JPH09187285A - 新規のｈｃｖ分離株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な単離株に由来するＣ型肝炎(HCV)の
診断に有用なポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提
供する。 【解決手段】 HCVの新規な単離株J1またはJ7に由来す
るポリヌクレオチドのためのプローブおよびプライマ
ー、ならびにJ1またはJ7に対する抗体を検出するための
ポリペプチド。このプローブおよびプライマーは、本願
開示のJ1またはJ7のポリヌクレオチド配列から得られ
る、少なくとも８個のヌクレオチドの連続する配列を含
み、この少なくとも８個のヌクレオチドの連続する配列
は、単離株HCV1のヌクレオチド配列とは相同ではない。
上記ポリペプチドは、J1またはJ7に対する抗体によって
結合され得る抗原決定基を含有する、少なくとも10個の
アミノ酸の連続配列をふくみ、この連続配列は、本願開
示のJ1またはJ7のアミノ酸配列から得られるが、HCV1配
列の対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも１つの
アミノ酸置換を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規のＣ型肝炎ウ
イルス分離株、それ由来のポリペプチド、ポリヌクレオ
チドおよび抗体、ならびに、アッセイ(例えば、イムノ
アッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ)およ
びウイルスポリペプチドの製造における、このようなポ
リペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体の使用に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ、非Ｂ型肝炎(NANBH)は、感染性疾
患、あるいはウイルスによって起こると考えられている
疾患のファミリーである。これは、公知の肝炎ウイル
ス、すなわちＡ型肝炎ウイルス(HAV)、Ｂ型肝炎ウイル
ス(HBV)、およびデルタ肝炎ウイルスによって起こる他
の型のウイルス関連の肝臓疾患、ならびにサイトメガロ
ウイルス(CMV)あるいはエプスタインバーウイルス(EBV)
によって起こる肝炎とは区別し得る。NANBHは、最初は
輸血された患者に検出された。ヒトからチンパンジーへ
の感染およびチンパンジーでの連続継代で、NANBHが伝
染性の(単数あるいは複数の)感染因子によることの確証
が提供された。疫学的証拠によってNANBHには３つの型
が存在し得ることが示唆されている。すなわち；水媒介
性の流行型：血液あるいは針に関連する型；および散発
的に発生する(コミュニティーが罹患する)型である。し
かし、最近までNANBHの原因である感染因子は同定され
ていなかった。

【０００３】NANBHの臨床診断および同定は、主に他の
ウイルスマーカーを除くことによってなされてきた。推
定されるNANBHの抗原および抗体を検出するのに用いら
れる方法には、寒天ゲル拡散法、カウンターカレント免
疫電気泳動法、免疫蛍光顕微鏡法、免疫電子顕微鏡法、
ラジオイムノアッセイ、およびELISA法がある。しか
し、これらのアッセイはいずれも、NANBHの診断テスト
として用いられるには十分な感度、特異性、ならびに再
現性を示さなかった。

【０００４】最近まで、NANBH因子に関連する抗原抗体
系の同定あるいは特異性は明瞭確実にはされていなかっ
た。NANBHは１つより多い感染因子によることは可能で
あって、血清学的アッセイによってNANBHを有する患者
の血清に何が検出されているか明かではない。

【０００５】かつては、NANBH因子であると考えられる
多くのものが推測された。例えば、Prince (1983) Ann.
Rev.Microbiol. 37:217；FeinstoneおよびHoofnagle (1
984)New Eng.J.Med. 311:185；Overby (1985) Curr.Hep
tol. 5:49；Overby (1986) Curr.Heptol. 6:65；Overby
(1981) Curr.Heptol. 7:35およびIwarson (1987) Brit
ish Med.J. 295:946を参照のこと。しかし、これらのい
ずれにも、NANBHの病因物質であることを示す証拠はな
い。

【０００６】1987年に、Houghtonらは、確実にNANBHに
関連するウイルスをクローン化した。例えば、欧州特許
公開第318,216号；Houghtonら、Science 244:359 (198
9)を参照のこと。Houghtonらは、そこで、新しいウイル
スクラスであるＣ型肝炎ウイルス(HCV)の分離株のクロ
ーニングを開示しており、そのプロトタイプの分離株を
「HCV1」と命名している。HCVは、RNAゲノムを有するフ
ラビ様ウイルスである。Houghtonらは、診断試薬として
有用なHCV配列からの組換えタンパク質の製造、ならび
に、診断用のハイブリダイゼーションアッセイおよび他
のHCV分離株のクローニングに有用なポリヌクレオチド
の製造について記載している。

【０００７】NANBH保持者およびNANBHに汚染した血液あ
るいは血液製剤のスクリーニングおよび同定に感度のよ
い特異的な方法の必要性は重大である。輸血後肝炎(PT
H)は輸血患者の約10％に起こり、NANBHが、これらの最
高90％を占める。しばしば慢性の肝臓障害に進行する(2
5〜55％)。

【０００８】患者の治療、ならびに血液および血液製剤
による、あるいは個人間の密接な接触によるNANBH感染
の予防には、NANBH関連の核酸、抗原および抗体を検出
する確実な診断手段および予後診断手段が必要とされ
る。さらに、この疾患を予防および／あるいは処置する
ための効果的なワクチンおよび免疫治療学的な治療剤の
必要性がある。

【０００９】前述の必要性をみたす有用な少なくとも１
つのHCV分離株の同定がなされたが、別の分離株、特に
ゲノムが相違を有する分離株は新規の応用性を有するこ
とを証明し得る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】新規なHCV分離株の核
酸、抗原および抗体を検出する確実な診断手段および予
後診断手段を提供する。さらに、新規なHCV分離株によ
る疾患を予防および／あるいは処置するための効果的な
ワクチンおよび免疫治療学的な治療剤を提供する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】NANBH保持者と考えられ
る日本人の血液提供者からのHCVの新規分離株を特徴付
けた。これらの分離株は、数種のウイルスドメインにお
いて、プロトタイプの分離株であるHCV1とはヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列の異質性(heterogeneity)を
示す。これらの異なる配列が特に診断アッセイおよびワ
クチンの開発に重要であると考えられている。

【００１２】１つの実施態様において、本発明は、グル
ープJ1あるいはJ7から選択される分離株と実質的に相同
であるHCV分離株の少なくとも15bpのヌクレオチド配列
を含有するDNA分子を提供する。このヌクレオチド配列
は、HCVの分離株HCV1のヌクレオチド配列とは異なる。

【００１３】他の実施態様では、本発明は、HCV分離株J
1あるいはJ7のアミノ酸配列をコードする少なくとも15b
pのヌクレオチド配列を含有するDNA分子を提供する。こ
こで、このJ1あるいはJ7のアミノ酸配列は、HCVの分離
株HCV1のアミノ酸配列とは異なる。

【００１４】さらに本発明の他の実施態様では、グルー
プJ1およびJ7から選択される分離株と実質的に相同なHC
V分離株のアミノ酸配列を含有する精製ポリペプチドを
提供する。ここで、このアミノ酸配列はHCV分離株のHCV
1のポリペプチドの配列とは異なる。

【００１５】さらに本発明の他の実施態様では、HCVの
分離株のJ1あるいはJ7のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを提供する。ここで、このJ1あるいはJ7のアミノ
酸配列はHCV分離株のHCV1のアミノ酸配列とは異なり、
このポリペプチドは固体支持体に固定される。

【００１６】さらに本発明の実施態様では、テスト試料
中の抗HCV抗体の存在を検出する、下記の(ａ)および
(ｂ)の工程を包含するイムノアッセイを提供する：(ａ)
グループJ1およびJ7から選択される分離株と実質的に相
同なHCV分離株のアミノ酸配列であって、HCV分離株HCV1
のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含有する免疫
原性ポリペプチドとともに、抗原−抗体複合体を形成す
る条件下で、テスト試料をインキュベートする工程；お
よび(ｂ)この免疫原性ポリペプチドを含有する抗原−抗
体複合体を検出する工程。

【００１７】本発明はさらに、HCVのエピトープに結合
しない抗体を実質的には含有していない、HCVのエピト
ープに結合する抗HCV抗体を含有する組成物を提供す
る：ここで、(ａ)HCVのエピトープは、グループJ1およ
びJ7から選択される分離株と実質的に相同であるHCV分
離株のアミノ酸配列を含有し、このアミノ酸配列は、HC
V分離株HCV1のアミノ酸配列とは異なる；および(ｂ)こ
のJ1あるいはJ7のアミノ酸配列は、HCV1とは免疫学的に
交差反応しない。

【００１８】本発明のもう１つの実施態様では、下記の
(ａ)および(ｂ)の工程を包含する、テスト試料中のHCV
ポリペプチドの存在を検出するイムノアッセイを提供す
る：(ａ)HCVのエピトープに結合する抗HCV抗体ととも
に、抗原−抗体複合体を形成する条件下でテスト試料を
インキュベートする工程：ここで、(ｉ)このHCVのエピ
トープは、HCV分離株J1あるいはJ7のアミノ酸配列を含
有する；(ii)このJ1あるいはJ7のアミノ酸配列はHCV分
離株HCV1のアミノ酸配列とは異なる；および(iii)このJ
1あるいはJ7のアミノ酸配列は免疫学的にHCV1とは交差
反応しない；および(ｂ)抗HCV抗体を含有する抗原−抗
体複合体を検出する工程。

【００１９】さらに本発明によって、哺乳動物に、HCV
の分離株HCV1のアミノ酸配列とは異なる、HCVの分離株J
1あるいはJ7のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
投与し、そしてこの哺乳動物が抗HCV抗体を産生するこ
とを包含する、抗HCV抗体を生産する方法を提供する。

【００２０】本発明のもう１つの実施態様では、下記の
(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の工程を包含する、テスト試料中
のHCVポリペプチドを検出する方法を提供する：(ａ)請
求項１に記載のDNA分子を含有するプローブを提供する
工程；(ｂ)テスト試料中に存在するHCVのポリヌクレオ
チドではない配列とプローブとのポリヌクレオチド二重
鎖の実質的な形成がなされない、プローブとその相補体
間でのポリヌクレオチドの二重鎖を形成させる条件下
で、テスト試料とプローブとを接触させる工程；および
(ｃ)このプローブを含有するポリヌクレオチドの二重鎖
を検出する工程。

【００２１】さらに別の本発明の実施態様では、下記の
(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の工程を包含する、HCVアミノ酸
配列を含有する組換えポリペプチドを生産する方法を提
供する：(ａ)HCV分離株J1あるいはJ7のアミノ酸配列を
コードするコード配列に作動可能に結合された宿主細胞
の制御配列を含有するDNA構築物によって形質転換され
た宿主細胞を提供する工程。ここで、このJ1あるいはJ7
のアミノ酸配列はHCV分離株HCV1のアミノ酸配列とは異
なる；(ｂ)このコード配列が組換えポリペプチドに転写
および翻訳される条件下で宿主細胞を増殖させる工程；
および(ｃ)組換えポリペプチドを回収する工程。

【００２２】本発明のこれらの実施態様および他の実施
態様は、当分野の通常の技術を有する当業者には下記の
記載において容易に明白になる。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明の実施においては、特に断
わりのない限り、当分野の技術範囲内である、分子生物
学、微生物学、組換えDNA技術、および免疫学の通常技
術を使用する。このような技術は、文献に詳細に記載さ
れている。例えば、Maniatis, FitschおよびSambrookの
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (1982): DNA
CLONING,VOLUMES I AND II (D.N Glover編集、1985)；
OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J.Gait編集、1984)；NU
CLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D.HamesおよびS.J.Higgi
ns編集、1984)；TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D.
HamesおよびS.J.Higgins編集、1984)；ANIMAL CELL CUL
TURE (R.I.Freshney編集、1986); IMMOBILIZED CELLS A
ND ENZYMES (IRL Press, 1986)；B.PerbalのA PRACTICA
L GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); METHODS IN EN
ZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)のシリーズ；GENE TR
ANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H.Millerおよ
びM.P.Calos編集、1987, Cold Spring Harbor Laborato
ry)、Methods in Enzymology Vol.154およびVol.155
(それぞれWuおよびGrossman編集、Wu編集)、Mayerおよ
びWalker編集(1987)のIMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL
AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London)、S
copes(1987)のPROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES ANDP
RACTICE, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)、
およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES
I-IV (D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編集、1986)、を
参照。前出および後出の、本明細書に記載の全ての特
許、特許出願およびその他の出版物を、参考文献として
援用する。

【００２４】「Ｃ型肝炎ウイルス」は、以前は未知であ
った非Ａ非Ｂ肝炎(NANBH)の病因物質のために、当分野
の研究者が用意しておいた用語である。従って本明細書
で用いる「Ｃ型肝炎ウイルス」(HCV)とは、Houghtonら
が記載したプロトタイプ分離株HCV1クラスから、NANBV
および／あるいはBB-NANBVと以前は呼ばれていたNANBH
の原因物質を指す。例えば、本明細書でその開示を参考
文献として援用する、欧州特許公開第318,216号、およ
び1989年5月19日付の米国特許出願第355,002号(同じ優
先権を有する米国以外の特許出願が入手できる)を参
照。HCV1のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列
は、図１４〜図１６に示した。本明細書では、用語HC
V、NANBV、およびBB-NANBVは互換可能に用いられる。こ
の用語法の延長として、以前の非Ａ非Ｂ肝炎(NANBH)と
呼ばれていた、HCVによる疾患をＣ型肝炎と呼ぶ。用
語、NANBH(非Ａ非Ｂ肝炎)およびＣ型肝炎は、本明細書
では互換可能に使用し得る。本明細書で用いる用語「HC
V」は、その病原株がNANBHを引き起こす、ウイルス種、
および弱毒化株あるいはそれらに由来する不完全な干渉
粒子を指す。

【００２５】HCVは、Flavi様のウイルスである。フラビ
ウイルス粒子の形態および形成は公知で、Brinton(198
6)の、THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDA
E (Fraenkel-ConratおよびWagnerシリーズ編集、Schles
ingerおよびShelesinger巻編集、Plenum Press), p.327
〜374に記載されている。形態に関しては、一般にフラ
ビウイルスは、脂質二重層に包まれた中心ヌクレオカプ
シドを含んでいる。ビリオンは球状で、そして約40〜50
nmの直径を有している。これらのコアは、約25〜30nmの
直径である。ビリオンエンベロープの外部表面に沿っ
て、直径約２nmのノブを末端に有する、約５〜10nmの長
さの放射状突起物がある。

【００２６】HCVゲノムはRNAからなる。RNAを含んだウ
イルスは、比較的高い自然変異度を有することが知られ
ている。即ち、取り込まれるヌクレオチド一個当たり10
^-3から10^-4の確率であると報告されている。従って、HC
Vのクラスあるいは種の中に、病原性あるいは非病原性
の多くの株が存在する。

【００２７】HCV分離株のゲノムは、HCV1と大きさが似
たポリタンパク質をコードし、コードされたポリタンパ
ク質がHCV1と類似の疎水性および抗原性の特徴を有し、
そして、HCV1で保存されているほぼ連続している(co-li
near)ペプチド配列の存在する、約9,000ヌクレオチドか
ら約12,000ヌクレオチドの単一のORFからなると考えら
れている。加えて、このゲノムは、＋(ポジティブ)鎖RN
Aであると考えられている。

【００２８】HCV単離株は、HCV1ゲノム中のエピトープ
と免疫学的に交差反応するエピトープを包含する。他の
既知のフラビウイルスと比較したときに、これらの内の
少なくともいくつかのエピトープはHCVに特有なもので
ある。エピトープの特異性は、抗HCV抗体との免疫学的
反応性、および他のフラビウイルス種に対する抗体に対
する反応性の欠如により決定される。免疫学的反応性を
調べる方法は、例えば、ラジオイムノアッセイによる方
法、ELISAアッセイによる方法、血球凝集反応による方
法が当分野で公知であり、そしてアッセイ用の適切な技
法のいくつかの実施例が、本明細書で提供される。

【００２９】さらに、ヌクレオチドレベルでのHCV単離
株とHCV1ゲノムとの総体的な相同性は、恐らく約40％あ
るいはそれ以上であり、恐らく約60％あるいはそれ以
上、そして約80％から約90％あるいはそれ以上であるこ
とがより可能性が高いと考えられている。加えて、多く
の対応する完全に相同な、少なくとも約13ヌクレオチド
の連続する配列が存在する。新しい分離株からの配列と
HCV1配列との間の対応は、当分野で公知の技術により調
べ得る。例えば、新しい分離株からのポリヌクレオチド
の配列情報とHCV1配列の直接比較により調べ得る。ある
いは、相同な領域で安定な二重鎖を形成するような条件
下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし(例
えば、S1消化に先立ち使用されるもの)、次いで一本鎖
特異的なヌクレアーゼ(一つあるいは複数)で消化し、次
いで消化した断片のサイズ決定により、相同性を調べ得
る。

【００３０】HCV株間の、あるいはHCV単離株間の進化的
関係から、ポリペプチドレベルでの相同性により、HCV
と推定される株あるいは分離株は同定可能である。従っ
て、新しいHCV分離株はポリヌクレオチドレベルで、約4
0％より高い相同性が予期され、恐らくは約70％より高
い相同性であり、約80％より高い相同性である可能性が
高い。アミノ酸配列の相同性を調べる方法は当分野での
公知である。例えば、アミノ酸配列を直接配列決定し、
そして本明細書で提供される配列と比較し得る。あるい
は、HCVと予測されるゲノム物質のヌクレオチド配列を
決定し、それにコードされているアミノ酸配列を決定
し、そして対応する領域を比較し得る。

