製可能なベクターに
ライゲートし、このベクターで宿主細胞を形質転換し、
宿主細胞を培養し、培養された細胞からプロドメイン、
アクティビンまたはインヒビンを回収することからなる
方法により、インヒビンα鎖および／またはβ鎖を組換
え細胞培養内で発現させた。本発明方法によれば、イン
ヒビン、アクティビンおよびプロドメインを、ホモロー
ガスな供給源のタンパク質を全く含まず、生物学的に活
性な形で製造することができる。

【０００９】本発明において同定された核酸はブタまた
はヒトのインヒビンのα, β_Aおよびβ_B鎖をコードして
いる。組換え細胞は、αβ_Aまたはαβ_Bインヒビンを発
現するか、あるいは、β−鎖ヘテロ二量体またはホモ二
量体(これらは文献中にアクティビンとして総括されて
いる)を発現するよう形質転換された。組換え細胞の発
現産物であるβ鎖二量体は、天然状態で普通に伴ってい
るホモローガスなタンパク質を含んでいない。

【００１０】インヒビンまたはアクティビン並びにそれ
らの無毒な塩と薬学上許容し得る担体とを混合して製剤
化し、稔性(妊性)をコントロールするためにヒトを含む
哺乳類に投与することができる。インヒビン投与によっ
て雌性哺乳類では稔性の減少、雄性哺乳類では精子形成
の減少を来し、充分量を投与することにより不稔を引き
起こす。インヒビンは不妊の診断にも有用である。文献
によるとアクティビンは脳下垂体細胞からのＦＳＨ分泌
を刺激することができることが示されており、従って、
稔性誘導治療に有用である。

【００１１】また、本発明方法により、インヒビン、ア
クティビンおよびプロドメインの、天然の類似体から
の、一次アミノ酸配列および／またはグリコシル化にお
ける変化を伴った変異体の簡便な製造方法、とりわけ、
インヒビン、アクティビンまたはプロドメイン領域と免
疫原ペプチドとの融合物を簡便かつ容易に製造すること
ができる。

【００１２】図面に関する説明 図１はブタα鎖のmＲＮＡの模式図である。配列決定に
用いたオーバーラップしたcＤＮＡクローンをmＲＮＡ構
造を示す図の上方に記した。λクローンの３'末端の黒
い四角はこれらのクローンが特異的なプライミング(pri
ming)により得られたことを表している。非翻訳配列を
直線で示し、暗号配列を四角で囲んで示した。空白部分
はシグナル配列およびプロ配列の暗号領域を指し、交差
した斜線で示した領域は１３４アミノ酸α−鎖を指す。
スケールはヌクレオチドを最長のcＤＮＡクローンの５'
末端から表したものである。

【００１３】図２および図３はブタインヒビンα鎖前駆
体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を示
す。ヌクレオチド番号は左側に、アミノ酸番号は全般を
通して記載されている。下線を付したアミノ酸配列は長
い合成ＤＮＡプローブを設計するのに用いられた配列で
ある。この３６４アミノ酸前駆体には、疎水性のシグナ
ル配列、プロ領域、並びに成熟の鎖(アミノ酸２３１−
３６４)が含まれている。成熟α鎖のＮＨ₂末端の直ぐ上
流にタンパク分解的なプロセッシング部位であるＡrg−
Ａrg(黒色バーで表示)がある。その他、プロ領域内に存
在する、幾つかの推定の二塩基性プロセッシング部位は
白色バー(空白の棒)で示されている。単一の、潜在的な
Ｎ−結合グリコシル化部位は、交差斜線を引いたバーで
示されている。mＲＮＡの３'末端と近接したＡＡＴＡＡ
Ａボックスに下線を施して示した。

【００１４】図４はブタのβ_AサブユニットmＲＮＡおよ
びβ_BサブユニットmＲＮＡを表し、その暗号配列を四角
で囲んで示した模式図である。β_Aサブユニットおよび
β_Bサブユニット(ダッシュで表示)は、暗号配列の３'末
端に向かってコードされている。３'および５'非翻訳領
域は線で示されている。β_BサブユニットmＲＮＡの５'
および３'非翻訳領域の長さはmＲＮＡのサイズ(図９)、
並びに、それとβ_A mＲＮＡとの明白な類似性に基づい
て帰納的に決められた。図中、破線はcＤＮＡの仮定の
領域を示している。オーバーラップするオリゴdＴにプ
ライムされたcＤＮＡクローンおよびランダムにプライ
ムされたクローン(λＰＩＮβ_A５s、λＰＩＮβ_B１s、
およびλＰＩＮβ_B２s)の相対的な位置を示した。スケ
ールは４.５kbmＲＮＡの５'末端から、ヌクレオチド番
号で示されている。

【００１５】図５、図６、図７および図８は、ブタ・イ
ンヒビンのβサブユニット前駆体のヌクレオチド配列お
よび推定のアミノ酸配列を示す。β_B配列はβ_A配列と、
最大限ホモロジィに並んでいる。βサブユニット前駆体
のＮＨ₂末端は角型括弧と矢印で示されている。システ
イン残基には陰影を施し、可能なプロセッシング部位を
白色バーで示すと共に、可能なグリコシル化部位を交差
した斜線を付した箱で囲んだ。両配列の、終止コドンの
３'側に存在する極めてＧＣに富む領域、イントロン配
列に、上線(オーバーライン)または下線を付した。オリ
ゴヌクレオチドの設計に用いたアミノ酸配列に、ＡＡＴ
ＡＡＡポリアデニル化シグナルのごとく下線を付した。
λＰＩＮ−β_A８とこの領域をカバーする他のクローン
類との間には１個のヌクレオチドの相違があった。Ｇ→
Ａ変化によりアミノ酸２７８のグリシンからセリンへの
変化が起きた。成熟β_AサブユニットのＮＨ₂末端の直ぐ
上流には、プロ配列を伴って、Ａrg Ａrg Ａrg Ａrg
Ａrg (黒色バー)タンパク分解的プロセッシング部位
が存在する。β_Aサブユニットのアミノ酸配列にのみ番
号が付されている。

【００１６】図９はα,β_Aおよびβ_Bサブユニット・ハ
イブリダイゼーションプローブを用いて行ったブタの卵
胞mＲＮＡについてのノーザン・ブロット・分析の結果
を示す図である。a、b、c、dおよびfレーンはポリＡ⁺m
ＲＮＡを、eおよびgレーンは全ＲＮＡを示している。２
８Ｓおよび１８Ｓリボソーム性ＲＮＡの位置を表示し
た。a、dおよびeレーンはαサブユニットcＤＮＡプロー
ブとハイブリダイズさせ; d、eおよびgレーンはβ_Aサブ
ユニット特異的プローブとハイブリダイズさせ;cレーン
はβ_Bサブユニット特定的プローブとハイブリダイズさ
せた結果を示す。αサブユニットmＲＮＡは約１.５kbで
あり、β_AサブユニットmＲＮＡは約４.５kbである。a、
bおよびcレーンに示したハイブリダイゼーションは、m
ＲＮＡの相対レベルを判定するために略等しい長さと特
異活性を有するプローブを用いて行われた。

【００１７】図１０はヒトβ−ＴＧＦアミノ酸配列と、
ブタインヒビンのβ_Aおよびβ_Bアミノ酸配列とを比較し
て示した図である。システイン残基周辺の配列が示され
ている。同一残基は箱で囲まれているが保存的な変化は
星印により示されている。図中、Ｉnhはインヒビンを表
す。

【００１８】図１１はαサブユニット配列とβ_Aインヒ
ビン配列との比較図である。図中、Ｉnhはインヒビンを
表す。

【００１９】図１２、図１３および図１４は代表的な、
ブタインヒビンの組換え発現プラスミドの組立て模式図
である。図中、Ｉnhはインヒビンを表す。

【００２０】図１５および図１６はヒトαインヒビンc
ＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を
示す図である。アミノ酸数３３５のプロまたはインヒビ
ン配列に、仮定のシグナル開裂部位から番号を付した。
アミノ酸数１６のシグナル配列は−１から−１６までの
番号が付されている。ブタの配列と相同(ホモロジィ)の
場合は、シグナル配列中の１２アミノ酸残基がさらに予
測される。この図および他の図において、推定の二塩基
性プロセッシング部位を白色バー、グリコシル化部位を
斜線を付したバーで、そしてアミノ末端成熟鎖プロセッ
シング部位を黒色バーで示した。ポリ(Ａ)付加シグナル
配列には下線を施した。システイン残基には陰影を施し
た。

【００２１】図１７および図１８はヒトとブタのαイン
ヒビンタンパク質配列の比較図である。ホモロジィを最
大にするために間隙を配し、同定していない位置には星
印を付した。番号はブタ配列に関して付されており、こ
れは、ヒトの配列よりもアミノ酸１個分短い。

【００２２】図１９、図２０および図２１はアミノ酸数
２８のヒトβ_Aインヒビンシグナル配列(残基−２８〜−
１)と、長さ３７８アミノ酸の前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す図である。前駆体中
の基本的なプロセッシング部位は黒色バーを、潜在的な
グリコシル化部位は斜線を付したバーを、それぞれ配列
の上方に配して示した。システイン残基には陰影を付し
た。

【００２３】図２２、図２３および図２４はヒトβ_Bイ
ンヒビンcＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミ
ノ酸配列を示す図である。この配列はシステイン残基
(７位)から始まり、β_A配列(図１９、図２０および図２
１)中の残基７に存在するシステインから並んでいる。
成熟インヒビンのプロセッシング部位は黒色バーで、潜
在的なグリコシル化部位は交差斜線を付したバーで示さ
れている。システイン残基には陰影を施した。

【００２４】詳しい記述 本発明のポリペプチドはインヒビンのα鎖およびβ鎖、
並びにそれらの多量体形(アクティビンおよびインヒビ
ン)、それらのプレプロ形、それらのプロドメイン、そ
れら各鎖および各形のグリコシル化および／またはアミ
ノ酸配列における変異体を含む。ヒトまたは動物供給源
由来のインヒビン(アレルを含む)は、脳下垂体前葉細胞
からのＦＳＨの基礎分泌を阻害するがＬＨの基礎分泌を
阻害せず、アクティビンはその逆の作用を表す[以後、
“ホルモン活性(hormonally active)"アクティビン、ま
たは“ホルモン活性"インヒビンと呼称]。

【００２５】一般に、アミノ酸配列変異体は図２、図
３、図５、図６、図７、図８、図１５、図１６、図１
９、図２０、図２１、図２２、図２３および図２４に示
したブタまたはヒトのαあるいはβ鎖配列と、適切な割
合で、実質上ホモローガスである。実質上ホモローガス
とは、２種のタンパク質を、そのアミノ酸残基の番号が
最大限一致する様に並べたとき、候補ポリペプチドの一
次アミノ酸配列の約７０％以上がブタまたはヒトの鎖と
対応していることを意味する。残基の一致を最大にする
ためには、アミノ酸および／またはカルボキシ末端のシ
フトや、必要なギャップの導入および／または候補ポリ
ペプチド中に挿入体として存在する残基の欠失が行われ
る。例として、β_Aおよびβ_Bサブユニット、あるいはヒ
トおよびブタのα−インヒビン配列が最大限ホモロジィ
に並んでいる図５、図６、図７、図８、図１７および図
１８を参照されたい。一般に、アミノ酸配列上の変異体
は図２、図３、図５、図６、図７、図８、図１５、図１
６、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３および図
２４に示した対応する天然の配列と約９０％ホモローガ
スである。

【００２６】ホルモン的に活性でないが(１)天然の対応
物(カウンターパーツ)に対して惹起された抗体と免疫学
的に交差反応し得るが、あるいは(２)その様な対応ポリ
ペプチドと、細胞表面の受容体への結合において拮抗し
得る変異体であって、成熟インヒビン鎖またはプロドメ
イン配列と実質上ホモローガスであるか、あるいはホモ
ローガスでないポリペプチドを包含する変異体も本発明
の範囲に含まれる。ホルモン的に不活性な変異体は、フ
ラグメントなかんずく単離されたインヒビンのαまたは
β鎖の組換え合成法あるいは有機合成法によって製造さ
れるか、またはアミノ酸配列に変化を導入することによ
り、分子が前記定義のホルモン活性をもはや示さなくな
り、生産される。

【００２７】免疫学的な交差反応性または受容体との交
差反応性という語句は、候補ポリペプチドがホルモン活
性類似体とホルモン活性類似体に対して惹起されたポリ
クローナル抗血清との結合を競合的に阻害し得ることを
意味する。その様な抗血清は、ヒツジまたはウサギの
Ｓ．Ｃとホルモン活性類似体を注射するか、あるいは、
完全フロインドのアジュバント中に入れた誘導体を与
え、不完全フロインド中のＳ．Ｃを腹腔内にブースター
注入することにより常法通り調製される。

【００２８】ホルモン活性を有さないが、ホルモン活性
なインヒビン、アクティビンまたはプロドメインに対す
る抗血清と反応し得る変異体は、(a)天然の類似体また
はその抗体の診断アッセイにおける試薬(b)既知の方法
で不溶化した場合には、抗血清から抗一天然同族体抗体
を精製するための物質として、(c)ホルモン活性同族体
に対する抗体を惹起するための免疫原として、有用であ
る。

【００２９】本発明は、インヒビンαまたはβ鎖前駆体
のプロ配列および／またはプレプロ配列、あるいはそれ
らの免疫学的または生物学的に活性なフラグメントであ
って、実質上、対応する成熟インヒビン鎖を含んでいな
いものを含む。ブタまたはヒトのインヒビンに関するこ
れらの配列は、図２、図３、図５、図６、図７、図８、
図１５、図１６、図１９、図２０、図２１、図２２、図
２３および図２４に示されている。ブタαサブユニット
前駆体のプレプロ配列は残基１から約２３０までのポリ
ペプチドであり、β_Aサブユニットのプロ配列は残基１
から約３０８によって構成されている。本明細書中で
は、これらの配列をプロドメイン配列に包含させること
とする。

【００３０】αおよびβサブユニットプロドメイン配列
は、タンパク分解的部位によって境を接しているいくつ
かのドメイン(領域)から成っており、本発明において
は、それらドメインを、個別に、あるいは他のドメイン
と結合した形で合成する。基本的なブタのβ_Aドメイン
は、残基１〜約７０(ドメインＩ)、約７０〜約１１０
(ドメインＩＩ)、約１１０〜約１８０(ドメインＩＩ
Ｉ)、約１８０〜約２６０(ドメインＩＶ)および約２７
０〜約３０９(ドメインＶ)にある。さらに詳しくは、ブ
タβ_Aドメインは、式:

【化７】ＧＨＳＡＡＰＤＣＰＳＣＡＬＡＴＬＰＫＤＶＰ
ＮＳＱＰＥＭＶＥＡＶ、ＨＩＬＮＭＬＨＬＫＫＲＰＤＶ
ＴＱＰＶＰＫＡＡＬＬＮＡＩ、ＬＨＶＧＫＶＧＥＮＧＹ
ＶＥＬＥＤＤＩＧ、ＡＥＭＮＥＬＭＥＱＴＳＥＩＩＴＦ
ＡＥＡＧＲＡＲＫＴＬＲＦＥＩＳＫＥＧＳＤＬＳＶＶＥ
ＲＡＥＩＷＬＦＫＶＰＫＡＮＲＴＲＴＫＶＳＩＲＬＦＱ
ＱＱ、ＰＱＧＳＡＤＡＧＥＥＡＥＤＶＧＦＰＥＥＫＳＥ
ＶＬＩＳＥＫＶＶＤＡ、ＳＴＷＨＩＦＰＶＳＳＳＩＱＲ
ＬＬＤＱＧＫＳＡＬＤＩＲＴＡＣＥＱＣＨＥＴＧＡＳＬ
ＶＬＬＧ、およびＧＨＳＡＡＰＤＣＰＳＣＡＬＡＴＬＰ
ＫＤＶＰＮＳＱＰＥＭＶＥＡＶＫＫＨＩＬＮＭＬＨＬＫ
ＫＲＰＤＶＴＱＰＶＰＫＡＡＬＬＮＡＩ のドメインを含む。また、ブタβ_Bドメインはホモロー
ガスなβドメインと同じ配列のドメインおよび、式:

【化８】ＲＡＡＨＩＬＬＨＡＶＲＶＳＧＷＬＮＬ で示されるドメインを含む。さらにブタαドメインは、
式:

