PT95329B - Novos isolados de hcv - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo Técnico

A presente invenção refere-se aos novos isolados da classe virai da hepatite C_f polipétidos, polinucleótidos e anticorpos deles derivados, bem como ao uso de tais polipéptidos, polinucleótidos e anticorpos em testes (e.g.,imunotestes, testes de hibridação de ácidos nucleicos, etc.) e na produção de polipéptidos virais.

Antecedentes

A Hepatite não-A, não-B ( NANBH ) é uma doença transmissível ou familia de doenças que se pensa serem induzidas por virus, e que se distinguem de outras formas de doenças de figado associadas a virus, incluindo as causadas pelos virus da hepatite conhecidos, i.e., virus da hepatite A ( HAV ), virus da hepatite B (HVB), virus da hepatite delta (HVD), bem como as hepatites induzidas pelo citomegalovirus (CMV) ou virus de Epstein-Barr (EBV). A NANBH foi primeiramente identificada em indivíduos que sofreram transfusões. A transmissão do homem para o chimpanzé e as passagens em série nos chimpanzés mostraram que

a NANBH é devida a um agente ou agentes de infecção transmissível. A evidência epidemiológica sugere que pode haver três tipos de NANBH : o tipo epidémico transportado pela água; o tipo associado a agulhas ou sangue; e o tipo que ocorre esporadicamente (contraído comunitariamente). Contudo, nenhum agente transmissível responsável pela NANBH tinha sido identificado até à data.

Inicialmente, foram conseguidos diagnóstico clinico e identificação da NANBH , pela exclusão de outros marcadores virais. Alguns dos métodos usados para detectar supostos anticorpos e antigénios da NANBH são a difusão em agar-gel, contraimunoelectroforese, microscopia de imunofluorescência, microscopia de electrão imune, radio imunoteste, e teste de ligação imunoabsorvente ao enzima. Contudo, nenhum destes testes provou ser suficientemente sensivel, especifico, e reproduzível para ser usado como teste de diagnóstico para a NANBH.

Até muito recentemente não havia nem clareza nem acordo quanto à identidade ou especificidade dos sistemas antigénio anticorpo associados com os agentes da NANBH. E possivel que a NANBH seja causada por mais de um agente infeccioso e mascare o que os testes serológicos detectam no soro dos pacientes com

NANBH.

No passado considerou-se a existência de um grande número de candidatos a agentes da NANBH. Ver, e.g., Prince (1983) Ann. Rev. Microbiol. 37:217; Feinstone & Hoofnagle (1984) New Eng. J. Med. 311:185; Overby (1985) Curr. Heptol. 5:49; Overby (1986) Curr. Heptol. 6_:65; Overby (1987) Curr. Heptol. 2^:^5; e

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Iwarson (1387) British Med. J. 295;946. Contudo, não há qualquer prova de que qualquer destes candidatos represente o agente etiológico da NANBH.

Em 1987, Houghton et al. clonaram o primeiro virus definitivamente ligado à NANBH. Ver, e.g., EPO pub. No 318.216; Houghton et al., Science 244:359 (1989). Houghton et al. descreveram ai a clonagem de um isolado de uma nova classe virai, virus da hepatite C (HCV), o protótipo do isolado ai descrito foi denominado HCV1. 0 HCV é um virus do tipo Flavi, com um genoma de RNA. Houghton et al. descreveram a produção de proteinas recombinantes a partir das sequências do HCV que são úteis como reagentes de diagnóstico, bem como os polinucleótidos úteis nos testes de hibridação de diagnóstico e na clonagem de isolados do

HCV adicionais.

A procura de métodos específicos e sensíveis para a pesquisa e identificação de portadores da NANBH e de sangue ou produtos sanguíneos contaminados com NANBH é significativa. As hepatites após-transfusão (PTH) ocorrem em aproximadamente 10% dos doentes que sofrem transfusões, e a NANBH contribui para mais de 90% destes casos. Existe uma progressão frequente (25-55%) de danos crónicos do figado.

tratamento de doentes, bem como a prevenção da transmissão da NANBH pelo sangue e produtos sanguíneos, ou por contacto pessoal intimo, requer diagnóstico de confiança e meios de prognóstico para detectar ácidos nucleicos, antigénios e anticorpos relacionados com a NANBH. Em adição, também há a necessidade de vacinas eficazes e agentes imunoterapêuticos para

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a prevenção e/ou tratamento da doença.

Enquanto pelo menos um isolado do HCV foi identificado, o que é útil para as necessidades acima referidas, isolados adicionais, particularmente aqueles com divergências no genoma, podem provar ter aplicações únicas.

Sumário da Invenção

Os novos isolados do HCV foram caracterizados a partir de sangue de dadores Japoneses que foram implicados como portadores da NANBH. Esses isolados exibem heterogeneidade de sequência de aminoácidos e nucleótidos em relação ao protótipo do isolado, HCV1, em vários dominios virais. Pensa-se que estas sequências distintas são de grande importância, particularmente nos testes de diagnóstico e desenvolvimento de vacinas.

Numa concretização, a presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleótidos de pelo menos, 15 pb, de um isolado do HCV substancialmente homólogo a um isolado seleccionado a partir do grupo J1 ou J7, em que a referida sequência de nucleótidos difere da sequência de nucleótidos do isolado HCV1 do HCV.

Numa outra concretização, a presente invenção fornece uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleótidos de, pelo menos, 15 pb que codificam uma sequência de aminoácidos a partir do isolado J1 ou J7 do HCV, em que a sequência de aminoácidos J1 ou J7 é diferente da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV.

Uma outra concretização da presente invenção fornece um

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polipéptido purificado compreendendo uma sequência de aminoâcidos, a partir do isolado do HCV, substancialmente homóloga do isolado seleccionado a partir do grupo Jl ou J7, em que a referida sequência de aminoâcidos difere da sequência do polipéptido codificada pelo isolado HCV1 do HCV.

Ainda outra concretização da presente invenção fornece um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoâcidos de um isolado Jl ou J7 do HCV em que a sequência de aminoâcidos Jl ou J7 é diferente da sequência de aminoâcidos do isolado HCV1 do HCV e o polipéptido está imobilizado num suporte sólido.

Ainda noutra concretização da presente invenção , um imunoteste para detectar a presença de anticorpos anti-HCV numa amostra-teste é fornecido compreendendo: (a) incubação da amostra teste em condições que permitem a formação dos complexos antigénio-anticorpo com um polipéptido imunogénico compreendendo uma sequência de aminoâcidos de um isolado do HCV substancialmente homólogo a um isolado seleccionado a partir do grupo Jl ou J7, em que a sequência de áminoácidos é diferente da sequência de aminoâcidos do isolado HCV1 do HCV; e (b) detecção do complexo antigénio-anticorpo compreendendo o polipéptido imunogénico.

A presente invenção também fornece uma composição, compreendendo anticorpos anti-HCV, que se liga a um epitopo do HCV substancialmente livre de anticorpos que não se ligam ao epitopo do HCV, em que: (a) o epitopo do HCV compreende uma sequência de aminoâcidos de um isolado do HCV, substancialmente homóloga a um isolado seleccionado do grupo Jl ou J7, em que a

sequência de aminoácidos é diferente da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV; e (b) a sequência de aminoácidos do J1 ou J7 não é imunologicamente de reacção cruzada com o HCV1.

Uma outra concretização da presente invenção fornece um imunoteste para detectar a presença de um polipéptido do HCV numa amostra-teste compreendendo: (a) incubação da amostra teste em condições que permitam a formação de complexos antigénioanticorpo, com anticorpos anti-HCV que se ligam ao epitopo do HCV, em que: (i) o epitopo do HCV compreende uma sequência de aminoácidos do isolado Jl ou J7 do HCV; (ii) a sequência de aminoácidos Jl ou J7 é diferente da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV; e (iii) a sequência de aminoácidos Jl o J7 não é imunologicamente de reacção cruzada com o HCV1; e (b) detecção de um complexo antigénio-anticorpo compreendendo os anticorpos anti-HCV.

Também é fornecido, pela presente invenção, um método para a produção de anticorpos anti-HCV compreendendo a administração a um mamifero, de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos do isolado Jl ou J7 do HCV, em que a sequência de aminoácidos Jl ou J7 é diferente da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV, pelo que o mamifero produz anticorpos anti-HCV.

Uma outra concretização da presente invenção fornece um método para detectar polinucleótidos HCV numa amostra-teste compreendendo: (a) fornecimento de uma sonda compreendendo a molécula de DNA da reivindicação 1; (b) contacto da amostra teste

J e sonda em condições que permitam a formação de um duplex de polinucleótidos entre a sonda e o seu complemento, na ausência da formação substancial de duplex de polinucleótidos entre a sonda e as sequências de polinucleótidos nâo-HCV presentes na amostrateste; e (c) detecção de qualquer duplex de polinucleótidos compreendendo a sonda.

Ainda outra concretização da presente invenção fornece um método para a produção de um polipéptido recombinante compreendendo uma sequência de aminoácidos do HCV, compreendendo o método : (a) fornecimento de células hospedeiras transformadas por uma estrutura de DNA, compreendendo sequências controlo para a operabilidade da célula hospedeira ligada a uma sequência de código que codifica uma sequência de aminoácidos do isolado J1 ou J7 do HCV, em que a sequência de aminoácidos J1 ou J7 é diferente da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV; (b) cultura das células hospedeiras em condições pelas quais a sequência de código é transcrita e traduzida para o polipéptido recombinante; e (c) recuperação do polipéptido recombinante.

Estas e outras concretizações da presente invenção serão evidentes para os especialistas na área em vista das seguintes descrições.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a sequência consensual da cadeia que codifica um fragmento do dominio J7 C/E com as heterogeneidades.

A Figura 2 mostra a sequência consensual da cadeia que codifica um fragmento do dominio J1 E com as heterogeneidades.

A Figura 3 mostra a sequência consensual da cadeia que

J codifica um fragmento do domínio J1 E/NS1 com as heterogeneidades.

A Figura 4 mostra a sequência consensual da cadeia que codifica um fragmento do dominio J1 NS3 com as heterogeneidades.

A Figura 5 mostra a sequência consensual da cadeia que codifica um fragmento do dominio J1 NS5 com as heterogeneidades.

A Figura 6 mostra a homologia da sequência consensual do J7 C/E com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1.

A Figura 7 mostra a homologia da sequência consensual do Jl E com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1.

A Figura 8 mostra a homologia da sequência consensual do J1 E/NS1 com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1.

A Figura 9 mostra a homologia da sequência consensual do J1 NS3 com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do

HCV1.

A Figura 10 mostra a homologia da sequência consensual | do Jl NS5 com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do

HCV1.

A Figura 11 mostra a suposta organização genómica do genoma do HCV1.

A Figura 12 mostra a sequência de nucleótidos da ORF do HCV1. Na figura o nucleótido com o número 1 é o primeiro A de uma suposta metionina de iniciação da extensa ORF; os nucleótidos a montante deste nucleótido são indicados com números negativos.

A Figura 13 mostra a sequência consensual de uma

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sequência de código de um fragmento do domínio J1 NS1 (J1 1519) com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1. Mostra também os aminoácidos ai codificados.

A Figura 14 mostra um composto da sequência consensual do centro até ao dominio NS1 do Jl, com a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1. Mostra também a sequência dos aminoácidos ai codificados.

A Figura 15 mostra uma sequência consensual da cadeia de código do dominio NS1 do Jl, como foi determinada no Exemplo

IV. Também mostra a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1, e os aminoácidos codificados nas sequências do HCV1 e Jl.

A Figura 16 mostra uma sequência consensual de uma cadeia de código da região C200 do dominio NS3-NS4 do Jl. Mostra também a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1. Também estão representados os aminoácidos codificados nas sequências.

A Figura 17 mostra uma sequência consensual da cadeia de código do dominio NS1 do Jl, como foi determinada no exemplo

V. Mostra também a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1, e os aminoácidos codificados nas sequências.

A Figura 18 mostra uma sequência consensual da cadeia de código dos dominios da parte central e não traduzidos do Jl. Mostra também a sequência de nucleótidos do mesmo dominio do HCV1, e os aminoácidos codificados nas sequências.