【００３１】HCV1のORFを図２９〜図５９に示した。HCV
1のポリタンパク質の非構造ドメイン、コアドメイン、
およびエンベロープドメインが予測されている(図１２
および図１３)。「C」すなわちコアのポリペプチドは、
HCV1の５'末端から345ヌクレオチドにコードされている
と考えられている。HCV1の推測される「E」すなわちエ
ンベロープドメインは、約346番目のヌクレオチドから
約1050番目のヌクレオチドにコードされていると考えら
れている。推測されるNS1すなわち非構造１ドメイン
は、約1051番目のヌクレオチドから約1953番目のヌクレ
オチドにコードされていると考えられている。残りのド
メインに関しては、推測されるNS2は約1954番目のヌク
レオチドから約3018番目のヌクレオチドに、推測される
NS3は約3019番目のヌクレオチドから約4950番目のヌク
レオチドに、推測されるNS4は約4951番目のヌクレオチ
ドから約6297番目のヌクレオチドに、そして推測される
NS5はヌクレオチド6298から３'末端にコードされている
と、各々考えられている。上記の境界は、ORFの分析に
基づく近似値である。本明細書の開示の観点から当業者
は、正確な境界を同定し得る。

【００３２】「HCV/J1」あるいは「J1」、および、「HC
V/J7」あるいは「J7」は、本明細書に開示されたヌクレ
オチド配列により特徴付られる新しいHCVの分離株、お
よびそれと実質的に相同的な；即ち、ヌクレオチドレベ
ルで少なくとも約90％あるいは約95％相同の、関連した
分離株を指す。本明細書に開示されている配列は、日本
および他のアジアおよび／あるいは環太平洋諸国で大勢
を占めるHCVのサブクラスを特徴付ると考えられてい
る。別のJ1およびJ7分離株は、本明細書および欧州特許
公開第318,216号に開示された観点から得られ得る。特
に、本明細書に開示したJ1およびJ7のヌクレオチド配
列、および図２９〜図５９中のHCV1配列は、J1およびJ7
あるいは別の分離株の別のドメインをクローニングする
ためのプライマーあるいはプローブとして使用し得る。

【００３３】本明細書の指定した配列あるいは材料「か
らの」ヌクレオチド配列は、指定した配列あるいは材
料、あるいはそれらの一部分の配列に、相同(即ち、同
じ)あるいは相補である、ヌクレオチド配列を指す。本
明細書で提供されるJ1の配列は、最小で約６ヌクレオチ
ド、好ましくは約８ヌクレオチド、さらに好ましくは約
１５ヌクレオチド、そして最も好ましくは20ヌクレオチ
ドあるいはそれ以上である。最大長は、完全なウイルス
ゲノムである。

【００３４】本発明の幾つかの局面では、ポリヌクレオ
チドが由来する領域の配列は、HCVゲノム、あるいはJ1
およびJ7に特有な配列に、相同であるか、あるいは相補
的であることが好ましい。ある配列がゲノムに特有であ
るかどうかは、当業者に公知の技術で同定し得る。例え
ば、その配列を、Genebankのようなデータバンク中の配
列と比較し、未感染の宿主中あるいは他の微生物中に存
在しているかどうかを確認し得る。さらにこの配列を、
例えばHAV、HBV、およびHDVのような肝炎を引き起こす
ことが知られているもの、およびフラビウイルスの他の
種を包含する、他のウイルス物質の既知の配列とも比較
し得る。派生した配列が、他の配列と対応するか、ある
いは対応しないかは、適切なストリンジェンシー条件下
でハイブリダイゼーションすることで同定し得る。核酸
配列の相補性を調べるためのハイブリダイゼーション技
術は当分野では公知である。例えば、Maniatisら(1982)
のMOLECULAR CLONING；A LABORATORY MANUAL (Cold Spr
ing Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)をさら
に参照。加えて、ハイブリダイゼーションにより形成さ
れた二重鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、たとえ
ば、二重鎖ポリヌクレオチドの中の一本鎖部分を特異的
に消化するS1のようなヌクレアーゼで消化することを含
む、公知の技術で同定し得る。典型的なDNA配列が派生
し得る領域には、これらに限定されないが、特異的エピ
トープをコードする領域、および非転写領域および／あ
るいは非翻訳領域がある。

【００３５】J1あるいはJ7のポリヌクレオチドは、示し
たヌクレオチド配列から直接取らなくても良く、例え
ば、化学合成、あるいはDNA複製、あるいは逆転写、あ
るいは転写、を含む任意の方法で生成し得る。加えて、
指定された配列の領域に対応する領域の組み合わせは、
意図した使用法と矛盾しないように、当分野で公知の方
法で改変し得る。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の
標識物を一つあるいはそれ以上含み得る。

【００３６】指定したポリヌクレオチドあるいはポリペ
プチドの材料「からの」アミノ酸配列は、指定したポリ
ペプチドの配列、あるいはその一部分の配列に、相同
(即ち、同じ)である、アミノ酸配列を意味する。指定さ
れた核酸配列「からの」アミノ酸配列は、その配列にコ
ードされたポリペプチド、あるいはその一部分と同じア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。本発明のポリ
ペプチド中の、J1あるいはJ7のアミノ酸配列は、その長
さが、少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは少なく
とも約10個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも15
個のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約20個
のアミノ酸である。

【００３７】本発明のポリペプチドは、必ずしも指定さ
れた核酸配列から翻訳される必要はない；ポリペプチド
は、例えば、化学合成、あるいは組換え発現系による発
現、あるいはウイルスからの単離を含む任意の方法で生
成し得る。ポリペプチドは、アミノ酸アナログ、あるい
は非天然アミノ酸を、一つあるいはそれ以上含み得る。
配列にアミノ酸アナログを挿入する方法は、当分野で公
知である。さらにポリペプチドは、当業者に公知の標識
物を一つあるいはそれ以上含み得る。

【００３８】本明細書で用いる用語「組換えポリヌクレ
オチド」は、ゲノム、cDNA、半合成、あるいは合成、の
起源のポリヌクレオチドであって、その起源あるいは操
作のために；(１)それが天然で結合しているポリヌクレ
オチド以外のポリヌクレオチドに結合されているもの；
あるいは(２)天然には存在しないものを意図している。

【００３９】本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチ
ド」は、任意の長さのポリマー型のヌクレオチドで、リ
ボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドのい
ずれかをも指す。この用語は、分子の一次構造をのみ指
す。従ってこの用語は二本鎖および一本鎖のDNA、およ
びRNAを指す。さらに、以下に示す既知の種類の改変さ
れたポリヌクレオチドをも改変されない型のポリヌクレ
オチドと同様に含む。改変には、例えば、当分野で公知
の標識、メチル化、「caps」、アナログによる天然ヌク
レオチド一つあるいはそれ以上の置換、およびヌクレオ
チド内の改変が含まれる。ヌクレオチド内の改変には、
例えば、非イオン性の結合による改変(例えば、メチル
リン酸、リン酸トリエステル、フォスフォアミデート、
カルバメート、等)、およびイオン結合による改変(例え
ば、フォスフォロチオエート、フォスフォロジチオエー
ト、等)、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、
毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン、等を
含む)のようなペンダント部分を含んだ改変、インター
カレーション剤(例えば、アクリジン、ソラレン、等)に
よる改変、キレート剤(例えば、金属、放射活性金属、
ホウ素、酸化性金属、等)を含んだ改変、アルキル化剤
を含んだ改変、改変された結合による改変(例えば、α
アノメリック核酸、等)、を含む。

【００４０】「精製されたポリヌクレオチド」は、他の
成分を実質的に含まない、特定のポリヌクレオチドを含
む組成物を指し、そのような組成物は、典型的には少な
くとも約70％の特定のポリヌクレオチドを含み、さらに
典型的には少なくとも約80％、90％あるいはさらに95％
から99％の特定のポリヌクレオチドを含む。

【００４１】「精製されたポリペプチド」は、他の成分
を実質的に含まない、特定のポリペプチドを含む組成物
を指し、この組成物は、典型的には少なくとも約70％の
特定のポリヌクレオチドを含み、さらに典型的には少な
くとも約80％、90％あるいはさらに95％から99％の特定
のポリヌクレオチドからなる。

【００４２】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および他のこの様
な用語は、単一細胞として培養された、組換えベクター
あるいは他の転移DNA用の受容細胞として用いられ得る
か、あるいは用いられた微生物あるいは高等真核細胞株
を指し、そして形質転換された元の細胞の子孫を包含す
る。一個の親細胞の子孫は、自然の変異、偶然の変異、
あるいは意図的な変異等の理由から、形態、あるいは、
ゲノム相補性あるいは総DNA相補性において必ずしも完
全に親細胞と同じである必要はないことは理解される。

【００４３】「レプリコン」は、例えば、プラスミド、
クロモソーム、ウイルス、コスミド、等であり、細胞内
でポリヌクレオチドの複製を行う自律的単位として働
く；即ち、自身の制御下で複製する能力がある、任意の
遺伝子エレメントである。

【００４４】「クローニングベクター」は、選択された
宿主細胞を形質転換し得るレプリコンであり、そして付
加されたセグメントの複製、および／あるいは発現が引
き起こされるように、他のポリヌクレオチドセグメント
が付加されている。典型的なクローニングベクターに
は、プラスミド、ウイルス(例えば、バクテリオファー
ジベクター)、およびコスミドが含まれる。

【００４５】「組み込み用(integrating)ベクター」
は、選択された宿主細胞中でレプリコンとしては働かな
いが、宿主を安定に形質転換するために、選択された宿
主中のレプリコン(典型的には、クロモソーム)に駐留物
を組み込む(integrate)能力を有するベクターである。

【００４６】「発現ベクター」は、選択された宿主細胞
を形質転換し得る構築物で、選択された宿主中で異種の
コード配列を発現させる。発現ベクターは、クローニン
グベクターあるいは組み込み用ベクターの何れでもよ
い。

【００４７】「コード配列」は、適切な調節配列の制御
下に置かれたとき、mRNAに転写される、および／あるい
はポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチド配列で
ある。コード配列の境界は、５'-末端の翻訳開始コドン
および３'-末端の翻訳停止コドンによって決定される。
コード配列は、mRNA、cDNA、および組換えポリヌクレオ
チド配列を含み得るが、これらに限定はされない。

【００４８】「制御配列」は、これらがライゲーション
されているコード配列を発現させるのに必要なポリヌク
レオチドの調節配列を指す。このような制御配列の特徴
は、宿主生物によって異なる。原核細胞では、制御配列
は一般にプロモーター、リポソーム結合部位、および転
写終結信号を含む。真核細胞では一般的に、制御配列は
プロモーター、転写終結信号、および時としてエンハン
サーを含む。用語「制御配列」は、発現のためにその存
在が必要な全ての構成要素を少なくとも含んでいること
を意図し、そして、別の有用な構成要素も含み得る。

【００４９】「作動可能に結合された」は、上述の構成
要素が意図された様式で機能し得るような関係の、近傍
にあることを指す。コード配列と「作動可能に結合され
た」制御配列は、制御配列と適合した条件下でコード配
列の発現がなされるような様式でつながれている。

【００５０】「オープンリーディングフレーム」あるい
はORFは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
の領域である；この領域は、コード配列の一部分、ある
いはコード配列の全体であり得る。

【００５１】「免疫学的に交差反応性である」は、同じ
抗体が結合する、二つあるいはそれ以上のエピトープ、
あるはポリペプチドを指す。交差反応性は、競合アッセ
イのような多くのイムノアッセイ法の何れかにより同定
され得る。

【００５２】本明細書で使用されるように、用語「抗
体」は、ポリペプチド、あるいは、少なくとも一つのエ
ピトープを含むポリペプチドの群を指す。「抗原結合部
位」は、(単数あるいは複数の)抗体分子の可変領域の折
り畳みで形成されて、抗原のエピトープの特性に相補的
な内部表面形および荷電分布を有する三次元的な結合部
位を形成し、これが特異的な結合を可能にして、抗原抗
体複合体を形成する。抗原結合部位は、重鎖および／あ
るいは軽鎖ドメイン(各々、VHおよびVL)から形成され
得、次いで抗原結合に寄与する超可変ループを形成す
る。用語「抗体」は、キメラ抗体、改変抗体、一価抗
体、Fabタンパク質、および単一ドメイン抗体を包含す
るが、これらに制限はされない。多くの場合、抗体の抗
原に対する結合現象は、他のリガンド／抗リガンド結合
と同等である。

【００５３】本明細書で使用されるように、用語「単一
ドメイン抗体」(dAb)は、HLドメインを含む抗体で、指
定された抗原と特異的に結合する。dAbは、VLドメイン
を含まないが、抗体に存在することが知られている他の
抗原結合ドメイン、例えばκおよびλドメインを含み得
る。dAbを調製する方法は当分野で公知である。例え
ば、Wardら、Nature 341:544(1989)を参照。

【００５４】抗体はまた、VHおよびVLドメイン、および
他の既知の抗原結合ドメインからなり得る。これらのタ
イプの抗体の例、およびこれらの調製方法は当分野で公
知であり(例えば、本明細書では参考文献として援用す
る、米国特許第4,816,467号を参照)、そして以下のもの
が含まれる。例えば、「脊椎動物抗体」は、四量体ある
いはその凝集体である、抗体を指し、通常は「Y」型の
形態に凝集している、鎖間に共有結合を有しても有さな
くともよい、軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物抗体で
は、鎖のアミノ酸配列は、脊椎動物中で産生された抗体
に見いだされる配列と、in situあるいはin vitro(例え
ば、ハイブリドーマ中で)に関わらず、相同である。脊
椎動物抗体は、例えば、精製されたポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体を含み、これらの調製方法は
以下に記載されている。

【００５５】「ハイブリッド抗体」は、各鎖が各々、哺
乳動物抗体の別々の鎖に対して相同であり、この四量体
あるいは凝集体により２つの異なる抗原が沈降するよう
に、これらを新たな集合物にしたものである。ハイブリ
ッド抗体では、一対の軽鎖および重鎖が、第一の抗原に
対して作成された抗体に見いだされるそれと相同であ
り、一方、第二の対の鎖が、第二の抗原に対して作成さ
れた抗体に見いだされるそれと相同である。この結果、
「二価」の特性がもたらされる、即ち、二つの抗原に同
時に結合することができる。このようなハイブリッド
は、以下に示すように、キメラ鎖を用いても形成し得
る。

【００５６】「キメラ抗体」は、重鎖および／あるいは
軽鎖が融合タンパク質である抗体を指す。典型的には、
鎖のアミノ酸配列の一部分は、特定の種あるいは特定の
クラスから由来する抗体の対応する配列に相同で、一
方、鎖の残りのセグメントは、他の種および／クラスか
ら由来する配列に相同である。通常、軽鎖および重鎖の
両方の可変領域は、一種類の脊椎動物から由来する可変
領域あるいは抗体によく似ており、一方、定常部分は、
他の種の脊椎動物から由来した抗体の配列に相同であ
る。しかしながら、この用語の定義は、この特定の例に
限定されない。材料が異なるクラスあるいは異なる種に
由来するかどうかにかかわらず、また融点が可変／定常
境界にあるかどうかにかかわらず、重鎖あるいは軽鎖の
いずれかあるいは両方が、異なる抗体の配列に似た配列
の組み合わせで構成される、任意の抗体も含まれる。従
って、定常あるいは可変領域のいずれも既知の抗体配列
に似ていない抗体を産生することも可能である。従って
例えば、可変領域が特定の抗原に対して高い特異的親和
性を有する抗体、あるいは、定常領域が増大した補体結
合作用を示す抗体を構築すること、あるいは、特定の定
常領域が有する特性に別の改善を加えることが可能であ
る。

【００５７】他の例は「改変抗体」である。これは、脊
椎動物の抗体中の天然のアミノ酸配列が変化した抗体を
指す。組換えDNA法を用いて、所望の特性が得られるよ
うに抗体を再設計し得る。可能なバリエーションは多
く、一つあるいはそれ以上のアミノ酸の変化から、例え
ば定常領域のような、領域の完全な再設計までを含む。
定常領域の変化は一般に、例えば、補体結合、細胞膜と
の相互作用、および他のエフェクター機能、の変化のよ
うな所望の細胞性プロセスの特性を得るために行われ
る。可変領域の変化は、抗原結合特性を変化させるため
に行い得る。抗体はまた、特定の細胞あるいは組織の部
位への、分子あるいは物質の特異的送達を補助するよう
に加工し得る。所望の改変は、例えば、組換え技術、部
位特異的変異誘発、等の分子生物学の公知の技術により
行い得る。

【００５８】さらに別の例は、「一価抗体」である。こ
れは、第二の重鎖のFc(即ち、幹)領域に結合した、重鎖
／軽鎖二量体からなる、凝集体である。このタイプの抗
体は、抗原変質を免れている。例えば、Glennieら、Nat
ure 295:712(1982)、を参照。抗体の定義に含まれるも
のにはさらに、抗体の「Fab」断片がある。「Fab」領域
は、重鎖および軽鎖の分枝部分を含む配列と、概ね同じ
か、あるいは類似の重鎖および軽鎖の同部分を指し、そ
して、特定の抗原に対し免疫学的結合性を示すが、エフ
ェクターであるFc部分を欠いている。「Fab」は、一つ
の重鎖および一つの軽鎖の凝集体(通常、Fab'として知
られている)、および2Hおよび2Lの鎖を含んだ四量体(F
(ab)₂と呼ぶ)を含み、指定した抗原あるいは抗原ファミ
リーと選択的に反応し得る。Fab抗体は、上述の抗体と
同じようにサブセットに、即ち、「脊椎動物Fab」、
「ハイブリッドFab」、「キメラFab」、および「改変Fa
b」、に分類し得る。抗体のFab断片を製造する方法は、
当分野で公知であり、例えば、タンパク質分解、および
組換え技術による合成が含まれる。