【化９】ＧＰＥＬＤＲＥＬＶＬＡＫＶＲＡＬＦＬＤＡＬ
ＧＰＰＡＶＴＧＥＧＧＤＰＧＶおよびＧＳＥＰＥＥＥＤ
ＶＳＱＡＩＬＦＰＡＴＧＡＲＣＧＡＥＰＡＡＧＥＬＡＲ
ＥＡＥＥＧＬＦＴＹＶＧＲＰＳＱＨＴＨＳＲＱＶＴＳＡ
ＱＬＷＦＨＴＧＬＤＲＱＧＭＡＡＡＮＳＳＧＰＬＬＤＬ
ＬＡＬＳＳＲＧＰＶＡＶＰＭＳＬＧＱＡＰＰＲＷＡＶＬ
ＡＡＳＡＬＰＬＬＴＨＰＶＬＶＬＬＬＲＣＰＬＣＳＣＳ
ＡＲＰＥＡＴＰＦＬＶＡＨＴＲＡＲＰＰＳＧＧＥＲＡ で示されるドメインを含む。代表的な結合(コンビネー
ション)ドメインポリペプチドは、β_AドメインＩＩのＣ
末端とβ_AドメインＩＩＩのＮＨ₂末端とが結合してなる
ポリペプチドである。さらに、これらのドメインは、図
２、図３または図５、図６、図７および図８に示される
様にタンパク分解部位で融合しているか、加水分解に抵
抗性の１〜４残基ポリペプチド(例えばグルタミニル残
基またはヒスチジル残基)により融合しているか、ある
いは直接、融合しており、結合ドメインポリペプチドの
産生にはこれら３種の場合の全てがあてはまる。

【００３１】基本的なヒトα鎖プロドメインは、大概残
基３０−１９９および１−２９、ヒトβ_Aプロドメイン
は大概、残基１−３０、３２−４０、４３−５９、６２
−８０、８３−１８５および１８６−２３０、ヒトβ_B
プロドメインは大概、残基１−１３、１５−３０、３２
−５９、６２−１４５、１４８−１９５および１９８−
２４１それぞれ、図１５、図１６、図１９、図２０、図
２１、図２２、図２３および図２４の番号付けによる)
である。結合プロドメインポリペプチドも本発明の範囲
内に含まれ、それらは、例えば、残基約４３−８０のβ
_Aプロドメイン、残基約１−３０および約３２−１４５
のβ_Bプロドメインである。好ましいヒトα、β_Aおよび
β_B鎖プロドメインは、残基約１−２９、約４３−８０
および約１−３０である。

【００３２】無傷の、単離されたプレプロまたはプロド
メインβ_A、β_Bまたはα配列は、組換え細胞培養により
最もよく製造できる。個々の準構成(サブコンポーネン
ト)ドメインは、有機化学における常套手段、あるいは
組換え細胞培養により合成される。次いで、それらを既
知の方法を用い、放射性同位元素、あるいは、酵素また
は蛍光等の検出可能な基で標識し、プレプロまたはプロ
形のインヒビン(個々のドメインをも含む)あるいはその
前駆体をコードしているＤＮＡを有する形質転換体にお
けるプレプロまたはプロ形のインヒビン(ドメインを含
む)のレベルを検出するためのイムノアッセイに用い
る。このアッセイは、プロインヒビンのタンパク分解的
加水分解が宿主形質転換体内で起きているか、あるいは
その培地中で起きているかを決定するのに有用である。
このアッセイはまた、組換え合成における律速段階が、
mＲＮＡのプレプロ形への翻訳か、プレプロ形から成熟
インヒビンへのプロセッシングのいずれにあるかを調べ
るにも有用である。例えば、プレプロまたはプロインヒ
ビンが細胞リゼイト中に高レベルに存在しており、分泌
された成熟インヒビンのレベルが比較的低いということ
は、宿主細胞がインヒビンＤＮＡを適当に転写し、翻訳
しているが、充分な速度で前駆体をプロセッシングして
いないことを示唆している。従って、この場合には、専
ら、形質転換用プラスミドの転写効率や翻訳効率の向上
を目的とする宿主細胞以外の宿主細胞を選ぶ方が良く、
それは、例えば、他のプロモーターを選択することで行
われる。プロドメイン配列は、動物の生殖サイクルおよ
び稔性における生理学上の共同調節に関与していると思
われる。

【００３３】アミノ酸配列の変異体は、(１)ホルモン活
性であるか、(２)成熟インヒビンあるいはプロドメイン
αまたはβ鎖配列に対して惹起された抗体と交差反応し
得るか、あるいは(３)インヒビン／アクティビンの細胞
表面受容体と交差反応し得るものであって、天然のイン
ヒビンまたはプロドメイン配列の配列を出発物質とする
一次アミノ酸配列を有することを特徴とする配列であ
る。これらの誘導体は、通常、標的ＤＮＡをコードして
いるＤＮＡが変異体をコードする様に修飾するために、
ヌクレオチドの挿入、欠失または置換を行った後、組換
え細胞培養内でＤＮＡを発現させることにより調製され
る。約１００−１５０までの残基を有するポリペプチド
はまた、インビトロ合成法により、好都合に調製でき
る。その様な変異体は、天然に存在するアレル変異また
は種間変異とは異なる特徴である、予め定められた性質
上の変化を有することを特徴とする。変異体は天然に存
在する類似体と質的に同じ生物学的活性を示すか、ある
いはその様な類似体に対して拮抗的に作用することがで
きる。

【００３４】配列の変化を導入する部位は予め定めてお
くが、突然変異そのものを予め定めておく必要はない。
例えば、特定の位置の残基での突然変異を適切に行うた
めには、標的コドンまたは領域に無作為な変異誘発を行
い、発現されたインヒビン突然変異体を、所望の活性の
適切な組み合わせについてスクリーニングする。既知の
配列を有するＤＮＡの予定の部位で置換突然変異を誘発
する方法はよく知られている(例、Ｍ１３プライマー突
然変異誘発)。

【００３５】突然変異誘発は、通常、アミノ酸残基約１
〜１０程度の挿入、または約１〜３０残基の欠失により
行われる。欠失または挿入は隣接する１対、即ち、２残
基の欠失または２残基の挿入により行うことが好まし
い。置換、欠失、挿入、またはそれらの併用、等を組み
合わせて最終的な組立てを行う。挿入には、アミノ末端
またはカルボキシ末端の融合、例えばカルボキシ末端に
おける付加的疎水性の延長も含まれる。しかしながら、
置換突然変異のみを行うことが好ましい。暗号ＤＮＡ内
における突然変異は、暗号配列をリーディングフレーム
外に位置せしめるようなものであってはならず、また、
ハイブリダイズして、ループやヘアピンのごとき、mＲ
ＮＡの二次構造を形成させる可能性のある相補領域を作
らないことが好ましいことは明らかである。

【００３６】本発明のポリペプチドをコードしているＤ
ＮＡにおける突然変異の全てが最終分泌産物に発現され
るわけではない。例えば、置換型のＤＮＡ突然変異体の
主なものは、固有のブタまたはヒトのαまたはβ鎖分泌
リーダーが、そのリーダー配列内での欠失、または置換
のいずれかにより、異なる分泌リーダーまたはシグナル
で置き換えられ、固有のリーダー配列の大部分または全
部が所望の宿主によって一層認識され易いリーダーに変
化されたものである。例えば、原核性発現ベクターを組
立てるには、細菌のアルカリホスファターゼリーダーま
たは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーのためにブ
タまたはヒトのαまたはβ鎖分泌リーダーを欠失させ、
酵母発現ベクターの組立てには、酵母インバーターゼリ
ーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダ
ーで、該リーダーを置換する。しかしながら、ブタおよ
びヒトの分泌リーダーは多くの、異質(ヘテロローガス)
のより高等な真核細胞によって認識される。宿主によっ
て分泌リーダーが「認識」されると、成熟インヒビンまた
はプロドメインと、Ｃ末端において融合しているリーダ
ーポリペプチドの融合が、宿主のシグナルペプチダーゼ
で開裂され、成熟インヒビンまたはプロドメインポリペ
プチドが分泌され得る。

【００３７】最終的なアミノ酸配列誘導体として発現さ
れないもう一つの主なＤＮＡ突然変異体は、発現を促進
するためのヌクオチド置換に関するものであり、それ
は、第一義的に、転写されたmＲＮＡに５'ステムアンド
ループ構造が形成されることを回避する[ドウ・ボアら
(de Ｂoer)ＥＰ７５, ４４４Ａを参照]ためであり、あ
るいは、選択された宿主によってより転写され易いコド
ンを与える(例えば、大腸菌または酵母による発現に好
都合な、周知のコドンを与える)ためのものである。こ
れらの置換物は、置換されたアミノ酸をコードしていて
も、いなくともよいが、コードしていない方が好まし
い。

【００３８】挿入および置換によるアミノ酸配列変異体
は、標的インヒビン、アクティビン、プロドメインある
いはプロ形のインヒビンまたはアクティビンの予め定め
られた位置に１またはそれ以上のアミノ酸残基が導入さ
れているか、その位置から除去されているタンパク質で
ある。最も一般的には、挿入変異体は、αまたはβ鎖、
プロドメイン、あるいは他のインヒビン誘導体のアミノ
末端またはカルボキシ末端にヘテロローガスなタンパク
質またはポリペプチドが融合している融合物である。免
疫原性誘導体は、例えばプロドメインポリペプチド等の
標的配列に、インビトロ合成、あるいは、融合物をコー
ドしているＤＮＡで形質転換した組換え細胞培養によ
り、免疫原性ポリペプチドを融合させることにより調製
される。その様な免疫原性ポリペプチドは、trpＬＥや
ベーターガラクトシダーゼ等とそれらの免疫原性フラグ
メントとが一緒になった細菌ポリペプチドであることが
好ましい。その他、分泌されるべきタンパク質のＮＨ₂
末端上流に、ヘテロローガスな真核性の分泌シグナル
(例えば、ヘルペスウイルスgＤシグナル)、または微生
物の分泌シグナルを挿入したり、プロテアーゼプロセッ
シング配列を挿入することも含まれる。システイン等の
不安定な残基の欠失は、例えば、α鎖またはβ鎖の酸化
安定性が増強されるので、好ましい。欠失誘導体は、α
鎖フラグメントまたはβ鎖フラグメントを産生するであ
ろう。その様なフラグメントも、それが生物学的または
免疫学的に活性であれば、本発明の範囲内に含まれる。
例えば、約１１〜４５(成熟Ｇly１からの番号による)の
β_Bまたはβ_A残基を含むフラグメントは本発明範囲に含
まれる。

【００３９】プロドメインポリペプチド、インヒビンお
よびアクティビンの免疫原性コンジュゲート(抱含体)
は、βラクタマーゼまたはヘルペスgＤタンパク質のご
ときウイルス性抗原の様な免疫原性ポリペプチドとの融
合物として、組換え細胞培養により合成するか、あるい
は、融合していない形でポリペプチドを合成(組換え法
またはインビトロ合成法により)した後、二価の交差結
合剤を用いてキーホール・リンペット・ヘモシアニンま
たはＳＴＩのごとき免疫原性ポリペプチドと共有結合性
の交差反応を生ぜしめることにより、容易に合成するこ
とができる。この免疫原性ポリペプチドは、ミョウバン
またはフロインドのごときワクチンアジュバントと一緒
に処方される。アジュバント中のタンパク質の調整法
や、交差結合の方法は、動物に対するワクチン接種法と
して当業者によく知られており、用いられている方法で
ある。免疫原性コンジュゲートは、インヒビン製造にお
ける監視に用いるための、プロドメイン領域に対する抗
体を製造する上で有用であり、あるいは、動物の生殖系
または稔性における生理学的調節を行い得る抗体を惹起
するためのワクチン接種において、インビボで有用であ
る。通常、様々な用量でプロドメインまたはその免疫原
を実験動物またはブタを稔性にするために投与し、動物
の生殖系および稔性を監視すると共に、通常の競合的ま
たはサンドイッチイムノアッセイによって抗イムノゲン
またはプロドメインの血清レベルを検定する。

【００４０】置換誘導体は、標的コドンのＤＮＡに突然
変異が誘発されており、以後はそのコドンにより異なる
アミノ酸がコードされているが、この突然変異したＤＮ
Ａから発現される分子の残基の番号が混乱していること
はない。置換または欠失は、例えば、タンパク分解部位
の内部で、またはその近辺で残基を置換する。あるいは
その部位の残基を欠失させる、または、システインを他
の残基で置き換えてジスルフィド結合を追加することに
よりタンパク分解部位を消失させ、本発明のタンパク質
の安定性を増加させるのに有用である。置換は成熟、ま
たはプロドメインαまたはβ鎖の合成あるいは回収を容
易にするのに有用である。例えば、成熟インヒビン配列
中のメチオニン残基を置換または欠失させ、プレプロ配
列を欠失させ、成熟ＮＨ₂末端残基のＮＨ₂末端の直ぐ隣
りの−１部位にメチオニンを挿入し、他の配列を外来性
メチオニンのＮ末端側に挿入する。この場合、インヒビ
ン誘導体は中間にメチニル残基を有する融合物として発
現し、次いで、この残基の位置において、臭化シアンを
用いる既知の手段はより開裂される。次いで、融合物か
ら遊離した成熟インヒビン誘導体を回収する。

【００４１】ブタインヒビン誘導体の例として、[Ａsn
₂₆₆→Ｇln]Ｉnhα(仮定のグリコシル化部位を除去する
ため)、[Ｃys₃₂₅またはＣys₃₂₄→Δ]Ｉnhα, [Ｃys₃₆₁
またはＣys₃₆₃→Δ]Ｉnhα, [Ｌys₃₂₁またはＬys₃₂₂→
Δ]Ｉnhβ_Aまたは[Ｌys₃₂₂→ＨisまたはＳer]Ｉnhβ
_A(潜在的なタンパク分解部位を不活化するため), [Ｌys
₃₁₅→Ａrg; Ｖal₃₁₆→Ｔhr]Ｉnhβ_A(β_A／β_Bハイブリ
ッドを生成するため), [Ｃys ₃₈₈またはＣys₃₈₉→Δ]Ｉn
hβ_A, [Ｌys₄₁₁→Ｇln]Ｉnhβ_A, [Ａrg₃₁₅→Ｌys, Ｔｈ
ｒ₃₁₆→Ｖａｌ]Ｉnhβ_B(β_B／β_Aハイブリッドを生成す
るため), [Ｃys₃₁₉またはＣys₃₂₀→Δ]Ｉnhβ_B[Ｐro₃₈₁
Ｇly₃₈₂→Ｐro Ｐhe Ｇly]Ｉnhβ_B, および[Ａrg₃₉₅
→Ｇln]Ｉnhβ_A[ここに、Ｉnhはインヒビンの省略形で
あり、Ｉnhβ_Bの残基番号は、Ｉnhβ_Aに用いられている
番号に対応している(図５、図６、図７および図８参
照)]を挙げることができる。