Descrição Detalhada da Invenção

A execução da presente invenção utilizará, a menos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia

molecular, microbiologia, técnicas de DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da especialidade. Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura. Ver e.g., Maniatis, FitSCh & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D.N Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gaited, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press,1986);B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); as series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzimology Vol. 154 e Vol.155 (Wu e Grossman, e Wu, eds., respectivamente), Mayer e Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres), Scopes,(1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, segunda edição(Springer-Verlag, N.Y.), e HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell eds.1986). Todas as patentes, Pedidos de patentes, e outras publicações aqui mencionadas, quer supra quer infra, são por este meio aqui incorporadas como referência.

termo virus da hepatite C foi destinado, pelos que trabalham nesta área, a um agente etiológico da NANBH, até agora desconhecido. Portanto, como usado aqui, virus da hepatite C (HCV) refere-se a um agente causador da NANBH, que foi anteriormente referido como NANBV e/ou BB-NANBV da classe do 'Ν prototipo do isolado HCV1 descrito por Houghton et al. Ver, por exemplo, a Publicação da EPO No. 318. 216, e a Patente norte americana com o No. de Série 355.002, depositada a 19 de Maio de 1989 (disponível em publicações não americanas que reivindicam prioridade a partir desta), cujas divulgações se encontram aqui incorporadas para referência. A figura 6 mostra a sequência de nucleótidos e a suposta sequência de aminoácidos do HCV1. Os termos HCV, NANBV e BB-NANBV são aqui usados permutavelmente. Como extensão desta terminologia, a doença causada pelo HCV, anteriormente chamada hepatite NANB (NANBH), é designada por hepatite C. Os termos NANBH e hepatite C podem ser aqui usados interpermutavelmente. O termo HCV, como aqui usado, indica uma espécie de virus cujas estirpes patogénicas causam NANBH, bem como as estirpes atenuadas ou as partículas incompletas intervenientes, suas derivadas.

HCV é um virus do tipo Flavi. A morfologia e constituição das partículas dos Flavivirus é conhecida e discutida por Brinton (1986) THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds. Fraenkel-Conrat e Wagner, vol. eds. Schlesinger e Schlesinger, Plenum Press), p.327-374. Geralmente, no que respeita à morfologia, os flavivirus contêm um nucleocapsideo central envolvido por uma bicamada lipidica. Os viriões são esféricos e têm um diâmetro de cerca de 40-50 nm. A sua parte central tem cerca de 25-30 nm de diâmetro. Ao longo da superficie exterior do envólucro do virião existem projecções que tem cerca de 5-10 nm de comprimento com protuberâncias terminais com cerca de 2nm de diâmetro.

J genoma do HCV é composto por RNA. Sabe-se que os virus contendo RNA têm taxas de mutação espontânea relativamente -3 -4 altas i.e., na ordem de 10 a 10 por nucleótido incorporado. Por isso, existem múltiplas estirpes que podem ser virulentas ou não virulentas dentro da classe HCV ou da espécie.

Pensa-se que o genoma do isolado do HCV é composto por uma simples ORF de aproximadamente 9.000 nucleótidos a aproximadamente 12.000 nucleótidos, que codificam uma poliproteina semelhante em tamanho à do HCV1, uma poliproteina codificada com caracteristicas antigénicas e hidrofóbicas semelhantes à do HCV1, e a presença de sequências de péptidos colineares que são conservados com o HCV1. Em adição, pensa-se que o genoma é uma cadeia de RNA positiva.

Os isolados do HCV compreendem epitopos que são imunologicamente de reacção cruzada com os epitopos do genoma do HCV1. Pelo menos alguns destes epitopos são únicos para o HCV quando comparados com outros flavivirus conhecidos especificidade do epitopo pode ser determinada pela reactividade imunológica com anticorpos anti-HCV, e pela falta de reactividade imunologica com anticorpos de outras espécies de Flavivirus. Métodos para determinar a reactividade imunológica são conhecidos na área, por exemplo por radioimunotestes, testes ELISA, por hemaglutinação, e vários exemplos de técnicas adequadas para os testes são aqui fornecidos.

Também se espera que a homologia total dos isolados do HCV e dos genomas do HCV1, a nivel dos nucleótidos, seja provavelmente cerca de 40% ou superior, provavelmente cerca de

A sua

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60% ou superior e ainda mais provavelmente cerca de 80% a 90% ou superior. Em adição, existem muitas sequências contíguas correspondentes de pelo menos cerca de 13 nucleõtidos que são totalmente homólogas. A correspondência entre a sequência de um novo isolado e a sequência do HCV1 pode ser determinada por técnicas conhecidas na área. Por exemplo, pode-se detectar por comparação directa da informação da sequência do polinucleótido do novo isolado e sequências do HCV1. Alternativamente, a homologia pode ser detectada por hibridação dos polinucleótidos, sob certas condições em que se formam duplexes estáveis entre as regiões homólogas (por exemplo, aquelas que são usadas antes da digestão Sl), seguida pela digestão com nucleases especificas para cadeias simples, seguida pela determinação do tamanho dos fragmentos digeridos.

Devido à relação evolucionária das estirpes ou isolados do HCV, supostas estirpes ou isolados de HCV são identificados pela sua homologia ao nivel do polipéptido. Assim, espera-se que os novos isolados do HCV sejam mais do que cerca de 40% homólogos, provavelmente mais de cerca de 70% e , ainda mais provavelmente mais de 80% homólogos, e possivelmente ainda mais de cerca de 90% homólogos, ao nivel do polipéptido. As técnicas para determinar a homologia da sequência de aminoácidos são conhecidas na área. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser determinada diretamente e comparada com as sequências aqui fornecidas. Alternativamente a sequência de nucleõtidos do material genómico do suposto HCV pode ser determinada, e a sequência de aminoácidos nele codificada pode ser determinada, e

J as regiões correspondentes comparadas.

A ORF do HCV1 é mostrada na Figura 12. Os dominios do envelope e parte central, não estrutural, da poliproteina foram previstos para o HCV1 (Fig. 5). 0 C ou parte central, polipéptido, pensa-se ser codificado pelo terminal 5' até cerca do nucleótido 345 do HCV1. 0 suposto E, ou envelope, do dominio do HCV1, pensa-se ser codificado a partir de cerca do nucleótido 346 até cerca do nucleótido 1050. O suposto dominio um nãoestrutural, NS1, pensa-se ser codificado a partir de cerca do nucleótido 1051 até cerca do nucleótido 1953. Para os dominios restantes, o suposto NS2 pensa-se ser codificado de cerca do nucleótido 1954 a cerca do nucleótido 3018, o suposto NS3 de cerca do nucleótido 3019 a cerca do nucleótido 4950, o suposto NS4 de cerca do nucleótido 4951 a cerca do nucleótido 6279, e o suposto NS5 de cerca do nucleótido 6298 até ao terminal 3' respectivamente. Os limites acima indicados são aproximações baseadas na análise da ORF. Os limites exactos podem ser determinados pelos especialistas na área, com vista nesta divulgação.

HCV/J1 ou Jl e HCV/J7 ou J7 referem-se aos novos isolados do HCV caracterizados pela sequência de nucleótidos aqui divulgada, bem como aos isolados relacionados que lhes são substancialmente homólogos, i.e., pelo menos cerca de 90% ou cerca de 95% ao nivel de nucleótidos. Crê-se que as sequências aqui reveladas caracterizam uma subclasse do HCV que é predominante no Japão e noutros paises da orla Asiática e/ou Pacifica. Isolados Jl e J7 adicionais podem ser obtidos em vista

J desta divulgação e da Publicação EPO No. 318.216. Em particular, a sequência de nucleótidos Jl e J7, aqui divulgada, bem como as sequências do HCV1 da Figura 12 podem ser usadas como primers ou sondas, para clonar domínios Jl, J7 adicionais,ou isolados adicionais.

A sequência de nucleótidos de uma sequência designada ou fonte, aqui usada, refere-se a uma sequência de nucleótidos que é homóloga a (i.e., idêntica) ou complementar da sequência designada ou fonte, ou sua porção. As sequências Jl, aqui fornecidas, tem, no minimo, cerca de 6 nucleótidos, preferencialmente cerca de 8 nucleótidos, preferencialmente cerca de 15 nucleótidos, e mais preferencialmente 20 nucleótidos ou mais. 0 comprimento máximo é o genoma virai completo.

Nalguns casos da invenção, a sequência da região da qual o polinucleótido é derivado é preferencialmente homóloga a ou complementar de uma sequência que é única para um genoma do HCV ou Jl e J7. Se a sequência é ou não única para o genoma pode ser determinado por técnicas conhecidas pelos especialistas na área. Por exemplo, a sequência pode ser comparada com sequências de bancos de dados, e.g., banco de genes, para determinar se está ou não presente no hospedeiro não infectado ou noutros organismos. A sequência também pode ser comparada com as sequências conhecidas de outros agentes virais incluindo aqueles que se sabe induzirem a hepatite, e.g., HAV, HBV e HVD, e de outros membros da Flaviviridae. A correspondência ou não da sequência derivada com outras sequências pode ser determinada também por hibridação em condições de adstringência apropriada.

J

Técnicas de hibridaçâo para determinar a complementaridade das sequências de ácidos nucleicos são conhecidas na área. Ver também, por exemplo, Maniatis et al. (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y.). Em adição, incompatibilidades dos duplexes de polinucleótidos formados por hibridaçâo podem ser determinadas por técnicas conhecidas, incluindo por exemplo, digestão com uma nuclease como a SI que digere especificamente áreas de cadeia simples nos polinucleótidos duplexes. Regiões a partir das quais sequências de DNA típicas podem derivar incluem, mas não estão limitadas a, regiões que codificam epitopos específicos, bem como regiões não-transcritas e/ou não traduzidas.

polinucleótido de J1 a J7 não é necessariamente derivado fisicamente da sequência de nucleótidos mostrada, mas pode ser gerado de qualquer modo, incluindo, por exemplo, sintese quimica ou replicação de DNA ou transcrição inversa ou transcrição. Em adição, combinações de regiões correspondentes às da sequência designada podem ser modificadas de várias maneiras de acordo com o uso pretendido. Os polinucleótidos também podem incluir um ou mais marcadores, que são conhecidos dos especialistas na área.

Uma sequência de aminoácidos de um polipéptido designado ou fonte de polipéptido, quer dizer que a sequência de aminoácidos é homóloga (i.e., idêntica) à sequência do polipéptido designado, ou sua porção. Uma sequência de aminoácidos de uma sequência de ácidos nucleicos designada refere-se a um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos

-Τ' idêntica à de um polipéptido codificado na sequência, ou sua porção. As sequências de aminoácidos J1 ou J7 nos polipéptidos da presente invenção têm pelo menos cerca de 5 aminoácidos de comprimento, preferencialmente pelo menos cerca de 10 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 15 aminoácidos, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 aminoácidos.

Os polipéptidos da presente invenção não são necessariamente traduzidos a partir de uma sequência de ácidos nucleicos designada; os polipéptidos podem ser formados de qualquer modo, incluindo por exemplo, sintese quimica, ou expressão de um sistema de expressão recombinante, ou isolamento do virus. Os polipéptidos podem incluir um ou mais análogos de aminoácidos ou aminoácidos não naturais. Os métodos de inserção de análogos de aminoácidos numa sequência são conhecidos na área. Os polipéptidos podem também incluir um ou mais marcadores, que são conhecidos dos especialistas na área.

termo polinucleótido recombinante, como aqui usado, pressupõe um polinucleótido de origem genómica, cDNA, semi-sintética ou sintética que, devido à sua origem ou manipulação (1) está ligado a um outro polinucleótido em vez daquele a que está ligado na natureza, ou (2) não ocorre na natureza.