【００５９】「エピトープ」は、抗体結合部位を指し、
通常はポリペプチドにより定義されるが、非アミノ酸の
ハプテンでも有り得る。エピトープは、エピトープに特
有な空間配置の３個のアミノ酸からなり得、一般にはエ
ピトープは少なくとも５個のこのようなアミノ酸からな
り、そしてさらに通常は、少なくとも８〜10個のこのよ
うなアミノ酸からなる。

【００６０】「抗原抗体複合体」は、抗原上のエピトー
プに特異的に結合した抗体により形成された複合体を指
す。

【００６１】「免疫原性ポリペプチド」は、単独で、あ
るいはキャリアーと結合して、アジュバントと共に、あ
るいはアジュバントなしで、哺乳類動物中に細胞性およ
び／あるいは液性の免疫応答を引き起こすポリペプチド
を指す。

【００６２】「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー
を指し、分子の長さを特定しない。従って、ペプチド、
オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの
定義に含まれる。この用語はまた、例えば、グリコシル
化、アセチル化、リン酸化、等のポリペプチドの発現後
の修飾を特定も除外もしない。定義に含まれるのは、例
えば、一つあるいはそれ以上のアミノ酸のアナログを含
んだポリペプチド(例えば、非天然のアミノ酸、等を含
む)、結合の変化したポリペプチド、および、天然およ
び非天然の両方の、他の当分野で公知の改変である。

【００６３】本明細書で使用されるように、用語「形質
転換」は、宿主細胞に外来のポリヌクレオチドを挿入す
ることを指し、挿入に用いた方法には無関係であり、例
えば、直接の取り込み、トランスダクション、f-接合、
あるいはエレクトロポーレーションである。外来のポリ
ヌクレオチドは、例えば、プラスミドのように、組み込
まれないベクターとして保持され得、あるいは宿主ゲノ
ムに組み込まれ得る。

【００６４】「形質転換された」宿主細胞は、形質転換
された当の細胞、および元々は外来であったポリヌクレ
オチドを保持しているその子孫の両方を指す。

【００６５】本明細書の用語「処置」は、予防および／
あるいは治療を指す。

【００６６】「個体」は、脊椎動物、特に哺乳類種のも
のを指し、そして、家畜、競技用動物、およびヒトを含
む霊長類を含むがこれらに限定されない。

【００６７】「センス鎖」は、それからのmRNA転写体に
相同な二本鎖DNAの一方の鎖を指す。「アンチセンス
鎖」は、「センス鎖」の配列に相補的な配列を含む。

【００６８】「抗体含有身体成分」は、目的の抗体の原
料である、個体の身体の構成物を指す。抗体含有体成分
は当分野で公知であり、全血およびその構成成分、血
漿、血清、脊髄液、リンパ液、呼吸管、消化管、および
尿生殖管の外部切片、涙、唾液、乳汁、白血球、および
ミエローマ細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【００６９】「精製されたHCV」分離株は、ウイルスが
通常付随している細胞構成物から、および感染した組織
中に存在し得る他のタイプのウイルスから、単離された
HCV粒子の調製物を指す。ウイルスを単離する技術は当
業者に公知であり、例えば、遠心分離およびアフィニテ
ィークロマトグラフィーが含まれる。

【００７０】HCV「粒子」は、全ビリオン、およびビリ
オン形成の中間体の粒子である。HCV粒子は、一般に、H
CV核酸に付随する一つあるいはそれ以上のHCVタンパク
質を有する。

【００７１】「プローブ」は、プローブの少なくとも一
つの領域と標的の領域との相補性により、標的ポリヌク
レオチド中の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌ
クレオチドを指す。

【００７２】「生物学的試料」は、個体から単離された
組織あるいは液体の試料を指し、例えば、全血およびそ
の構成成部、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼
吸管、消化管、および尿生殖管の外部切片、涙、唾液、
乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、およびin vitroの細胞培
養構成物の試料(細胞培養培地中で生育した細胞から得
られる馴化培地、ウイルス感染細胞と推測される細胞、
組換え細胞、および細胞構成物を含むが、これらに限定
されない)もまた含まれるが、これらに限定されない。

【００７３】本発明は、HCVの新たに発見された分離
株、J1およびJ7、これらのヌクレオチド配列、タンパク
配列、および得られるポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、およびこれらに由来する抗体の単離および特徴付に
関する。分離株J1およびJ7は、ヌクレオチド配列および
アミノ酸配列が新規であり、そしてこれらの配列は、日
本および他のアジア諸国からのHCV単離株に特徴的であ
ると考えられている。

【００７４】HCV/J1およびHCV/J7に由来するヌクレオチ
ド配列は、試料中のウイルスの存在を診断するための、
および、このウイルスの天然変異株を単離するためのプ
ローブとして有用である。さらにこれらのヌクレオチド
配列は、J1およびJ7のゲノムの中にコードされたHCV抗
原のポリペプチド配列を得ることも可能とし、そして、
標準物質として、あるいは、診断テストおよび／あるい
はワクチンの成分として、有用なポリペプチドの製造を
可能とする。さらにこれらのポリペプチド配列に含まれ
るHCVのエピトープに対するポリクローナルおよびモノ
クローナルの両方の抗体は、診断テスト用に、治療剤と
して、抗ウイルス剤のスクリーニング用に、およびNANB
Hウイルスの単離用に、有用である。加えて、本明細書
に開示された配列に由来するプローブを用いると、J1お
よびJ7のゲノムの他の部分の単離および配列決定が可能
となり、従って、NANBHの、予防的および治療的の両方
の、診断および／あるいは処置に有用な、別のプローブ
およびポリペプチドが得られる。

【００７５】HCV/J1およびHCV/J7のヌクレオチド配列が
得られると、HCV感染によるNANBHの診断に有用な、そし
て、供血者および供与された血液および血液製剤の感染
をスクリーニングするのに有用な、ポリヌクレオチドプ
ローブおよびポリペプチドの構築が可能となる。例え
ば、この配列から８〜10個のヌクレオチドあるいはもっ
と長いDNAオリゴマーを合成することが可能である。こ
れは例えば、ウイルスを有すると予測される患者の血清
中のHCV RNAの存在を検出するための、あるいは、ウイ
ルスの存在に関して供与された血液をスクリーニングす
るためのハイブリダイゼーションプローブとして有用で
ある。このHCV/J1およびHCV/J7配列はまた、NANBHの期
間に生成された抗体の存在を診断する試薬として有用
な、HCV特異的ポリペプチドの設計および製造を可能と
する。HCV/J1およびHCV/J7の配列に由来する精製された
ポリペプチドに対する抗体はまた、感染した個体および
血液中のウイルス抗原を検出するために使用し得る。

【００７６】これらHCV/J1およびHCV/J7の配列に関する
知識はさらに、HCVに対するワクチンとして使用し得、
また抗体の産生にも使用し得るポリペプチドの設計およ
び製造を可能とする。そして、それは病気に対する防御
としておよび／あるいはHCV感染した個体の治療に使用
し得る。さらに、開示されたHCV/J1およびHCV/J7の配列
は、HCVゲノムのさらなる特徴付けを可能とする。これ
らの配列およびHCVゲノムに由来するポリヌクレオチド
プローブは、別のウイルスcDNA配列をcDNAライブラリー
からスクリーニングするために使用し得、次いでこれを
別の重複配列を得るために使用し得る。例えば、欧州特
許公開第318,216号を参照。

【００７７】HCV/J1およびHCV/J7のポリヌクレオチド配
列、それらに由来するポリペプチド、およびこれらのポ
リペプチドに対する抗体は、(単数あるいは複数の)BB-N
ANBV物質の単離および同定に有用である。例えば、HCV/
J1配列に由来するポリペプチドに含まれるHCVのエピト
ープに対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィ
ーに基づくウイルスの単離法で使用し得る。あるいは、
この抗体を、他の方法によって単離されたウイルス粒子
の同定に使用し得る。次に、単離されたウイルス粒子内
のウイルス抗原およびゲノム物質は、さらに特徴付けら
れ得る。

【００７８】HCV/J1およびHCV/J7のゲノムのさらなる配
列決定から、および、HCV/J1およびHCV/J7の抗原のさら
なる特徴付けおよびゲノムの特徴付けから得られる情報
により、別のプローブ、およびポリペプチド、および抗
体の設計および合成が可能となる。この抗体は、HCVに
より引き起こされるNANBHの予防および治療のための診
断、および、感染血液および血液関連製剤のスクリーニ
ングのために使用し得る。

【００７９】HCV/J1およびHCV/J7のcDNA配列が得られる
と、いずれかの鎖にコードされたポリペプチドの抗原的
に活性な領域をコードする発現ベクターの構築が可能と
なる。これらの抗原的に活性な領域は、コートあるいは
エンベロープ抗原、あるいはコア抗原、あるいは、例え
ばポリヌクレオチド結合タンパク質、(単数あるいは複
数の)ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およびウイルス
粒子の複製および／あるいは組立に必要とされる他のウ
イルスタンパク質を含む、非構造タンパク質の抗原に由
来し得る。所望のポリペプチドをコードする断片は、通
常の制限酵素消化あるいは合成的方法を用いてｃDNAク
ローンから誘導し、そして、例えばβ-ガラクトシダー
ゼあるいはスーパーオキサイドジムスターゼ(SOD)のよ
うな融合配列の部分を含み得る、ベクターにつなぎ入れ
る。SODの融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な
方法およびベクターは、欧州特許公開第196,056号に記
載されている。SODおよびHCVポリペプチドの融合ポリペ
プチドをコードするベクターは、欧州特許公開第318,21
6号に記載されている。いずれかのセンス鎖の、オープ
ンリーディングフレームを含んだHCV cDNAのいかなる所
望の部分でも、成熟タンパク質あるいは融合タンパク質
のような組換えポリペプチドとして得ることができる。
あるいは、cDNA中にコードされたポリペプチドは、化学
合成により提供し得る。

【００８０】融合あるいは成熟の形態を問わず、所望の
ポリペプチドをコードするDNAは、任意の都合のよい宿
主に適した発現ベクターにつなぎ入れ得る。組換えポリ
ペプチドの形成には、現在、真核細胞および原核細胞宿
主系の両方が使用されており、そしてより一般的な制御
システムおよび宿主細胞のいくつかに関する要約を以下
に記した。このような宿主細胞中で産生されたポリペプ
チドは、次に溶解された細胞から、あるいは培養液から
単離され、そして目的の使用法が必要とする状態まで精
製される。精製は、例えば分別抽出、塩分画、イオン交
換樹脂でのクロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、遠心分離等の分野で公知の方法で行い得
る。タンパク質の精製のための種々の方法に関しては、
例えば、Methods in Enzymologyを参照。

【００８１】このような組換えあるいは合成のHCVポリ
ペプチドは、診断試薬として、あるいはワクチン中に処
方し得る中和抗体を生成させる物質として、使用し得
る。これらのポリペプチドに対する抗体はまた、診断試
薬、あるいは受動免疫療法剤として使用し得る。加え
て、これらのポリペプチドに対する抗体は、HCV粒子の
単離および同定に有用である。

【００８２】HCV抗原はまた、HCVのビリオンから単離し
得る。ビリオンは、組織培養中のHCV感染細胞中、ある
いは感染した宿主中で生育し得る。

【００８３】本発明のポリペプチドは、実質的に完全な
ウイルス領域を含むが、多くの適用で必要とされるのは
ウイルスの抗原領域あるいは免疫原性領域を含むポリペ
プチドである。ポリペプチドの抗原的な領域は一般に相
対的に小さく、典型的には、長さが８〜10個のアミノ
酸、あるいはそれ以下である。僅か５個のアミノ酸の断
片でも、抗原的領域を特徴付け得る。このような断片
は、HCV/J1あるいはHCV/J7(HCV/J&)のエピトープ領域に
対応し得る。従ってHCV/J1およびHCV/J7のcDNAを元とし
て使用して、HCV/J1およびHCV/J7ポリペプチドの短い断
片をコードするDNAを、融合タンパク質、あるいは分離
したポリペプチドとして、組換え技術で発現させ得る。
加えて、短いアミノ酸配列は、化学合成により簡便に得
られ得る。

【００８４】合成されたポリペプチドが、正しいエピト
ープを提供するべく正しく配置されてはいるが免疫原と
しては小さ過ぎる場合には、このポリペプチドを適切な
キャリアーと結合し得る。このような結合を得るための
多くの方法は当分野で公知であり、Pierce Company, Ro
ckford, Illinoisから市販されている、N-スクシンイミ
ジル-3-(2-ピリジル-チオ)プロピオネート(SPDP)および
スクシンイミジル4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキ
サン-1-カルボキシレート(SMCC)を用いたジスルフィド
結合の形成が含まれる(ペプチドがスルフヒドリル基を
欠く場合、システイン残基の付加によりスルフヒドリル
基が提供される)。これらの試薬は、自身と一つのタン
パク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィ
ド結合を生成し、そして、リジンのε-アミノ基、ある
いは他方のタンパク質の他のフリーのアミノ基を介し
て、アミド結合を生成する。種々のこのようなジスルフ
ィド／アミノ形成試薬は公知である。例えば、Immun.Re
v.(1982) 62:185を参照。他の二価のカップリング試薬
は、ジスルフィド結合でなくチオエーテルを形成する。
これらのチオエーテル形成試薬の多くは市販されてお
り、そして、6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸、
2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサ
ン-1-カルボン酸等の反応性エステルが含まれる。カル
ボキシル基は、スクシンイミド、あるいは1-ヒドロキシ
ル-2-ニトロ-4-スルフォン酸ナトリウム塩と組み合わせ
ることにより活性化し得る。抗原を結合する他の方法
は、欧州特許公開第259,149号(本明細書で参考文献とし
て援用する)に記載されたロタウイルス／「結合ペプチ
ド」システムを採用している。以上のリストは完全なも
のではなく、名を挙げた化合物を改変したものも使用し
得るのは明白である。

【００８５】それ自身は宿主に有害な抗体の産生を誘起
しない、任意のキャリアーが使用し得る。典型的な適切
なキャリアーは大きく、ゆっくり代謝される巨大分子で
ある。その例には、タンパク質；ラテックスに加工され
たセファロース、アガロースセルロース、セルロースビ
ーズ等のような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジン
等のような、ポリマー性のアミノ酸；アミノ酸コポリマ
ー；および不活性なウイルス粒子がある。特に有用なタ
ンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペッ
トヘモシアニン、イムノグロブリン分子、サイログロブ
リン、オバアルブミン、破傷風トキソイド、および当業
者に良く知られた他のタンパク質である。

【００８６】完全長のウイルスタンパク質に加えて、少
なくとも一つのウイルスエピトープをコードする、先端
切断したHCVアミノ酸配列を含むポリペプチドも、免疫
学的試薬として有用である。例えば、このような先端切
断した配列を含むポリペプチドは、イムノアッセイの試
薬として使用し得る。これらのポリペプチドはまた、抗
血清の製造あるいはワクチン用の組成物中の、抗原サブ
ユニットの候補でもある。これらの先端切断した配列
は、天然のウイルスタンパク質に種々の公知の処理を行
うことで製造し得るが、一般に、HCV配列を含む、合成
あるいは組換えポリペプチドを作成するのが好ましい。
これらの先端切断したHCV配列を含むポリペプチドは、H
CV配列からのみ(隣接したあるいは隣接しない、一つの
あるいはそれ以上のエピトープ)作成し得、あるいはHCV
配列および異種の配列を融合タンパク質の形で作成し得
る。有用な異種配列には、組換え宿主からの分泌を促す
配列、(単数あるいは複数の)HCVエピトープの免疫学的
反応性を増強する配列、あるいはポリペプチドがイムノ
アッセイ支持体あるいはワクチンキャリアーヘカップリ
ングするのを促進する配列が含まれる。例えば、欧州特
許公開第116,201号；米国特許第4,722,840号；欧州特許
公開第259,149号；米国特許第4,629,783号(本明細書で
は開示内容を参考文献として援用する)を参照。

【００８７】先端切断されたHCVを含むポリペプチドの
大きさは広く変化し得、最小の大きさはHCVエピトープ
を提供するのに充分な大きさの配列であるが最大の大き
さは特に重要ではない。幾つかの例では、最大の大きさ
は一般に、所望するHCVのエピトープ、および、もし存
在するならば、異種の配列の(単数あるいは複数の)機能
を提供するために必要とされるよりも実質的に大きくは
ない。典型的には、先端切断されたHCVアミノ酸配列
は、約５個から100個のアミノ酸の範囲の長さである。
しかし、さらに典型的には、HCV配列は最大約50個のア
ミノ酸の長さで、好適には最大約30個のアミノ酸であ
る。一般に、少なくとも約10、12あるいは15個のアミノ
酸、最大約20個あるいは25個のアミノ酸までのHCV配列
を選択するのが望ましい。

【００８８】エピトープを含む先端切断したHCVアミノ
酸配列は、多くの方法で同定し得る。例えば、全長のウ
イルスタンパク質配列は、全体で全長のタンパク質配列
を包含する一連の短いペプチドを調製することによりス
クリーニングし得る。例えば、100-merのポリペプチド
から始めて、目的の反応性を示す(単数あるいは複数の)
エピトープの存在に関して各ポリペプチドをテストし、
そして次に、確認された100-merからより小さい、重複
する断片をテストして目的のエピトープの位置を決める
ことはルーチンである。イムノアッセイでこのようなペ
プチドをスクリーニングすることは、当分野の技術範囲
内である。タンパク質配列のコンピューター分析を行っ
て、潜在的なエピトープを同定し、そして次に同定され
た領域を含むオリゴヌクレオチドをスクリーニングのた
めに調製することも公知である。抗原性に関するこのよ
うなコンピューター分析が実際に存在するエピトープを
常に同定するわけではなく、タンパク質のある領域をエ
ピトープを含んだ領域として誤って同定することもあり
得ることは、当業者も認めている。