【００４２】突然変異性の置換または欠失を行う上で主
な候補であるhβ_Aアミノ酸(あるいは、残基挿入部位の
隣接アミノ酸)の位置は、残基２９３−２９７、３６４
−３７６、および３８７−３９８(図１９、図２０およ
び図２１)である。これらの配列中のプロリン、システ
インおよびグリシン残基は修飾しない方が好ましい。イ
ンヒビンまたはアクティビンよりも大きい効力を有する
候補、あるいは、インヒビンまたはアクティビン拮抗物
として作用する候補を、該候補を一定量のインヒビンま
たはアクティビンを含有している溶液で希釈し、得られ
た組成物をラット脳下垂体細胞アッセイにより分析する
ことからなるスクリーニングアッセイにかけて同定す
る。インヒビンまたはアクティビンの作用を示さず、ま
たそれらに拮抗することもない候補を、天然のホルモン
に対するポリクローナル抗体に対する、天然ホルモン由
来のラベルしたインヒビンまたはアクティビンとの競合
的な免疫置換を測定することにより、インヒビンまたは
アクティビンを測定するためのイムノアッセイに用いる
目的でスクリーンする。想定されるhβ_A変異体配列の例
には、Ｐhe₃₀₂→ＩleまたはＬeu;Ｇln₂₉₇→Ａspまたは
Ｌys;Ｔrp₃₀₇→ＴyrまたはＰhe;Ｔrp₃₁₀→ＴyrまたはＰ
he;Ｉle₃₁₁→ＰheまたはＶal;Ｔyr₃₁₇→ＴrpまたはＴh
r;Ｈis₃₁₈→Ｌys;Ａla₃₁₉→Ｓer;Ａsn₃₂₀→Ｇln, Ｔyr
またはＨis;Ｔyr₃₂₁→ＴhrまたはＡsp, Ｐhe₃₄₀→Ｔyr
(ＴＧＦ−β／β_A鎖間ハイブリッド); Ｈis₃₅₃→Ａsp;
Ｈis₃₅₃→Ｌys(β_A／β_Bハイブリッド); Ｐhe₃₅₆→Ｔy
r;Ｖal₃₆₄→Ｐhe;Ｖal₃₆₄→Ｌeu;Ｔyr₃₇₅→Ｔhr;Ｔyr
₃₇₆→Ｔrp;Ａsn₃₈₉→Ｇln, ＨisまたはＬys;Ｉle₃₉₁→
ＬeuまたはＴhr;Ｍet₃₉₀→ＬeuまたはＳer;Ｖal₃₉₂→Ｐ
he, Ｇlu, ＴhrまたはＩleが含まれる。ヒトβ_B鎖にも
これと匹敵する修飾が施される。例えば、hβ_Aは残基３
０２にフェニルアラニル残基を含有しており、hβ_Bを、
図１０のブタβ_Bに見られる様なやり方と同様に並べる
と、これもまたホモローガスな位置(２６４位、図２
２、図２３および図２４)にフェニルアラニル残基を含
有している。上記の如くβ_AのＰhe₃₀₂はイソロイシニル
またはロイシニル基で置換されるので、β_BのＰhe₂₆₄も
同じ残基で置換される。

【００４３】ポリペプチドをインヒビン、アクティビン
またはインヒビン変異体であると同定するための因子の
１つは、成熟インヒビンまたはアクティビンのホルモン
活性を実質上中和し得る抗血清が懸案のポリペプチドの
ホルモン活性をも実質上、中和し得るということであ
る。しかしながら、免疫学的同一性とホルモン活性とは
必ずしも同一範囲内でなくてよい。例えば、インヒビン
のための中和抗体は、該中和抗体がたまたまインヒビン
の活性にとって臨界的な部位に特異的に結合するもので
ないために候補タンパク質と結合しないかもしれない。
むしろ、この抗体は、無害な領域に結合し、その中和効
果を立体障害によって表しているのかもしれない。従っ
て、その無害な領域で突然変異を生じた候補タンパク質
はもはや中和抗体と結合しないが、それにも拘わらず、
実質上ホモロジィという意味、および生物学的活性にお
いて、インヒビンである。

【００４４】卵胞液等の組織供給源から得た天然または
野生型の成熟インヒビンまたはアクティビンに関する分
子量や等電点の様な特性が天然形のもののみについて記
載されているということを観察することが重要である。
前記の定義に包含される変異体は天然の同族体の特性を
全て表すわけではない。例えば、上記の、挿入突然変異
体、欠失突然変異体または融合タンパク質のごときイン
ヒビン誘導体において、例えば、成熟インヒビンとの融
合物またはプロインヒビンそれ自体、並びに挿入突然変
異体は、天然の成熟インヒビンよりも大きい分子量を有
しているので、対応する天然インヒビンに対して確立さ
れた分子量から離脱した分子量を示すことになる。他
方、天然の成熟インヒビンの欠失突然変異体は、より低
い分子量を有することになる。最後に、ヘテロローガス
なセルラインにおけるプレプロインヒビン鎖の翻訳後プ
ロセッシングは、ホモローガス宿主細胞による程忠実に
行われないかもしれないので、αおよび／またはβ鎖の
アミノ末端に幾らかの変異が生じ得る。この変異は、成
熟タンパク質にプロ配列が残留しているか、あるいは、
プロ配列と一緒に成熟タンパク質の残基数個が開裂さ
れ、失われていることによる場合もある。同じことがヘ
テロローガス組換え細胞内でのプレタンパク質のプロセ
ッシングについても言える。

【００４５】インヒビン、アクティビンまたはプロドメ
インの共有結合的修飾物も本発明の範囲内に含まれ、そ
れらには他の化学部分との共有結合的または凝集による
コンジュゲートが含まれる。共有結合誘導体は、当業者
既知の方法でインヒビンアミノ酸側鎖あるいはＮまたは
Ｃ末端に見い出される基の機能的部分と結合させること
により調製される。例えば、これらの誘導体にはカルボ
キシ末端、あるいはアスパルチル残基のごときカルボキ
シ残基を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、セリ
ルまたはアラニル等のヒドロキシル基含有残基のＯ−ア
シル誘導体、並びにアミノ末端アミノ酸またはリジンや
アルギニン等のアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体が
含まれる。アシル基を形成するにはアルキル部分(Ｃ₃〜
Ｃ₁₀の直鎖アルキルを含む)のグループから選んでアル
カノイル種を形成することにより、また、炭素環または
異項環化合物を選んでアロイル種を形成することができ
る。反応性の基は、例えば、m−マレイミドベンゾイル
−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルのごとく、反
応性の側鎖基を通してタンパク質を交差結合させて不溶
性のマトリックスにするのに用い得ることが自体既知で
ある二機能性化合物であることが好ましい。好ましい誘
導体化部位はヒスチジン残基である。

【００４６】成熟インヒビン、アクティビンまたはプロ
ドメイン配列の共有結合誘導体または凝集反応誘導体は
イムノアッセイにおける試薬、あるいはアフィニティ精
製法のための試薬として有用である。例えば、インヒビ
ンまたはプロドメインを臭化シアン−活性化セファロー
スと自体既知の方法で共有結合的に結合させて不溶化す
るか、あるいはポリオレフィン表面(グルタルアルデヒ
ド交差結合を持つものまたは持たないもの)に吸着させ
ることにより不溶化し、抗−インヒビン抗体または抗プ
ロドメイン抗体、あるいは細胞表面受容体の分析または
精製に用いる。またインヒビンまたはプロドメイン配列
を、例えば、クロラミンＴ法によって放射性ヨウ素化す
る。希土類キレート化合物と共有結合させる、あるいは
別の蛍光成分と結合させる、等の方法で標識し、診断学
的アッセイ、特に、生物標本中のインヒビンまたはプロ
ドメインレベルを競合型イムノアッセイによって診断学
的アッセイするのに用いる。

【００４７】インヒビン／アクティビンの完全なα鎖お
よびβ鎖をコードしているＤＮＡは化学合成するか、あ
るいは卵巣から得たmＲＮＡ逆転写物をスクリーニング
する、または何らかの細胞からのゲノムライブラリィを
スクリーニングすることにより得られる。スクリーニン
グには、αおよびβ鎖をコードしているcＤＮＡまたは
ゲノムライブラリィからＤＮＡを同定しなければならな
いので、所望のＤＮＡ部分を単純に合成する方が効率が
良い。また、合成法によれば、ＤＮＡの調製時に特異
(ユニーク)な制限部位を導入し、さもなければ、天然の
配列中に存在しない制限部位を含有するベクター内で遺
伝子を用いることができると共に、突然変異等によるＤ
ＮＡをさらに修飾する必要なしに上記のごとき翻訳効率
の向上を図る工程をとることができるので、これもまた
有利な方法である。αまたはβ鎖をコードしているcＤ
ＮＡは非翻訳介在配列(イントロン)並びに、それらの供
給源にとってホモローガスな他のタンパク質をコードし
ている、側方の(フランキング)ＤＮＡを含んでいない。

【００４８】αおよびβ鎖をコードしているＤＮＡは、
(a)標的動物の卵巣からcＤＮＡライブラリィを得、(b)c
ＤＮＡライブラリィ中の、ホモローガスな配列を含んで
いるクローンを検出するためにブタまたはヒトのαおよ
びβ鎖あるいはそのフラグメントをコードしている標識
ＤＮＡを用いてサザーン分析を行い、(c)得られたクロ
ーンを制限酵素分析および核酸配列決定に付してクロー
ンの全長を同定し、もしも、ライブラリィ中に全長に及
ぶクローンが存在していないときには、種々のクローン
から適当なフラグメントを回収し、これらをクローンに
とって共通の制限部位でライゲートして全長に及ぶ分子
をコードしているクローンを組立てることにより、ブタ
またはヒト以外の供給源からも得ることができる。以下
に示すごとく、ライブラリィ中に不足している配列は、
ライブラリィのスクリーニングによって同定されたcＤ
ＮＡと相補的な合成オリゴデオキシヌクレオチドを卵巣
mＲＮＡの３'側に延長させて得るか、あるいは、既知の
動物cＤＮＡからホモローガスな配列を得てもよい。こ
の方法は、所望の種からのプレプロインヒビンから成熟
インヒビンへのプロセッシングが容易なプレまたはプレ
プロインヒビン配列を組立てる上で特に有用である。

【００４９】ブタおよびヒトの卵巣cＤＮＡライブラリ
ィを、まず、精製ブタインヒビンを分析して決定した部
分的アミノ酸配列に基づく配列を有するオリゴヌクレオ
チドであって標識されているもの(ヒトcＤＮＡの場合は
ブタcＤＮＡプローブ)を用い、インヒビンをコードして
いるＤＮＡに関してプローブする。しかしながら、一度
ヒトおよびブタのインヒビン、並びにプロドメインをコ
ードしているcＤＮＡが記録されれば、当業者はこの記
述された配列を基に、残余のヒトまたはブタの遺伝子を
得るために、確実にハイブリダイズするプローブを容易
に調製し得る。

【００５０】同定されたブタおよびヒトのcＤＮＡクロ
ーンのヌクレオチド配列決定によりインヒビンの両型の
生合成による前駆体の構造が明らかになった。興味深い
ことに、２本のインヒビン鎖は単一の、プロセッシング
された前駆体から得られたものでなかった。そうでな
く、これら２本の鎖は別々のmＲＮＡから翻訳され、そ
の後にジスルフィド交差結合による２本鎖分子に組立て
られている。

【００５１】図２、図３、図５、図６、図７、図８、図
１５、図１６、図１９、図２０、図２１、図２２、図２
３および図２４は、ブタおよびヒトのプレプロインヒビ
ンおよびプレプロアクティビンを構成するポリペプチド
鎖をコードしているＤＮＡを示す図である。明らかに、
これらの図中に開示されたコドンには縮重があってよ
く、それによっても同じアミノ酸がコードされている。
図２、図３、図５、図６、図７、図８、図１５、図１
６、図１９、図２０、図２１、図２２、図２３および図
２４のＤＮＡを突然変異させ、上記のαおよびβ鎖のア
ミノ酸変異体をコードさせる。特に、懸案の成熟鎖を組
換え培養中で直接発現させるために、プレプロ配列を欠
失させ、該配列の５'側に隣接して開始コドンを挿入す
る。このＤＮＡを例えば放射活性なリンで標識し、卵巣
cＤＮＡライブラリィのスクリーンに用い、上で一総括
的に述べた様に、他の種のものをコードしているＤＮＡ
から、αまたはβ鎖を同定することができる。

【００５２】このＤＮＡの共有結合的な標識は、蛍光性
の基、放射活性な原子、あるいは化学発光性の基等の検
出可能な基により自体既知の方法で行われる。次いで、
標識ＤＮＡを、通常のハイブリダイゼーション分析(ア
ッセイ)に用いる。その様な分析法は、以下の実施例に
述べるごとく、ベクターや形質転換体を同定するため
に、または、組織試料中のmＲＮＡの検出のごとく、イ
ンビトロでの診断に利用される。

【００５３】長い配列はそれら、例えばインヒビンまた
はプロドメイン配列をコードしているＤＮＡを含むベク
ターで形質転換された宿主細胞中で合成されることが望
ましい。ベクターは、以後のプロセッシングのために多
量のＤＮＡを調製する(クローニングベクター)か、ある
いは、これらの鎖を発現させる(発現ベクター)目的で、
該鎖をコードしているＤＮＡを増幅させるために用いら
れる。発現ベクターは、αまたはβ鎖をコードしている
ＤＮＡと、それらの適当な宿主内での発現に影響を及ぼ
し得る適当なコントロール配列とが機能的に結合した複
製可能なＤＮＡ組立て物である。クローニングベクター
は発現コントロール配列を含有している必要がない。一
般に、コントロール配列には、転写プロモーター、転写
をコントロールするための任意のオペレーター配列、適
切なmＲＮＡリボゾーム結合部位をコードしている配列
(原核性発現のために)、および転写および翻訳の終止を
コントロールするための配列が含まれる。ベクターは、
所望のポリペプチドを安定な発現、および／または形質
転換体の選択を容易にするために選択遺伝子を含有して
いる必要がある。しかしながら、αおよび／またはβ鎖
の発現を維持するための選択遺伝子は真核性宿主細胞を
用い同時(共)形質転換法により、別のベクターから供給
することもできる。

【００５４】ベクターにはプラスミド、ウイルス(ファ
ージを含む)、および組込み可能なＤＮＡフラグメント
(即ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得る
もの)が含まれる。本明細書に記載されている、αおよ
び／またはβ鎖の真核性細胞内発現に用いるためのベク
ターは、微生物内でクローニングするためのプラスミド
配列を含有しており、該微生物内でプラスミドは、宿主
のゲノムと別に自律して複製するが、形質転換に際して
ＤＮＡは真核性宿主細胞のゲノムに組込まれると考えら
れている。同様に、細菌内でホモローガス組換えによっ
てゲノム内に組込むことのできるバチルス(bacillus)ベ
クターも有用である。しかしながら、その他の同等な機
能を有する他の形のベクターであって、現在知られてい
る、あるいは将来知られるであろうベクターも本発明に
用いることができる。

【００５５】適当なベクターは一般に、意図する発現用
宿主にとって適合し得る種から導かれたレプリコン(複
製起源、非組込み性ベクターの場合)およびコントロー
ル配列を含有している。形質転換された宿主細胞とは、
インヒビンαおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮ
Ａを含有しているベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトされた細胞である。形質転換された宿主細胞はク
ローンしたＤＮＡを含有しており、発現ベクターで形質
転換された場合にはαおよび／またはβ鎖を発現する。
発現されたポリペプチドは、選択した宿主細胞、並びに
発現したタンパク質中の適当なプロセッシングシグナル
(ホモローガスまたはヘテロローガスなシグナル配列)の
存在に応じて、細胞内に沈着するか、あるいはペリプラ
スミック間隙に分泌される。

【００５６】ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に
関連している場合は、機能的(操作可能)に結合(operabl
y linked)している。例えば、プレ配列または分泌リー
ダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に与
えるプレタンパク質として発現されるならば、該ポリペ
プチドに関するＤＮＡと機能的に結合している; プロモ
ーターは、それが結合している暗号配列の転写をコント
ロールするものであるならば、該配列と機能的に結合し
ている; リボゾーム結合部位は、それが結合している暗
号配列の翻訳を可能にする様な位置に存在しているなら
ば、該暗号配列と機能的に結合している。一般に、機能
的に結合している、ということは結合しているＤＮＡが
近接(コンティギュアス)していることを意味し、分泌リ
ーダー配列の場合には、近接し、かつ解読相内にあるこ
とを意味する。

【００５７】適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞ま
たは高等な真核細胞である。原核生物にはグラム陰性ま
たはグラム陽性の微生物、例えば、大腸菌(Ｅ．coli)や
バチルス(桿菌、Ｂacilli)が含まれる。高等な真核細胞
には、以下に述べるごとく哺乳類動物起源の樹立(確立
された)セルラインが含まれる。好適な宿主細胞は大腸
菌２９４(ＡＴＣＣ ３１,４４６)株であるが、他の原核
生物、例えば大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ ３
１,５３７)、大腸菌２９４(ＡＴＣＣ ３１,４４６)、大
腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ２７,３２５)、シュードモー
ナス(Ｐsendomonas)種、あるいはセラシア・マーセサン
ス(Ｓerratia Ｍarcesans、霊菌)等も適する。