O termo polinucleótido, como aqui usado refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer tamanho, quer ribonucleótidos quer desoxiribonucleótidos. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim, este termo inclui DNA simples e duplo e RNA. Inclui também tipos conhecidos de

J modificações, por exemplo, marcadores que são conhecidos na área, metilaçâo, caps, substituição de um ou mais dos nucleótidos que ocorrem naturalmente, por um análogo, modificações internucleótidos tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (e.g., fosfonatos rnetil, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (e.g., fosforotioatos, fosforoditioatos,etc.), aqueles contendo porções pendentes, tais como por exemplo proteínas( incluindo e.g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos sinalizadores, poli-Llisina, etc.), os com intercaladores (e.g., acridina, psoralen, etc.), e os que contêm agentes quelantes (e.g., metais, metais radioactivos, boro, metais oxidativos, etc.), os que contêm alquiladores, aqueles com ligações modificadas (e.g., ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.), bem como as formas não modificadas do polinucleótido.

Polinucleótido purificado refere-se a uma composição compreendendo um polinucleótido especificado que é substancialmente livre de outros componentes, composição tal compreendendo tipicamente pelo menos cerca de 70% do polinucleótido especificado, mais tipicamente pelo menos cerca de 80%, 90% ou mesmo 95% a 99% do polinucleótido especificado.

Polipéptido purificado refere-se a uma composição compreendendo um polipéptido especificado que é substancialmente livre de outros componentes, composição tal compreendendo tipicamente pelo menos cerca de 70% do polipéptido especificado, mais tipicamente pelo menos cerca de 80%, 90% ou mesmo 95% a 99% do polipéptido especificado.

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Células hospedeiras recombinantes, células hospedeiras, células, linhas celulares, cultura de células, e outros termos tais, indicam microorganismos ou linhas celulares eucariotas superiores, cultivadas como entidades unicelulares, que podem ser ou foram usadas como recipientes para vectores recombinantes ou outro DNA de transferência, e incluem a progénie da célula original que foi transformada. Fica entendido que a progénie de uma célula parental simples pode não ser necessariamente completamente idêntica na morfologia ou no complemento do DNA total ou genómico, ao progenitor original, devido a mutações naturais, acidentais ou deliberadas.

Um replicâo é qualquer elemento genético, e.g., um plasmideo, um cromossoma, um virus, um cosmideo, etc., que se comporta como uma unidade autonoma de replicaçâo do polinucleótido dentro da célula, i.e., capaz de se replicar sob o seu próprio controlo.

Um vector de clonagem é um replicâo que pode transformar uma célula hospedeira seleccionada, e à qual está agarrado outro segmento polinucleotidico, de modo que provoca a replicaçâo e/ou expressão do segmento agarrado. Tipicamente, vectores de clonagem incluem plasmideos, virus (e.g., vectores bacteriofágicos) e cosmideos.

Um vector de integração é um vector que não se comporta como um replicâo numa célula hospedeira seleccionada, mas tem a capacidade de se integrar num replicâo( tipicamente um cromossoma) residente num hospedeiro seleccionado para transformar de forma estável o hospedeiro.

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Um vector de expressão é uma construção que pode transformar uma célula hospedeira seleccionada e fornecer a expressão de uma sequência de código heteróloga no hospedeiro seleeeionado. Vectores de expressão podem ser, quer um vector de clonagem quer um vector de integração.

Uma sequência de código é uma sequência de polinucleótidos que é transcrita no RNAm e/ou traduzida num polipéptido quando colocada sob controlo de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de código são determinados por um codão de iniciação da tradução no terminal 5' e por um codão de terminação da tradução no terminal 3'. Uma sequência de código pode incluir, mas não está limitada a um RNAm, cDNA, e sequências de polinucleótidos recombinantes.

A sequência de controlo refere-se a sequências reguladoras de polinucleótidos que são necessários para a expressão das sequências de código às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro. Nos procariotas, as sequências de controlo geralmente incluem o promotor, sitio de ligação ribossomal e os terminadores. Nos eucariotas, as sequências de controlo geralmente incluem, promotores, terminadores e nalguns casos activadores. 0 termo sequências de controlo pretende incluir, no minimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão, e pode também incluir componentes vantajosos adicionais.

Ligado operativamente a refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão numa relação •^In - —J—

J permitindo-lhes funcionar do modo pretendido. Uma sequência de controlo ligada operativamente a uma sequência de código está ligada de tal modo que a expressão da sequência de código é conseguida em condições compatíveis com as da sequência de controlo.

Uma estrutura de leitura aberta ou ORF é uma região de uma sequência de polinucleótidos que codifica um polipéptido; esta região pode compreender uma porção de uma sequência de código ou uma sequência de código total.

Imunologicamente de reacção cruzada refere-se a dois ou mais epitopos ou polipéptidos que estão ligados pelo mesmo anticorpo. A reactividade cruzada pode ser determinada por qualquer uma das numerosas técnicas de imunotestes, tal como o teste de competição.

termo anticorpo, como aqui usado refere-se a polipéptido ou grupo de polipéptidos que compreendem pelo menos um epitopo. Um sitio de ligação ao antigénio é formada a partir do enrolamento dos dominios variáveis de uma molécula(s) do anticorpo para formar sitios de ligação tridimensionais com a forma da superficie interna e distribuição de cargas, complementar das caracteristicas de um epitopo de um antigénio, que permite a ligação especifica para formar um complexo antigénio-anticorpo. Um sitio de ligação ao antigénio pode ser formado a partir de um dominio da cadeia pesada e/ou leve (VH e VL, respectivamente), que forma ansas hipervariáveis que contribuem para a ligação ao antigénio. 0 termo anticorpo inclui sem limitações, anticorpos quiméricos, anticorpos alterados, anticorpos univalentes, proteinas Fab e anticorpos de dominio simples. Em muitos casos, o fenómeno de ligaçao de anticorpos a antigénios é correspondente a outras ligações ligandos/não ligandos.

Um anticorpo de dominio simples (dAb) aqui usado, é um anticorpo que compreende um dominio HL que se liga especificamente a um antigénio designado. Um dAb não contém um dominio VL, mas pode conter outros domínios de ligação ao antigénio, que se sabe existirem no anticorpo, por exemplo, os dominios Kappa e lambda. Métodos para preparar DAbs são conhecidos na área. Ver, por exemplo, Ward et al.,Nature 341:544(1989).

Os anticorpos também podem compreender dominios VH e VL, bem como outros dominios de ligação ao antigénio conhecidos. Exemplos destes tipos de anticorpo e métodos para a sua preparação são conhecidos na área (Ver, por exemplo a Patente Norte Americana No. 4.816.467, aqui incorporados para referência), e inclui o seguinte. Por exemplo anticorpos de vertebrados referem-se a anticorpos que são tetrâmeros ou seus agregados, compreendendo cadeias leves e pesadas que são geralmente agregadas numa configuração em Y, e que pode ou não ter ligações covalentes entre as cadeias. Nos anticorpos dos vertebrados, as sequências de aminoácidos das cadeias são homólogas das sequências encontradas nos anticorpos produzidos em vertebrados, quer in situ quer in vitro (por exemplo, em hibridomas). Anticorpos de vertebrados incluem, por exemplo, anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais purificados.

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Métodos para a preparação destes são descritos infra.

Anticorpos hibridos são anticorpos em que as cadeias são homólogas separadamente com referência às cadeias de anticorpos de mamíferos e representam suas novas combinações, de modo que dois antigénios diferentes são precipitados pelo tetrâmero ou agregado. Nos anticorpos hibridos, um par de cadeias pesada e leve são homólogas das encontradas num anticorpo produzido contra um primeiro antigénio, enquanto um segundo par de cadeias são homólogas das encontradas num segundo anticorpo produzido contra um segundo anticorpo. Isto resulta na propriedade da bivalência, i.e., a capacidade de ligar dois antigénios simultaneamente. Tais hibridos podem ser também formados usando cadeias quiméricas como indicado abaixo.

Anticorpos quiméricos referem-se a anticorpos nos quais as cadeias pesada e /ou leve são proteínas de fusão. Tipicamente, uma porção das sequências de aminoácidos da cadeia é homóloga das sequências correspondentes num anticorpo derivado de uma espécie particular ou classe particular, enquanto o segmento restante da cadeia é homólogo das sequências derivadas de outra espécie e/ou classe. Usualmente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada é uma cópia das regiões variáveis ou dos anticorpos de uma espécie de vertebrados, enquanto as porções constantes são homólogas das sequências nos anticorpos derivados de uma outra espécie de vertebrados. Contudo, a definição não é limitada a este exemplo particular. Também é incluido qualquer anticorpo no qual qualquer uma ou ambas as cadeias pesada e leve, são compostas de combinações de sequências copiando as sequências

J nos anticorpos de diferentes origens,quer essas fontes sejam de classes divergentes ou espécies diferentes de origem, e quer ou nâo o ponto de fusão se encontre na ligação variável/constante. Assim, é possivel produzir anticorpos nos quais nem a região constante nem a variável sejam cópias de sequências de anticorpos conhecidos. Torna-se assim possivel, por exemplo, construir um anticorpo cuja região variável tenha uma afinidade especifica superior para um antigénio particular, ou cuja região constante possa melhorar a fixação do complemento, ou fazer outros melhoramentos das propriedades possuídas por uma região constante particular.

Outro exemplo consiste nos anticorpos alterados que se refere a anticorpos nos quais a sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente num anticorpo de vertebrados foi variada. Utilizando técnicas de DNA recombinante, o anticorpo pode ser redelineado para obter as caracteristicas desejadas. As variações possíveis são muitas e o alcançe das mudanças pode ir de um ou mais aminoácidos até à re-concepção completa de uma região, por exemplo, região constante. Alterações na região constante, em geral, para obter as caracteristicas dos processos celulares desejados, e.g., alterações na fixação do complemento, interacçâo com membranas e outras funções efectoras. Alterações na região variável podem ser feitas para alterar as caracteristicas da ligação ao antigénio. 0 anticorpo pode também ser concebido para ajudar a libertação especifica de uma molécula ou substância para uma célula especifica ou tecido localizado. As alterações desejadas podem ser feitas por técnicas conhecidas na biologia molecular e.g., técnicas de recombinaçâo, mutagénese localmente dirigida, etc.

Ainda outro exemplo são anticorpos univalentes, que são agregados compostos por um dimero de cadeia-pesada/ cadeialeve ligado à região Fc (i.e.,tronco) de uma segunda cadeia pesada. Este tipo de anticorpos evita a modulação antigénica. Ver, e.g., Glennie et al. Nature 295;712(1982) . Introduzidos dentro da definição de anticorpo, estão os fragmentos de anticorpo Fab. A região Fab refere-se às porções das cadeias leve e pesada que são aproximadamente equivalentes, ou análogas, das sequências que compõem a porção do ramo das cadeias leve e pesada, e que mostraram exibir ligações imunológicas para um antigénio especifico, mas a que falta a porção efectora Fc. Fab inclui agregados de uma cadeia leve e uma cadeia pesada (usualmente conhecidas como Fab'), bem como os tetrameros contendo as cadeias 2H e 2L ( referidas como F(ab)2), que são capazes de reagir selectivamente com um antigénio designado ou familia de antigénios. Anticorpos Fab podem ser divididos em subgrupos análogos dos descritos acima, i.e., Fab de vertebrados, Fab híbridos, Fab quiméricos, e Fab alterados. Métodos de produção de fragmentos Fab de anticorpos são conhecidos na área e incluem, por exemplo, proteólise, e sintese por técnicas de recombinaçâo.

Epitopo refere-se a um sitio de ligação ao anticorpo usualmente definido por um polipéptido, mas também por haptenos não aminoacidicos. Um epitopo pode compreender três aminoácidos numa conformação espacial que é única para o epitopo, sendo

J geralmente um epitopo composto por, pelo menos, 5 de tais aminoácidos, e mais usualmente consiste em pelo menos 8-10 de tais aminoácidos.

Complexo anticorpo-antigénio refere-se a um complexo formado por um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo num antigénio.

Polipéptido imunogénico refere-se a um polipéptido que produz uma resposta imune celular e/ou humoral num mamífero, quer só, quer ligado a um transportador, na presença ou ausência de adjuvante.