【００８９】HCVの推定されるポリタンパク質とフラビ
ウイルスとの関係の観察によって、HCVの「非構造」(N
S)タンパク質の推定ドメインの予測が可能となった。推
定されるフラビウイルスの前駆体ポリタンパク質中のNS
タンパク質の個々の位置は、かなり良く知られている。
さらに、これらはまた、ポリタンパク質の観察された疎
水性プロフィールの総体的変動とも一致する。フラビウ
イルスのNS5は、ビリオンのポリメラーゼをコードし、
そしてNS1は、動物に対して有効なワクチンであること
が示された補体結合抗原に相当することが確認された。
最近、フラビウイルスのプロテアーゼ機能は、NS3中に
在ることが示された。HCVとフラビウイルスとの観察さ
れた類似性のため、HCVポリタンパク質中の対応するタ
ンパク質ドメインおよび機能の概ねの位置に関する推論
が可能である。図２８は、HCVポリタンパク質の推定ド
メインの概要を示している。例えば、細菌、酵母、昆
虫、および脊椎動物細胞を含む種々の組換え宿主細胞中
でのこれらのドメインを含んだポリペプチドの発現は、
診断、検出、およびワクチンに使用し得る重要な免疫学
的試薬を提供する。

【００９０】本明細書に記載されたHCV分離株およびフ
ラビウイルスの推定されたポリタンパク質の非構造タン
パク質領域は、全般的に類似であるように見えるが、N-
末端に向かう推定構造領域の間では類似性が低い。この
領域では、配列の相違が大きく、そして加えて、二つの
領域の疎水性プロフィールはさらに類似性が低い。この
「相違」は、HCV中の推定NS1ドメインのN-末端領域に始
まり、推定N-末端まで延びている。しかしながら、推定
されるヌクレオカプシド(N-末端塩基性ドメイン)および
Ｅ(一般的に疎水性)ドメインのHCVポリタンパク質中で
のおおまかな位置を予測することは、可能である。これ
らの予測から、有用な免疫学的試薬に対応し得るHCVポ
リタンパク質の大まかな領域を同定することは可能で有
り得る。例えば、フラビウイルスのＥおよびNS1タンパ
ク質は、防御的ワクチンとして有効性を有することが知
られている。このような領域、および、例えば推定NS
3、C、およびNS5等の中のHCV1で抗原性であることを示
された幾つかの領域もまた、診断試薬を提供するに違い
ない。

【００９１】HCV配列の免疫原性はまた、例えば、Ｂ型
肝炎表面抗原あるいはロタウイルスVP6抗原のような粒
子形成タンパク質と、融合あるいは組み合わされた配列
を調製することで増強され得る。HCVエピトープが粒子
形成タンパク質をコードする配列に直接結合された構築
物は、HCVエピトープに関して抗原性であるハイブリッ
ドを産生する。加えて、調製されたベクターの全てはHB
Vに特異的なエピトープを含み、例えば、プレ-Sペプチ
ドのような様々な程度の免疫原性を有する。従って、HC
V配列を含む粒子形成タンパク質から構築された粒子
は、HCVおよび粒子形成タンパク質に関して、免疫原性
である。例えば、米国特許第4,722,840号；欧州特許公
開第175,261号；欧州特許公開第259,149号；Michelleら
(1984) Int.Symposium on Viral Hepatitis；を参照。

【００９２】HCV/J1あるいはHCV/J1に由来する一つある
いはそれ以上の免疫原性ポリペプチドから、ワクチンが
調製し得る。HCVとフラビウイルスとの間の観察された
相同性は、ワクチンとして最も効果的と思われるポリペ
プチド、および、これらがコードされているゲノムの領
域に関する情報を提供する。フラビウイルスのゲノムの
一般的構造は、THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLA
VIVIRIDAE (シリーズ編集Fraenkel-ConratおよびWagne
r、巻編集SchlesingerおよびSchlesinger, Plenum Pres
s)中でRiceら(1986)により、論議されている。フラビウ
イルスゲノムRNAは、唯一のウイルス特異的mRNA種であ
ると考えられており、これは３つの、即ちＣ、Ｍおよび
Ｅのウイルス構造タンパク質、および２つの大きな非構
造タンパク質NV4およびNV5、および、より小さい非構造
タンパク質の複合セットに翻訳される。フラビウイルス
の主要な中和エピトープは、Ｅ(エンベロープ)タンパク
質に存在することが知られている。THE VIRUSES: THE T
OGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (シリーズ編集Fraenkel-
ConratおよびWagner、巻編集SchlesingerおよびSchlesi
nger, Plenum Press)中のRoehrig (1986)。対応するHCV
のＥ遺伝子およびポリペプチドをコードする領域は、フ
ラビウイルスに対する相同性に基づき予測し得る。従っ
てワクチンは、HCVのＥのエピトープを含む組換えポリ
ペプチドを含み得る。これらのポリペプチドは、細菌、
酵母、あるいは哺乳類細胞中で発現され得、あるいは、
ウイルス調製物から単離され得る。他の構造タンパク質
もまた、防御用の抗HCV抗体を誘起するエピトープを含
み得ることもまた予測される。従って、単独で、あるい
は組合せでＥ、Ｃ、およびＭのエピトープを含むポリペ
プチドもまた、HCVワクチンに使用し得る。

【００９３】上記に加えて、NS1(非構造タンパク質１)
での免疫は、黄熱病に対する防御をもたらすことが示さ
れた。Schlesingerら(1986) J.Virol. 60:1153。この免
疫は中和抗体の産生を引き起こさないが、これは事実で
ある。従って、特にこのタンパク質がフラビウイルス間
で高度に保持されていることから、HCVのNS1もまたHCV
感染に対する防御となり得ると考えられる。さらにこの
ことは、非構造タンパク質が、中和抗体の産生は引き起
こさないにも拘らず、ウイルス病原性に対する防御を与
え得ることも示す。

【００９４】上記の観点から、HCVに対する多価のワク
チンは、一つあるいはそれ以上の構造タンパク質からの
一つあるいはそれ以上のエピトープ、および／あるいは
一つあるいはそれ以上の非構造タンパク質からの一つあ
るいはそれ以上のエピトープを含み得る。これらのワク
チンは、例えば、組換えHCVポリペプチドおよび／ある
いはビリオンから単離されたポリペプチドを含み得る。
特に、一つあるいはそれ以上の以下のHCVタンパク質：
E、NS1、C、NS2、NS3、HS4、およびNS5、あるいは、そ
れらに由来するサブユニット抗原を含むワクチンが期待
されている。特に好適なのは、Eおよび／あるいはNS1、
あるいはそのサブユニットを含むワクチンである。加え
て、不活性化したHCVをワクチンに使用することも可能
であり得る；不活性化は、ウイルス溶解液の調製によ
り、あるいはフラビウイルスの不活性化を引き起こす、
当分野で公知の手段、例えば、有機溶媒あるいは界面活
性剤による処理、あるいはホルマリン処理によって行い
得る。さらにまた、ワクチンは、弱毒化されたHCV株か
ら、あるいは当分野で公知の［Brownら、Nature 319:54
9-550 (1986)］、ワクシニアベクターのようなハイブリ
ッドウイルスから、調製し得る。

【００９５】有効成分として(単数あるいは複数の)免疫
原性ポリペプチドを含んだワクチンの調製物は、当業者
に公知である。このようなワクチンは典型的には、液体
溶液あるいは懸濁液のいずれかとして注射可能に調製さ
れる；また注射に先立ち溶液中で、溶液として、あるい
は懸濁液として調製するのに適した固体の形態でも調製
し得る。この調製物は乳化し得、あるいはリポソーム中
にタンパク質をカプセル化し得る。免疫原性の有効成分
はしばしば、薬学的に許容可能で有効成分と適合する賦
形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理
食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等、
およびそれらの組合せである。加えて、所望するならば
ワクチンは、湿潤剤あるいは乳化剤、pH緩衝剤、および
／あるいはワクチンの有効性を増強するアジュバントの
ような少量の補助物質を含み得る。有効で有り得るアジ
ュバントの例には、以下のものが含まれるが、これらに
制限はされない：水酸化アルミニウム、N-アセチル-ム
ラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-WDP)、N-
アセチル-nor-ムラニル-L-アラニル-D-イソグルタミン
(CGP 11637、nor-MDPと呼ぶ)、N-アセチルムラミル-L-
アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジ
パルミトイル-sn-グリセロール-3-ヒドロキシホスホリ
ルオキシ)-エチルアミン(CGP 19835A、MTP-PEと呼ぶ)、
および細菌から抽出したモノホスホリル脂質Ａ、トレハ
ロースジミコレートおよび細胞壁骨格の３つの成分(MPL
＋TDM＋CWS)を２％のスクアレン／Tween 80乳化液中に
含むRIBI。アジュバントの有効性は、このポリペプチド
を含み、さらに種々のアジュバントを含むワクチンの投
与により得られる、HCVの抗原性配列を含んだ免疫原性
ポリペプチドに対する抗体の量を測定することで決定し
得る。

【００９６】このワクチンは、注射により、通常は皮下
あるいは筋肉内のいづれかに非経口的に従来のように投
与される。別の様式の投与に適した別の処方には、座剤
および、ときとして経口処方が含まれる。座剤には、例
えば、ポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリ
ドのような伝統的な結合剤およびキャリアーが含まれ得
る；このような座剤は、有効成分を0.5％〜10％、好ま
しくは１％〜２％の範囲で含んだ混合物から形成され
る。経口処方には、例えば薬剤等級の、マンニトール、
ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカ
リンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等の
ような通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成
物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処
方あるいは粉末の形態を取り、そして10％〜95％の、好
ましくは25％〜70％の有効成分を含む。

【００９７】タンパク質は、中性あるいは塩の形態でワ
クチンに処方され得る。薬学的に許容可能な塩には、酸
付加塩(ペプチドのフリーのアミノ基と形成した)、およ
び例えば、塩酸あるいはリン酸のような無機酸、あるい
は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸等のような有機
酸と形成した塩が含まれる。フリーのカルボキシル基と
形成した塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、あ
るいは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロ
ピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノ
ール、ヒスチジン、プロカイン、等のような有機塩基か
ら誘導し得る。

【００９８】ワクチンは、投与処方が適合する様式で、
そして、予防的におよび／あるいは治療的に有効な量
で、投与される。投与される量は一般に、投与当り抗原
が５μgから250μgの範囲であり、処置される対象、対
象の抗体を合成する免疫系の能力、および所望する防御
の程度に依存する。投与に必要とされる有効成分の正確
な量は、実施者の判断に依存し得、そして個体毎に固有
となり得る。

【００９９】ワクチンは、単回投与のスケジュールで、
あるいは好ましくは複数投与スケジュールで与え得る。
複数投与スケジュールでは、予防接種の第一過程が１〜
10回の別々の投与であり得、その後、免疫応答を維持あ
るいは補強するために、必要な投与をさらに引き続き、
期間毎に行い、例えば、１〜４ヶ月に第二の投与を行
い、そして必要ならば、数カ月後に次の(単数あるいは
複数の)投与を行う。投薬法はまた、少なくとも部分的
には、個体の必要に応じて決定され、実施者の判断によ
る。

【０１００】加えて、(単数あるいは複数の)免疫原性の
HCV抗原を含んだワクチンは、例えば、免疫グロブリン
のような他の免疫調節物質と共に投与し得る。

【０１０１】上述のようにして調製された免疫原性のポ
リペプチドは、ポリクローナルおよびモノクローナルの
両方の抗体の製造に使用される。ポリクローナル抗体が
所望ならば、選択した哺乳類(例えば、マウス、ウサ
ギ、ヤギ、ウマ、その他)をHCVの(単数あるいは複数の)
エピトープを有する免疫原性のポリペプチドで免疫す
る。免疫した動物からの血清を、回収し、そして公知の
方法に従って処理する。HCVエピトープに対するポリク
ローナル抗体を含んでいる血清が、他の抗原に対する抗
体を含んでいる場合、ポリクローナル抗体はイムノアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。ポ
リクローナルの抗血清の製造および処理の技術は当分野
で公知であり、例えば、MayerおよびWalker編集 (1987)
IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOL
OGY (Acadenic Press, London)を参照。

【０１０２】HCVエピトープに対するモノクローナル抗
体もまた、当業者は容易に製造し得る。ハイブリドーマ
によるモノクローナル抗体作成の一般的方法は良く知ら
れている。永久に継代可能な抗体産生細胞株は、細胞融
合、および、ガン遺伝子DNAでＢリンパ球を直接形質転
換したり、あるいはエプスタインバーウイルスによるト
ランスフェクションのような他の方法によっても創製し
得る。例えば、M.Schreierら(1980) HYBRIDOMA TECHNIQ
UES；Hammerlingら(1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND
T-CELL HYBRIDOMAS；Kennettら(1980) MONOCLONAL ANT
IBODIES；を参照。また、米国特許第4,341,761号；第4,
399,121号；第4,427,783号；第4,444,887号；第4,466,9
17号；第4,472,500号；第4,491,632号；および、第4,49
3,890号も参照。HCVエピトープに対して製造された一連
のモノクローナル抗体は、種々の性質、即ち、アイソタ
イプ、エピトープ親和性、その他に関してスクリーニン
グし得る。

【０１０３】HCVエピトープに対する、ポリクローナル
およびモノクローナルの両方の抗体は、特に診断に有用
であり、中和抗体は、受動的免疫療法に有用である。特
にモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体の作成
に有用である。

【０１０４】抗イディオタイプ抗体は、それに対する防
御が望まれている感染物質の抗原の「内部イメージ」を
有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を
作成する技術は当分野で公知である。例えば、Grzych
(1985), Nature 316:74；MacNamaraら(1984), Science
226:1325、Uytdehaagら(1985), J.Immunol. 134:1225、
を参照。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、NANBH
の治療および／あるいは診断に、およびHCV抗原の免疫
原性領域の解明に、有用で有り得る。

【０１０５】HCV/J1あるいはHCV/J7のポリヌクレオチド
配列を基として用いて、切り出しあるいは合成的に、約
８ヌクレオチドあるいはそれ以上のオリゴマーを調製し
得る。このヌクレオチドは、HCVゲノムにハイブリダイ
ズし、そして、(単数あるいは複数の)ウイルス物質の同
定に、(単数あるいは複数の)ウイルスゲノムのさらなる
特徴付けに、および病気の個体中の(単数あるいは複数
の)ウイルスの検出に、有用である。HCVポリヌクレオチ
ド(天然あるいは誘導体)用のプローブは、ハイブリダイ
ゼーションにより特有のウイルス配列の検出が可能とな
る長さである。６〜８個のヌクレオチドは、実際に使用
し得る長さであり得るが、約10〜12個のヌクレオチドの
配列が好ましく、そして約20個のヌクレオチドが最適の
ようである。これらのプローブは、自動オリゴヌクレオ
チド合成法を含む、日常的方法を用いて調製し得る。有
用なプローブには、例えば以下に記載する、本明細書に
開示されたクローン、およびcDNAライブラリーをプロー
ブするのに有用な種々のオリゴマーがある。HCVゲノム
の任意の特有な部分に相補的であれば充分である。プロ
ーブとして使用するためには、断片の長さが増せば不必
要となるが、完全な相補性が望ましい。

【０１０６】このようなプローブを診断試薬として使用
する場合、所望するならば血液あるいは血清のような分
析される生物学的試料を処理して、その中に含まれる核
酸を抽出し得る。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳
動、あるいは他のサイズ選別技術にかけ得る；あるい
は、サイズ選別せずに核酸試料をドットブロットし得
る。このプローブを次に標識する。適切な標識、および
プローブを標識する方法は当分野で公知であり、例え
ば、ニックトランスレーションあるいはカイネーション
による放射活性標識の組み込み、ビオチン、蛍光プロー
ブ、および化学発光プローブが含まれる。試料から抽出
された核酸を次に、適切なストリンジェンシーのハイブ
リダイゼーション条件下で標識プローブで処理する。偽
陽性を妨げるために、通常は高いストリンジェンシーの
条件が好ましい。ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さ、およびホ
ルムアミドの濃度を包含する、ハイブリダイゼーション
中および洗浄工程中の多くの因子によって、決められ
る。例えば、Maniatis,T.(1982) MOLECULAR CLONING；A
LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, N.Y.)に、これらの因子の概略が示さ
れている。

【０１０７】一般的に、HCVゲノム配列は、感染した個
体の血清中に相対的に低い濃度で、即ち、約10²〜10³チ
ンパンジー感染量(chimp infectious doses)(CID)/mlの
濃度で、存在していると考えられている。このレベル
は、ハイブリダイゼーションアッセイに増幅技術が用い
られることを必要とし得る。このような技術は当分野で
公知である。例えば、Enzo Biochemical Corporationの
「Bio-Bridge」システムは、修飾されていない3'-ポリ-
dT-テイルをDNAプローブに付け加えるために、ターミナ
ルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用す
る。このポリdT-テイルを付けたプローブを、標的ヌク
レオチド配列とハイブリダイゼーションし、そして次
に、ビオチン修飾したポリ-Aとハイブリダイゼーション
する。PCT特許出願No.84/03520、および欧州特許公開第
124,221号にはDNAハイブリダイゼーションアッセイが記
載され、その中で：(１)被分析物を、酵素標識したオリ
ゴヌクレオチドに相補的な一本鎖DNAプローブとアニー
ルさせ、そして、(２)得られたテイルの付いた二重鎖を
酵素標識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシ
ョンしている。欧州特許公開第204,510号には、被分析
物DNAを、ポリ-dTテイルのようなテイルを有するプロー
ブ、および、ポリ-A配列のようなプローブのテイルとハ
イブリダイゼーションする配列を有し、そして複数の標
識された鎖と結合し得る、アンプリファイアー鎖と接触
させる、DNAハイブリダイゼーションアッセイを記載し
ている。