【００５８】一般に、宿主細胞のための発現ベクターに
は、複製起源(クローニングの場合の様に染色体外での
増幅が望まれる場合の複製起源は、細菌起源である)、
インヒビン暗号領域の上流に位置するプロモーターであ
って、リボゾーム結合部位を伴うもの(リボゾーム結合
配列またはシャイン−ダルガノ配列は、原核性発現の場
合にのみ必要とされる)、ＲＮＡスプライス部位(インヒ
ビンＤＮＡが１またはそれ以上のイントロンを含むゲノ
ムＤＮＡを含有している場合)、ポリアデニル化部位、
並びに転写終止配列を含有している。当業者なら認める
ことであるが、ある種の宿主内における発現には、上記
の配列の内、ある種のものは必要でない。微生物に用い
る発現ベクターの場合には、所望の宿主が認識し得る複
製起源、宿主内で機能し得るプロモーター、並びに表現
型の選択性遺伝子(例えば、抗生物質耐性を付与するタ
ンパク質をコードしている遺伝子、または独立栄養生物
の要求を満たす様なタンパク質をコードしている遺伝子
のみが必要とされる。インヒビンＤＮＡは通常、大腸菌
種から得られるプラスミドpＢＲ３２２[ボリバー(Ｂoli
var)ら、１９７７、“ジーン(Ｇene)" ２: ９５]を用い
て大腸菌内でクローニングされる。pＢＲ３２２はアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を
含有しており、これらは形質転換細胞を容易に同定し得
る手段となる。

【００５９】発現ベクターはクローニングベクターと異
なり、宿主生物によって認識され得るプロモーターを含
有していなければならない。このことは、一般に、プロ
モーターは所望の宿主にとってホモローガスであること
を意味する。組換えＤＮＡ組立て物に最も普通に用いら
れるプロモーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシリナ
ーゼ)およびラクトースプロモーター系([チャン(Ｃhan
g)ら、１９７８ “ネイチャー"、２７５: ６１５; およ
びゲッテル(Ｇoeddel)ら、１９７９ “ネイチャー" ２
８１: ５４４]、トリプトファン(trp)プロモーター系
[ゲッテル(Ｇoeddel)ら、１９８０ “ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)" ８: ４
０５７およびＥＰＯ出願公開番号３６,７７６]並びにta
cプロモーター[Ｈ．ドウ ボエル)Ｈ．Ｄe Ｂoer)ら、
“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンスイズ(Ｐroc．Ｎat'l．Ａcad．
Ｓci)Ｕ.Ｓ.Ａ.“８０: ２１−２５(１９８３)]が含ま
れる。これらが最も普通に用いられているが、その他の
既知の微生物プロモーターも使用し得る。それらの詳し
いヌクレオチド配列は公開されているので、当業者は、
それらをプラスミドベクター内の、インヒビンをコード
しているＤＮＡと機能的にライゲートさせることができ
る[シーベンリスト(Ｓiebenlist)ら、１９８０、“セル
(Ｃell)" ２０:２６９]。原核性発現系に用いられるプ
ロモーターは、インヒビンと機能的に結合したシャイン
ダルガノ(Ｓ．Ｄ．)配列をも含有していることを要する
(Ｓ．Ｄ．は翻訳を容易にする様に位置している)。この
ことは、一般に、細菌の構造遺伝子の第２コドンの上流
に位置してプロモーターおよびＳ．Ｄ．配列があり、こ
れらが成熟αおよび／またはβ鎖の５'側における、プ
レプロインヒビンの配列と置換されていることを意味す
る。

【００６０】原核生物に加えて、酵母培養のごとき真核
生微生物もインヒビン暗号化ベクターにより、形質転換
され得る。下等な真核生宿主微生物の内、サッカロミケ
ス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cereviciae)または通
常のパン酵母が最も一般的に用いられる。しかし、その
他多数の株も普通に手に入れ、本発明に用い得る。酵母
ベクターは、通常、２ミクロン酵母プラスミドからの複
製起源または自律的複製配列(ＡＲＳ)、プロモーター、
αおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮＡ並びにポ
リアデニル化および転写の終止のための配列、および選
択遺伝子配列を含有している。酵母内での発現に適した
プラスミドはＹＲ_p7である[ステインチコム(Ｓtinchcom
b)ら、１９７９、“ネイチャー" ２８２: ３９: キング
スマン(Ｋingsman)ら、１９７９、“ジーン" ７: １４
１: チェンパー(Ｔschemper)ら、１９８０、“ジーン"
１０: １５７]。このプラスミドは既にtrp１遺伝子を含
有しており、この遺伝子は、酵母の突然変異株、例えば
ＡＴＣＣ Ｎo．４４０７６またはＰＥＰ４−１[ジョー
ンズ(Ｊones)、１９７７、“ジェネテックス" ８５:１
２]に、トリプトファン中で増殖する能力を持たないと
いう選択マーカーを与える。この酵母宿主細胞ゲノムは
trp１障害を有するので、形質転換体をトリプトファン
の非存在下で増殖させることで、形質転換体の検出に効
果的な環境を得ることができる。

【００６１】酵母用ベクターの好適なプロモーティング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る: メタロチオナイン(metallothionein)、３−ホスホ
グリセレート・キナーゼ[ヒッツマン(Ｈitzeman)ら、１
９８０ “ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリィ" ２５５: ２０７３]またはエノラーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、
ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、
ピルベート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメ
ラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナ
ーゼ等の他の解糖酵素類[ヘス(Ｈess)ら、１９６８、"
ジャーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム
・レグ(Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒeg．)"７: １４９: およ
びホランド(Ｈolland)ら、１９７８、"バイオケミスト
リィ"１７: ４９００]。更に、酵母内で発現させる上で
好適なベクターおよびプロモーターはＲ．ヒッツマン
(Ｒ．Ｈitzeman)らにより、ＥＰ７３,６５７Ａ中に記述
されている。

【００６２】その他、増殖条件によって転写がコントロ
ールされるという利点をも有する酵母プロモーターとし
て、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵
素、前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースお
よびラクトースの利用に与える酵素類等に関するプロモ
ーター領域が含まれる。適当な発現プラスミドを組立て
るには、これらの遺伝子に関連する終止配列を、発現ベ
クター内のインヒビンまたは誘導体暗号配列の３'側に
ライゲートし、mＲＮＡの終止およびポリアデニル化を
与える。

【００６３】多細胞生物からの細胞培養も、ホルモン活
性なインヒビンまたはアクティビンの発現はその様な細
胞内でのみ起こり、微生物発現では、免疫学的交差反応
活性の発現が殆んどであると考えられるので、本発明に
おける好ましい宿主である。原則として、脊椎動物の培
養物であるか無脊椎動物の培養物であるかに拘わらず、
あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。最近では、
その様な細胞を細胞培養中で増殖させることは日常的な
操作となっている[ティッシュ・カルチャー(Ｔissue
Ｃulture)アカデミック・プレス、クルスおよびパター
ソン(Ｋrus andpatterson)編、(１９７３)]。

【００６４】高等な真核生物内でαまたはβ鎖を発現さ
せる上で適切な宿主細胞には以下のものが含まれる: Ｓ
Ｖ４０で形質転換されたサルの腎臓ＣＶＩ系(ＣＯＳ−
７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１); ベビーハムスター
の腎臓細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＲＬ１０); チャイニー
ズハムスターの卵巣細胞−ＤＨＦＲ[ウーラウブ(Ｕrlau
b)およびチャッシン(Ｃhasin)著、ＰＮＡＳ(ＵＳＡ)７
７ ４２１６(１９８０)]; マウス・セルトリー細胞[Ｔ
Ｍ４、マザー(Ｍather)、Ｊ．Ｐ．、バイオロ・レプロ
ド(Ｂiol．Ｒeprod．)２３: ２４３−２５１(１９８
０)]; サル腎細胞(ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); ア
フリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５８７); ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ、Ａ
ＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ３４); バッファロー・ラット腎細胞(ＢＲＬ ３
Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞(Ｗ１３
８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞(ＨepＧ２ Ｈ
Ｂ８０６５); マウス乳腺腫(ＭＭＴ０６０６５２、ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ５１); ラット肝腫瘍細胞[ＨＴＣ、Ｍ１、
５４、バウマンら(Ｂauman)、ジャーナル・オブ・セル
ラー・バイオロジィ(Ｊ．Ｃell．Ｂiol．)８５: １−８
(１９８０)]; およびＴＲＩ細胞[マザーＪ．Ｐ．ら、ア
ナルス・Ｎ．Ｙ．アカド・サイ(Ａnnals Ｎ．Ｙ．Ａca
d．Ｓci．)３８３:４４−６８(１９８２)]。

【００６５】脊椎動物細胞に使用される発現ベクターの
ための転写および翻訳コントロール配列は、ウイルス起
源から供給されることが好ましい。例えば、普通用いら
れているプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス
２、および最も好ましくはシミアンウイルス４０(ＳＶ
４０)から導かれる。初期(早期)および後期プロモータ
ーは、いずれもＳＶ４０ウイルスの複製起源をも含有し
ているフラグメントとして該ウイルスから容易に得られ
るので特に有用である[ファイヤーズ(Ｆiers)ら、１９
７８、“ネイチャー" ２７３: １１３]、ＳＶ４０のよ
り小さい、またはより大きいフラグメントも、それらが
ウイルス性複製起源内に存在するＨindＩＩＩ部位から
ＢglＩ部位に至る約２５０bpの配列を含有している限り
用いることができる。更に、αまたはβ鎖に自然に伴わ
れているゲノムプロモーター、コントロールおよび／ま
たはシグナル配列も、その様なコントロール配列が宿主
細胞に適合し得ることを条件として用いることができ、
またしばしば好ましいことである。

【００６６】複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウイ
ルス性起源(例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、Ｖ
ＳＶ、ＢＰＶ等)から導かれる複製起源等の外来性起源
を含む様にベクターを組立てることにより、あるいは宿
主細胞の染色体複製機構により与えられる。もしも、ベ
クターが宿主細胞染色体に組込まれるなら、しばしば、
後者の機構で十分である。

【００６７】ウイルス性の複製起源を含有しているベク
ターを用いずに、選択マーカーをコードしているＤＮＡ
とαおよび／またはβ鎖をコードしているＤＮＡとを用
い、同時形質転換法によって哺乳類細胞を形質転換する
こともできる。適当な選択マーカーの例として、ジヒド
ロ葉酸還元酵素(ＤＨＥＦＲ)またはチミジン(thymizin
e)キナーゼを挙げることができる。その様なマーカー類
はタンパク質であり、一般には形質転換細胞(即ち、外
因性ＤＮＡの取り込みに適合した(コンピテント)細胞)
の同定を可能にする酵素である。通常、同定は細胞がそ
のマーカータンパク質を取り込んでいなければ、該細胞
にとって有毒な培地、あるいは、該細胞が必須栄養素を
得ることができない培地で、形質転換体は生存し得る、
ということに基づいて行う。

【００６８】インヒビンとＤＨＦＲの両者をコードして
いるＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトする
のに好適な哺乳類宿主細胞を選択するのに際しては、用
いるＤＨＦＲタンパク質のタイプに従って宿主を選択す
るのが適当である。野生型ＤＨＦＲタンパク質を用いる
場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択するのが好まし
く、そうすることにより、ＤＨＦＲの非存在下では利用
し得ない必須栄養素である。ピポキサンチン、グリシン
およびチミジンを欠く選択培地(hgt^-)内で成功したトラ
ンスフェクションを選択するためのマーカーとしてＤＨ
ＦＲ暗号配列を用いることができる。この場合、好まし
い宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスタ
ーの卵巣(ＣＨＯ)セルラインであり、これは、ウーラウ
ブおよびチャッシン(Ｕrlaub and Ｃhasin)[１９８
０、“プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミィ・オブ・サイエンスイズ"(ＵＳＡ)７７: ４２
１６]の方法で調製し、増殖させることができる。

【００６９】メトトレキセート(ＭＴＸ)に対する結合親
和性の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしているＤＮＡ
をコントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ耐性細
胞を用いる必要はない。突然変異ＤＨＦＲはＭＴＸ耐性
であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感受性であるなら
ば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として用いることがで
きる。ＭＴＸを吸収することのできる真核細胞の大多数
は、メトトレキセート感受性であると思われる。その様
な、有用なセルラインはＣＨＯ系、ＣＨＯＫＩ(ATCC N
o．ＣＣＬ６１)である。まず、形質転換体をネオマイシ
ン耐性に関して選択し(ネオマイシン耐性付与遺伝子を
コードしているＤＮＡを共に用いてトランスフェクショ
ンを行う)、次いで、場合に応じてαおよび／またはβ
鎖発現のＭＴＸ増幅を選択することが好ましい[キムら
(Ｋim)、“セル(Ｃell)" ４２:１２９−１３８(１９８
５)およびＥＰ１６０,４５７Ａ参照]。

【００７０】その他、組換え脊椎細胞培養内でのαおよ
び／またはβ鎖の合成に適用するのに好ましい方法とし
て、Ｍ−Ｊ．ゲシング(Ｇething)ら、“ネイチャー" ２
９３:６２０−６２５(１９８１); Ｎ．マンティ(Ｍante
i)ら、“ネイチャー" ２８１: ４０−４６; Ａ．レビン
ソン(Ｌevinson)ら、ＥＰ１１７,０６０Ａおよび１１
７,０５８Ａ等が述べている方法がある。

【００７１】組換え細胞培養中で、インヒビンα鎖は、
β鎖分子のいずれかと一緒に、または別個に発現され
る。同様に、成熟β鎖のいずれかまたは両方をコードし
ているＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。ＴＧＦ−βと
の類似性に基づいて、組換え培養中での発現に際し、成
熟β鎖はホモ二量体またはβ_A／β_Bヘテロ二量体を形成
し得る。これらの構造物はインヒビンでなく、従って、
本明細書中ではβ−鎖二量体またはアクティビンと称す
る。これらは、活性インヒビンの製造におけるβ鎖の供
給源として有用であり、あるいは、αおよびβ鎖同時形
成転換によって合成されたβ鎖のβ鎖二量体への転換を
検出する上で、ゲル電気泳動法における標準として用い
ることができる。実施例４に見られる様に、このことは
仮定の問題ではない。勿論、上記のごとく、生殖の調節
においても二量体は有用である。

【００７２】β鎖のヘテロ二量体あるいはホモ二量体
は、インビトロで個々の鎖を変性(アンホールディング)
した後、一般に既知の方法に従ってα−鎖と酸化的ジス
ルフィド結合させて分離する。しかしながら、成熟イン
ヒビンの調製には、α鎖と、β鎖のいずれか一方との両
者をコードしているＤＮＡで組換え宿主を形成転換する
のが好ましい。その結果、宿主細胞の生体内でホルモン
活性な分子がそのまま結合するので、インビトロでの処
理により２本の鎖を結合させる必要がない。αおよびβ
鎖は同じベクター内に、同じプロモーターのコントロー
ル下に配置されていることが好ましいが、それが必須と
いうわけではない。

【００７３】スクリーニングにおいて同定されたある種
のβ鎖アミノ酸配列変異体は下垂体の細胞表面受容体を
結合しないか、あるいは、結果的にホルモン活性を表さ
ない。その様な変異体が組換え細胞培養中でホモ二量体
として発現された場合、それらが天然のβ鎖と交差反応
性の免疫学的エピトープを有するならば、アクティビン
のイムノアッセイに有用である。さらに、その様な変異
体は、ホルモン活性なβ鎖をコードしているＤＮＡと一
緒に同時発現され、固有のβ鎖と変異体β鎖とを含むハ
イブリッドが得られる。この場合、変異体は固有のβ鎖
の構造を安定化する様、作用する。この形のβ鎖ヘテロ
二量体はホモ二量体と同様に、アクティビンのイムノア
ッセイに有用である。これはまたアクティビンの拮抗体
としても機能し得る。

【００７４】また、β鎖／ＴＧＦ−βハイブリッドを生
産するためにアクティビン／インヒビンβ鎖をＴＧＦ−
βと同時発現させる。ＴＧＦ−βを発現するベクター並
びに発現させる方法は既知である[例えば、デリンクら
(Ｄerynck)、ヒト形質転換成長因子−β相補ＤＮＡ配
列、並びに正常および形質転換細胞内での発現(Ｈuman
Ｔransforming Ｇrowth Ｆactor−β Ｃomplementar
y ＤＮＡ Ｓequenceand Ｅxpression in Ｎormal
and Ｔransformed Ｃells) “ネイチャー" ３１６:
７０１−７０５(１９８５)参照]。デリンク(Ｄerynck)
らの記載のごとくに、ＴＧＦ−β遺伝子を担ったベクタ
ーによる哺乳類細胞の同時形質転換をアクティビン／イ
ンヒビンのβ_Aまたはβ_B鎖と一緒に行うことにより、β
鎖／ＴＧＦ−βハイブリッド二量体がある割合で分泌さ
れるであろう。このハイブリッドはＴＧＦ−β／β鎖イ
ムノゲンの調製またはイムノアッセイに有用である。