Polipéptido refere-se a um polimero de aminoácidos e não refere um comprimento especifico da molécula. Assim, péptidos, oligopéptidos, e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipéptido. Este termo também não se refere ou exclui a expressão posterior de modificações dos polipéptidos, por exemplo, glicosilaçâo, acetilação, fosforilação e semelhantes. Estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), polipéptidos com ligações substituídas, bem como outras modificações conhecidas na área, quer ocorrendo naturalmente quer ocorrendo não naturalmente.

Transformação como usado aqui, refere-se Δ inserção de um polinucleótido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, retirada, transduçâo, combinaçâo-f ou electroporação. O polinucleótido exógeno pode ser mantido como um vector não26

J integrado, por exemplo, um plasmideo, ou alternativamente pode ser integrado no genoma do hospedeiro.

Uma célula hospedeira transformada refere-se quer à célula directa que sofreu a transformação quer à sua progenia que mantém o polinucleótido exógeno original.

Tratamento, como aqui usado, refere-se à profilaxia e/ou terapia.

Indivíduo refere-se a vertebrados, particularmente membros de espécies de mamíferos e inclui mas não está limitado a, animais domésticos, animais para desportor, e primatas incluindo o homem.

sentido da cadeia refere-se à cadeia da molécula de DNA de cadeia dupla que é homóloga de um RNAm transcrita a partir dela. 0 sentido anti-sentido contém a sequência que é complementar da do sentido da cadeia.

Componente do corpo contendo o anticorpo refere-se a um componente do corpo de um indivíduo que é origem dos anticorpos com interesse. Componentes do corpo contendo o anticorpo são conhecidos na área, e incluem mas não estão limitados a, sangue completo e seus componentes, plasma, soro, fluido medular, fluido linfático, seccões externas do tracto genito-urinário, intestinal e respiratório, lágrimas, saliva, leite, glóbulos brancos e mielomas.

Isolados do HCV purificados referem-se a uma preparação de partículas do HCV que foram isoladas dos constituintes celulares com que o virus é normalmente associado, e a partir de outros tipos de virus que se podem encontrar nos

J tecidos infectados. As técnicas de isolamento de virus são conhecidas dos especialistas da área e incluem, por exemplo, centrifugação, e cromatografia de afinidade.

Uma partícula do HCV é um virião inteiro, bem como as partículas que são intermediárias na formação do virião. As partículas do HCV geralmente têm uma ou mais proteínas do HCV associadas ao ácido nucleico do HCV.

Sonda refere-se a um polinucleótido que forma uma estrutura hibrida com uma sequência num alvo polinucleotidico, devido à complementaridade de, pelo menos, uma região na sonda com a região no alvo.

Amostra biológica refere-se à amostra de tecido ou fluido, isolado a partir de um individuo, incluindo mas não limitado a, por exemplo, sangue completo, e seus componentes, plasma, soro, fluido medular, fluido linfático, e secções externas do tracto genito-urinário, intestinal, respiratório, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, e também amostras de constituintes de culturas de células in vitro (incluindo, mas não estando limitado a, meio condicionado resultante do crescimento das células no meio de cultura celular, supostamente de células infectadas pelo virus, células recombinantes e componentes celulares).

A invenção refere-se ao isolamento e caracterização de um isolado do HCV recentemente descoberto, J1 e J7, suas sequências nucleotidicas, sua sequência de proteínas e polinucleótidos resultantes, polipéptidos e anticorpos seus derivados. Os isolados J1 e J7 são novos nas suas sequências de

J 'W aminoácidos e nucleótidos, e pensa-se que são caracteristicos dos isolados do HCV do Japão e outros paises asiáticos.

As sequências de nucleótidos derivadas do HCV/J1 e HCV/J7 são úteis como sondas para diagnosticar a presença do virus nas amostras , e para isolar outras variantes de virus que ocorrem naturalmente. Estas sequências de nucleótidos também tornam disponíveis sequências polipeptidicas dos antigénios de HCV, codificadas dentro do genoma Jl e J7, e permite a produção de polipéptidos que são úteis como padrões ou reagentes nos testes de diagnóstico e/ou como componentes de vacinas Anticorpos, quer policlonais quer monoclonais, dirigidos contra os epitopos do HCV, contidos dentro destas sequências polipeptidicas, são também úteis para testes de diagnóstico, como agentes terapêuticos, para pesquisa de agentes antivirais, e para o isolamento do virus da NANBH. Em adição, utilizando sondas derivadas das sequências aqui divulgadas, é possivel isolar e sequenciar outras porções do genoma Jl e J7, aumentando assim as sondas adicionais e polipéptidos úteis no diagnóstico e /ou tratamento, quer profiláctico quer terapêutico da NANBH.

A disponibilidade das sequências de nucleótidos do HCV/J1 e HCV/J7 permite a construção de sondas de polinucleótidos e polipéptidos úteis no diagnóstico da NANBH devido à infecção por HCV e na pesquisa na infecção nos dadores de sangue, bem como no sangue doado e nos produtos sanguíneos. Por exemplo, a partir das sequências é possivel sintetizar oligómeros de DNA com cerca de 8-10 nucleótidos, ou maiores, que são úteis como sondas de hibridação para detectar a presença de RNA do HCV em, por exemplo, soro de sujeitos que se suspeita albergarem o virus, ou para pesquisar o sangue doado quanto à presença do virus. As sequências HCV/J1 e HCV/J7 também permitem a concepção e produção de polipéptidos específicos do HCV que são úteis como reagentes de diagnóstico quanto à presença de anticorpos formados durante a NANBH. Também podem ser usados anticorpos para os polipéptidos purificados derivados das sequências HCV/J1 e HCV/J7, para detectar antigénios virais nos indivíduos e sangue infectados.

conhecimento destas sequências do HCV/J1 e HCV/J7 também permite a concepção e produção de polipéptidos que possam ser usados como vacinas contra o HCV e também para a produção dos anticorpos, que por sua vez possam ser usados para protecção contra a doença, e /ou para terapia dos indivíduos infectados com HCV. Mais ainda, as sequências do HCV/J1 e HCV/J7 divulgadas permitem uma caracterização adicional do genoma do HCV. Sondas de polinucleótidos derivadas dessas sequências, bem como do genoma do HCV, podem ser usadas para pesquisar o partrimónio do cDNA para as sequências do cDNA virai adicional, que por sua vez pode ser usado para obter sequências sobrepostas adicionais. Ver, e.g., Pub. EPO No. 318.216.

As sequências de polinucleótidos do HCV/Jl e HCV/J7, os polipéptidos dai derivados, e os anticorpos dirigidos contra esses polipéptidos, são úteis no isolamento e identificação do(s) agente(s) BB-NANBV. Por exemplo, anticorpos dirigidos contra os epitopos do HCV, contidos nos polipéptidos derivados das sequências do HCV/Jl, podem ser usados em processos baseados na afinidade cromatográfica para isolar o virus. Alternativamente,

os anticorpos podem ser usados para identificar particulas virais isoladas por outras técnicas. Os antigénios virais e o material genómico dentro das particulas virais isoladas pode ser posteriormente caracterizado.

A informação obtida da sequenciação posterior do genoma do HCV/J1 e HCV/J7, bem como da caracterização adicional dos antigénios do HCV/J1 e HCV/J7 e a caracterização dos genomas, permite a concepção e sintese de sondas adicionais e poplipéptidos e anticorpos que podem ser usados para diagnóstico, para prevenção, e para terapia da NANBH induzida pelo HCV, e para pesquisa de produtos relaccionados com o sangue e de sangue infectado.

conhecimento das sequências do cDNA do HCV/J1 e HCV/J7 permite a construção de vectores de expressão que codificam regiões antigenicamente activas do polipéptido codificado em qualquer uma das cadeias. Estas regiões antigenicamente activas podem ser derivadas do revestimento ou dos antigénios do envelope ou dos antigénios da parte central, ou dos antigénios que são não estruturais incluindo, por exemplo, proteínas ligadas a polinucleótidos, polimerase(s) polinucleotidicas, e outras proteínas virais necessárias para a replicação e/ou montagem da partícula do virus. Os fragmentos que codificam os polipéptidos desejados são derivados dos clones de cDNA usando a digestão de restrição convencional ou por métodos sintéticos, e são ligados a vectores que podem, por exemplo, conter porções das sequências de fusão como beta-galactosidase ou superóxido dismutase (SOD). Métodos e vectores que são úteis

I para a produção dos polipéptidos que contêm sequências de fusão do SOD são descritas na Pub. EPO No 196.056. Os vectores que codificam os polipéptidos de fusão do SOD e polipéptidos do HCV são descritos na EPO Pub. No 318.216. Qualquer porção desejada do cDNA do HCV contendo uma estrutura de leitura aberta, em qualquer sentido das cadeias, pode ser obtida como um polipéptido recombinante, tal como uma proteina madura ou de fusão. Alternativamente, um polipéptido codificado no cDNa pode ser fornecido por sintese quimica.

| 0 DNA que codifica o polipéptido desejado, quer na forma madura quer fundido, e quer contendo ou não a sequência sinal para permitir a secrecçâo, pode ser ligado a vectores de expressão adequados para qualquer hospedeiro conveniente. Ambos os sistemas hospedeiros eucarióticos e procarióticos são presentemente usados na formação de polipéptidos recombinantes, e um sumário de alguns dos sistemas de controlo e células hospedeiras mais comuns é indicado a seguir. 0 polipéptido produzido em tais células hospedeiras é a seguir isolado das células lisadas ou do meio de cultura, e purificado até à dimensão necessária para o uso pretendido. A purificação pode ser através de técnicas conhecidas na área, por exemplo, extracção diferencial, fraccionamento salino, cromatografia em resina de troca iónica, cromatografia de afinidade, centrifugação e semelhantes. Ver, por exemplo, Methods in Enzimology para uma variedade de métodos de purificação de proteinas.

Tais polipétidos do HCV sintéticos ou recombinantes podem ser usados como diagnóstico, ou aqueles que dão origem a anticorpos neutralizantes podem ser formulados em vacinas. Anticorpos criados contra tais polipéptidos podem também ser usados como diagnótico ou para imunoterapia passiva. Em adição, anticorpos para tais polipéptidos são úteis no isolamento e identificação das partículas do HCV.

Os antigénios HCV podem também ser isolados dos viriões do HCV. Os viriões podem crescer em células infectadas com HCV em cultura de tecidos, ou num hospedeiro infectado.

Enquanto os polipéptidos da presente invenção podem compreender um dominio virai substancialmente completo em muitas aplicações, o que é necessário é que o polipéptido compreenda uma região antigénica ou imunogénica do virus. Uma região antigénica de um polipéptido é geralmente pequena — tipicamente de 8 a 10 aminoácidos ou menos de comprimento . Fragmentos de poucos como 5 aminoácidos podem caracterizar uma região antigénica. Estes segmentos podem corresponder a regiões dos epitopos HCV/J1 ou HCV/J7. Portanto, usando os cDNA dos HCV/Jl e HCV/J7 como base, os DNA que codificam os pequenos segmentos dos polipéptidos dos HCV/Jl e HCV/J7 podem ser expressos recombinadamente, quer como proteinas de fusão, quer como polipéptidos isolados. Em adição, curtas sequências de aminoácidos podem ser convenientemente obtidas por síntese quimica.