【０１０８】特に望ましい技術は、先ず、血清中の標的
HCV配列を約10,000-倍に、即ち、約10⁶配列/mlに増幅す
る工程を含む。例えば、Saikiら(1986) Nature 324:16
3、Mullisらの米国特許第4,683,195号、およびMullisら
の米国特許第4,683,202号に記載されたポリメラーゼチ
ェインリアクション(PCR)法により行える。増幅された
(単数あるいは複数の)配列は次に、係属出願の、欧州特
許公開第317-077号、および日本特許出願番号第63-2603
47号(これらは本明細書の譲受人に譲渡され、本明細書
ではこれらを参考文献として援用する)に記載されたハ
イブリダイゼーションアッセイを用いて検出する。10⁶/
mlのレベルの配列を検出する必要のあるこれらのハイブ
リダイゼーションアッセイは、一本鎖の被分析物核酸に
結合し、さらに複数の標識一本鎖オリゴヌクレオチドと
も結合する、核酸マルチマーを利用している。標識ポリ
ヌクレオチドプローブに使用し得る適切な液相サンドイ
ッチアッセイ、およびプローブを調製するための方法
は、欧州特許公開第225,807号(本明細書では参考文献と
して援用する)に記載されている。

【０１０９】これらのプローブは、診断キット中に包括
し得る。診断キットは、プローブDNAを含み、プローブ
は標識されていても良く；あるいは、DNAプローブは非
標識で、標識用の成分をキット中の別の容器中に含んで
いても良い。キットはまた、例えば、スタンダード用物
質、洗浄バッファー、およびテストを行うための指示書
のような、特定のハイブリダイゼーションプロトコール
に必要とされる、他の適切に包装された試薬および物を
含み得る。

【０１１０】HCV抗体を含む血清およびHCV/J1およびHCV
/J7のポリペプチド中のHCV特異的エピトープに対する抗
体と免疫学的に反応する、HCV/J1およびHCV/J7のポリペ
プチドの両者は、生物学的試料中のHCV抗体の存在を、
あるいは、ウイルスおよび／あるいはウイルス抗原の存
在を検出するイムノアッセイに有用である。イムノアッ
セイの設計は非常に多様で、これらの多様性は当分野で
公知である。抗HCV抗体用のイムノアッセイは、一つの
ウイルスエピトープ、あるいは数個のウイルスエピトー
プを利用し得る。複数のエピトープを用いる場合、この
エピトープは、同じあるいは異なるウイルスポリペプチ
ドに由来し得、そして、エピトープは、別々の、組換え
ポリペプチドあるいは天然のポリペプチド中に、あるい
は同じ組換えポリペプチド中に一緒に、存在しても良
い。

【０１１１】ウイルス抗原用のイムノアッセイは、例え
ば、ウイルスエピトープに対するモノクローナル抗体、
一つのウイルスポリペプチドのエピトープに対するモノ
クローナル抗体の組合せ、異なるウイルスポリペプチド
の複数のエピトープに対するモノクローナル抗体の組合
せ、同じウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、異
なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、あるい
は、モノクローナルおよびポリクローナルの抗体の組合
せが使用し得る。

【０１１２】イムノアッセイのプロトコールは、例え
ば、競合法、あるいは直接反応、あるいはサンドイッチ
タイプのアッセイに基づき得る。プロトコールはまた、
例えば固相支持体を使用しても良く、あるいは免疫沈降
法であっても良い。殆どのアッセイは、標識した抗体あ
るいはポリペプチドの使用を含む。標識は、例えば、蛍
光、化学発光、放射活性、あるいは色素分子であり得
る。プローブからの信号を増幅するアッセイもまた公知
である。その例は、ELISAアッセイのような、ビオチン
およびアビジンを利用するアッセイ、および、酵素標識
および酵素を介するイムノアッセイである。

【０１１３】典型的には、抗HCV抗体用のイムノアッセ
イは、生物学的試料のようなテスト試料を選択および調
製し、そして次に、それを抗原性(即ち、エピトープを
含有する)HCVポリペプチドと共に、抗原抗体複合体が形
成される条件下でインキュベートすることを含む。この
ような条件は当分野では公知である。不均一系では、イ
ンキュベーション後にポリペプチドから試料を分離する
ために、ポリペプチドは固相支持体に結合される。使用
し得る固相支持体の例には、メンブレンあるいはマイク
ロタイターウェルの形態のニトロセルロース、シートあ
るいはマイクロタイターウェルの形態のポリ塩化ビニ
ル、ビーズあるいはマイクロタイターウェルの形態のポ
リスチレンラテックス、Immobulon^TMとして知られてい
るポリビニリジンフルオライド、ジアゾ化紙、ナイロン
メンブレン、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズ
である。最も好適なのは、DynatechのImmulon^TM１マイ
クロタイタープレートあるいは0.25-インチのポリスチ
レンビーズであり、これはPrecision Plastic Ballでス
ペック(Spec)仕上げされ、不均一系で使用されている。
固相支持体は、テスト試料から分離された後に一般に典
型的に洗浄される。均一系では、当分野で公知のよう
に、テスト試料は抗原と共に、溶液中で、形成された如
何なる抗原抗体複合体をも沈降させる条件下でインキュ
ベートする。沈降した複合体を次に、例えば、遠心分離
により、テスト試料から分離する。抗HCV抗体を含む形
成された複合体は、次に多くの技術のいずれかにより検
出される。系によってはこの複合体は、標識した抗異種
Igにより、あるいは、競合系が用いられた場合には、結
合した標識競合抗体量を測定することにより、検出し得
る。

【０１１４】HCVポリペプチドが被分析物であるイムノ
アッセイでは、典型的には生物学的試料であるテスト試
料は、抗HCV抗体と共に、抗原抗体複合体の形成が可能
な条件下で同様にインキュベートされる。抗体が固相支
持体に結合され、テスト試料と共にインキュベートさ
れ；洗浄され；被分析物と第二の標識抗体とを共にイン
キュベートされ；そして、支持体を再び洗浄する、「サ
ンドイッチ」アッセイのような種々の系を採用し得る。
被分析物は第二抗体が支持体に結合したかどうかを調べ
ることで検出される。不均一系あるいは均一系のいづれ
でも有り得る競合系では、テスト試料は通常、抗体およ
び標識された競合する抗原と共に、順番にあるいは同時
に、インキュベートされる。これらおよび他の系は、当
分野で良く知られている。

【０１１５】HCVのフラビウイルスモデルは、ビリオン
の構造タンパク質の診断用エピトープの存在しそうな位
置に関する予測を可能とする。C、プレ-M、M、およびE
ドメインは全て、ウイルス抗原の検出、および特に診断
に役立つ可能性の高いエピトープを含んでいると考えら
れる。同様に、非構造タンパク質のドメインは、重要な
診断用エピトープ(例えば、推定ポリメラーゼをコード
するNS5；および、推定補体結合抗原をコードするNS1)
を含むと考えられる。これらの特異的なドメインのエピ
トープを含む、組換えポリペプチドあるいはウイルスポ
リペプチドは、感染性血液の供与者および感染患者中の
ウイルス抗体の検出に有用であり得る。加えて、Eおよ
び／あるいはMタンパク質に対する抗体は、HCVにより引
き起こされたNANBHの患者、および感染性血液の供与者
の、ウイルス抗原検出用のイムノアッセイに使用し得
る。さらに、これらの抗体は、急性期の供血者および患
者からの検出に、非常に有用であり得る。

【０１１６】推定ポリタンパク質の抗原性領域は、細菌
でのポリタンパク質の部分をコードするHCVのcDNAの発
現産物の抗原性をスクリーニングすることにより、位置
付けおよび同定し得る。HCVの他の抗原性領域は、酵母
系、および、昆虫および脊椎動物由来の細胞系を含む、
他の発現系でHCVのcDNAの部分を発現させることにより
検出し得る。加えて、抗原性指数および疎水性／親水性
プロフィールに関する研究により、領域の抗原性の見込
みに関する情報が得られる。有効な検出系は、一連のエ
ピトープの使用を含み得る。この一連のエピトープは、
一つあるいは複数のポリペプチドに構築し得る。

【０１１７】免疫診断に適し、そして適切な標識試薬を
含んだ適切なキットは、適切な容器中のHCVエピトープ
を含んだ本発明のポリペプチドあるいはHCVエピトープ
に対する抗体、そしてアッセイの実施に必要な他の試薬
および物質(例えば、洗浄バッファー、標識抗ヒトIgの
ような検出手段、標識抗HCV、あるいは標識HCV抗原)、
および適当なアッセイ指示書のセットを含む、適切な物
質をパッケージに入れることで構築される。

【０１１８】本明細書に記載したHCV/J1およびHCV/J7の
ヌクレオチド配列情報は、HCVゲノムの配列に関するさ
らなる情報を得るために、そしてJ1あるいはJ7に関連し
た別のHCV分離株の同定および単離にも、使用し得る。
そしてこの情報は、別のポリヌクレオチドプローブ、HC
Vゲノムから誘導したポリペプチド、およびHCVにより引
き起こされたNANBHの診断およびあるいは処置に有用で
あろうHCVエピトープに対する抗体を導き出す。

【０１１９】本明細書に記載したHCV/J1およびHCV/J7の
ヌクレオチド配列情報は、それからJ1およびJ7配列が由
来する、HCVゲノムの未だ定義されていない領域に由来
する別の配列を単離するためのプローブの設計に有用で
ある。例えば、実施例に開示されたHCVのcDNA配列の５'
末端あるいは３'末端に近い領域に由来する、約８個の
あるいはそれ以上の、そして好ましくは20個のあるいは
それ以上のヌクレオチドの配列を含んだ標識プローブ
は、HCVのcDNAライブラリーから重複するcDNA配列を単
離するために使用し得る。上記のクローン中のcDNAと重
複するが、上記のクローン中のcDNAが由来しないゲノム
の領域から由来する配列をも含む、これらの配列は次
に、以下に記載するcDNAと必ずしも重複しない他の重複
断片を単離するためのプローブの合成に使用し得る。cD
NAライブラリーを構築する方法は当分野で公知である。
例えば、欧州特許公開第318,216号を参照。HCV1抗原に
対する抗体が証明されてNANBHを有すると診断された、
日本および他のアジアの患者からライブラリーを調製す
るのが特に好ましい；これらの人々は、HCV/J1、HCV/J7
あるいは関連した分離株の保持者の最も有力な候補であ
ると考えられている。

【０１２０】HCV粒子は、NANBHの固体の血清から、ある
いは細胞培養物から、当分野で公知の任意の方法で単離
し得る。この方法には例えば、沈降あるいは排除法のよ
うなサイズ分別に基づく技術、あるいは密度勾配中での
超遠心のような密度に基づく技術、あるいはポリエチレ
ングリコールのような物質と共に沈澱させる方法、ある
いはアニオン性あるいはカチオン性の交換物質、および
疎水性により結合する物質のような種々の物質によるク
ロマトグラフィーが含まれる。

【０１２１】HCV粒子あるいは抗原を単離するための好
ましい方法は、イムノアフィニティーによる方法であ
る。イムノアフィニティーの技術は当分野で公知であ
り、固相支持体に抗体を固定し、それらの免疫選択性を
保持しておく技術が含まれる。これらの技術は、抗体が
支持体に吸着されるもの(例えば、KurstakのENZYME IMM
UNODIAGNOSIS, p.31〜37を参照)、および抗体を支持体
に共有結合するものであり得る。一般に、この技術は上
述の抗原を固相支持体に共有結合するために使用したも
のと類似である。しかし、抗体の抗原結合部位が接近可
能に保たれるようスペーサーグループが二価のカップリ
ング試薬中に含まれ得る。抗体はモノクローナル、ある
いはポリクローナルで良く、イムノアッセイに使用する
前に抗体を精製しておくことが望ましい。

【０１２２】ウイルスからのゲノムの抽出、cDNAライブ
ラリーの調製およびプロービング、クローンの配列決
定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、ラジオイム
ノアッセイあるいはELISAアッセイのような免疫学的ア
ッセイの実施、培養による細胞の増殖、等に使用される
一般的技術は当分野で公知であり、これらの技術を記載
したラボラトリーマニュアルは入手できるが、一般的指
針として、これらの方法に関する現在得られる情報源、
および実施する際に有用な物質を以下に記載する。

【０１２３】指定の宿主と適合する適切な制御配列が使
用できるなら、望みのコード配列を発現させるために、
原核および真核宿主細胞が使用し得る。原核細胞宿主の
中ではE.coliが最も頻繁に使用されている。原核細胞用
の発現制御配列は、プロモーターを含み、オペレーター
部分、およびリボソーム結合部位を随意に含む。原核細
胞宿主に適合するトランスファーベクターは、通常は、
例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付
与するオペロンを含んだプラスミドpBR322、および、抗
生物質耐性マーカーを付与する配列を含んだ種々のpUC
ベクターから誘導される。これらのマーカーは、選択に
よりうまく形質転換体を得るために使用し得る。通常使
用される原核細胞の制御配列には、β-ラクタマーゼ(ペ
ニシリナーゼ)、およびラクトースプロモーターシステ
ム(Changら(1977), Nature 198:1056)、トリプトファン
(trp)プロモーターシステム(Goeddelら(1980) Nucleic
Acid Res. 8:4057)、および、λ-由来のＰ_Lプロモータ
ーおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位(Shimatakeら(198
1) Nature 292:128)、およびtrpおよびlac UV5プロモー
ターの配列に由来するハイブリッドtacプロモーター(De
Boerら(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 292:128)が含
まれる。以上のシステムは特にE.coliに適合したもので
ある；所望するならば、BacillusあるいはPseudomonas
の株のような他の原核細胞宿主も対応する制御配列と共
に使用し得る。

【０１２４】真核細胞宿主には、培養システム中の酵母
および哺乳類細胞が含まれる。Saccharomyces cerevisi
ae、Saccharomyces carlsbergensis、Klebsiela lactis
およびPichia pastorisは、最も一般的に使用される酵
母宿主であり、便利な真菌宿主である。酵母に適合した
ベクターは、栄養素要求性変異株に原栄養菌性を変換、
あるいは、野生株に重金属耐性を付与することによる、
首尾良い形質転換体の選択を可能とするマーカーを有し
ている。酵母に適合したベクターは、２micron複製開始
点(Broachら(1983) Math Enz. 101:307)、CEN3およびAR
S1の組合せ、あるいは、宿主細胞ゲノムに適切な断片の
組み込みをもたらす配列のような複製を保証する他の手
段を使用し得る。酵母ベクター用の制御配列は、当分野
で公知であり、解糖酵素合成のプロモーター(Hessら(19
68) J.Adv.Enzyme Eng. 7:149；Hollandら(1978), J.Bi
ol.Chem. 256:1385)を含み、これには３フォスフォグリ
セレートキナーゼ(Hitzeman (1980), J.Biol.Chem. 25
5:2073)が含まれる。さらに、エノラーゼ遺伝子に由来
するような転写停止信号(Holland (1981), J.Biol.Che
m.256:1385)も含まれ得る。特に有用な制御システム
は、グリセルアルデヒド-3フォスフェートデヒドロゲナ
ーゼ(GAPDH)プロモーター、あるいはアルコールデヒド
ロゲナーゼ(ADH)を調節し得るプロモーター、これもGAP
DHに由来する転写停止信号、そして分泌が望ましいなら
ば、酵母α因子からのリーダー配列を含むものである。
加えて、作動可能に結合された転写調節領域および転写
開始領域は、野生種生物では天然に結合しないような様
式であり得る。これらのシステムは、欧州特許公開第12
0,551号、欧州特許公開第116,201号、および欧州特許公
開第164,556号(本明細書ではこれら全てを参考文献とし
て援用する)に詳細に記載されている。

【０１２５】発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞
株は、当分野で公知であり、HeLa細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細
胞、および多くの他の細胞株を含む、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション(ATCC)から得られる多くの不死
化細胞株が含まれる。哺乳類細胞用の適切なプロモータ
ーもまた、当分野で公知であり、Simian Virus 40(SV4
0)(Fiers (1978), Nature 273:113)、ラウスサルコーマ
ウイルス(PSV)、アデノウイルス(ADV)、およびウシパピ
ローマウイルス(BPV)、からのもののようなウイルスプ
ロモーターが含まれる。哺乳類細胞はまた、転写停止信
号およびポリＡ付加配列を必要とし得る；発現を増大さ
せるエンハンサー配列もまた含まれ得、そして遺伝子の
増幅を引き起こす配列もまた望ましい。これらの配列
は、当分野で公知である。哺乳類細胞中での複製に適し
たベクターは、ウイルスレプリコン、あるいは宿主ゲノ
ムへのNANBVエピトープをコードする適切な配列の組込
みを保証する配列を含み得る。

【０１２６】ワクシニアウイルスシステムもまた、哺乳
類細胞中で外来DNAを発現させるために使用し得る。異
種遺伝子を発現させるために、通常、この外来DNAはワ
クシニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入さ
れ、そして次に感染した細胞を選択し得る。この方法は
当分野で公知であり、さらなる情報は以下の文献中に見
いだされる［Mackettら、J.Virol.49：857-864 (1984)
およびDNA Cloning, Vol.2の第７章、IRL Press］。