【００７５】形質転換細胞から自体既知の方法によって
インヒビン、アクティビンまたはプロドメイン配列を回
収する。ポリペプチドが組換え細菌内で屈折体として発
現される場合には、所望のポリペプチドを回収し、常法
通り、所望のポリペプチドを再生する。別法として、ア
クティビンまたはインヒビンを分泌する形質転換細胞、
好ましくは哺乳類細胞の細胞培養を単に遠心することに
より、細胞から上清を分離する。次いで、一般に、ヘパ
リン−セファロースアフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過、および少なくとも１回の(好ましくは数回の)
固定相および／または移動相内での種々の条件下におけ
るＲＰ−ＨＰＬＣ(逆相高速液体クロマトグラフィー)工
程を含む連続精製法により、インヒビンを精製する。イ
ンビトロ合成法で生産されたプロドメイン配列は常法通
り精製される。

【００７６】本発明に用いるのに好ましいプロドメイン
ポリペプチドは、所望のプロドメインに適したαおよび
／またはβ鎖を合成する様、形質転換された組換え細胞
の培地から回収される。特にそれらの回収は、まず固有
の電気泳動ゲル上で培養培地ポリペプチドを分離し、予
測される分子量のバンドを切り取った後、溶離したポリ
ペプチドを例えばＦＰＬＣまたはＨＰＬＣによってさら
に精製し、次いで、実質上ホモジーニアスな分離された
ポリペプチドをアミノ酸配列決定に付すことにより回収
される。次に、この精製(純化)プロドメインポリペプチ
ドを用いて、例えば、ウサギ等に抗体を産生させ、それ
をイムノアフィニティ精製に用いれば、プロドメインの
回収が単純になると思われる。

【００７７】単離されたブタのホルモン活性なインヒビ
ンを精製するには、まず、清澄な形質転換培養の上清ま
たは細胞リゼイトをヘパリン−セファロースアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより精製し、次に、セファクリ
ルＳ−２００ゲルにかけてゲル濾過した後、種々の移動
相グラディエントおよび／または誘導体化シリカゲル支
持体を用い、４回の連続的なＲＰ−ＨＰＬＣに付す方法
が好ましい。好ましくは、比較的疎水性の低い固定相を
用い、Ｃ₃−Ｃ₈カラムで行うことが好ましく、Ｃ₃−Ｃ₅
であってフェニルカラムを用いることが特に好ましい。
移動相の溶質特異性は、有機成分特にアセトニトリルの
濃度を変えることにより適宜調節できる。１回のＲＰ−
ＨＰＬＣ分画によってもゲル濾過物質に比べてかなり純
度が高くなるが、ヘパリン−セファロースクロマトグラ
フィーおよびゲル濾過による連続処理の後、通常、２ま
たはそれ以上、好ましくは４回のＲＰ−ＨＰＬＣ精製を
行う。この方法は、組換え細胞培養からのヒトインヒビ
ンの精製にも同様に適用し得ることが分かった。

【００７８】精製の第１段階はヘパリン−セファロース
アフィニティクロマトグラフィーであり、ここでは、タ
ンパク質を適用した条件下においてセファロース−結合
ヘパリン部分に吸着され、この吸着されたインヒビンを
１Ｍ ＮaＣlで溶離して回収する。この段階において、
かなり大量の粗抽出物を相当迅速に処理し、総インヒビ
ン活性が粗抽出物の少なくとも９０％に匹敵する多量の
タンパク質を回収することができるのでこの段階で、粗
抽出物の精製工程が極めて促進される。

【００７９】様々なカラム画分中のインヒビン活性を検
出するために、容量比で約０.０１％〜０.１％を分取
し、水１００μl中に入れたヒト血清アルブミン１００
μgを加えた後、スピード−バク(Ｓpeed−Ｖac)コンセ
ントレーター(濃縮器)[サバント(Ｓavant)、ヒックスビ
レ、ＮＹ]中で溶媒を留去した。残留物を３mlのＨＤＭ
ＥＭ中１％ウシ胎児血清に再溶解し、ミレックス(Ｍill
ex)−ＧＳ ０.２２μmフィルター[ミリポア(Ｍillipor
e)コーポレーション、ベットフォード、ＭＡ]で濾過
し、複製して分析した。精製工程におけるバイオアッセ
イのスピードを上げるために、インヒビン活性によるＦ
ＳＨ分泌の基礎的な阻害のみを測定し、クロマトグラム
中の、インヒビンタンパク質が泳動していると予測され
る領域をプロットした。

【００８０】ヘパリン−セファロースアフィニティクロ
マトグラフィーを行うために、細胞分屑を、ベックマン
Ｊ２−２１遠心機(ベックマンインスツルメンツインコ
ーポレーテッド、パロ・アルト、ＣＡ)中において、Ｊ
Ａ２０ローターを用い、１０,０００rpmで３０分間遠心
することにより沈降させた。エーレンマイヤーフラスコ
中で、上清１／２に０.１Ｍ ＮaＣl含有０.０１Ｍトリ
スＨＣl(pＨ７)を加えて元の容量の１０倍に希釈し、２
個のラビット(Ｒabbit)４チャンネル蠕動ポンプ[ライニ
ン・インスツルメント(Ｒainin Ｉnstrument)Ｃo．Ｉn
c．エメリービレ、ＣＡ]により、ヘパリン−セファロー
ス[ファルマシア・ファイン・ケミカルス(Ｆarmacia
Ｆine Ｃhemicals)、ピスカッタウエイ、Ｎ．Ｊ．]カ
ラム(３.５×９cm)に、カラム当たり、４０ml／時間の
速度で、シラスティック(Ｓilastic)チューブ(０.７６m
mＩＤ)を通して同時にポンプ注入した。液体全てがヘパ
リン−セファロースカラム内にポンプ注入された後、８
本のカラム全てを同時に、０.１Ｍ ＮaＣlを含有する
０.０１ＭトリスＨＣl、pＨ７により、同様にして洗浄
した。吸着された、インヒビン活性を有するタンパク質
を、８本のカラムを、上記のごとく１Ｍ ＮaＣl含有
０.０１ＭトリスＨＣl(pＨ７)によって同時に洗浄する
ことにより除き、洗浄液を画分に分けて集めた。上記の
ごときインビトロでのバイオアッセイによってインヒビ
ン活性を監視した。残る抽出物の精製のために、カラム
を０.０１ＭトリスＨＣl(pＨ７)中２Ｍ ＮaＣlで洗浄
して再生させ、０.１Ｍ ＮaＣl含有０.０１ＭトリスＨ
Ｃlで再度平衡化した。

【００８１】次に、得られた物質をゲル濾過して分画
し、通常、分子量に従ってタンパク質を分ける。ヘパリ
ン−セファロースカラムによって抽出したインヒビン活
性を有する画分をプールし、分子量(Ｍr)カットオフ３,
５００である、シリンダー(直径２８.６mm)のスペクト
ラポール(Ｓpectrapor)Ｎo．３ メンブラン・チュービ
ング[スペクトラム・メジカル・インダストリィズ(Ｓpe
ctrum Ｍedical Ｉndustries)インコーポレーテッ
ド、ロスアンゼルス、ＣＡ]中、３０％酢酸に対して一
夜透析し、ＮaＣlを除去する。上記のごとくにして保持
液を遠心して白色の沈澱を除き、上清を５×１００cmの
セファクリル(Ｓephacryl)Ｓ−２００微細(スーパーフ
ァイン)カラム[ファルマシア・ファイン・ケミカルス
(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals)ピスカッタウェイ、
Ｎ．Ｊ．]にかけるために等分量づつ分ける。各カラム
を３０％酢酸２０mlで、２２分間溶離し、２８０nmにお
けるＵＶ吸収とバイオアッセイによりカラムからの画分
を監視する。

【００８２】Ｓ−２００カラムから得たバイオアッセイ
陽性タンパク質をプールし、凍結乾燥する。この凍結乾
燥品を０.２Ｎ酢酸に溶解し(１ml／ml)、ミレックス−
ＨＡ(Ｍillex−ＨＡ)０.４５μmフィルター[ミリポア
(Ｍillipore)Ｃorp．、ベッドフォード、ＭＡ]で濾過す
る。濾液を１×２５cmヴィダック(Ｖydac)５μm粒子サ
イズのＣ４カラム[ザ・セパレーションズ・グループ・
ヘスペリア(Ｔhe Ｓeparations Ｇroup Ｈesperi
a)、ＣＡ]に直接適用し、ＴＥＡＰバッファーのグラデ
ィエントで展開する。ＴＥＡＰ系において、バッファー
Ａは０.２５Ｎリン酸トリエチルアンモニウム(pＨ３)か
らなり、バッファーＢはバッファーＡ中の８０％アセト
ニトリルで構成されている。全濾液を適用した後、ＵＶ
吸収が基線に至るまで、水性バッファーＡによりカラム
を洗浄する。インヒビン活性を示す画分をスペクトロフ
ロー(Ｓpectroflow)７５７ＵＶ検出器[クラトス・アナ
リティカル・インスツルメンツ(Ｋratos Ａnalytical
Ｉnstruments)、ラムセイ、Ｎ．Ｊ．]、ソルテック
(Ｓoltec)２２０記録計[ソルテック(Ｓoltec)Ｃorp．サ
ンバレー、ＣＡ]およびレディラック(Ｒedirac)２１１
２ フラクション・コレクター[ＬＫＢインスツルメン
ツＩnc．、ギャザースバーグ、ＭＤ]を備えたベックマ
ン２３２グラディエント液体クロマトグラフィー系[ベ
ックマン・インスツルメンツ(Ｂeckman Ｉnstruments)
Ｉnc．バークレー、ＣＡ]内で分離する。インヒビン活
性を示すゾーンをバイオアッセイによって検出する。

【００８３】所望によりさらに２段階のＲＰ−ＨＰＬＣ
を行うことにより、β_B鎖を含むインヒビンタンパク質
を精製し、β_A種を含まないインヒビンを得る。第１段
階では１×２５cmのＶydac ５μm−粒子サイズのＣ４カ
ラムとトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)バッファーとを用い、
第２段階では１×２５cm Ｖydac ５μm粒子サイズのフ
ェニルカラムとＴＥＡＰバッファー系とを用いる。ＴＦ
Ａ系において、バッファーＡは水９９９ml中にトリフル
オロ酢酸１mlを含有し、バッファーＢは水１９９mlおよ
びアセトニトリル８００ml中にトリフルオロ酢酸１mlを
含有している。２種のインヒビン種は別々に溶離され
る。いくつかのバッチから蓄積したインヒビンを０.４
６×２５cmのアクアポア(Ａquapore)ＲＦ−３００ １
０μm粒子サイズカラム[ブラウン・リー(Ｂrownlee)ラ
ボス(Ｌabs)、サンタクララ、ＣＡ]とＴＦＡバッファー
系とを用いるＲＰ−ＨＰＬＣにより濃縮した。しかしな
がら、通常、β_Aまたはβ_B鎖のみをコードしているＤＮ
Ａによる形質転換体から得た細胞培養上清については、
この精製段階は使用されない。

【００８４】インヒビン、アクティビン、プロドメイン
配列またはそれらの変異体は薬学的に許容し得る無毒な
塩類、例えば酸付加塩や、金属錯体(コンプレックス)、
例えば、亜鉛および鉄等(これらもまた、本発明の目的
においては、塩と見なされる)の形で投与される。その
様な酸付加塩の例には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、
リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香
酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、お
よび酒石酸塩等がある。等張性生理食塩水やリン酸緩衝
液等の溶液として静脈内投与するのが適当である。

【００８５】本発明のポリペプチドは医師の指導の下で
投与されるべきであり、普通、医薬組成物中には、有効
量のペプチドと通常の、薬学的に許容し得る担体とが含
まれている。投与量は、該タンパク質の投与における特
定の目的により変化し、雄性の不稔のために規則的にイ
ンヒビンを投与する場合の用量レベルは約０.１〜約１m
g／kg(体重)の範囲とすることができる。

【００８６】インヒビン、アクティビン、プロドメイン
配列およびそれらの誘導体は、埋め込み(移植)可能な、
あるいは皮膚に接着可能な、持続的放出製品から投与す
ることが望ましい。適当な系には、例えば、Ｌ−グルタ
ミン酸とガンマーエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合
体[シドマン(Ｕ．Ｓidman)ら、１９８３、“バイオポリ
マーズ(Ｂiopolymers)" ２２(１): ５４７−５５６]、
ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)[ランガ
ー(Ｒ．Ｌanger)ら、１９８１、“ジェイ・バイオメド
・マター・レス(Ｊ．Ｂiomed．Ｍater．Ｒes．)" １５:
１６７−２７７およびＲ．ランガーら、１９８２、
“ケミ・テク(Ｃhem．Ｔech．)" １２: ９８−１０
５]、エチレンビニルアセテート(Ｒ．ランガーら、同
上)、あるいはポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸(Ｅ
Ｐ１３３,９８８Ａ)等が含まれる。その様な製品は、皮
下に埋め込んだり、皮膚または粘膜と接触させる様に付
して用いられる。

【００８７】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。プラスミドは小
文字のpを先頭にし、そして／または大文字および／ま
たは数字を続けることによって表される。本発明の出発
物質であるプラスミドは市販されているか、または非制
限的な施設から一般に入手可能であり、あるいはこの様
にして入手し得るプラスミドまたはＤＮＡから、公知の
方法に従って組立てることができる。更に、その他の同
等なプラスミドも当業者には知られており、通常の技術
者にとって自明であろう。

【００８８】ＤＮＡの“消化"とは、ＤＮＡを、該ＤＮ
Ａのある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂
することを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵
素にとって特異的な部位を制限部位(サイト)と称する。
“部分"消化とは、制限酵素による不完全な消化であ
り、特定のエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質中の
部分の全てでなく、そのうちのいくつかを開裂する様な
条件を選んで行う。本発明において用いる様々な制限酵
素は市販されており、その反応条件、コファクター、お
よびその他必要なものは、酵素の供給業者の指示に従っ
て使用した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られ
た微生物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通
常、数字からなる略号で表される。一般に、特別の場合
を除き、約１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメン
トを、約２０μlの緩衝液中の約１単位の酵素と共に使
用する。特定の酵素について適当な緩衝液および基質の
量は、製造業者によって明示されている。通常、インキ
ュベーション時間は３７℃で１時間とするが、供給者の
指示に従って変えてもよい。インキュベーションした
後、フェノールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出
して除き、水性フラクションからエタノール沈澱によっ
て消化された核酸を回収する。時たま、制限酵素による
消化の後、ＤＮＡフラグメントの２つの制限的開裂末端
が“閉環(サーキュライディング)"したり、閉じたルー
プを形成することにより、該制限部位に他のＤＮＡフラ
グメントが挿入されにくくなるのを防止するために、
５'末端のホスフェートを細菌性アルカリホスファター
ゼで加水分解することがある。明示しない限り、プラス
ミドの消化には、５'末端の脱リン酸反応は伴わないも
のとする。脱リン酸の方法および試薬は常法に従う
[Ｔ．マニアティス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、１９８２、モレ
キュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)pp．１
３３−１３４]。

【００８９】制限酵素による消化によって得られたＤＮ
Ａフラグメントの“回収"または“単離"とは、この消化
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、
フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフ
ラグメントのそれと比較して所望のフラグメントを同定
し、該フラグメントを含む部分を取り除き、該ゲルから
ＤＮＡを分離することを意味する。この方法は一般的に
知られている。例、Ｒ．ローン(Ｒ．Ｌawn)ら、１９８
１、“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"９:６１０３
−６１１４およびＤ．ゲッデル(Ｄ．Ｇoeddel)ら、１９
８０“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ" ８: ４０５
７参照。