Nos casos em que o polipéptido sintetizado tem a configuração correcta para fornecer o epitopo correcto, mas é pequeno demais para ser imunogénico, o polipéptido pode ser ligado a um transportador adequado. Conhece-se na área, um grande número de técnicas para obtenção de tais ligações, incluindo a e incluem ácido 2formação de ligações disulfeto usando N-succinidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP) e succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) obtido da Pierce Company, Rockford, Illinois, ( se falta ao péptido um grupo sufidril, este pode ser fornecido por adição de residuos de cisteina). Estes reagentes criam uma ligação disulfeto entre eles próprios, e os residuos de cisteina do péptido de uma proteina e uma ligação amida através do epsilon-amino numa lisina, ou outro grupo amino livre . Conhece-se uma grande variedade de tais agentes de formação -amida/dissulfeto. Ver, por exemplo, Immun. Rev. (1982) 62:185. Outros agentes de ligação bifuncional formam uma ligação tioeter em vez de uma dissulfeto. Muitos destes agentes de formação tio-eter são comercialmente disponíveis ésteres reactivos de ácido 6-maleimidocaproico, bromoacético; ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimidometil)ciclo hexano-1-carboxilico, e semelhantes. Os grupos carboxil podem ser activados combinando-os com succinimeto ou ácido l-hidroxil-2-ditro-4-sulfónico, sal de sódio. Métodos adicionais de emparelhar oa antigénios utilizam o sistema rotavirus/pêptidos de ligação descrito em Pub EPO No 259.149, cuja divulgação é aqui incorporada para referência. A lista seguinte não pretende ser exaustiva, e as modificações dos compostos referidos podem ser facilmente usadas.

Qualquer transportador pode ser usado desde que não induza a produção de anticorpos prejudiciais ao hospedeiro. Transportadores adequados são tipicamente grandes, macromoléculas lentamente metabolizadas como proteínas, polisacáridos como sefarose funcionalizada em latex, agarose, celulose, contas de celulose e semelhantes; aminoácidos poliméricos como ácido poliglutâmico, polilisina, e semelhantes, copolímeros de aminoácidos, e partículas de virus inactivos. Especialmente, substratos proteicos úteis são a albumina do soro, hemacianina de lapas , moléculas de imunoglobulinas, tiroglobulinas, ovalbumina, toxoide de tétano, e outras proteinas bem conhecidas dos especialistas na área.

Em adição às proteinas virais completas, polipéptidos compreendendo as sequências de aminoácidos do HCV truncado, codificando, pelo menos, um epitopo virai são reagentes imunologicamente úteis. Por exemplo, polipéptidos compreendendo tais sequências truncadas podem ser usados como reagentes num imunoteste. Estes polipéptidos são também antigénios de subunidades candidatas em composições para produzir antisoro ou vacinas. Enquanto que estas sequências truncadas podem ser produzidas por vários tratamentos conhecidos da proteína virai nativa, é geralmente preferível conceber polipéptidos sintéticos ou recombinantes compreendendo uma sequência do HCV. Polipéptidos compreendendo estas sequências truncadas do HCV podem ser feitas inteiramente a partir das sequências do HCV (um ou mais epítopos, quer sequências contíguas quer não-contiguas), ou sequências do HCV e sequências heterólogas numa proteina de fusão. Sequências heterologas úteis incluem as sequências que fornecem a secrecçâo de um hospedeiro recombinante, aumentando a reactividade imunológica do(s) epitopo(s) do HCV, ou facilitando o emparelhamento do polipéptido a um suporte do imunoteste ou

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transportador da vacina. Ver,e.g., Pub. EPO No. 116.201; Patente Norte-Americana No. 4.722.840; Pub EPO No. 259.149; Patente Norte-Americana No. 4.629.783, que são aqui incorporadas para referência.

O tamanho do polipéptido compreendendo as sequências do HCV truncadas, pode variar grandemente, sendo o tamanho minimo uma sequência de tamanho suficiente para fornecer um epitopo do HCV, enquanto o tamanho máximo não é critico. Nalguns casos, o tamanho máximo usualmente não é substancialmente maior que o necessário para fornecer os epitopos do HCV desejados e a(s) função(Oes) da sequência heterologa, se existir. Tipicamente, a sequência de aminoâcidos truncada do HCV terá cerca de 5 a cerca de 100 aminoâcidos de comprimento. Mais tipicamente, contudo, a sequência do HCV terá um máximo de cerca de 50 aminoâcidos de comprimento, preferencialmente um máximo de cerca de 30 aminoâcidos. Usualmente é desejável seleccionar sequências do HCV de, pelo menos, cerca de 10, 12 ou 15 aminoâcidos até ura máximo de cerca de 20 ou 25 aminoâcidos.

Sequências de aminoâcidos do HCV truncadas compreendendo os epitopos podem ser identificadas de vários modos. Por exemplo, a sequência da proteina virai completa pode ser pesquisada, preparando uma série de pequenos péptidos que juntos abrangem a sequência inteira da proteina. Começando com, por exemplo, polipéptidos de 100-mero, seria rotina testar cada polipéptido quanto à presença do epitopo(s), mostrando a reactividade desejada, e depois testando progressivamente fragmentos mais pequenos e sobrepostos a partir de um 100-mero

identificado para mapear o epitopo com interesse. A pesquisa de tais péptidos num imunoteste está dentro da especialidade. Também é conhecida a análise por computador de uma sequência da proteina para identificar os epitopos potenciais, e depois preparar os oligopéptidos compreendendo as regiões identificadas para pesquisa. Sabe-se, pelos especialistas na área, que tal análise por computador da antigenicidade nem sempre identifica um epitopo que existe realmente, e pode também identificar incorrectamente uma região da proteina como contendo um epitopo.

A relação observada das supostas poliproteinas do HCV e dos Flavivirus permite prever os dominios supostos das proteínas não estruturais (NS) do HCV. A localização das proteínas individuais NS, na suposta poliproteina precursora dos Flavivirus, é bastante bem conhecida. Mais ainda, isto também coincide com as flutuações maciças observadas no perfil de hidrofobicidade da poliproteina. Ficou estabelecido que a NS5 dos Flavivirus codifica a polimerase do virião, e que NS1 corresponde a um antigénio de fixação ao complememto que mostrou ser eficaz em vacinas nos animais. Recentemente, mostrou-se que a função protease dos Flavivirus reside no NS3. Devido às semelhanças observadas entre o HCV e o Flavivirus, são possiveis as deduções respeitantes à localização aproximada dos dominios das proteínas correspondentes e funções na poliproteina do HCV. A Figura 11 é um esquema do suposto domínio da poliproteina do HCV. A expressão dos polipéptidos contendo estes dominios numa grande variedade de hospedeiros recombinantes, incluindo, por exemplo, bactérias, leveduras, células de vertebrados e insectos, deve produzir

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reagentes imunológicos importantes que podem ser usados para diagnóstico, detecção e vacinas.

Apesar da região da proteina não estrutural das supostas poliproteinas do isolado do HCV aqui descrito e do Flavivirus, parecer ser geralmente semelhante, existem menos semelhanças entre as supostas regiões estruturais na direcção do terminal-N. Nesta região, há uma grande divergência na sequência, e em adição, o perfil hidrofóbico das duas regiões mostra menos semelhanças. Esta divergência começa na região do ternimal-N do suposto dominio NS1 do HCV, e estende-se até à presumível terminaçâo-N. Mesmo assim, ainda é possivel prever a localização aproximada dos dominios do suposto nucleocapsideo (dominio básico do terminal-N) e do E (geralmente hidrofóbico) dentro da poliproteina do HCV. Destas previsões é possivel identificar regiões aproximadas da poliproteina do HCV , que podem corresponder a reagentes imunológicos úteis. Por exemplo, sabe-se que as proteínas E e NS1 dos Flavivirus são eficazes como vacinas protectoras. Estas regiões, bem como algumas que mostraram ser antigénicas no HCV1, por exemplo, as dentro das supostas NS3, C, e NS5, etc, devem também fornecer reagentes de diagnóstico.

A imunogenicidade das sequências do HCV pode ser aumentada, preparando as sequências fundidas , ou reunidas com proteínas formadoras de partículas como, por exemplo, antigénios de superfície da hepatite B ou antigénios VP6 do rotavirus. Construções em que o epitopo do HCV está ligado directamente à sequência que codifica as proteínas formadoras de partículas, produzem hibridos que são imunogénicos no que diz respeito ao

epítopo do HCV. Em adição, todos os vectores preparados incluem epitopos específicos para o HBV, possuindo vários graus de imunogenicidade, tal como por exemplo, o péptido pre-S. Assim, as partículas construídas a partir de proteínas formadoras de partículas, que incluem sequências do HCV são imunogénicas no que respeita ao HCV e a proteina formadora de partículas. Ver, por exemplo, a Patente Norte-Americana No. 4.722.840; a Pub EPO No. 175.261; a Pub EPO No. 259.149; Michelle et al. (1984) Int. Symposium on Virai Hepatitis.

As vacinas podem ser preparadas a partir de um ou mais polipéptidos imunogénicos derivados do HCV/Jl ou HCV/J7. A homologia observada entre o HCV e os Flavivirus, fornece a informação respeitante aos polipéptidos que parecem ser os mais eficazes como vacinas, bem como as regiões do genoma nos quais estão codificados. A estrutura geral do genoma dos Flavivirus é discutida em Rice et al. (1986) em THE VIRUSES; THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds Fraenkel-Conrat e Wagner, Vol eds Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press). Pensa-se que o RNA genómico dos Flavivirus é a única espécie de RNAm especifico de virus, e que é traduzido nas três proteínas estruturais virais, i.e., C, M, e E, bem como nas duas grandes proteínas não estruturais, NV4 e NV5, e num conjunto complexo de pequenas proteinas não estruturais. Sabe-se que os epitopos neutralizadores maiores para os Flavivirus se encontram na proteina E (envelope). Roehrig (1986) em THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds Fraenkel-Conrat e Wagner, Vol eds Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press). O

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gene do HCV E correspondente e a região que codifica o polipéptido pode ser previsto, baseando-se na homologia dos Flavivirus. Assim, as vacinas podem ser compostas por polipéptidos recombinantes contendo os epitopos do HCVE. Estes polipéptidos podem ser expressados em bactérias, leveduras, ou células de mamiferos, ou, alternativamente, podem ser isolados de preparações virais. Prevê-se, também, que outras proteinas estruturais possam conter epitopos que produzam anticorpos antiHCV protectores. Assim, os polipéptidos contendo os epitopos do E, C, e M podem também ser usados, quer isoladamente quer em combinações nas vacinas do HCV.

Em adição ao indicado acima, mostrou-se que a imunização com NS1 (proteina não estrutural 1) resulta na protecção contra a febre amarela. Schlesinger et al. (1986) J. Virol (/0:1153. Isto é verdade embora a imunização não produza anticorpos neutralizantes. Assim, particularmente uma vez que estas proteinas parecem ser grandemente conservadas entre os Flavivirus, é provável que a NS1 do HCV também seja protectora contra infecções por HCV. Mais ainda, também mostra que as proteinas não estruturais podem fornecer protecção contra patogenicidades virais, mesmo que não provoquem a produção de anticorpos neutralizantes.

Em vista do acima descrito, vacinas multivalentes contra o HCV podem compreender um ou mais epitopos de uma ou mais proteinas estruturais, e/ou um ou mais epitopos de uma ou mais proteinas não estruturais. Estas vacinas podem compreender, por exemplo, polipéptidos do HCV recombinantes e/ou polipéptidos

J isolados de viriões. Em particular, as vacinas pretendem ser compostas por uma ou mais das seguintes proteinas do HCV, ou subunidades de antigénios seus derivados: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4, e NS5. Particularmente, são preferidas as vacinas compreendendo a E e/ou NS1, ou suas sub-unidades. Em adição, é possivel usar o HCV inactivado em vacinas, podendo a inactivaçâo ser por preparação de lisados virais ou por outros meios conhecidos na área, de modo a causar a inactivaçâo dos Flavivirus, por exemplo, tratamento com solventes orgânicos ou / detergentes, ou tratamento com formalina. Mais ainda, as vacinas podem ser preparadas a partir de estirpes do HCV atenuadas ou virus hibridos como vectores de variola, conhecidos na área [Brown et al. Nature 319:549-550(1986)1.