【０１２７】加えて、ウイルス抗原は、バキュロウイル
スシステムにより昆虫細胞中で発現し得る。Summerおよ
びSmithによるバキュロウイルスの発現に関する概説ガ
イドブックは、A Manual of Methods for Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures (Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555)
である。異種遺伝子をバキュロウイルスゲノムに組込む
ために、先ず遺伝子を、バキュロウイルス配列を幾つか
含むトランスファーベクターにクローニングする。この
トランスファーベクターを、昆虫細胞へ野生型ウイルス
と共に同時にトランスフェクトすると、野生型ウイルス
との組換えが起こる。通常トランスファーベクターは、
異種遺伝子が野生型バキュロウイルスの多面体遺伝子を
崩壊させるように作成されている。この組換えウイルス
に感染した細胞は、野生型ウイルスに感染した細胞とは
表現形が異なっているので、この崩壊により組換えウイ
ルスの選択が容易となる。精製された組換えウイルス
は、細胞を感染させ、異種遺伝子を発現させるために使
用し得る。もしシグナルペプチドを異種遺伝子のフレー
ムに結合してあれば、外来タンパク質は培地中に分泌さ
れ得る；そうでない場合には、タンパク質は細胞の溶解
物に結合している。さらなる情報は、SmithらのMol.& C
ell.Biol.3：2156-2165 (1983)、あるいはLuckowおよび
SummersのVirology 17:31-39 (1989)を参照。

【０１２８】形質転換は、例えば、ウイルス中にポリヌ
クレオチドをパッケージングしそして宿主をウイルスで
変換する、およびポリヌクレオチドの直接の取り込みを
含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための
任意の方法によって行い得る。使用される形質転換法
は、形質転換される宿主に依存する。直接の取り込みに
よる細菌の形質転換は一般に、塩化カルシウムあるいは
塩化ルビジウムでの処理を用いている(Cohen (1972), P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110；Maniatisら(1982), M
OLECULAR CLONING；A LABORATORY MANUAL (Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor. N.Y.))。直接の
取り込みによる酵母の形質転換は、Hinnenら(1978) Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929の方法により行い得る。
直接の取り込みによる哺乳類細胞の形質転換は、Graham
およびVan der Eb (1978), Virology 52:546のリン酸カ
ルシウム沈降法を、あるいはそれの公知の種々の変法を
用いて行い得る。

【０１２９】ベクターの構築は、当分野で公知の方法を
用いて行う。部位特異的なDNAの開裂を、適切な制限酵
素で、これらの市販されている酵素の製造者により通常
は特定された条件下で、処理することにより行われる。
開裂された断片は、Methodsin Enzymology (1980) 65:4
99-560に見いだされる一般的方法に従って、ポリアクリ
ルアミドあるいはアガロースのゲル電気泳動法を用いて
分離し得る。非平滑末端の開裂断片は、E.coli DNAポリ
メラーゼＩ(クレナウ断片)を用い、混合物中の適切なデ
オキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の存在下で、平滑末
端化し得る。S1ヌクレアーゼでの処理もまた使用し得、
如何なる一本鎖DNA部分も加水分解される。

【０１３０】ライゲーションは、標準的なバッファーお
よび温度条件を用い、T4 DNAリガーゼおよびATPを用い
て行われる；非平滑末端のライゲーションは、平滑末端
のライゲーションに比べ、ATPおよびリガーゼが少なく
て済む。ベクター断片がライゲーション混合物の一部分
として用いられた場合、５'-リン酸を除去し、そしてそ
の結果ベクターの再ライゲーションを妨害する目的でし
ばしば、ベクター断片を細菌アルカリフォスファターゼ
(BAP)あるいは仔ウシ腸アルカリフォスファターゼで処
理する；あるいは、ライゲーションを妨害するために不
要な断片の制限酵素消化が使用され得る。ライゲーショ
ン混合物は、E.coliのような適切なクローニング宿主に
形質転換され、成功した形質転換体は、例えば抗生物質
耐性により選択され、そして正しい構築に関してスクリ
ーニングされる。

【０１３１】合成オリゴヌクレオチドは、Warner (198
4)，DNA 3:401に記載されているように、自動オリゴヌ
クレオチド合成装置を用いて調製し得る。所望するなら
ば、³²P-ATPの存在下で、反応の標準的条件を用いて、
ポリヌクレオチドキナーゼで処理することで、合成鎖を
³²Pで標識し得る。cDNAライブラリーから単離されたも
のを含む、DNA配列は、例えば、Zoller (1982), Nuclei
c Acids Res.10:6487に記載された部位特異的変異誘発
を含む、既知の方法で改変し得る。

【０１３２】DNAライブラリーは、GrunsteinおよびHogn
ess (1975), Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:3961の方法を
用いてプローブし得る。簡単に説明すると、この方法で
は、プローブされるDNAはニトロセルロースフィルター
に固定され、変性され、そしてバッファーでプレハイブ
リダイゼーションされる。バッファー中のホルムアミド
の％、および、プレハイブリダイゼーションおよび引さ
続くハイブリダイゼーション工程の時間および温度条件
は、必要とされるストリンジェンシーに依存する。低い
ストリンジェンシー条件を要求するオリゴマープローブ
は一般に、低いホルムアミド濃度、低い温度、および長
いハイブリダイゼーション時間で用いられる。cDNAある
いはゲノム配列から由来するもののように、30個あるい
は40個より多いヌクレオチド以上を含んだプローブに
は、一般に、より高い温度、例えば約40〜42℃、そして
高い％の、例えば50％のホルムアミドを用いる。プレハ
イブリダイゼーションの後、５'-³²P-標識オリゴヌクレ
オチドプローブをバッファーに加え、そしてフィルター
をハイブリダイゼーション条件下でこの混合物とインキ
ュベートする。洗浄後、処理されたフィルターをオート
ラジオグラフィーにかけ、ハイブリダイゼーションした
プローブの位置を表示させる；元のアガープレート上の
対応する位置のDNAを、所望のDNAの材料として使用す
る。

【０１３３】酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を、抗
原あるいは抗体の濃度の測定に使用し得る。この方法
は、抗原あるいは抗体のいずれかに結合させた酵素に依
存し、そして、結合した酵素活性を定量的標識として用
いる。抗体を測定するために、既知の抗原を固相(例え
ば、マイクロプレートあるいはプラスチックカップ)に
固定し、試験する希釈血清とインキュベートし、洗浄
し、酵素で標識した抗イムノグロブリンとインキュベー
トし、そして再び洗浄する。標識に適した酵素は、当分
野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
を含む。固相に結合した酵素活性を特異的基質の添加、
そして生成物形成あるいは基質の利用を比色的に測定に
より測定する。結合した酵素活性は、結合した抗体量の
直接機能である。

【０１３４】抗原を測定するには、既知の特異的抗体を
固相に固定し、抗原を含む試験材料を添加し、インキュ
ベーションの後、固相を洗浄し、そして第二の酵素標識
した抗体を加える。洗浄後、基質を添加し、そして酵素
活性を比色的に測定し、そして抗原濃度に関連させる。

【０１３５】

【実施例】

（実施例１）この実施例には、HCV/J1およびHCV/J7のヌ
クレオチド配列のクローニングが記載されている。

【０１３６】両方のHCVビリオン源として用いられた血
液試料は、抗HCV抗体アッセイで陽性であった。これら
の試料からのHCV分離株を、HCV/J1およびHCV/J7と命名
した。J1分離株を含有する血液試料の感染力は、受血者
の将来的な輸血後の経過の研究によって確認された。Na
tional Tokyo Chest Hospitalの外科のTohru Katayama
博士は、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の患者から採血した。さら
に彼は、これらの患者への各々の血液供与者からの血液
試料も集めた。次に、これらの試料を、C100-3 HCV1抗
原(欧州特許公開第318,216号)に対する抗体についてア
ッセイしたところ、供与者の１人からの血液が陽性であ
った。

【０１３７】血液試料からのRNAの単離は、超遠心分離
による血液試料中のビリオンをペレット化することから
始めた［Bradley,D.W., McCaustland,K.A., Cook E.H.,
Schable,C.A., Ebert,J.W.およびMaynard,J.E.(1985)
Gastroenterology 88, 773-779］。次に、RNAを、塩化
グアニジニウム／塩化セシウム法によってペレットから
抽出し［Maniatis T., Fritsch,E.P.,およびSambrook
J.(1982) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbo
r］、そして、さらに尿素存在下に、フェノール／クロ
ロホルム抽出によって精製した［Berk,A.J.Lee,F., Har
rison,T., Williams,J.およびSharp,P.A.(1979) Cell 1
7, 935-944］。

【０１３８】HCV1のヌクレオチド配列のC/E、Ｅ、E/NS
1、NS3およびNS5ドメインから、合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーの５組のぺアーを設計して、J1およびJ7の
ゲノムから断片を単離した。プライマーの第１番目の組
は、コアドメインおよびいくつかのエンベロープドメイ
ンの配列を単離して分析するためのものであった。プラ
イマーの第２番目の組は、エンベロープドメイン中の配
列の単離のためのものであった。プライマーの第３番目
の組は、推定エンベロープドメインおよび非構造ドメイ
ン１、すなわちNS1の領域が重なったドメインの断片を
単離するためのものであった。プライマーの第４および
第５番目の組は、非構造ドメイン３および５、すなわち
NS3およびNS5の断片を単離するために用いた。種々のプ
ライマーの配列を以下に示す：C/E領域のプライマーの
配列は、 21S 5' CGTGCCCCCGCAAGACTGCT 3' J80A 5' CCGTCCTCCAGAACCCGGAC 3' である。

【０１３９】Ｅ領域のプライマーの配列は、 71S 5' GCCGACCTCATGGGGTACAT 3' J132A 5' AACTGCGACACCACTAAGGC 3' である。

【０１４０】E/NS1の領域のプライマーの配列は、 127S 5' TGGCATGGGATATGATGATG 3' 166A 5' TTGAACTTGTGGTGATAGAA 3' である。

【０１４１】NS3領域のプライマーの配列は、 464S 5' GGCTATACCGGCGACTTCGA 3' 526A 5' GACATGCATGTCATGATGTA 3' である。

【０１４２】NS5領域のプライマーの配列は、 870S 5' GCTGGAAAGAGGGTCTACTA 3' 917A ５’ ＧＴＴＣＴＴＡＣＴＧＣＣＣＡＧＴＴ
ＧＡＡ ３’ である。

【０１４３】アンチセンスプライマー１６６Ａ、526Aあ
るいは911Aの１μgを10ユニットの逆転写酵素(Biorad)
に加えて、単離されたRNAを鋳型としてからcDNA断片を
合成した。次に、適切なセンスプライマー21S、71S、12
7S、464Sあるいは870Sの１μgを加えた後、cDNA断片を
標準的なポリメラーゼチェーンリアクションによって増
幅した［Saiki,R.K., Scharf,S., Faloona,F., Mullis,
K.B., Horn G.T., Erlich,H.A.およびArnheim,N.(1985)
Science 230, 1350-1354］。

【０１４４】PCR法によって増幅されたcDNA断片をゲル
単離し、pUC119のSmaI部位[Vieira,J.およびMessijng,
J.(1987) Methods in Enzymology 153, 3-11］、あるい
はクローニングベクターcharomid 9-42［Saito,I.およ
びStark,G.(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8664-86
68］の誘導体であるcharomid SBのSnaBI部位に平滑末端
結合してクローン化した。５個のウイルスドメインの断
片を含有するクローンを首尾よく構築した。

【０１４５】（実施例２）日本の分離株J1およびJ7のPC
R反応から、C/E、E、E/NS1、NS3およびNS5のそれぞれの
領域の、３つの個々のクローンを、ジデオキシチェイン
ターミネーション法によって配列決定した。

【０１４６】C/E以外の全領域の配列は、J1分離株から
単離した。C/E領域の配列のみ、J7分離株から単離し
た。意外にも、両方の分離株から単離された断片は、HC
V1ゲノムから推測されるよりも長くも短くもなかった。
しかし、同じ領域の配列を含有するクローン間には異質
性が存在する。従って、コンセンサス配列は、図１〜図
１３にそれぞれ示されているように、C/E、E、E/NS1、N
S3およびNS5のそれぞれのドメインについて構築した。
これらの相違は、PCRでの増幅中に無作為に生じた人工
なものとして説明され得る［Saiki,R.K., Scharf,S., F
aloona,F., Mullis,K.B., Horn G.T., Erlich,H.A.およ
びArnheim,N.(1985) Science 230, 1350-1354］。他の
説明は、１人の健康な保持者の血漿に１つ以上のウイル
スゲノムが存在していて、これらのゲノムがヌクレオチ
ドレベルでは異質であるというものである。

【０１４７】この点を明確にするために、何個のヌクレ
オチドの相違がアミノ酸の変化を導くのか、例としてJ1
分離株のNS3ドメインの配列を用いて決定した。５個の
ヌクレオチドの相違のうち、３個がアミノ酸コドンの３
番目の位置であって、アミノ酸配列を変化させない。残
りの２個のヌクレオチドの相違の両方とも、アミノ酸コ
ドンの１番目の位置であって、スレオニンからアラニン
への変化、およびプロリンからアラニンへのアミノ酸の
変化を生じた。これら全ては、小さな中性アミノ酸残基
である。同様に、他のドメインでのヌクレオチドの相違
が分析されるときも、多くのサイレントな保持された変
異が認められる。これらの結果は、１人の健康な供与者
の血漿中のHCVゲノムのヌクレオチド配列が、ヌクレオ
チドレベルで異質であることを示唆している。

【０１４８】さらに、各々の断片に対するコンセンサス
配列がまとめられると、各々の配列を、図１４〜図２７
に記載されているHCV1分離株と比較した。図１４〜図１
６では、J7分離株のC/E領域の断片が、HCV1分離株に対
して、512/552で92.8％のヌクレオチド相同性および150
/154で97.4％のアミノ酸相同性を有することが示されて
いる。図１７〜図１９では、J1のEドメインの断片は、H
CV1に対して僅かに低いヌクレオチド相同性およびアミ
ノ酸相同性を、それぞれ76.2％および82.9％有すること
が示されている。エンベロープドメインおよび非構造ド
メイン１個に重なっているJ1分離株の断片は、図２０お
よび図２１に示されているように、HCV1に対して最も低
い相同を有する。そこでは、J1分離株は、HCV1に対して
71.5％ヌクレオチド相同性および73.5％アミノ酸相同性
を有する。図２２〜図２４では、J1のNS3ドメインの断
片とHCV1との比較が示されている。ヌクレオチド配列間
の相同性は79.8％であって、一方、分離株間のアミノ酸
相同性は、アミノ酸で179/194、あるいは92.2％と大変
高い。図２５〜図２７では、J1のNS5配列とHCV1と間の
相同性が示されている。この配列は、84.3％のヌクレオ
チド相同性および８８．７％のアミノ酸相同性を有す
る。

【０１４９】上記実施例に記載されているベクターは、
Ｐａｔｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏ
ｓｉｔｏｒｙ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ， Ａｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｔ１−３， Ｈｉｇａｓｈｉ １−ｃｈｏｍｅ Ｔｓ
ｕｋｕｂａ−ｃｈｉ， Ｉｂａｒａｇｉ−ｋｅｎ ３０
５， Ｊａｐａｎに寄託されていて、ブダペスト条約の
もとに維持されている。受託番号および寄託日は表１に
示されている。

【０１５０】（実施例３）HCV/J1クローンであるJ1-151
9は、本質的には上記記載の方法によって単離した。し
かし、単離に用いたプライマーは、J159Sおよび199Aで
あった。オリゴマーのプライマーJ159Sおよび199Aの配
列は、以下に示すものであって、これらはJ1-1216およ
びHCV1中の配列に基づいている。 J159S 5' ACT GCC CTG AAC TGC AAT GA 3' 199A 5' AAT CCA GTT GAG TTC ATC CA 3'

【０１５１】クローンJ1-1519は、367ヌクレオチドのHC
V cDNA配列を含有する。これはNS1領域の５'側のほとん
ど半分に広がっていて、そしてＥ領域のクローンJ1-121
6と31個のヌクレオチドが重なっている。この領域に広
がっている３つのそれぞれのクローンは配列決定され、
３つのクローンから得たこの領域の配列は、同一であっ
た。J1-1216(図中ではJ1として示されている)のHCV cDN
Aの配列およびここに(上記に示されているヌクレオチド
配列)コードされるアミノ酸配列が図６０〜図６２に示
されている。さらに、図６０〜図６２には、J1-1216と
プロトタイプHCV1 cDNAの比較し得る領域との配列の相
違(図中ではPTで示されている)、およびそれによって得
られるコードされたアミノ酸の変化が示されている。J1
-1216とHCV1 cDNAとの間の相同性は、ヌクレオチドレベ
ルで約70％、そしてアミノ酸レベルで約75％である。

【０１５２】J1分離株の推定されるコアからNS1領域に
かけての配列組成は、図６３〜図６８に示されていて、
さらに、図中にはJ1配列コードされたアミノ酸が示され
ている。HCV1プロトタイプ配列からの変化は、J1のヌク
レオチド配列の下の行に示している。そして破線は相同
の配列を示している。HCV1プロトタイプ配列中にコード
された相同でないアミノ酸は、HCV1のヌクレオチド配列
の下に示されている。

【０１５３】J1/1519 HCV cDNAを含有するクローン化さ
れたもの(pS1-1519)は、DH5αに維持されていてPatent
Microorganism Depositoryに寄託されている。