【００９０】“サザーン分析"とは、消化物中のＤＮＡ
配列またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、
既知の、標識したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラ
グメントとのハイブリダイゼーションによって確認する
方法である。本明細書中では、特に断らない限り、サザ
ーン分析という時は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)の
方法[１９７５ “ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジィ(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)" ９８: ５０３−５１
７]に従って、消化物を１％アガロース上で分離し、変
性し、そしてニトロセルロース上に移し、Ｔ．マニアテ
ィスらの方法[１９７８、“セル" １５: ６８７−７０
１]に従ってハイブリダイゼーションを行うことを意味
する。

【００９１】“形質転換"とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果、ＤＮＡが染色体外成分と
して、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを
意味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌
の形質転換法はマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl₂法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ィ" ５３: １５４)を採用する。

【００９２】“ライゲーション(結合)"とは、２個の二
本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ．マニアティスら、前掲p１４
６)。特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩
衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤ
ＮＡフラグメント０.５μg当たりＴ₄ ＤＮＡリガーゼ
(“リガーゼ")１０単位を用いて行う。

【００９３】形質転換体からＤＮＡを“調製する"と
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアティスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上p．９０)を採用する。

【００９４】“オリゴヌクレオチド"とは、短い一本鎖
または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、既知
の方法によって化学的に合成され、次いで、ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製されたものである。

【００９５】引用した文献は、参考までに全て末尾の文
献目録に示した。

【００９６】以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明
する。

【００９７】実施例１ クローン化したインヒビン・α−サブユニットcＤＮＡ
の単離 ブタインヒビンのサブユニットをコードしている配列を
含有するクローンの同定法は、いくつかの先行例[アン
ダーソン等(Ａnderson et al.)、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)、８０: ６８３６
−６８４２(１９８３)およびユルリッチ(Ｕllrich et a
l.)、ネイチャー(Ｎature)、３０９: ４１８−４２５
(１９８４)]において成功した、“長いプローブ"を用い
る方法に基づいている。簡単に説明すると、λgt１０に
おいて作成し、そしてオリゴ−dＴをプライマーとするc
ＤＮＡ合成によってブタ卵巣mＲＮＡから得た、高度に
錯綜したcＤＮＡライブラリーを、ブタインヒビンのα
−鎖のＮ−末端アミノ酸配列に向けられた６４塩基の長
さの一本鎖合成オリゴデオキシヌクレオチドでスクリー
ニングした。インヒビン鎖のmＲＮＡは明らかに不安定
であるが故に、ライブラリーを新鮮な卵巣組織から調製
すべきであるということがわかった。２０００個のプラ
ーク中約１個がこのプローブと交雑し、雑種化している
クローン化cＤＮＡ数個を配列分析してプローブ同定が
正しいことを確認した。この分析により、特徴づけられ
たcＤＮＡのすべてが、α−鎖の前駆体タンパク質の完
全な構造を予想するための十分な配列情報を含んでいな
いことがわかった。同一のcＤＮＡライブラリー由来の
さらに多くのクローンを分析する代わりに、α−前駆体
残基６０−６４(図１)をコードする配列化領域に相補的
な合成オリゴヌクレオチドの卵巣mＲＮＡ上の３'側延長
によって第２のライブラリーを作成した。このライブラ
リーを、予め分析しておいたcＤＮＡからの適当な制限
フラグメントでスクリーニングし、α−前駆体のＮ−末
端領域をコードするＤＮＡ配列の残りを指定する数個の
単離体を得た。このコード化配列の完全性を、ブタα−
鎖ペプチド配列を指定し、そしてメチオニンコドン(前
にフレーム内停止コドンを有し、後ろにシグナルペプチ
ドの特質を備えた疎水配列が続く)で開始する長いリー
ディング・フレームの存在によって判定した。この前駆
体タンパク質およびそのcＤＮＡの完全配列を図２およ
び図３に示す。シグナルペプチドを含有する完全なタン
パク質は、３６４個のアミノ酸からなり、〜４０ＫのＭ
r値を有し、このうちＣ末端側の１３４個(Ｍr〜１４.５
Ｋ)はブタインヒビンα−鎖を構成する。前駆体のプロ
領域にはＡrg−Ａrg配列が数個存在し、そのうちの１個
はα−サブユニットの前に直接して存在する。この塩基
残基の後者の対がタンパク質加水分解によるα−ペプチ
ド放出のプロセシング部位であると我々は考えている。
この推定の前駆体配列により、２つのＮ−連鎖グリコシ
レート化部位が予想され、その１つはα鎖プロパー内に
あると予想される。

【００９８】コード領域に加え、このcＤＮＡ配列は１
６７個のヌクレオチドからなる３'−非翻訳配列(正規の
ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルを含有する)、お
よび５'−非翻訳領域(この領域の正確な長さは現在わか
っていない)。

【００９９】この方法の詳細は以下のようである。ポリ
アデニル化したmＲＮＡを、新鮮なうちに凍結させたブ
タ卵巣から調製した[カプラン等(Ｋaplan et al.)、ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｊ．Ｂioche
m．)、１８３: １８１−１８４]。用いたＥcoＲＩアダ
プターが配列:

【化１０】 ５'−ＡＡＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＣ−３' ３'−ＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧ−５'Ｐ を有するものであること以外は、ウッド等[Ｗood et a
l.、ネイチャー(Ｎature)、３１２: ３３０−３３７(１
９８４)]の開示のようにして、ポリＡ＋mＲＮＡ５μgか
らλgt１０において〜６×１０⁶クローンのオリゴ−dＴ
プライマー処理したcＤＮＡライブラリー[ヒューイン等
(Ｈuynh et al.)、ＤＮＡ・クローニング・テクニック
ス(ＤＮＡ clonig Ｔechniques)、クローバー(Ｄ．Ｃ
lover)編、１９８４]を調製した。

【０１００】約１×１０⁶の未増幅 cＤＮＡ クローン
を、図２および図３で下線を引いたアミノ酸配列に基づ
く、５α−サブユニット・オリゴヌクレオチド:

【化１１】５'−ＡＣＣＧＣＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧ
ＧＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡ
ＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧ−３' でスクリーニングした。交雑は、５×ＳＳＣ、４０％ホ
ルムアミド中、３７℃で、ホスホリル化した³²Ｐラベル
化プローブを用いて行った。交雑が陽性であるクローン
約５００個が得られ、そのうち１２個を精製し、挿入の
大きさについて試験した。これらのうち５個のＥcoＲＩ
総入隊(λＰＩＮ−α２、−α５Ａ、−α５、−α９、
−α１０)をＭ１３誘導体[メシング等(Ｍessing et a
l.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl．Ａcid
s．Ｒes．)、９: ３０９−３２１(１９８１)]にサブク
ローンし、サンガー等[Ｓanger et al.、Ｐroc．Ｎat．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、７４: ５４６３−５４６７(１９
７７)]のジデオキシ鎖停止法によって配列決定した。特
異的にプライマー処理されたライブラリーを、ポリＡ＋
mＲＮＡ ５μgをオリゴヌクレオチド：

【化１２】 ５’−ＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴ−３' (ヌクレオチド２４８−２６３に相補性)でプライマー処
理し、次いで、λgt１０にクローニングすることによっ
て調製した。得られた１×１０⁶クローンのうち約２×
１０⁵クローンを、λＰＩＮ−α２から調製した５' １
００bp ＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントでスクリーニ
ングした。得られた交雑が陽性であるクローン１７０個
のうち１２個について精製を行い、２個(λＰＩＮ−Ｓ
１２s、−Ｓ４s)についてジデオキシ法で配列決定し
た。α−サブユニットcＤＮＡの完全なヌクレオチド配
列は、異なるλ単離体からの種々の制限フラグメントを
Ｍ１３ファージ誘導体にサブクローンすることによって
得られた。Ｅ．コリの一本鎖結合タンパク質(ファーマ
シア)と組み合わせてデオキシイノシン混合物を用いる
ことによって圧縮体を溶解した。

【０１０１】クローン化したインヒビン・β−サブユニ
ットcＤＮＡの単離 インヒビン・β−サブユニットの前駆体をコードしてい
るcＤＮＡ配列は、α−サブユニットの際に用いたもの
と同一のcＤＮＡライブラリーから得られた。重なり合
うcＤＮＡクローンは、始めに２つのＮ−末端・β−サ
ブユニット配列に基づく単独の長い合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドのプローブでスクリーニングし、次いで、
５'および３'の両方向に“歩く"プローブとして働く、
特徴づけがなされたcＤＮＡクローン由来の適当な制限
フラグメントでスクリーニングすることによって単離し
た(図４)。

【０１０２】より詳細に説明すると、約２×１０⁵のオ
リゴ−dＴプライマー処理した卵巣cＤＮＡクローンを、
残基３２１〜３３９のアミノ酸配列に基づく５'末端標
識化β_Aオリゴヌクレオチド:

【化１３】５'−ＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＴ
ＧＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴ
ＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣ−３' でスクリーニングした。交雑が陽性であるものが５つ得
られ、そのうちの３つが、β_Aコード化配列(λＰＩＮ−
β_A２、−β_A４、−β_A８)を含有することを証明した。
λＰＩＮβ_A２由来の３'末端２１３bp ＥcoＲＩ−Ｐst
フラグメント(ヌクレオチド１６７９−１８９２)および
５'末端１５４bp ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ(ヌクレオチド
１５８−２９７)を用いて、α−鎖の特異的プライマー
処理ライブラリーからの２×１０⁵クローンおよび２×
１０⁶オリゴ−dＴプライマー処理化cＤＮＡクローンを
スクリーニングした。詳細に分析した１６のクローンの
他に、２つがより大きい５'末端を有することがわかり
(λＰＩＮ−β_A５Ｓ、−β_A２２)、そして１つのクロー
ン、λＰＩＮ−β_A２１は完全な３'−非翻訳領域を含有
していた。ブタインヒビンβ_BサブユニットcＤＮＡクロ
ーンは、特異的にプライマー処理したライブラリーから
の２×１０⁵クローンを、図１に記載されているＮＨ₂−
末端配列に基づくβ_Bオリゴヌクレオチド:

【化１４】５'−ＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧ
ＧＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧ
ＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＧＣＴ−
３' でスクリーニングすることによって単離した。陽性を示
したクローンについては、さらにオリゴヌクレオチド・
イノシン・プローブ:

【化１５】 [配列中、Ｉはイノシンを表す]でスクリーニングした
(これは、アミノ酸配列: ＱＱＦＦＩＤＦのための非コ
ード化鎖におけるすべての可能性をカバーしている)。

【０１０３】２種のクローン(λＰＩＮβ_B−１Ｓ、−２
Ｓ)を単離し、配列決定し、β_Bサブユニットをコードし
ていることを確認した。２３０bpのＥcoＲＩ−Ｓma(ヌ
クレオチド２１−２５１)フラグメントをλＰＩＮβ_B−
Ｉから単離し、これを交雑プローブとして用いて２×１
０⁶オリゴ−dＴプライム処理したcＤＮＡクローンをス
クリーニングした。陽性を示したものが２種類得られた
(λＰＩＮβ_B−３,４)。これらの重なり有ったクローン
のヌクレオチド配列を用いて、示されている配列を作成
した。すべての配列は、特異的なフラグメントをＭ１３
ファージベクター[メシング等、前記]にサブクローニン
グすることによって得た。上記に記載したＥcoＲＩ制限
部位はすべてcＤＮＡアダプターフラグメント中に含ま
れており、cＤＮＡ中に存在する配列を意味するもので
はない。

【０１０４】オリゴ−dＴプライマー処理したライブラ
リー由来の極めてわずかのクローン(２×１０⁵のうち４
つ)だけがインヒビンＡのβ−サブユニット用の合成プ
ローブと交雑することに我々は気付いた。これらのほと
んどはＤＮＡ配列分析によって正しいことが証明された
が、その３'末端においてポリＡホモポリマーがないこ
とから判断する限り、完全な３'−非翻訳化領域を含有
するものは全くない。ポリＡの尾部がないことは、ライ
ブラリー作成用に用いるポリメラーゼによって複製する
ことが困難であることを示す構造領域および／またはこ
のmＲＮＡ片における極めて長い３'−未翻訳化配列の存
在を示唆した。より多量(〜１０倍)のインヒビンβ_Aサ
ブユニットコード化配列が、予想外に、α−サブユニッ
トmＲＮＡ上を特異的にプライマー処理して作成したcＤ
ＮＡライブラリー中に見い出された。このライブラリー
を、α前駆体mＲＮＡがβサブユニットをもコードして
いるであろうという間違っていることが後に証明された
理論に基づいて、インヒビンＡのβ−鎖用の合成プロー
ブでスクリーニングした。このライブラリーにおける極
めて多量のインヒビンβ_A cＤＮＡを、後に、対応するm
ＲＮＡの３'−非翻訳化部分中の領域に対する、この特
異的なα鎖プライマーの偶然の相補性までトレースし
た。

【０１０５】我々のライブラリーにおいては、インヒビ
ンＢのβサブユニットをコードしているクローン化cＤ
ＮＡが４つだけ見い出された。これらのクローンから得
られた配列情報によっては、対応する前駆体タンパク質
およびそのcＤＮＡの完全な構造を明らかにすることが
できなかった。βサブユニットの前駆体の推定タンパク
質構造およびcＤＮＡ配列を図５、図６、図７および図
８において比較する。インヒビンβ_AサブユニットcＤＮ
Ａのヌクレオチド配列は、その長さが３.６kbであり、
４２５アミノ酸からなるタンパク質(Ｍr〜４６Ｋ)のた
めのオープン・リーディング・フレーム[このうちＣ−
末端側１１６残基はβサブユニットプロパー(Ｍr〜１３
Ｋ)を表している]を含有している。このリーディング・
フレームはメチオニンで始まり、特徴的なシグナルペプ
チドをコードする配列がこれに続き、その真の長さは２
９残基であると考えられている。このコードされたβサ
ブユニットの前には一連の５個のアルギニンが存在し、
この位置でタンパク質加水分解的に前駆体から切断され
るものと推定される。αサブユニット前駆体と同様に、
このβ前駆体は数個の付加的な塩基残基対を含有し、こ
こで今まで未知であった生物学的に活性なペプチド物質
が放出されるものと考えられる。また、プロ領域(Ａs
n、残基１６５)にはＮ−結合グリコシル化が可能な部位
が１個含まれている。

【０１０６】インヒビンＢのβサブユニットのこの推定
タンパク質配列は、β_Aサブユニット配列との高度な相
同性を示す。７１個のアミノ酸残基が同一であり、ほと
んどの変化はコンサーバティブ(保存的)なものである。
比較的程度は少ないが、配列相同性は両方のβサブユニ
ット前駆体のプロ領域にも見い出される。興味あること
に、極端にプリンに富む配列はコード化領域にはめった
に見られないが、このインヒビンβ_A前駆体をコードし
ているcＤＮＡ中には存在し、相同のβ_B前駆体をコード
しているcＤＮＡ中には見い出されることのない珍しい
アミノ酸配列になる。このことは、タンパク質配列を相
同性が最大になるように並べたときに、インヒビンのβ
_B前駆体由来の２２アミノ酸残基の欠陥となる。また、
このように並べると、両前駆体のシステイン位置に完全
な好一対をも生じさせる(図５、図６、図７および図８
を参照)。

【０１０７】αおよびβ鎖前駆体mＲＮＡのノーザン分
析 卵巣の全ての、そしてポリアデニル化したＲＮＡを、配
列決定されたcＤＮＡをプローブとして用いるノーザン
法で分析して、ヘテロダイマー性インヒビン分子のβ_B
およびペプチドサブユニットαおよびβをコードしてい
るmＲＮＡのサイズおよび相対的豊富さについて評価し
た。ポリアデニル化したmＲＮＡ(２μg:レーンa、b、c
およびf; ８μg: レーンd)および全ＲＮＡ(１０μg: レ
ーンeおよびg)をホルムアルデヒド１.２％アガロースゲ
ルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルターにプロッ
トした。以下に挙げる³²Ｐ−標識化したcＤＮＡフラグ
メントを、厳格な条件下、交雑プローブとして用いた。
レーンa: αサブユニットcＤＮＡからの２４０bp Ｅco
ＲＩ−ＳmaＩ(ヌクレオチド１３４−３７１); b: β_Aサ
ブユニットcＤＮＡからの１５４bp ＥcoＲＩ−ＨindＩ
ＩＩ(ヌクレオチド１５８−２９７); Ｃ: β_Bサブユニ
ットcＤＮＡからの２３０bp ＥcoＲＩ−Ｓma(ヌクレオ
チド２１−２５１); dおよびe: λＰＩＮ−α２のＥco
ＲＩ挿入体; fおよびg: λＰＩＮ−β_A５のＥcoＲＩ挿
入体。０.１Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを３回交換し
て、６０℃で２時間フィルターを洗浄した。