A preparação de vacinas que contêm polipéptido(s) imunogénico(s) como ingredientes activos é conhecida dos especialistas na área. Tipicamente, tais vacinas são preparadas quer como injectáveis, quer como soluções liquidas ou suspensões; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas à solução em, ou suspensão em, liquidos anteriormente à injecção. A preparação pode ser emulsionada, ou a proteina encapsulada em lipossomas. Os ingredientes imunogénicos activos são frequentemente misturados com excipientes que são farmaeeuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Em adição, se desejável, as vacinas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes

J humidificantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH, e/ou adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, mas não estão limitados a : hidróxido de alúminio, N-acetil-muramil-L-treonilD-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-Disoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmuramilL- alanil- D- isoglutaminil-L- alanina- 2-( l'-2'-dipalmitoil-snglicerol -3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE), e RIBI, que contem três componentes extraidos de bactérias, lipido A monofosforil, dimicolato trealose e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) numa emulsão de squalene/Tween 80 a 2% . A eficácia de um adjuvante pode ser determinada pela medição da quantidade de anticorpos dirigidos contra um polipéptido imunogénico contendo uma sequência antigénica do HCV, resultante da administração deste polipéptido em vacinas que também são compostas por vários adjuvantes.

As vacinas são convencionalmente administradas por via parental, ou por injecção, normalmente quer subcutânea quer intramuscularmente. Formulações adicionais que são adequadas a outros modos de administração incluem supositórios e, nalguns casos, formulações orais. Para os supositórios, ligantes tradicionais e transportadores podem incluir, por exemplo, polialquilenos glicois ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo os ingredientes activos na ordem de 0.5% a 10%, preferencialmente l%-2% Formulações orais incluem excipientes normalmente empregues como, por exemplo, gradientes farmacêuticos de manitol, lactose,

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amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pilulas, cápsulas, formulações de libertação constante ou pós, e contêm 10%-95% do ingrediente activo, preferencialmente 25%-70%.

As proteinas podem ser formuladas em vacinas, como formas salinas ou neutras. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com grupos amino livres do péptido) e que são formados por ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido fosfórico ou clorídrico, ou ácidos orgânicos como o acético, oxálico, tartárico, maleíco, e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxil livres podem ser também derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, sódio, potássio, amónia, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, etanol 2-etilamino, histidina, procaina e semelhantes.

As vacinas são administradas de forma compatível com a formulação da dose, e numa tal quantidade que será profilaticamente e/ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada, que é geralmente na ordem de 5 microgramas a 250 microgramas de antigénio por dose, depende do sujeito do tratamento, capacidade do sistema imune do sujeito para a sintese de anticorpos e grau de protecção desejado. As quantidades precisas do ingrediente activo necessário para a administração podem depender da decisão do clinico e serem caracteristicas de cada sujeito.

A vacina pode ser dada num programa de dose única, ou,

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preferencialmente, de dose múltipla. Um programa de dose múltipla é aquele em que uma série principal de vacinação pode ser formada por 1-10 doses separadas, seguida de outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes, necessários para manter ou reforçar a resposta imune, por exemplo, de 1-4 meses para uma segunda dose, e, se necessário, dose(s) subsequentes após vários meses. O regime de dosagem também será, pelo menos em parte, determinado pela necessidade do individuo e estará dependente da decisão do clinico.

Em adição, a vacina contendo o(s) antigénio(s) do HCV imunogénico(s) pode ser administrada em conjunto com outros agentes imunoreguladores, por exemplo, imunoglobulinas.

Os polipéptidos imunogénicos, preparados como foi descrito acima, são usados para produzir anticorpos quer policlonais quer monoclonais. Se se desejar anticorpos policlonais, um mamifero seleccionado (e.g., rato, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um polipéptido imunogénico transportando o(s) epitopo(s) do HCV. O soro dos animais imunizados é recolhido e tratado de acordo com os processos conhecidos. Se o soro que contém os anticorpos policlonais para o epitopo do HCV, contém anticorpos para outros antigénios, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. Técnicas para a produção e processamento de antisoro policlonal são conhecidas na área, ver por exemplo, Mayer e Walker, eds. (1987) IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

Os anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos do

J

HCV podem ser prontamente produzidos pelos especialista na área. A metodologia geral, para produzir anticorpos monoclonais por hibridoma é bem conhecida. Linhas celulares produtoras de anticorpos imortais podem ser criadas por fusão celular, e também por outras técnicas como transformação directa de linfócitos B com DNA oncogénico, ou transfecçâo com virus Epstein-Barr. Ver, e.g., M. Schreier et al.(1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES; Hammerling et al.(1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS; Kennett et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES; ver também, Patente Norte Americana No. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; e 4.493.890. Painéis de anticorpos monoclonais, produzidos contra epitopos do HCV podem ser pesquisados quanto a várias propriedades, i.e., para isotipos, afinidade de epitopos,etc.

Anticorpos quer monoclonais quer policonais, que são dirigidos contra epitopos do HCV, são particularmente úteis no diagnóstico , e os que são neutral iz adores são úteis em imunoterapia passiva. Anticorpos monoclonais, em particular, podem ser usados para aumentar os anticorpos anti-idiotipo.

Anticorpos anti-idiotipos são imunoglobulinas que possuem uma imagem interna do antigénio do agente infeccioso contra o qual se deseja a protecção. As técnicas para aumentar anticorpos anti-idiotipo são conhecidas no ramo. Ver, por exemplo, Grzych (1985), Nature 316:74; MacNamara et al. (1984), Science 224:1325, Yytdehaag et al (1985), J. Immunol. 134:1225. Estes anticorpos anti-idiotipos podem também ser úteis no tratamento e/ou diagnóstico da NANBH, bem como no esclarecimento

J

das regiões imunogénicas dos antigénios do HCV.

Usando as sequências dos polinucleótidos do HCV/J1 ou HCV/J7 como uma base, oligómeros de aproximadamente 8 ou mais nucleótidos podem ser preparados, quer por excisâo, quer sinteticamente, que hibridam com o genoma do HCV e são úteis na identificação do(s) agente(s) virais, caracterização posterior do(s) genoma(s) virais, bem como na detecçâo dos virus em indivíduos doentes. As sondas para os polinucleótidos do HCV (naturais ou derivados) são de um comprimento que permite a detecçâo de sequências virais únicas por hibridação. Enquanto 6-8 nucleótidos podem constituir um comprimento operável, são preferíveis sequências de cerca de 10-12 nucleótidos, e cerca de 20 nucleótidos parecem ser óptimas. Estas sondas podem ser preparadas usando métodos de rotina, incluindo métodos sintéticos de oligonucleótidos automatizados. Entre as sondas úteis, encontram-se, por exemplo, os clones aqui descritos, bem como os vários oligómeros úteis na sondagem do património do cDNA, como a seguir se indica. Um complemento para qualquer porção única do genoma do HCV será satisfatório. Para usar como sondas, é desejável uma complementaridade completa, embora possa ser desnecessária à medida que o comprimento do fragmento aumenta.

Para usar tais sondas como diagnóstico, a amostra biológica a analisar, como sangue ou soro, pode ser tratada, se fôr desejado, para extrair os ácidos nucleicos ai contidos. 0 ácido nucleico resultante de uma amostra pode ser sujeito a electroforese em gel ou outras técnicas de separação pelo tamanho; alternativamente, a amostra de ácido nucleico pode ser

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marcada sem separação pelo tamanho. As sondas são então marcadas. Marcadores adequados, e métodos para marcar as sondas, são conhecidos na área e incluem, por exemplo, marcadores radioactivos incorporados por tradução ou activação, biotina, sondas fluorescentes e sondas quimioluminescentes. Os ácidos nucleicos extraídos da amostra são depois tratados com a sonda marcada em condições de hibridação de adstringência adequadas. Usualmente são desejáveis condições de adstringência elevada, para evitar positivos falsos. A adstringência da hibridação é determinada por vários factores durante a hibridação e durante o processo de lavagem, incluindo a temperatura, força iónica, intervalo de tempo e concentração de formamida. Estes factores são indicados em, por exemplo, Maniatis, T. (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press,Cold Sprind Harbor,N.Y.).

Geralmente, espera-se que as sequências do genoma do

HCV estejam presentes no soro de indivíduos infectados a niveis 2 3 relativamente baixos, i.e., de, aproximadamente, 10 - 10 das doses de chimpanzé infectado (CID) por ml. Este nivel pode requerer que as técnicas de amplifiçâo sejam usadas em testes de hibridação. Tais técnicas de amplificação são bem conhecidas na área. Por exemplo, o sistema Enzo Biochemical Corporation BIOBridge usa transferases desoxinucleotidicas terminais para adicionar caudas-3'-poli-dT não modificadas a uma sonda de DNA. A sonda com a cauda poli-dT é hibridada com a sequência de nucleótidos alvo e depois com uma poli-A biotina modificada. 0 Pedido PCT No. 84/03520 e Pub EPO No. 124.221

J descrevem um teste de hibridação de DNA em que: (1) o objecto da análise é emparelhado com uma sonda de DNA de cadeia simples que é complementar de um oligonucleótido marcado com um enzima; e (2) o duplex com cauda resultante é hibridado com um oligonucleótido marcado com enzimas. A Pub EPO No. 204.501, descreve um teste de hibridação de DNA, em que o DNA da análise contacta com uma sonda que tem uma cauda, como uma cauda poli-dT, uma cadeia amplificadora que tem uma sequência que hibrida com a cauda da sonda, tal como uma sequência poli-A, e que é capaz de ligar uma pluridade de cadeias marcadas.

Uma técnica particularmente desejável pode primeiro envolver a amplificação da sequência do HCV alvo em soros, de, g

aproximadamente, 10.000 vezes, i.e., a, aproximadamente, 10 sequências/ml. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela técnica de polimerase de reacção em cadeia (PCR), descrita por Saiki et al. (1986) Nature 324:163, Mullis, Patente Norte

Americana No. 4.683.195, e Mullis et al. Patente Norte Americana No. 4.683.202. A(s) sequência(s) amplificada(s) podem ser depois detectadas usando um teste de hibridação que é descrito na Publicação Europeia co-pendente No. 3157-077 e na Aplicação Japonesa No. 63-260347, que são aqui referidas, e aqui incorporadas para referência. Estes testes de hibridação, que g

devem detectar sequências ao nivel de 10 /ml, utilizam multimeros de ácido nucleico que se ligam ao ácido nucleico da análise de cadeia simples, e que também se ligam a uma multiplicidade de olignucleótidos marcados de cadeia simples. Um teste sandwich de fase solução adequado que pode ser usado com as sondas

J polinucleotidicas marcadas, e os métodos para a preparação das sondas é descrito na Pub EPO No. 225.807 aqui incorporado para referência.

As sondas podem ser embaladas em kits de diagnóstico. Os kits de diagnóstico incluem a sonda de DNA, que pode ser marcada; alternativamente, a sonda de DNA pode ser não marcada e os ingredientes para a marcação serem incluídos no kit em recipientes separados. O kit pode também conter outros reagentes embalados e materiais necessários para o protocolo de hibridação particular, por exemplo, padrões, tampões de lavagem, bem como instruções para a realização do teste.

Quer os polipéptidos do HCV/J1 quer do HCV/J7, que reagem imunologicamente com o soro contendo anticorpos HCV e os anticorpos produzidos contra os epitopos específicos do HCV nesses polipéptidos são úteis em imunotestes, para detectar a presença de anticorpos HCV, ou a presença do virus e/ou antigénios virais, em amostras biológicas. A concepção do imunoteste está sujeita a uma grande dose de variação, e a variedade deste é conhecida na área. Um imunoteste para anticorpos anti-HCV pode utilizar um epitopo virai ou vários epitopos virais. Quando são usados múltiplos epitopos, os epitopos podem ser derivados do mesmo ou de diferentes polipéptidos virais e podem estar separados em polipéptidos naturais ou recombinantes, ou juntos nos mesmos polipéptidos recombinantes.

Um imunoteste para o antigénio virai pode usar, por exemplo, um anticorpo monoclonal dirigido para um epitopo virai,

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uma combinação de anticorpos monoclonais dirigidos para epitopos de um polipéptido virai, anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos de diferentes polipéptidos virais, anticorpos policlonais dirigidos contra o mesmo antigénio virai, anticorpos policlonais dirigidos contra antigénios virais diferentes ou uma combinação de anticorpos monoclonais e policlonais.