【０１５４】（実施例４）HSV1(欧州特許公開第318,216
号を参照)の5-1-1ポリペプチドをコードする領域を取り
囲む、推定のNS3−NS4領域、および推定NS1−E領域から
のC200−C100領域を含む、J1分離株の数個の領域をPCR
法によって増幅した。このC200−C100領域は、プロトタ
イプHCV1の3799から5321のヌクレオチドを含む。抽出
を、プロティナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム(S
DS)(Maniatis(1982)、前述)の存在下でグアニジニウム
チオシアネートで行った以外は、上記のようにRNAを抽
出した。各々のプライマー１μM、40ユニットのRNアー
ゼインヒビター(RNASIN)、５ユニットのAMV逆転写酵
素、および反応に必要な塩および緩衝液を含む25μl反
応液中でインキュベートして、RNAをHCV cDNAへ転写し
た。指定された領域からのHCVcDNAのセグメントの増幅
は、合成オリゴマーの16-merプライマーのぺアーを用い
て行った。PCR増幅を３回(PCRＩ、PCRII、およびPCRII
I)行って完成した。PCR増幅の２回目および３回目(PCRI
I)には、異なったPCRプライマーの組を用いた。１回目
のPCR反応物を10倍に希釈し、そして新しいプライマー
を用いて複数回のPCR増幅を行ったので、最終的に最高
で50％の１回目のPCR反応(PCRＩ)の生成物がさらに増幅
された。領域の増幅に用いたプライマーは、下記に示し
た。J1分離株の配列由来のJ1C200-3を除いて、これらの
プライマーは、プロトタイプHCV1配列由来であった。

【０１５５】NS3−NS4の「5-1-1」領域の増幅用のプラ
イマー PCRＩ511/16A (センス、HCV1の1528番から始まるヌクレオチ
ド由来) 5' AAC AGG CTG CGT GGT C 3'511/16B (アンチセンス、HCV1の5260で終わるヌクレオ
チド由来) 5' AGT TGG TCT GGA CAG C 3' PCR II511/35A (センス、HSV1の5057番から始まるヌクレオチ
ド由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTGAATTC TCG TCT TGT CCG GGA AGC CGG CAA TC
3'511/35B (アンチセンス、HSV1の5233番で終わるヌクレ
オチド由来のHCV部分タンパク質；制限酵素部位には下
線が引いてある) 5' CTTGAATTC CCT CTG CCT GAC GGG ACG CGG TCT GC
3' PCR III511/35A (前述参照)VSNrc7 (アンチセンス、HSV1の5804番で終わるヌクレオ
チド由来である) 5' GTA GTG CGT GGG GGA AAC AT 3'

【０１５６】「NS1/E」領域の増幅用のプライマー PCRＩJ1(E2)3 (センス、HSV1の953番から始まるヌクレオチド
由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTAGAATTC TGG CAT GGG ATA TGA TGA TG 3'J1(E)4 (センス、HSV1の1087番から始まるヌクレオチド
由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTAGAATTC TCC ATG GTG GGG AAC TGG GC 3'J1rc12 (アンチセンス、HSV1の1995番で終わるヌクレオ
チド由来であるHCV部分；制限酵素部位には下線が引い
てある) 5' CTTGAATTCC TAA CGG GCT GAG CTC GGA 3'J1rc13 (アンチセンス、HSV1の1941番で終わるヌクレオ
チド由来であるHCV部分；制限酵素部位には下線が引い
てある) 5' CTTAGAATTC CGT CCA GTT GCA GGC AGC TTC 3' PCR IIJ1rc13 (前記参照)J1IZ-1 (センス、HCV部分はHCV1の1641番から始まるヌ
クレオチド由来；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTGAATTC CAA CTG GTT CGG CTG TAC A 3'J1IZ-2 (センス、HCV部分はHCV1の1596番から始まるヌ
クレオチド由来；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' TGA GAC GGA CGT GCT GCT CCT 3'

【０１５７】「NS3−NS4」領域のC200−C100領域用のプ
ライマー PCRＩJ1C200-1 (センス、HCV1の3478番から始まるヌクレオチ
ド由来である) 5' TCC TAC TTG AAA GGC TC 3'J1C200-3 (アンチセンス、HCV1の4402番で終わるヌクレ
オチド由来である) 5' GGA TCC AAG CTG AAA TCG AC 3'J1rc52 (アンチセンス、HCV1の5853番で終わるヌクレオ
チド由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いてあ
る) 5' CTTAGAATTC GAG GCT GCT GAG ATA GGC AGT 3'511/16A (前記参照) PCR IIJ1C200-2 (センス、HCV1の3557番から始まるヌクレオチ
ド由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTGAATTC CCC GTG GAG TGG CTA AGG CGG TGG ACT
3'J1C200-4 (アンチセンス、HCV1の4346番で終わるヌクレ
オチド由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いて
ある) 5' CTTGAATTC TCG AAG TCG CCG GTA TAG CCG GTC ATG
3'511/35A (前記参照)J1rc51 (アンチセンス、HCV1の5826番で終わるヌクレオ
チド由来のHCV部分；制限酵素部位には下線が引いてあ
る) 5' CTTAGAATTC GGC AGC TGC ATC CTC CGG CAC 3'

【０１５８】増幅されたHCV cDNAは、クローニングしな
いで直接に、および／またはクローニングして、配列決
定した。配列決定は、本質的にはShyamalaおよびAmes,
J.Bacteriology 171:162 (1989)に記載されているよう
に、アシンメトリックPCR法によって行った。この方法
では、cDNAの増幅は、１つの鎖の増幅が優先して行われ
るように、プライマーの１つの濃度を制限(通常、約
１：50の割合)して行う。次に、優先的に増幅された鎖
は、ジデオキシチェインターミネーション法によって配
列決定される。

【０１５９】PCR法によるアシンメトリック配列決定に
用いるプライマーを下記に示す。NS1領域用：J1lZ-1お
よびJ1rc13(両方とも配列決定されている)；J1lZ-2、J1
rc13(両方の鎖で確認されている)。C200-C100のＮ末端
領域、C200-C100のＣ末端領域、および5-1-1領域を含有
するNS3−NS4領域用：J1C200-2およびJ1C200-7(C200-C1
00のＮ未端領域に対する)およびJ1C200-4およびJ1C200-
6(C200-C100のＣ末端領域に対する)；および511/35Aお
よびhep 4(5-1-1領域に対する)。J1C200-2、J1C200-4、
および511/35Aの配列は、前記に示されている；hep 4、
J1C200-6、およびJ1C200-7の配列は、以下に示す。hep 4 (HCV1の5415番から始まるヌクレオチド由来であ
る) 5' TT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'J1C200-6 (HCV1の3875番から始まるヌクレオチド由来の
HCV部分；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTGAATTC CGT ACT CCA CCT ACG GCA AGT TCC TT
3'J1C200-7 (HCV1の3946番から始まるヌクレオチド由来の
HCV部分；制限酵素部位には下線が引いてある) 5' CTTGAATTC GTG GCA TCC GTG GAG TGG CAC TCG TC
3'

【０１６０】「NS1」領域、C200-C100領域および5-1-1
領域のアシンメトリック配列決定によって得られた配列
は、それぞれ図６９および図７０、ならびに図７１〜図
７６に示されている。図中、J1配列にコードされるアミ
ノ酸は、J1のヌクレオチド配列の上に示されている。J1
配列とHCV1のプロトタイプヌクレオチド配列との差は、
J1配列の下に示されている(棒線は、両方の配列の相同
なヌクレオチドを示している)。HCV1のプロトタイプ配
列の異なるコードされるアミノ酸配列は、HCV1のヌクレ
オチド配列の下に示されている。

【０１６１】NS1領域、C200-C100領域、および5-1-1領
域のHCV cDNAをクローン化した。推定NS1領域の300bpお
よび230bpの断片を、宿主HB101中で、商業的に入手可能
なベクターの誘導体pGEM-3Zにクローン化して、そしてA
W-300bpとしてATCCに寄託した。誘導体ベクターは、元
来のpCEM-3Zポリリンカー、完全なAmp^r遺伝子、および
E.coliでの複製に必要な遺伝子を維持している。HCV cD
NA断片は、SacIおよびXbaIで取り出し得る。C200のＮ末
端断片770bpを含有するHCV cDNAを、HB101でpM1Eにクロ
ーン化して12クローンをプールし、AW-770bp-NとしてAT
CCに寄託した。HCV cDNAは、HaeIIによってベクターか
ら取り出し得る。得られたHaeII断片は、５'末端および
３'末端にそれぞれ300bpおよび250bpのベクターDNAを含
有する。また700bpのC200のＣ末端断片(AW-700bp-C)を
含有するHCV cDNAを、M13mp10にクローン化して宿主DH5
α-F'に維持した；クローニングはベクターのポリリン
カー部位に行った。得られたファージをプールして、AW
-700bp-NあるいはAW-700bp-Cとして1990年9月11日にATC
Cに寄託した。HCV1の5-1-1領域に等しいJ1からのHCVcDN
Aを、mp191 R1部位にクローン化し、そしてDH5α-F'中
に維持した。このクローニングからのいくつかのm13フ
ァージ上清をプールして、J1 5-1-1としてATCCに1990年
9月11日に寄託した。HCV cDNAはファージをEcoRI処理し
て得られ得る。J1 5-1-1およびAW-700bp-NあるいはAW-7
00bp-Cの受託番号は、ATCCの(301)881-2600に電話で問
い合わせれば得られる。

【０１６２】上記のクローン化されたものは、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託されてい
る。

【０１６３】（実施例５）J1分離株の予想される「NS
1」領域の配列を含有するHCV cDNAライブラリーは、λ-
gt22に直接クローニングすることによって得られた。
「NS1」領域は、HCV1のプロトタイプ核酸配列の番号系
の、ヌクレオチド約1460番からヌクレオチド約2730番に
拡がっている。ここで、ヌクレオチドの１番目は、推定
されるポリタンパク質の開始メチオニンコドンの最初の
ヌクレオチドである。HCV cDNAの１番目および２番目の
鎖の合成用のプライマーは、それぞれJHC67およびJHC68
であって、RNA源はJ1血漿であったこと以外は、クロー
ニングは、本質的には、HanおよびRutterのGENETIC ENG
INEERING, Vol.10 (J.K.Setlow編, Plenum publishing
Co.,1988)に記載されている方法によってなされた。こ
の方法では、RNAは低温においてグアニジウムチオシア
ネートで抽出する。次に、全長のcDNAに変換し、これを
λファージに、lacZプロモーターの特定の方向にクロー
ン化する。この方法によって、J1 RNAに対するHCV cDNA
を、λ-gt22のNotI部位に挿入した。ライブラリー中に
「NS1」配列が存在することは、Alx54プローブを用いて
検出した。

【０１６４】図６３〜図６８に示されている領域と約20
ヌクレオチドが重なって、この領域から下流の「NS1」
領域の配列は、PCR増幅用のプライマーとしてAlx61およ
びAlx62に変えて、上記のアシンメトリック配列決定法
によって決定した。得られた配列は、図７７および図７
８に示されている。(PCR増幅は、ヌクレオチドの約1930
番からヌクレオチドの約2340番の領域であって、この領
域は、図６９および図７０に示されている配列にも含ま
れることに注意。)λ-gt22のHCV cDNAライブラリーを得
るため、および「NS1」領域の部分の配列を決定するた
めに用いたプライマーおよびプローブの配列は、以下に
示した。JHC 67 5' GACGC GGCCG CCTCC GTGTC CAGCG CGT 3'JHC 68 5' CGTGC GGCCG CAAGA CTGCT AGCCG AGGT 3'ALX 61 5' ACCTG CCACT GTGTA GTGGT CAGCA GTAAC 3'ALX 62 5' ACGGA CGTCT TCGTC CTTAACAATA CCAGG 3'ALX 54 5' GAACT TTGCG ATCTG GAAGACAGGG ACAGG 3'

【０１６５】配列決定された領域由来のJ1 HCV cDNAの4
00bpの断片を、pGEM3zにクローン化してHB101に維持し
た。HCV cDNAは、SacIおよびXbaIによってベクターから
取り出し得る。ベクター(JH-400bp)で形質転換された宿
主細胞は、ATCCに寄託されている。

【０１６６】プールされた。DNAライブラリーは、J1血
清からつくった。プールされたライブラリーはJ1ゲノム
を全般にわたって含み、HCV-J1 λ gt22として同定され
る。プールされたcDNAライブラリーは、11個の別々のcD
NAライブラリーの一部をプールしてつくった。このライ
ブラリーは、そのゲノムを全般にわたって含んだHCVcDN
Aを得るために設計されたプライマーからライブラリー
をつくること以外は、上記の直接(directional)クロー
ニング法によって調製した。このプライマーは、HCV1の
配列由来であって、JHC67およびJHC68を含んでいた。HC
V cDNAを、λ-gt22のNotI部位に挿入した。プールされ
たcDNAライブラリーHCV-J1 λ gt22は、ATCCに寄託され
ている。

【０１６７】（実施例６）図６３〜図６８に示されてい
る配列の上流のポリヌクレオチドの領域の配列を決定し
た。この領域は、HCV-1(図２９〜図５９参照)のヌクレ
オチドの-267位から始まり、560個のヌクレオチドに広
がる。J1血清から抽出したRNAからHCV cDNAを調製し、
そしてPCR法によってHCV cDNAを増幅して配列決定がな
された。

【０１６８】RANは、プロティナーゼＫおよびドデシル
硫酸ナトリウム(SDS)で処理した後、血清100μlから抽
出した。試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、RN
Aをエタノールで沈澱させた。

【０１６９】J1分離株由来のHCV cDNAを、沈澱させたRN
Aを0.01MのMeHgOHで変性させて調製した；10分間室温で
放置した後、2-メルカプトエタノールを水銀イオンを離
すためにsequesterに加えた。直ちに、cDNA合成の第一
番目の鎖用の混合物を加えて、37℃で１時間インキュベ
ートを続けた。アンチセンス鎖の合成の条件を、以下に
示した：50mM Tris HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgC
l₂、10mMジチオスレイトール、500μMの各々のデオキシ
ヌクレオチド３リン酸、250pmolの特定のアンチセンスc
DNAプライマーr25、250ユニットのMMLV逆転写酵素。第
２の鎖(センス)を合成するために、合成反応成分を加え
て14℃で１時間インキュベートした。第２の鎖の反応成
分を以下に示した：14mM Tris HCl、pH8.3、68mM KCl、
7.5mM硫酸アンモニウム、3.5mM MgCl₂、2.8mMジチオス
レイトール、25ユニットのDNAポリメラーゼＩおよび１
ユニットのRNアーゼＨ。反応は、試料を95℃で10分間加
熱して停止した。その後、氷上で冷却した。

【０１７０】HCV cDNAを、PCRを２回行って増幅した。
１回目は、20μlのcDNA混合物を用いて行った。PCR反応
条件を以下に示した：10mM Tris HCl、pH8.3、50mM KC
l、1.5mM MgCl₂、0.002％ゼラチン、各々のデオキシヌ
クレオチド３リン酸200mM、および2.5ユニットのAmplit
aq。PCRの温度サイクルは、以下に示すとおりであっ
た：94℃１分間、50℃１分間、72℃１分間、40回繰り返
した後、72℃７分間。PCRの第２回目は、PCR産物の特異
性を増すために、組み合わされたプライマー(すなわ
ち、PCR増幅の第１回目の産物の内部領域に結合された
プライマー)を用いて行われた。第１回目のPCR反応物の
１パーセントを、プライマーを取り替え、そしてPCR反
応の第２工程を、50℃を60℃に変えて行った以外は、本
質的には第１回目のように増幅した。PCRの第１回目に
用いたプライマーは、ALX90およびr14であった。PCRの
第２回目に用いたプライマーは、r14およびp14であっ
た。

【０１７１】HCV cDNAの合成用およびPCR法用のプライ
マーの配列を以下に示した： r25 5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3' ALX90 5' CCA TGA ATC ACT CCC CTG TGA GGA ACT A 3' r14 5' GGG CCC CCAG CTA GGC CGA GA 3' p14 5' AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC 3'

【０１７２】PCR産物をゲル精製し、約615bpの位置に移
動したものを単離し、そして標識に³²P-ATPを用いて、S
angerのジデオキシチェーンターミネーション法の変法
によって配列決定した。この変法では、配列の複製はプ
ライマーとしてP32およびR31を用いて開始した；２本鎖
のDNAを複製の前に、３分間95℃で分離し、標識された
ジデオキシによって停止するポリヌクレオチドの合成
は、業者の指針に従って、Bstポリメラーゼ(BioRad Cor
p.より入手した)で触媒した。配列決定は、シーケンシ
ング反応当りPCR産物500ngから１μgを用いて行った。

【０１７３】プライマーP32(センス)およびR31(アンチ
センス)は、それぞれに、HCV1配列のヌクレオチド-137
から-115およびヌクレオチド192から173由来であった。
プライマーの配列を以下に示す。 P32プライマー 5' AAC CCG CTC AAT GCC TGG AGA TT 3' R31プライマー 5' GGC CGX CGA GCC TTG GGG AT 3' ここでX＝AあるいはG

【０１７４】５'非翻訳領域および推定「コア」領域の
一部を含むJ1分離株中の領域の配列は、図７９および図
８０に示す。図中、J1配列中にコードされるアミノ酸は
ヌクレオチド配列の上に示している。プロトタイプHCV1
の配列は、J1配列の下に示している。棒線は、J1と相同
な配列を示す。HCV1配列中にコードされる異なるアミノ
酸は、HCV1配列の下に示されている。