【０１０８】cＤＮＡクローニングから得られる結果で
示されるように、αおよびβmＲＮＡが異なる大きさお
よび量を有するものであることが分析によってわかった
(図９)。それぞれのバンドの強さからα前駆体mＲＮＡ
は、β_A前駆体のmＲＮＡに比べ少なくとも１０倍以上の
量であり、かつβ_B前駆体のmＲＮＡに比べ約２０倍以上
大きい量であると概算される。

【０１０９】リボソームＲＮＡを大きさの標準として用
いると、単一の種であるこのα前駆体mＲＮＡはその長
さが〜１５００ヌクレオチドであり、これはクローン化
したcＤＮＡ配列とよく一致する大きさである(図２およ
び図３)。β_A前駆体mＲＮＡ配列は、長さが〜４.５およ
び〜７.２kbである２つの主な種で表される。全ＲＮＡ
に比べポリアデニル化したＲＮＡにおいての方が両方の
種の強度が高いことは、この４.５kbの種が、cＤＮＡプ
ローブと交雑する２８Ｓ ＲＮＡを表すものではないこ
とを示唆する。従って、図５、図６、図７および図８で
示されるβ前駆体cＤＮＡ配列が４.５kbのmＲＮＡを表
すと考えられ、β_AmＲＮＡの５'非翻訳化領域が約９０
０ヌクレオチドの長さであることを示唆する。このβ_B
前駆体は、大きさが約４.５kbである１つのmＲＮＡ以上
にコードされており、２つのβ_A mＲＮＡの約半分のレ
ベルで存在する。この２つのβmＲＮＡは密接に関係し
ているので、両mＲＮＡが同じ構造を有し、従って、こ
のβ_B mＲＮＡが恐らく長い５'および３'非翻訳化領域
(β_A mＲＮＡについて示されるものと同じ領域)を有す
るであろうということを予想することができる。異なる
ポリアデニル化シグナルを選択すれば７.２kbの種の存
在を説明しうるであろう。

【０１１０】形質転換成長因子−βとの相同性 完全なαおよびβインヒビンサブユニットはそれぞれ７
および９個のシステイン残基を含有している。システイ
ン残基を並べると、この２つのサブユニットが同様のシ
ステイン分布を分け合っており、そして、ある配列相同
性がこの残基のまわりに存在していること(図１０およ
び図１１)が明らかであり、両種類のサブユニットが１
つの前駆遺伝子に由来することを示唆している。驚くべ
きことに、このβ鎖と最近決定されたヒトＴＧＦ−βの
一次構造との間にかなりの相同性が見い出された。図１
０および図１１中に下線を引いたように、両ペプチドは
ほぼ等しい長さであり(インヒビンβ_Aサブユニット:１
１６;β_Bサブユニット:１１５;ＴＧＦＳ:１１６残基)、
それらのシステイン残基９個の著しく類似した分布を示
す。並べかえにこのシステイン“骨格"を用いると、こ
のβ_AおよびＴＧＦ−β配列は同一位置に３１個の付加
的な残基を有し、９つの相同場所にわずかな差異を示
す。同様の相同性の高さはβ_Bとβ−ＴＧＦの比較にお
いても見られる。よりうまく並べるためにある空白を導
入した(図１０および図１１)。全体の相同性は３５％で
あるが、ある部分(ブタインヒビンβ_A鎖残基１１〜４５
とＴＧＦ残基１５〜４９を比較して)では６０％に達
し、種の違いを考慮するとその相同性は極めて高い。興
味あることに、この相同性はそれぞれのcＤＮＡ中のタ
ンパク質合成のための停止コドンを越えて延びている。
従って、このＴＧＦ−βのcＤＮＡおよび両方のインヒ
ビンβサブユニットは極めてＧとＣに富む配列をこの領
域に含有し、またこれらは異常に長い５'および３'非翻
訳化領域を有している。

【０１１１】ヒトおよびネズミのβ−ＴＧＦの間にはほ
とんど絶対的な相同性が存在するので、インヒビンのβ
サブユニットがヒトＴＧＦ−βのブタ等価物であるとい
うこの示唆を割り引いて考えることができる。これらの
知見は、インヒビンサブユニットとＴＧＦ−βの両者が
共通の祖先を有し、１種類の遺伝子の族に属するという
ことを強く示している。３種のペプチドすべては、同様
の大きさの前駆体(Ｍｒ〜４０Ｋ）から生じる(それらは
Ｃ−末端の１１０残基程度を占め、アルギニン対の所で
タンパク質加水分解切断によって放出される)。それら
はホモまたはヘテロダイマーを形成し、生物学的に活性
な複合体中のサブユニットはジスルヒド架橋で結合す
る。しかし、βサブユニットおよびＴＧＦペプチドの前
にある普通ではない残基を含有する領域は、制限されて
いるとはいえかなりの配列関連性を示すが、ＴＧＦ−β
とβサブユニット間には、それらの前駆体のプロ部分に
おいては配列相同性が少ししか存在しない。

【０１１２】実施例２ ブタインヒビンの組換え合成 ブタインヒビンの組換え合成に用いたプラスミドはpＳ
ＶＥ−Ｐ_αＢ_AＩnh−ＤＨＦＲである。このプラスミド
の構築法を図１２、図１３および図１４に示すが、これ
を以下のようにして行った。pＨＢＳ３４８−Ｅ(ＥＰ０
０７３６５６Ａ)をＥcoＲＩで部分消化し、Ｅ．コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩ(クレノウフラグメント)および４種
のdＮＴＰで平滑にし、ライゲートし、そしてライゲー
ション混合物をＥ．コリ２９４(ＡＴＴＣ３１４４６)に
導入して形質転換した。この形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選別
した。ＳＶ４０初期プロモーターの前にあるＥcoＲＩ部
位の欠失に対してプラスミドをスクリーニングした。こ
の欠失部位を有するプラスミドをpＨＢＳ３４８−ＥＩ
Ｉと称する。

【０１１３】pＨＢＳ３４８−ＥＩＩをＥcoＲＩおよび
ＥcoＲＩで消化して２種のフラグメント、すなわちＳＶ
４０初期プロモーター、pmＬ−Ａmp^r配列およびＨＢsＡ
g３'非翻訳化領域を含有するフラグメントＩ、並びにＨ
ＢsＡg(肝炎Ｂ抗原)コード化配列を含有するフラグメン
ト２を得た。

【０１１４】ブタインヒビンβ_Aサブユニットのコード
化領域を含有するλＰＩＮβ_A５sをＥcoＲＩおよびＳma
Ｉで消化し、β_Aコード化領域を含有する１３３５bpの
フラグメント(フラグメント３)をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で回収した。アガロースゲル電気泳動で回収
したフラグメントＩをフラグメント３にライゲートし、
このライゲーション混合物をＥ．コリ株２９４(ＡＴＣ
Ｃ ３１４４６)に導入して形質転換した。この形質転
換培養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養し、
耐性コロニーを選別した。プラスミドＤＮＡを形質転換
体から調製し、制限分析によって正しいＤＮＡフラグメ
ントの存在を確認した。このプラスミドをpＳＶＥ−pβ
_AＩnhと称する。

【０１１５】pＨＢＳ３４８−Ｅ(ＥＰ ００７３６５６
Ａ)をＥcoＲＩで部分的に消化し、Ｅ．コリＤＮＡポリ
メラーゼＩ(クレノウフラグメント)および４種のdＮＴ
Ｐで平滑にし、ＳalＩ認識部位を含有する合成オリゴヌ
クレオチド:

【化１６】５'−ＧＧＴＣＧＧＡＣＣ−３' にライゲートした。この形質転換培養物をアンピシリン
培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選別し
た。プラスミドを余分のＳalＩ制限部位の存在について
スクリーニングした。プラスミドＤＮＡをこの構築物か
ら調製した(pＨＢＳ３４８−ＥＳalＩ)。

【０１１６】λＰＩＮα−１２sおよびλＰＩＮα−２
をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化した。５'コード化領
域を含有するλＰＩＮα−１２sからの１０４bp ＥcoＲ
Ｉ−ＢamＨＩフラグメントおよび中央部分と３'コード
化領域を含有するλＰＩＮα−２からの１２４６bp Ｅc
oＲＩ−ＢamＨＩを回収し、一緒にしてライゲートし
た。このライゲーション混合物をＥcoＲＩで消化し、酵
素を熱変性し、混合物をＥcoＲＩ消化したpＵＣ９(ＢＲ
Ｌ)にライゲートした。組換え体を選別し、制限分析に
よって確認した。ＤＮＡを正しいプラスミドから調製し
た(pＰＩＮα)。

【０１１７】ブタα−インヒビンの完全なコード化領域
を含有するpＰＩＮαをＮcoＩおよびＥcoＲＩで消化
し、４dＮＴＰの存在下、Ｐol(Ｉ)Ｋで充填し、１２８
０bpのフラグメント(フラグメント４)をゲル電気泳動で
回収した。pＨＢＳ３４８−ＥＳalＩをＳstＩＩおよび
ＨindＩＩＩで消化し、４dＮＴＰの存在下、Ｐol(Ｉ)Ｋ
で充填し、ＰＭＬ−Ａmpr領域、ＳＶ４０初期プロモー
ターおよびＨＢsＡg３'非翻訳化領域を含有するフラグ
メント５をゲル電気泳動で回収した。フラグメント４お
よび５を一緒にしてライゲートし、このライゲーション
混合物を用いてＥ．コリ２９４(ＡＴＣＣ ３１４４６)
を形質転換した。組換え体をアンピシリン培地プレート
上での増殖によって選別した。目的の組換え体をpＳＶ
Ｅ−ＰαＩnhと称する。

【０１１８】pＨＢＳ３４８−ＥＳalＩをＳalＩおよび
ＨindＩＩＩで消化し、pＭＬ−ＡmprおよびＳＶ４０初
期プロモーターを含有するフラグメント６をゲル電気泳
動で回収した。pＦＤＩＩ(ＥＰ １１７,０６０Ａ)をＳa
lＩおよびＨindＩＩＩで消化し、ＨＢsＡg３'非翻訳化
領域と融合した正常なマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する
フラグメント７を回収した。フラグメント６および７を
ライゲートし、このライゲーション混合物でＥ．コリ株
２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換した。この形質
転換培養物をアンピシリン培地プレート上で平板培養
し、耐性コロニーを選別した。プラスミドＤＮＡを形質
転換体から調製し、制限分析によって正しいＤＮＡフラ
グメントの存在を確認した。この構築物をpＦＤＩＩ−
ＳalＩと称する。

【０１１９】pＳＶＥ−ＰαＩnhをＳalＩで消化し、Ｈ
ＢsＡg３'非翻訳化領域と融合したα−インヒビンコー
ド化領域およびＳＶ４０初期プロモーターを含有するフ
ラグメント８を回収した。pＦＤＩＩ−ＳalＩをＳalＩ
で消化し、ＨＢsＡg３'非翻訳化領域と結合したマウス
ＤＨＦＲコード化領域およびＳＶ４０初期プロモーター
を含有するフラグメント９を回収した。pＳＶＥ−β_AＩ
nhをＳalＩ消化して直線化し、フラグメント８および９
と３成分ライゲーションでライゲートした。このライゲ
ーション混合物でＥ．コリ株２９４(ＡＴＣＣ３１４４
６)を形質転換した。この形質転換培養物をアンピシリ
ン培地プレート上で平板培養し、耐性コロニーを選別し
た。３つのＳＶ４０初期プロモーターからの転写が同一
の方向に進行するように、フラグメント８および９が正
しい方向で存在しているかどうかについて形質転換体を
スクリーニングした。この最終のプラスミドをpＳＶＥ
−Ｐαβ_AInh−ＤＨＦＲと称する。

【０１２０】プラスミドpＳＶＥ−Ｐαβ_AＩnh−ＤＨＦ
ＲをＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞[ウルラウブおよびチャー
ジン(Ｕrlaub and Ｃhasin)、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Ｐ
ＮＡＳ)、７７、４２１６−４２２０(１９８０)]中にト
ランスフェクションした。しかし、すべてのＤＨＦＲ^-
哺乳動物宿主細胞がこのプラスミドの使用に適してい
る。あるいはまた、宿主細胞をネオマイシン耐性をコー
ドしているプラスミドで同時形質転換するときには、す
べての哺乳動物宿主細胞が使用でき、この場合、形質転
換体は、ネオマイシン含有培地において増殖しうるその
能力によって同定される。

【０１２１】このトランスフェクションしたＣＨＯ細胞
を１５ＨＧＴ^-培地で培養して選別した。この細胞を直
径１５cmのプレート中、集密状態になるまで増殖させ
た。次いで、細胞を集める前に、血清を含まない培地で
４８時間培養した。ヒト血清アルブミン１００mgを加え
た後、上清培地５０mlを凍結乾燥した。残留物を１％ウ
シ胎児血清のＨＤＭＥＭ[ギブコ・ラボラトリーズ(ＧＩ
ＢＣＯ Ｌaboratories)、Ｓanta Ｃlara、ＣＡ]溶液
３mlに再溶解し、マイレックス−ＧＳ ０.２２mＭフィ
ルター[Ｍillex−ＧＳ、ミリポアー社(Ｍillipere Ｃo
rp．)、Ｂedford、ＭＡ]で濾過し、正副対で検定した。

【０１２２】形質転換体上清におけるインヒビンのホル
モン様活性を、ラット下垂体前葉単層培養物を用いる試
験管内バイオアッセイによって測定した[ベール等(Ｖal
e,Ｗ．et al.)、エンドクリノロジー(Ｅndocrinolog
y)、９１、５６２−５７２(１９７２)]。簡単に説明す
ると、生後２１日目の雌ラット下垂体前葉を集め、酵素
的に分散し、１日目は２４−ウエル組織培養プレート
[ファルコン・プラスチック(Ｆalcon Ｐlastic)、Ｏxn
ard、ＣＡ]に入れ、１０％ウシ胎児血清のＨＤＭＥＭ
(前記)溶液中で平板培養した。２日目に培地１％ウシ胎
児血清のＨＤＭＥＭ溶液に交換し、形質転換体培地試料
を加え、さらに４８時間インキュベーションを続けた。
次いで、この単層培地を集め、“ＮＩＡＤＤＫＤの下垂
体ホルモンプログラム"から入手した材料を用い、放射
線免疫検定(ＲＩＡ)によってＬＨおよびＦＳＨ含量を測
定した。この検定において、インヒビンを含有するＣＨ
Ｏ細胞培養物は、インキュベーション培地だけを与えた
対照下垂体細胞と比較すると、基礎的なＦＳＨの放出を
阻害するが、ＬＨは阻害しない。形質転換体上清中で検
知されたブタインヒビンの量は２０ng／mlであり、純粋
なブタ卵巣インヒビンで得られた用量−反応曲線に相応
する曲線を示した。

【０１２３】免疫学的な交叉反応性をサンドイッチ型放
射線免疫検定によって検定する。フロイントの完全アジ
ュバント中、ブタインヒビンをウサギに経皮投与するこ
とによって免疫化し、精製ブタ卵胞インヒビンに対する
ウサギ抗血清を高める。抗血清中の抗インヒビンの存在
は、抗血清を精製ブタインヒビンとともにインキュベー
ションし、常法、例えばゲル濾過によって免疫複合体の
生成を検定して測定する。この抗血清の一部を、ヤギ−
抗−ウサギＩgＧを予め塗布したポリスチレン試験管に
塗布する。組換え培養物上清あるいは抽出物をリン酸緩
衝食塩水で希釈し、上記の塗布試験管に加え、一晩イン
キュベートし、洗浄する。ウサギ抗血清の別の一部をこ
の試験管に加え、インキュベートし、洗浄する。放射線
ヨウ素化したヤギ抗ウサギＩgＧをこの試験管に加え、
インキュベートし、未結合のヤギ抗血清を洗浄して除去
する。試験管での結合数から明白であるように(これ
は、非形質転換宿主細胞からの抽出物または培養培地で
インキュベートした対照群のそれを上回る)、この組換
えによって生成したインヒビンはウサギ抗血清と交叉反
応する。