Os protocolos de imunotestes podem ser baseados, por exemplo, em competição, ou reaeção directa, ou testes tipo sandwich . Protocolos podem também, por exemplo, usar suportes sólidos, ou podem ser realizados através de imunoprecipitaçâo. A maioria dos testes envolve o uso de anticorpos marcados ou polipéptidos. Os marcadores podem ser, por exemplo, fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivos, ou moléculas coradas. Testes que amplificam os sinais da sonda são também conhecidos. Exemplos destes são os testes que utilizam biotina e avidina, e imunotestes com enzimas marcados e mediados, tais como o teste ELISA. Tipicamente, um imunoteste para anticorpos antiHCV envolve a selecçâo e preparação da amostra-teste, tal como uma amostra biológica, e depois incubação com um polipéptido do HCV antigénico (i.e., contendo-epitopo), sob condições que permitem a formação de complexos antigénio-anticorpo. Tais condições são bem conhecidas na área. Num formato heterogéneo, o polipéptido é ligado a um suporte sólido para facilitar a separação da amostra do polipéptido após a incubação. Exemplos de suportes sólidos que podem ser usados são nitrocelulose, em membranas, ou sob a forma de poços de microtitulação, polivinilcloreto, em folhas ou poços de microtitulação, latex de poliestireno, em contas ou placas de microtitulaçâo, fluoreto de polivinilidina, conhecido como Immobulon , papel diazotizado, membranas de nylon, contas activadas, e contas de proteina A.

Mais preferencialmente, são usados, no formato heterogéneo, o TM

Dynatech, uma placa de microtitulaçâo Immulon ou as contas de poliestireno de 0,25-polegada, cujo Spec termina por Precision Plastic Bali. 0 suporte sólido é tipicamente lavado após ser separado da amostra-teste. Num formato homogéneo, a amostra-teste é incubada com o antigénio em solução, em condições que farão precipitar qualquer complexo antigénio-anticorpo que se tenha formado, como é sabido na área. Os complexos precipitados são depois separados da amostra-teste, por exemplo, por centrifugação. Os complexos formados, compreendendo o anticorpo anti-HCV, são depois detectados por qualquer uma das numerosas técnicas. Dependendo do formato, os complexos podem ser detectados com imunoglobulinas anti-xenogeneicas marcadas, ou se fôr usado um formato competitivo, por medição da quantidade do anticorpo competitivo marcado de ligação.

Em imunotestes em que os polipéptidos do HCV são os objectos de análise, a amostra-teste, tipicamente uma amostra biológica, é incubada com anticorpos anti-HCV, outra vez sob condições que permitam a formação de complexos antigénioanticorpo. Podem ser utilizados vários formatos, tal como um teste sandwich, em que o anticorpo ligado a um suporte sólido é incubado com a amostra-teste; lavado; incubado com um segundo anticorpo marcado para o objecto da análise; e o suporte é novamente lavado. 0 objecto da análise é detectado,

determinando-se se o segundo anticorpo está ligado ao suporte. Num formato competitivo, que pode ser quer heterogéneo ou homogéneo, uma amostra-teste é usualmente incubada com um anticorpo e um antigénio competitivo marcado, quer sequencial quer simultaneamente. Estes e outros formatos são bem conhecidos na área.

de potencial virais, e.

modelo do Flavivirus para o HCV permite previsões quanto à localização provável dos epitopos de diagnóstico para as proteinas estruturais do viriâo. Os domínios C, pré-M, M e E, provavelmente contêm os epitopos significativo para detectar antigénios particularmente, para diagnóstico. Similarmente, espera-se que os domínios das proteinas não estruturais contenham epitopos de diagnóstico importantes (e.g., NS5 que codifica uma suposta polimerase; e NS1 que codifica um suposto antigénio de ligação ao complemento). Polipéptidos recombinantes, ou polipéptidos virais, que incluem epitopos deste dominio especifico podem ser úteis na detecção de anticorpos virais, na infecção através do sangue de dadores e pacientes infectados. Em adição, anticorpos dirigidos contra as proteinas E e/ou M podem ser usados em imunotestes para a detecção de antigénios virais em pacientes com NANBH causada por HCV, e em dadores de sangue infectado. Mais ainda, estes anticorpos podem ser extremamente úteis na detecção em dadores e pacientes em fase-aguda.

Regiões antigénicas da suposta poliproteina podem ser mapeadas e identificadas por pesquisa de antigenicidade dos produtos de expressão bacteriana do cDNA do HCV que codificam porções da poliproteina. Outras regiões antigénicas do HCV podem ser detectadas por expressão das porções do cDNA do HCV noutros sistemas de expressão incluindo sistemas de leveduras, e sistemas celulares derivados de insectos e vertebrados. Em adição, estudos que deram origem a um index de antigenicidade e a um perfil de hidrofobicidade/hidrofilicidade forneceram informação respeitante à probabilidade de uma região de antigenicidade. Sistemas de detecção eficientes podem incluir o uso de painéis de epitopos. Os epitopos do painel podem ser construidos num ou em múltiplos polipéptidos.

Kits adequados ao imunodiagnóstico e contendo os reagentes apropriados marcados são construidos embalando os materiais apropriados, incluindo os polipéptidos da invenção, contendo os epitopos do HCV ou anticorpos dirigidos contra os epitopos do HCV em recipientes adequados, juntamente com os restantes reagentes e materiais necessários para a realização do teste (e.g.,tampão de lavagem, meios de detecção como imunoglobulinas anti-humanas marcadas, antigénio de HCV marcado), bem como um conjunto adequado de instruções do teste.

A informação da sequência de nucleótidos do HCV/J1 e HCV/J7 descrita aqui, pode ser usada para adquirir mais informação sobre a sequência dos genomas do HCV, e para identificar e isolar isolados do HCV adicionais relacionados com o Jl ou J7 . Esta informação por sua vez, pode levar a sondas de polinucleótidos adicionais, polipéptidos derivados do genoma do HCV, e anticorpos dirigidos contra os epitopos do HCV que seriam úteis para o diagnóstico e/ou tratamento da NANBH causada pelo

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HCV.

A informação da sequência de nucleótidos do HCV/Jl e HCV/J7 é útil para a concepção de sondas para o isolamento de sequências adicionais que são derivadas de regiões ainda não definidas do genoma do HCV das quais são derivados as sequências J1 e J7. Por exemplo, sondas marcadas contendo uma sequência de aproximadamente 8 ou mais nucleótidos, e preferencialmente 20 ou mais nucleOtidos que são derivados da região próxima do terminal 5' ou 3', da familia de sequências de cDNA do HCV, divulgadas nos exemplos, podem ser usadas para isolar sobreposições das sequências do cDNA, proveniente do património do cDNA do HCV. Estas sequências, em que há sobreposição dos cDNA nos clones acima mencionados, mas que também contêm sequências derivadas de regiões do genoma do qual o cDNA dos clones acima mencionados não é derivado, podem ser depois usadas para sintetizar sondas para identificação de outros fragmentos sobrepostos que não sobreponham necessariamente os cDNA descritos a seguir. Métodos para construir o património de cDNA são conhecidos na área. Ver | e.g., Pub EPO No. 318.216. E particularmente preferível preparar patrimónios a partir do soro de pacientes japoneses ou outros asiáticos, diagnosticados como tendo NANBH demonstrando anticorpos para antigénios do HCV1 ;pensa-se que estes são os candidatos mais prováveis como portadores de HCV/Jl, HCV/J7 ou isolados relacionados.

As partículas do HCV podem ser isoladas a partir do soro de um individuo com NANBH ou da cultura de células por qualquer dos métodos conhecidos na área, incluindo por exemplo,,

J técnicas baseadas na discriminação de tamanho , como métodos de exclusão ou sedimentação, ou técnicas baseadas em densidade como ultracentrifugação em gradiente de densidade, ou precipitação com agentes como o glicol polietileno, ou oromatografia de uma variedade de materiais como materiais de troca aniónica ou catiónica, e materiais que se ligam devido a hidrofobicidade.

Um método preferível de isolamento de partículas do HCV ou antigénios , é por colunas de imunoafinidade. Técnicas para cromatografia de imunoafinidade são conhecidas na área, incluindo técnicas de fixação de anticorpos a suportes sólidos, de modo a reter a sua actividade imunoselectiva. As técnicas podem ser aquelas nas quais os anticorpos são adsorvidos ao suporte (ver, por exemplo, Kurstak em ENZIME IMMUNODIAGNOSIS, pag 31-37), bem como as em que os anticorpos são ligados covalentemente ao suporte. Geralmente, as técnicas são semelhantes às usadas para a ligação covalente dos antigénios a um suporte sólido, descrito acima. Contudo, grupos separadores podem ser incluídos nos agentes emparelhadores bifuncionais, de modo a que o sitio de ligação ao antigénio, do anticorpo fique acessível. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais, e é desejável purificar os anticorpos antes do seu uso em imunotestes.

As técnicas gerais usadas na extracção do genoma de um virus, preparação e sondagem de um património de cDNA, sequenciação de clones, construção de vectores de expressão, transformação de células, realização de testes imunológicos, tais como radioimunotestes e testes ELISA, para o crescimento de células em cultura, e semelhantes, são conhecidas na área e estão

J disponíveis manuais de laboratório descrevendo essas técnicas. Contudo, como guia geral, as seguintes informações fornecem algumas fontes correntemente disponíveis para tais procedimentos, e para materiais úteis na sua realização.

Quer células hospedeiras procarióticas, quer eucarióticas, podem ser usadas para a expressão das sequências de código desejadas quando se usam as sequências controlo apropriadas, as quais são compatíveis com o hospedeiro designado. Entre os hospedeiros procariotas, o E. coli é o mais frequentemente usado. As sequências de controlo da expressão para os procariotas incluem promotores, facultativamente contendo porções operadoras, e sitios de ligação a ribossomas. Vectores de transferência compatíveis com os hospedeiros procariotas são normalmente derivados de, por exemplo, pBR322, um plasmídeo contendo operões que conferem resistência à ampicilina e tetraciclina, e os vários vectores pUC que também contêm sequências conferindo aos marcadores resistência aos antibióticos. Estes marcadores podem ser usados para obter transformantes bem sucedidos, por selecção. As sequências controlo procarióticas, normalmente usadas, incluem Betalactamase (penicilinase) e sistemas promotores da lactose (Chang et al. (1977), Nature 198:1056, sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al. (1980) Nucleic Acid Res. (3:4057), e o promotor lambda-derivado PL e o gene N do sitio de ligação ao ribossoma (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128) e o promotor tac hibrido (De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei USA 292:128) derivados das sequências dos promotores trp e lac UV5.

Os sistemas seguintes são particularmente compatíveis com a E.coli; se desejável, podem ser usados outros hospedeiros procariotas como estirpes de Bacillus ou Pseudomonas, com as correspondentes sequências de controlo.

Hospedeiros eucariotas incluem leveduras e células de mamíferos em sistemas de cultura. Sacchromyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Klebsiela lactis e Pichia pastoris são os hospedeiros de levedura mais geralmente usados, e são hospedeiros fúngicos convenientes. Vectores compatíveis de leveduras transportam marcadores que permitem a selecção de transformantes bem sucedidos, conferindo prototrofia a mutantes auxotróficos ou resistência a metais pesados em estirpes selvagens. Vectores compatíveis de levedura podem empregar a origem de 2 micra de replicação (Broach et al. (1983) Math Enz. 101:307), a combinação de CNE3 e ARS1 ou outros meios de assegurar a replicação, como as sequências que resultam na incorporação de um fragmento apropriado no genoma da célula hospedeira. As sequências de controlo para os vectores de leveduras são conhecidas na área e incluem promotores para a

1986) sintese de enzimas glicoliticos (Hess et al.