【０１７５】上記の600bp(TC 600bp)のJ1配列を代表す
るHCV cDNA断片を、pGEM3Zにクローン化して、宿主HB10
1に維持した。HCV cDNA断片はSacIおよびXbaIで取り出
し得る。これは、ATCCに寄託されている。

【０１７６】ブダペスト条約に基づいてPatent Microor
ganism Depositoryに寄託されているもの。

【０１７７】

【表１】

【０１７８】実施例に記載されている以下のベクターは
アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)，1230
1 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852に寄託さ
れていて、以下の受託番号が付けられた。寄託物はブダ
ペスト条約に基づいている。

【０１７９】

【表２】

【０１８０】これらの寄託物は当業者の利用に提供され
る。これらの寄託物は、これらの寄託物が本発明を実施
するために必要であることを認めるものでもなければ、
本発明の開示に関する同等の実施態様が当業者の範囲内
に属さないことを認めるものでもない。これらの寄託物
の公衆への入手可能性は、本特許および他の特許のもと
に、寄託物の製造、使用、あるいは販売のライセンスを
与えるものではない。寄託物の塩基配列は、本発明の開
示に引例として引用され、本発明に記載された全ての配
列に関して争いを生じた場合にこれを規制する。

【０１８１】本発明が、当該分野の当業者のために特定
の実施例によって記述したが、本発明の範囲はこれに制
限されない。なぜならば、本発明の開示からさらに別の
実施態様が、当業者には明らかだからである。

【図面の簡単な説明】

【図１】J7 C/Eドメインの断片のコード鎖のコンセンサ
ス配列を、異なる箇所とともに示す。

【図２】図１の続きである。

【図３】図２の続きである。

【図４】J1 Eドメインの断片のコード鎖のコンセンサス
配列を、異なる箇所とともに示す。

【図５】図４の続きである。

【図６】図５の続きである。

【図７】J1 E/NS1ドメインの断片のコード鎖のコンセン
サス配列を、異なる箇所とともに示す。

【図８】図７の続きである。

【図９】J1 NS3ドメインの断片のコード鎖のコンセンサ
ス配列を、異なる箇所とともに示す。

【図１０】図９の続きである。

【図１１】図１０の続きである。

【図１２】J1 NS5ドメインの断片のコード鎖のコンセン
サス配列を、異なる箇所とともに示す。

【図１３】図１２の続きである。

【図１４】HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列との
J7 C/Eのコンセンサス配列の相同性を示す。

【図１５】図１４の続きである。

【図１６】図１５の続きである。

【図１７】J1 Eのコンセンサス配列の、HCV1の同じドメ
インのヌクレオチド配列との相同性を示す。

【図１８】図１７の続きである。

【図１９】図１８の続きである。

【図２０】J1 E/NS1のコンセンサス配列の、HCV1の同じ
ドメインのヌクレオチド配列との相同性を示す。

【図２１】図２０の続きである。

【図２２】J1 NS3のコンセンサス配列の、HCV1の同じド
メインのヌクレオチド配列との相同性を示す。

【図２３】図２２の続きである。

【図２４】図２３の続きである。

【図２５】J1 NS5のコンセンサス配列の、HCV1の同じド
メインのヌクレオチド配列との相同性を示す。

【図２６】図２５の続きである。

【図２７】図２６の続きである。

【図２８】HCV1ゲノムの推定ゲノム構造を示す。

【図２９】HCV1のORFヌクレオチド配列を示す。図で
は、ヌクレオチド番号１は、大きいORFの推定開始メチ
オニンの最初のＡである。このヌクレオチドの上流のヌ
クレオチドはマイナスの番号が賦されている。

【図３０】図２９の続きである。

【図３１】図３０の続きである。

【図３２】図３１の続きである。

【図３３】図３２の続きである。

【図３４】図３３の続きである。

【図３５】図３４の続きである。

【図３６】図３５の続きである。

【図３７】図３６の続きである。

【図３８】図３７の続きである。

【図３９】図３８の続きである。

【図４０】図３９の続きである。

【図４１】図４０の続きである。

【図４２】図４１の続きである。

【図４３】図４２の続きである。

【図４４】図４３の続きである。

【図４５】図４４の続きである。

【図４６】図４５の続きである。

【図４７】図４６の続きである。

【図４８】図４７の続きである。

【図４９】図４８の続きである。

【図５０】図４９の続きである。

【図５１】図５０の続きである。

【図５２】図５１の続きである。

【図５３】図５２の続きである。

【図５４】図５３の続きである。

【図５５】図５４の続きである。

【図５６】図５５の続きである。

【図５７】図５６の続きである。

【図５８】図５７の続きである。

【図５９】図５８の続きである。

【図６０】HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列と比
べた、J1 NS1のドメイン(J1 1519)の断片のコード鎖の
コンセンサス配列を示す。さらに、そこにコードされる
アミノ酸も示す。

【図６１】図６０の続きである。

【図６２】図６１の続きである。

【図６３】HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列と比
べた、J1のコアからNS1ドメインのコンセンサス配列を
示す。さらに、そこにコードされるアミノ酸も示す。

【図６４】図６３の続きである。

【図６５】図６４の続きである。

【図６６】図６５の続きである。

【図６７】図６６の続きである。

【図６８】図６７の続きである。

【図６９】実施例４で決定されたJ1のNS1ドメインのコ
ード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じ
ドメインのヌクレオチド配列およびHCV1およびJ1配列に
コードされるアミノ酸を示す。

【図７０】図６９の続きである。

【図７１】J1のNS3-NS4ドメインのC200領域のコード鎖
のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じドメイ
ンのヌクレオチド配列を示す。さらに、配列中にコード
されるアミノ酸も示す。

【図７２】図７１の続きである。

【図７３】図７２の続きである。

【図７４】図７３の続きである。

【図７５】図７４の続きである。

【図７６】図７５の続きである。

【図７７】実施例５で決定されたJ1のNS1ドメインのコ
ード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じ
ドメインのヌクレオチド配列を示す。さらに、配列中に
コードされるアミノ酸も示す。

【図７８】図７７の続きである。

【図７９】J1の非翻訳ドメインおよびコアドメインのコ
ード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じ
ドメインのヌクレオチド配列、および配列中にコードさ
れるアミノ酸も示す。

【図８０】図７９の続きである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/576 33/576 Ｚ 33/577 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＹ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 斎藤 泉 東京都 渋谷区 代々木 ２−37−15− 412 (72)発明者 マイケル ホートン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94526 ダンビル，ローズメッド コート 53 (72)発明者 エイミー ジェイ．ウェイナー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94510 ベニシア，グリーンブライヤー コート 433 (72)発明者 ヤン ハン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549 ラファイエット，デル マー 3238 (72)発明者 ジャニス エイ．コルバーグ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94804 リッチモンド，スクーナー コート 179 (72)発明者 タイ−アン チャ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94583 サン ラモン，スプリングビュー サー クル 964 (72)発明者 ブルース ダンカン アービン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94519 コンコード，エル モンテ ドライブ 3401

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 J7 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図１４から図１６において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして89、99、111、116、12
   5、129、156、168、171、183、216、219、231、237、24
   0、267、270、273、276、279、297、327、333、362、37
   2、387、393、408、419、420、444、471、501、507、51
   9、520、522、525、546、および552からなる群より選択
   される。
2. 【請求項２】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図１７から図１９において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして１、19、20、22、25、4
   6、52、67、94、95、97、100、124、125、130、136、13
   9、142、148、149、151、154、160、163、166、167、17
   9、180、181、182、184、188、190、196、202、205、20
   8、212、214、220、223、232、241、244、246、247、25
   1、256、259、262、271、274、283、287、288、292、29
   3、298、299、301、304、310、314、316、319、322、32
   6、328、331、332、338、342、345、346、347、353、35
   5、359、361、362、364、370、374、379、380、385、38
   8、393、394、397、398、400、401、406、409、412、41
   3、415、427、430、436、442、445、448、449、452、45
   3、457、472、475、476、478、481、484、485、486、49
   0、491、492、493、496、498、499、505、511、526、52
   7、530、532、535、538、547、571、574、578、および5
   80からなる群より選択される。
3. 【請求項３】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、そして該連続するヌクレオチド配列が、
   Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプロ
   ーブ、ここで、Ｘは図２０および図２１において同定さ
   れるヌクレオチド位置に対応し、９、12、16、18、21、
   24、27、28、31、33、37、39、57、58、61、70、72、7
   5、78、81、96、103、105、108、111、113、114、135、
   141、142、145、147、151、156、159、171、176、178、
   180、185、189、192、198-204、211-216、220、221、22
   3、225-230、235、237-239、243、246、249-252、258、
   259、261、267、268、270、279、291、292、297、300、
   303、321-323、328、330、333、336、338-340、342、34
   5、347、および351からなる群より選択される。
4. 【請求項４】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図２２から図２４において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして４、10、16、19、22、3
   1、37、50、52、55、58、70、76、78、79、82、83、8
   5、91、97、100、103、109、112、115、118、121、13
   6、138、140、141、151、154、161、163、166、169、17
   2、175、181、183、184、193、196、199、205、214、22
   3、253、259、260、262、269、271、274、277、281、28
   3、286、289、292、296、298、304、319、321、324、33
   2、340、352、355、361、370、371、373、382、389、39
   0、391、394、397、401、403、406、418、430、439、44
   6、448、451、454、457、469、472、485、487、490、49
   3、496、502、505、508、511、520、529、532、535、53
   8、541、544、547、556、557、565、568、574、575、お
   よび577からなる群より選択される。
5. 【請求項５】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図２５から図２７において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして16、19-21、28、32、3
   4、52、70、88、96、100、106、107、115、124、133、1
   36、142-144、146、152、158、159、163、166、173、17
   5、181、187、188、190、205、214、217、226、234、23
   5、241、244、256、259、277、295、298、310、311、32
   1、324、337、348、349、358、365、367、370、381、38
   5、389、392、393、397、400、406、411、および412か
   らなる群より選択される。
6. 【請求項６】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図６０から図６２において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして１-３、10、13、16、18-
   20、22、25、27、31、37-40、53、55、58、61、64、6
   7、71、73、74、76、85、88、89、92、95、96、98、10
   0、103、112、118、121、126、127、133、134、136-14
   1、143、144、146、148、155、157、160、163、176、17
   8、181-183、186、187、190、196、199、206、207、20
   9、210、211、217、223、226、238、241、247、250、25
   3、259、268、269、271、273、274、280、283、286、28
   9、291、298、301、307、316、317、319、320、325、33
   1、334、335、340、345、346、352、および361からなる
   群より選択される。
7. 【請求項７】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図６３から図６８において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして１、19、20、22、25、4
   6、52、67、94、95、97、100、124、125、136、139、14
   2、148、149、151、154、160、163、166、167、179、18
   0、181、182、184、188、190、196、202、205、208、21
   2、214、220、223、232、241、244、246、247、251、25
   6、257、259、262、271、274、283、287、288、292、29
   3、298、299、301、304、310、314、316、319、322、32
   6、328、331、332、338、342、345-347、353、355、35
   9、360、361、362、364、370、374、379、380、385、38
   8、393、394、397、398、400、401、406、409、412、41
   3、415、427、430、436、442、445、448、449、452、45
   3、457、472、475、476、478、481、484-486、490-49
   3、496、498、499、505、511、526、527、530、532、53
   5、538、547、571、574、578、580、583、586、589、59
   0、593、595、599、601、619、620、623、632、634、63
   7、640、643、658、665、667、670、673、675、676、69
   7、703、704、707、709、713、718、721、733、738、74
   0、742、747、751、754、760-766、773-778、782-785、
   787-792、797、799-801、805、808、811-815、820、82
   1、823、829、830、832、841、853、854、859、862、86
   5、883-885、890、892、895、898、900-902、904、90
   7、909、913、919-923、935、937、940、943、946、94
   9、953、955、956、958、967、970、971、974、977、97
   8、980、982、985、994、1000、1003、1008、1009、101
   5-1026、1028、1030、1037、1039、1042、1045、1058、
   1060、1063-1065、1068、1069、1072、1078、1081、108
   8、1089、1091-1093、1099、1105、1108、1120、1123、
   1129、1132、1135、1141、1151、1153、1155、1156、11
   62、1165、1168、1171、1173、1180、1183、1189、119
   8、1199、1201、1202、1207、1213、1216、1217、122
   2、1227-1228、1234、および1243からなる群より選択さ
   れる。
8. 【請求項８】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図６９および図７０において同定されるヌ
   クレオチド位置に対応し、そして８、17、23、32-35、4
   1、50-52、61、62、65、68、72、73、80、85、86、99、
   102、103、113、116、125、129-131、135-137、143、14
   7、149-152、155、158、161、164、167、171、173、17
   9、186、191、200、203、209、215、218、221、224、22
   7、228、235、236、242、245、248、249、251、260、26
   6、269、272、および275からなる群より選択される。
9. 【請求項９】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少なく
   とも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを
   含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプロ
   ーブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位の
   ヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、
   ここで、Ｘは図７１から図７６において同定されるヌク
   レオチド位置に対応し、そして3799、3801、3813、381
   9、3821、3825、3828、3837、3840、3846、3849、385
   2、3855、3861、3864-3866、3873、3888、3889、3909、
   3912、3918、3927、3936、4134-4137、4144、4149、415
   1、4152、4164、4167、4182、4188、4200、4206、4222-
   4224、4227、4228、4230、4233、4234、4248、4251、42
   66、4278、4281、4284、4290、4293、4296、4299、431
   1、4314、5134、5136-5139、5143、5145、5148、5157、
   5160、5163、5167、5168、5181、5196、5202、5203、52
   05、5211、5214、5217、5218、5221-5223、5226、522
   9、5234、5236-5238、5241、5244-5246、5249-5253、52
   55-5257、および5260-5265からなる群より選択される。
10. 【請求項１０】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少な
    くとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマー
    を含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプ
    ローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位
    のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプロー
    ブ、ここで、Ｘは図７７および図７８において同定され
    るヌクレオチド位置に対応し、そして２、23、39、47、
    87、101、106、118、160、175、178、194、202、223、2
    29、230、242、244、247、251、277、291、295、316、3
    22、および331からなる群より選択される。
11. 【請求項１１】 J1 HCVゲノムまたはその相補体の少な
    くとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマー
    を含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプ
    ローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位
    のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプロー
    ブ、ここで、Ｘは図７９および図８０において同定され
    るヌクレオチド位置に対応し、そして169、266、276、2
    93、299、318、345、348、373、390、393、396、414、4
    17、444、447、450、453、456、474、476、490、531、5
    38、539、540、および549からなる群より選択される。
12. 【請求項１２】 少なくとも15個のヌクレオチドを含
    む、請求項１〜１１のいずれかに記載のプライマーまた
    はプローブ。
13. 【請求項１３】 少なくとも20個のヌクレオチドを含
    む、請求項１２に記載のプライマーまたはプローブ。
14. 【請求項１４】 テスト試料中のHCVポリヌクレオチド
    を検出する方法であって、 (ａ)請求項１〜１３のいずれかに記載のプローブを提供
    する工程、 (ｂ)該プローブとその相補体との間でポリヌクレオチド
    二重鎖を形成させ、該テスト試料中に存在する非HCVポ
    リヌクレオチド配列と該プローブとの間で実質的なポリ
    ヌクレオチド二重鎖の形成が無い条件下で、該テスト試
    料と該プローブとを接触させる工程、および (ｃ)該プローブを含有するいかなるポリヌクレオチド二
    重鎖をも検出する工程、を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 受託番号FERM BP-2593、FERM BP-259
    4、FERM BP-2595、FERM BP-2637、FERM BP-2638、FERM
    BP-3081、ATCC No.68392、ATCC No.68393、ATCC No.683
    94、ATCC No.68395、ATCC No.40884で寄託されている材
    料からなる群由来のHCV由来の材料を含有する生物学的
    材料。
16. 【請求項１６】 少なくとも10個のアミノ酸の連続配列
    を含有する、精製されたポリペプチドであって、該連続
    配列が、 (ａ)図１４から図１６、図１７から図１９、図２０およ
    び図２１、図２２から図２４、図２５から図２７、図６
    ０から図６２、図６３から図６８、図６９および図７
    ０、図７１から図７６、図７７および図７８、または、
    図７９および図８０に示されるJ1またはJ7アミノ酸配列
    から得られ、 (ｂ)HCV-J1またはHCV-J7に対する抗体によって結合され
    得る抗原性決定基を含有し、そして (ｃ)図２９から図５９に示されるHCV-1配列の対応する
    部分によりコードされるアミノ酸と比較して少なくとも
    １つのアミノ酸置換を含む、ポリペプチド。
17. 【請求項１７】 前記連続する配列が少なくとも15個の
    アミノ酸からなる、請求項１６に記載のポリペプチド。
18. 【請求項１８】 前記連続する配列が少なくとも20個の
    アミノ酸からなる、請求項１６に記載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 化学的に合成される、請求項１６に記
    載のポリペプチド。
20. 【請求項２０】 固体支持体上に固定されている、請求
    項１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド。
21. 【請求項２１】 テスト試料中の抗HCV抗体の存在を検
    出するための方法であって、 (ａ) 請求項１６〜２０のいずれかに記載のポリペプチ
    ドとともに、抗原−抗体複合体を形成する条件下で、該
    テスト試料をインキュベートする工程であって、ここ
    で、該ポリペプチドが、HCV-1に対する抗体と免疫学的
    に交差反応しない、工程、および (ｂ)形成したいかなる抗原−抗体複合体をも検出する工
    程、を包含する、方法。
22. 【請求項２２】 前記テスト試料がヒト血液またはその
    画分を含む、請求項２１に記載の方法。