【０１２４】実施例３ ヒトインヒビンベクターの構築および組換え細胞培養物
−Ｉ中でのヒトインヒビンの発現 完全なブタおよびヒトβ_A鎖が同一であるという発見に
より、ヒトインヒビンαβ_Aの発現は容易である。すな
わち、ヒトインヒビン発現用ベクターの構築は、ブタβ
_AをコードしているcＤＮＡを含有する、実施例１のプラ
スミドpＳＶＥ−β_Aから行うことができる。

【０１２５】卵巣mＲＮＡ１０μgから調製したヒト卵巣
cＤＮＡのλgt１０ライブラリーを、α、β_Aおよびβ_B
鎖をコードしている放射線リン酸標識化ブタcＤＮＡを
用いて、サザン分析にかけた。λＨＩＮα−２はヒトα
インヒビン鎖のコード化領域を含有することが確認され
た。ヒトαインヒビンの場合の雑種化クローンの割合
は、ブタαインヒビンについて見い出されるそれよりか
なり低く、αＩnh用のブタcＤＮＡの６８５bp ＳmaＩフ
ラグメントと交雑したヒトクローン１００,０００個
中、１個の位である。β鎖クローンもまれであり、β_B
クローンはβ_Aの約３倍量存在する(クローン１,０００,
０００個中、それぞれ１個および３個である)。β鎖ク
ローンのすべては完全な長さのものではない。これらを
プライマー処理したcＤＮＡライブラリーで補充し、通
常ブタcＤＮＡについて上記したようにして組立てた。
このλ挿入体をＥcoＲＩ消化して回収した。

【０１２６】プラスミドpＨＩＮα−２をＮcoＩおよび
ＳmaＩで消化し、ゲル電気泳動によって１０４９bp１５
フラグメント(フラグメント１０)を回収した。pＰinα
(実施例２)をＥcoＲＩおよびＰvuＩＩで消化した。９８
bpフラグメント(フラグメント１１)をゲル電気泳動によ
って回収した。フラグメント１０および１１をアダプタ
ーＩ:

【化１７】５'−ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＴ
ＧＧＣＣＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ
ＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣ−３' に、アダプターＩの相補体であるアダプターＩＩと組み
合わせてライゲートした。得られた１２０８bpフラグメ
ント(フラグメント１２)を４dＮＴＰおよびＰol(Ｉ)の
クレノウフラグメントで処理し、ＨindＩＩＩおよびＳa
cＩＩで制限消化して実施例１に記載のようにして平滑
末端にしておいたpＨＢＳ３４８−ＥＳalＩにライゲー
トした。別法では、ＨpaＩＩ部位の上流(すなわち、ブ
タ配列の最初の２１残基)をコードしているフラグメン
トを回収しながら、pＰinαをＥcoＲＩおよびＨpaＩＩ
で消化した。この別法において用いたアダプターを以下
に示す：

【化１８】５’ＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣ３' ３' ＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧ５' 正しく配向したフラグメント１２を有するプラスミドp
ＳＶＥ−ＨαＩnhを形質転換体の配列文節によって同定
した。従って、この構築物(pＳＶＥ−ＨαＩnh)は、ブ
タシグナル配列の最初の２４残基を、プレプロヒトイン
ヒビンである残部とともに含有する。プラスミドpＳＶ
Ｅ−Ｈα鎖ＩnhをＳalＩで消化した。ＳＶ４０プロモー
ターおよびヒトインヒビン配列を含有するフラグメント
を、フラグメント９およびＳalＩ消化したpＳＶＥ−β_A
Ｉnh(実施例２)にライゲートした。pＳＶＥ−hαβ_AＩn
h−ＤＨＦＲ１と称するこの最終プラスミドをＤＨＦＲ
欠失のＣＨＯ細胞中にトランスフェクションし、実施例
２に記載のようにして選別した。この培養物の上清はホ
ルモン的に活性なヒトインヒビンを含有していた。

【０１２７】実施例４ ヒトインヒビンベクターの構築および組換え細胞培養物
−ＩＩにおけるヒトインヒビンの発現 本実施例は、ブタβ_Bプレプロ領域の代わりにヒトイン
ヒビンβ_Bのプロ配列を用いること以外は実施例３と同
様である。

【０１２８】実施例３のラムダgt１０ライブラリーは、
実施例３に記載したように、λＨＩＮα２を、λＨＩＮ
β_A−５および−１４とともに生成した。この後者２種
類のファージを用い、λＨＩＮβ_A−５の３１１bp Ｅc
oＲＩ−ＨindＩＩＩフラグメント(フラグメント１３)を
λＨＩＮβ_A−１４の１１０１bp ＨindＩＩＩ−ＨpaＩ
フラグメント(フラグメント１４)にライゲートし、この
混合物をＥcoＲＩ−ＳmaＩ消化したmp１８ベクター(バ
イオラブズ)中でライゲートして、完全長さのβ_Aコード
化cＤＮＡを構築した。クローンを適切な大きさの挿入
体についてスクリーニングし、選別した。二本鎖にする
ため、正しい挿入体を含有するmp１８ベクターをＤＮＡ
ポリメラーゼ(Ｉ)および４種のdＮＴＰで処理し、次い
で、ＸbaＩで消化し(これはmp１８ポリリンカー配列内
を切断する)、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび４種のdＮＴ
Ｐで平滑にし、そしてＥcoＲＩで消化した。１３２０bp
のフラグメント(フラグメント１５)を、実施例２のＥco
ＲＩ−ＥcoＲＶフラグメント１にライゲートした。この
ライゲーション混合物を用いてＥ．コリ２９４細胞を形
質転換した。クローンをサザン・ハイブリダイゼーショ
ンでスクリーニングし、制限分析で確認した。hＩnhβ_A
コード化配列を含有するこのクローンをpＳＶＥ−humβ
_AＩnhと称する。ヒトβ_Aコード化配列およびヒトα−イ
ンヒビン配列をＤＨＦＲ遺伝子とともに含有するプラス
ミドを、上記に略述したようにしてプラスミドpＳＶＥ
−humβ_AＩnh、pＳＶＥ−ＨαＩnhおよびpＦＤＩＩＳal
Ｉから構築する。すなわち、ヒトαインヒビンおよびＤ
ＨＦＲ遺伝子を含有するpＦＤＩＩＳalＩおよびpＳＶＥ
−ＨαＩnh由来のＳalフラグメントをＳalＩ消化したp
ＳＶＥ−humβ_AＩnhとライゲートし、３種の遺伝子全部
を含有するクローンを同定した。pＳＶＥ−humαβ_A Ｉ
nh−ＤＨＦＲ２と称するこのプラスミドをＤＨＦＲ^-Ｃ
ＨＯ細胞中にトランスフェクションし、ght^-培地で培養
して選別した。２４のクローンを取り出し、ＣＨＯ細胞
に対する通常の条件下、ght^-培地で２日間集密状態にな
るまで増殖させ、さらに２日間そのままにしておき、次
いで、この培養培地を、上記のラット下垂体細胞検定を
用いてインヒビンおよびアクチビン活性について検定し
た。４つのクローンがかなりの量のヒトαβ_Aインヒビ
ンを分泌することがわかった(hαβ_A−８、１２、１４
および１８)。クローンそれぞれの培養培地中のレベル
はそれぞれ１２５、１２５、２００および２５０ng／ml
であった。別のクローン(hαβ_A−１１)は、このクロー
ンについて培養培地におけるα鎖免疫反応性の欠如およ
び生物学的活性によって測定する限り、検知しうるイン
ヒビンは全く産生しないが、β_Aβ_Aホモダイマーとして
アクチビンを産生した。クローンhαβ_A−１６はα鎖だ
けを分泌し、アクチビンまたはインヒビン活性を欠いて
いた。

【０１２９】実施例５ ヒトアクチビンの組換え発現 ベール等(Ｖale et al.、同じ)およびリング等(Ｌing e
t al.、同じ)が報告しているように、β鎖Ａおよび／ま
たはＢのホモダイマーおよびヘテロダイマーは、下垂体
においてインヒビンの逆効果を有し、ＦＳＨを阻害する
よりむしろ誘起する。これらのタンパク質を一括してア
クチビンと称するが、これらを実施例４に記載したよう
にして、αおよびβ鎖共形質転換体において調製する。
しかし、最初のトランスフェクションがα鎖遺伝子を含
有しないベクターあるいはベクター群で行なわれたとき
には、適切な形質転換体を探すためのスクリーニングは
幾分少なくてもよい。適切なベクターは、上記のベクタ
ーからα鎖遺伝子を切除することによって容易に構築さ
れる。実施例４からのプラスミドpＳＶＥ−humβ_AＩnh
をＳalＩで消化し、ＤＨＦＲ遺伝子を含有するフラグメ
ント９(実施例２)にライゲートする。このライゲーショ
ン混合物を用いてＥ．コリ２９４細胞をトランスフェク
ションし、β鎖ＤＮＡと雑種化しているが、α鎖配列と
は雑種化していないことに基づいてコロニーを選別し
た。α鎖ＤＮＡを削除したクローンpＳＶＥ−humβ_AＩn
h−ＤＨＦＲを同定した。このクローンを上記のように
してＤＨＦＲ^-ＣＨＯ細胞中にトランスフェクションし
た。形質転換体が培養培地中にアクチビンを分泌するこ
とを確認した。同様に、β_Bコード化配列(ヒトβ_Aの最
初の３４アミノ酸をコードしているＤＮＡをヒトβ_B鎖
の残りのコード化配列にライゲートして再構築される)
を含有する発現ベクターは容易に構築され、pＳＶＥ−h
umβ_AＩnh−ＤＨＦＲと共トランスフェクションしてヘ
テロダイマーを得た。また、試験管内バイオアッセイに
おいてインヒビンのαβ_A形と実質的に非都市医生物学
的活性を有するαβ_Bインヒビンを得るために、この再
構築ヒトβ_B遺伝子を前記プラスミドに用いた。

【０１３０】本発明をその好ましい態様について記載
し、これが、本発明者が現在知りうる限り最良の態様で
あるが、当分野で通常の知識を有する者にとって明白で
ある種々の変更および修正を、本明細書中の特許請求の
範囲に記載した本発明の範囲を逸脱することなく、これ
を行いうることを理解しておくべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ブタα鎖mＲＮＡを示す模式図である。

【図２】 ブタインヒビンα鎖前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図３】 ブタインヒビンα鎖前駆体のヌクレオチド配
列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図４】 ブタβ_AサブユニットmＲＮＡおよびブタβ_B
サブユニットmＲＮＡを示す模式図である。

【図５】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図６】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図７】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図８】 ブタインヒビンβサブユニット前駆体のヌク
レオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図で
ある。

【図９】 ブタ卵巣mＲＮＡのノーザン・ブロット分析
法による分析結果を示す模写図である。

【図１０】 ヒトβ−ＴＧＦのアミノ酸配列とブタイン
ヒビンβ_Aおよびβ_Bのアミノ酸配列を対比させて示した
模式図である。

【図１１】 αサブユニット配列とβ_Aインヒビン配列
とを対比させて示した模式図である。

【図１２】 ブタインヒビンの代表的な組換え発現プラ
スミドの組立て模式図である。

【図１３】 ブタインヒビンの代表的な組換え発現プラ
スミドの組立て模式図である。

【図１４】 ブタインヒビンの代表的な組換え発現プラ
スミドの組立て模式図である。

【図１５】 ヒトαインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図１６】 ヒトαインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図１７】 ヒトαインヒビンタンパク質配列とブタα
インヒビンタンパク質配列とを比較して示した模式図で
ある。

【図１８】 ヒトαインヒビンタンパク質配列とブタα
インヒビンタンパク質配列とを比較して示した模式図で
ある。

【図１９】 ヒトβ_Aインヒビンシグナル配列のヌクレ
オチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図であ
る。

【図２０】 ヒトβ_Aインヒビンシグナル配列のヌクレ
オチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図であ
る。

【図２１】 ヒトβ_Aインヒビンシグナル配列のヌクレ
オチド配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図であ
る。

【図２２】 ヒトβ_BインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図２３】 ヒトβ_BインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図２４】 ヒトβ_BインヒビンcＤＮＡのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトインヒビンβ_B鎖ポリペプチドをコ
   ードしている核酸を含有するベクターを用いて形質転換
   された真核性宿主細胞を培養することを包含するヒトイ
   ンヒビンβ_B鎖ポリペプチドの製造方法であって、該ヒ
   トインヒビンβ_B鎖ポリペプチドが少なくとも式： 【化１】 【化２】 【化３】 で示される配列の２４５−３５９位の残基の配列を有し
   ているか、または上記化１〜３の配列の２４５−３５９
   位の残基の配列の変異体であって、２６４位のフェニル
   アラニン残基がイソロイシンもしくはロイシン残基に変
   化しているか、２５９位のグルタミン残基がアスパラギ
   ンもしくはリジン残基に変化しているか、２６９位のト
   リプトファン残基がチロシンもしくはフェニルアラニン
   残基に変化しているか、２７２位のトリプトファン残基
   がチロシンもしくはフェニルアラニン残基に変化してい
   るか、２７３位のイソロイシン残基がフェニルアラニン
   もしくはバリン残基に変化しているか、２７９位のチロ
   シン残基がトリプトファンもしくはトレオニン残基に変
   化しているか、２８２位のアスパラギン残基がグルタミ
   ン、チロシンもしくはヒスチジン残基に変化している
   か、２８３位のチロシン残基がトレオニンもしくはアス
   パラギン残基に変化しているか、３０２位のフェニルア
   ラニン残基がチロシン残基に変化しているか、３３６位
   のチロシン残基がトレオニン残基に変化しているか、３
   ５０位のアスパラギン残基がグルタミン、ヒスチジンも
   しくはリジン残基に変化しているか、３５２位のイソロ
   イシン残基がロイシンもしくはトレオニン残基に変化し
   ているか、３５１位のメチオニン残基がロイシンもしく
   はセリン残基に変化しているか、または３５３位のバリ
   ン残基がフェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン
   もしくはイソロイシン残基に変化している、二量体化し
   たときに二量体化した母ポリペプチドと同じホルモン活
   性を有するものである該ポリペプチドの製造方法。
2. 【請求項２】 さらに培養物から該ポリペプチドを回収
   する工程を包含する請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 該ポリペプチドが化１〜３のアミノ酸配
   列かまたは成熟型ヒトインヒビンβ_B鎖（上記化１〜３
   の配列の残基２４５−３５９）のアミノ酸配列を有する
   ものである請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 該インヒビンβ_B鎖をコードしている核
   酸が宿主細胞によって認識されるプロモーターに機能的
   に連結している請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 該プロモーターがウイルスのプロモータ
   ーである請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 該プロモーターがＳＶ４０プロモーター
   である請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 ２６４位のフェニルアラニン残基がイソ
   ロイシンもしくはロイシン残基に変化しているか、２５
   ９位のグルタミン残基がアスパラギンもしくはリジン残
   基に変化しているか、２６９位のトリプトファン残基が
   チロシンもしくはフェニルアラニン残基に変化している
   か、２７２位のトリプトファン残基がチロシンもしくは
   フェニルアラニン残基に変化しているか、２７３位のイ
   ソロイシン残基がフェニルアラニンもしくはバリン残基
   に変化しているか、２７９位のチロシン残基がトリプト
   ファンもしくはトレオニン残基に変化しているか、２８
   ２位のアスパラギン残基がグルタミン、チロシンもしく
   はヒスチジン残基に変化しているか、２８３位のチロシ
   ン残基がトレオニンもしくはアスパラギン残基に変化し
   ているか、３０２位のフェニルアラニン残基がチロシン
   残基に変化しているか、３３６位のチロシン残基がトレ
   オニン残基に変化しているか、３５０位のアスパラギン
   残基がグルタミン、ヒスチジンもしくはリジン残基に変
   化しているか、３５２位のイソロイシン残基がロイシン
   もしくはトレオニン残基に変化しているか、３５１位の
   メチオニン残基がロイシンもしくはセリン残基に変化し
   ているか、または３５３位のバリン残基がフェニルアラ
   ニン、グルタミン酸、トレオニンもしくはイソロイシン
   残基に変化している配列を有し、二量体化したときに二
   量体化した母ポリペプチドと同じホルモン活性を有する
   ものであるヒトインヒビンβ_B鎖ポリペプチド変異体。