Enzyme Eng. _7^:149; Holland et al. (1978), J. Biol. Chem. 256:1385), incluindo o promotor para a cinase 3 fosfoglicerato (Hitzen (1980), J. Biol. Chem. 255:2073). Os terminadores podem ser também incluídos, como os derivados do gene enolase (Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385). Sistemas de controlo particularmente úteis são aqueles que compreendem o promotor desidrogenase fosfato 3 gliceraldeido (GAPDH) ou o promotor

Adv.

regulador desidrogenase álcool (ADH), os terminadores derivados também do GAPDH, e se a secrecçâo fôr desejada, sequências principais do factor alfa da levedura. Em adição, a região reguladora da transcrição e região de iniciação da transcrição que estão ligadas operacionalmente podem ser tais que não estão naturalmente associadas no organismo do tipo selvagem. Estes sistemas são descritos em detalhe na Pub. EPO No. 120.551; Pub.EPO No. 116,201; e Pub EPO No. 164.556, todas aqui incorporadas para referência.

Linhas celulares de mamiferos, disponíveis como hospedeiros para expressão, são conhecidas na área e incluem muitas linhas celulares imortalizadas, disponíveis a partir da American Type Culture Collecton (ATCC), incluindo células HeLa, células de ovários de hamster chineses (CHO), células de rins de hamster bébés (BHK), e um grande número de outras linhas celulares. Promotores adequados para células de mamiferos são também conhecidos na área e incluem promotores virais como o do virus Simios 40 (SV40) (Fiers (1978), Nature 273;113), virus do sarcoma Rous (RSV), adenovirus (ADV), e virus do papiloma bovino (BPV). As células de mamiferos também necessitam de sequências terminadoras e sequências de adição poli A; sequências aumentadoras que aumentam a expressão podem ser incluidas, e sequências que provocam a amplificação do gene podem também ser desejáveis. Estas sequências são conhecidas na área. Vectores adequados para a replicaçâo nas células de mamiferos podem incluir replicões virais, ou sequências que assegurem a integração de sequências apropriadas que codificam os epitopos da

J

NANBV no genoma do hospedeiro.

sistema do virus da variola pode também ser usado para expressar o DNA estranho na célula do mamifero. Para expressar genes heterólogos, o DNA estranho é geralmente inserido no gene activador da timidina guinase do virus da variola, e as células infectadas podem ser escolhidas. Este método é conhecido na área e pode-se encontrar mais informação nestas referências [Mackett et al. J. Virol. 49: 857-864 (1984) e Capitulo 7 do DNA Cloning, Vol. 2, IRL Press].

Em adição, os antigénios virais podem ser expressos em células de insectos, pelo sistema Baculovirus. Um guia geral para a expressão do baculovirus é de Summer e Smith A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture

Procedures (Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No 1555). Para incorporar o gene heterólogo no genoma do baculovirus, o gene é primeiramente clonado num vector de transferência contendo algumas sequências do baculovirus. Este vector de transferência quando é co-transferido com o virus tipo selvagem em células de insectos, recombinará com o virus do tipo selvagem. Usualmente, o vector de transferência será construído de modo a que o gene heterólogo irá destruir o gene poliédrico do baculovirus do tipo selvagem. Esta destruição permite uma selecçâo fácil do virus recombinante uma vez que as células infectadas com o virus recombinante serão fenotipicamente diferentes das células infectadas com o virus tipo selvagem. 0 virus recombinante purificado pode ser usado para infectar células para expressar o gene heterólogo. A proteina estranha

pode ser segregada para o meio se um péptido de sinalização for ligado à estrutura do gene heterólogo; de outra forma, a proteina será ligada ao lisado celular. Para mais informação, ver Smith et al. Mol. & Cell. Biol. _3^;2156-2165 (1983), ou Luckow e Summers em Virology 17: 31-39 (1989).

A transformação pode ocorrer por qualquer dos métodos conhecidos para introduzir polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo por exemplo, a retirada directa do polinucleótido do virus e transduçâo de uma célula hospedeira com o virus, e por retirada directa do polinucleótido. 0 processo de transformação depende do hospedeiro a ser transformado. A transformação bacteriana por retirada directa geralmente utiliza tratamento com cloreto de rubidio ou cálcio (Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110; Maniatis et al. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). A tranformaçâo de leveduras por retirada directa pode ser levada a cabo usando o método de Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929. A transformação de mamíferos por retirada directa pode ser conduzida usando o método de Graham e Van der Eb de precipitação por fosfato de cálcio (1978), Virology 52:546 ou várias modificações do mesmo.

A construção de vectores utiliza técnicas que são conhecidas na área. A clivagem do DNA em sitios específicos é realizada por tratamento com os enzimas de restrição adequados, em condições que são geralmente especificadas pelos fabricantes destes enzimas comercialmente disponíveis. Os fragmentos clivados podem ser separados usando técnicas de electroforese em gel de

J agarose ou poliacrilamida, de acordo com o procedimento geral encontrado em Methods of Enzymology (1980) 65:499-560. As terminações aderentes dos fragmentos de clivagem podem ser transformadas em terminações cegas usando DNA polimerase I de E. coli (Klenow), na presença dos trifosfatos desoxinucleótidos apropriados (dNTPs) presentes na mistura. 0 tratamento com nucleases SI também pode ser usado resultando na hidrólise de qualquer porção de DNA de cadeia simples.

As ligações foram executadas usando um tampão e condições de temperatura padrão, usando ligases T4 DNA e ATP; as ligações com extermidades aderentes requerem menos ATP e menos ligases que as ligações com extermidades cegas. Quando os fragmentos do vector são usados como parte da mistura de ligação, o fragmento do vector é frequentemente tratado com fosfatase alcalina bacteriana (BAP) ou fosfatase alcalina intestinal de vitela, para remover o fosfato-5' e assim evitar re-ligação do vector; alternativamente, digestão com enzimas de restrição, de fragmentos não desejados, pode ser usada para evitar a ligação. Misturas de ligação são transformadas em hospedeiros de clonagem adequados tais como E. coli, e os transformantes bem sucedidos seleccionados, por exemplo, por resistência a antibióticos, e pesquisados quanto à construção correcta.

Os oligonucleóticos sintéticos podem ser preparados usando um sintetizador automatizado de oligonucleótidos como descrito por Warner (1984), DNA 3:401. Se fôr desejável, as 32 cadeias sintéticas podem ser marcadas com P, por tratamento com 32 cinases polinucleotidicas, na presença de P-ATP, sob condições

J padrão para a reacção. As sequências de DNA, incluindo as isoladas do património do cDNA, podem ser modificadas por técnicas conhecidas, incluindo por exemplo, mutagénese dirigida para o local, como foi descrito por Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

Patrimónios de DNA podem ser utilizados como sondas usando o método de Grunstein e Hogness (1975), Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 73:3961. Resumidamente, neste método o DNA a ser sondado é imobilizado em filtros de nitrocelulose, desnaturado, e pré— hibridado com um tampão. A percentagem de formamida no tampão, bem como as condições de tempo e temperatura da pré-hibridaçâo e etapas de hibridação subsequente, dependem da adstringência requerida. Sondas oligoméricas que requerem condições de baixa adstringência são geralmente usadas com baixas percentagens de formamida, baixas temperaturas, e períodos de hibridação longos.

Sondas contendo mais de 30 ou 40 nucleótidos, como as derivadas do cDNA ou sequências genómicas, geralmente utilizam temperatura mais elevada, por exemplo, cerca de 40-42°C, e uma alta percentagem, e.g., 50% de formamida. A seguir à pré-hibridação, a 32 sonda de oligonucleótidos 5'- P-marcados é adicionada ao tampão, e os filtros incubados nesta mistura em condições de hibridação. Após a lavagem, os filtros tratados são sujeitos a autoradiografia para revelar a localização da sonda hibrida; o DNA das localizações correspondentes nas placas de agar originais é usado como fonte do DNA desejado.

Um teste imunoabsorvente de ligação ao enzima (ELISA) pode ser usado para medir quer a concentração do antigénio quer

J

do anticorpo. Este método depende da conjugação do enzima quer a um antigénio quer a um anticorpo, e usa a actividade do enzima ligado como marcador quantitativo. Para quantificar o anticorpo, o antigénio conhecido é fixado a uma fase sólida (e.g., uma microplaca ou taça de plástico), e incubado com as diluições do soro a testar, lavado, incubado com anti-imunoglobulina marcada com um enzima e lavado novamente. Enzimas adequados para a marcação são conhecidos na área, e incluem, por exemplo, peroxidases de rábano. A actividade do enzima ligado à fase sólida é medida, adicionando o substrato especifico, e determinando a formação do produto ou a utilização do substrato colorimetricamente. A actividade do enzima ligado é uma função directa da quantidade de anticorpo ligado.

Para quantificar o antigénio, um anticorpo especifico conhecido é fixado à fase sólida, o material teste contendo o antigénio é adicionado, após uma incubação a fase sólida é lavada, e um segundo anticorpo marcado com um enzima é adicionado. Após lavagem, o substrato é adicionado, e a actividade do enzima é calculada colorimetricamente, e está relacionada com a concentração do antigénio.

Exemplos

I

Este exemplo descreve a clonagem das sequências dos nucleótidos do HCV/Jl e HCV/J7.

Ambas as amostras de sangue que foram usadas como fonte

Μ

J de viriões HCV foram positivas nos testes de anticorpos anti-HCV. Os isolados do HCV destas amostras foram denominados HCV/J1 e HCV/J7. A infectividade da amostra de sangue contendo o isolado Jl foi confirmada por um estudo de prospecção dos receptores de transfusão de sangue. 0 dr Tohru Katayama, do Departamento de Cirurgia Toráxica do Hospital Nacional de Tóquio, recolheu sangue de pacientes que contraíram hepatite não A, não B pós-transfusâo. Ele também recolheu amostras de sangue dos respectivos dadores de sangue desses doentes. A seguir, estas amostras foram testadas quanto aos anticorpos para o antigénio C100-3 do HCV1 (Pub. EPO No. 318.216), e o sangue de um dos dadores era positivo.

isolamento do RNA das amostras de sangue começa pela deposição dos viriões, na amostra de sangue, por ultracentrifugação [Bradley, D.W., McCaustland, K.A., Cook E.H.,

Schable,

C.A., Ebert,

J.W.

e Maynard, J.E.

(1985)

Gastroenterology 88, 773-779]. 0 RNA foi depois extraido do pellet pelo método do cloreto de césio/guanidinio [Maniatis T.,Fritsch, E.F., e Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor], e posteriormente purificado pela extracção em clorofórmio/fenol na presença de ureia, [Berk, A.J. Lee, F., Harrison, T., Williams, J. e Sharp, Ρ. A. (1979) Cell 17, 935944].

Foram concebidos cinco pares de primers oligonucleótidos sintéticos a partir da sequência de nucleótidos dos dominios C/E, E, E/NS1, NS3, e NS5 do HCVl para isolar fragmentos do genoma Jl e J7. 0 primeiro conjunto de primers

J

serviu para isolar a sequência do domínio da parte central e parte do envelope. 0 segundo conjunto de primers serviu para isolar as sequências do domínio do envelope. 0 terceiro conjunto de primers serviu para isolar um fragmento que sobrepunha os domínios do suposto envelope e dominio um não estrutural NS1. 0 quatro e quinto conjuntos de primers para isolar fragmentos dos domínios não estruturais três e cinco, NS3 e NS5. A sequência para os vários primers são indicadas em baixo:

A sequência do primer para a região C/E era:

21S 5' CGTGCCCCCGCAAGACTGCT 3'

J80A 5' CCGTCCTCCAGAACCCGGAC 3'

A sequência dos primers para a região E era:

71S 5' GCCGACCTCATGGGGTACAT 3'

J13 2A 5' AACTGCGACACCACTAAGGC 3'

A sequência dos primers para a região E/NS1 era:

< 127S 5' TGGCATGGGATATGATGATG 3'

166A 5' TTGAACTTGTGGTGATAGAA 3'

A sequência dos primers para a região NS3 era:

464S 5' GGCTATACCGGCGACTTCGA 3'

526A 5' GACATGCATGTCATGATGTA 3'

A sequência dos primers para a região NS5 era:

870S 5' GCTGGAAAGAGGGTCTAÇTA 3'

917A 5' GTTCTTACTGCCCAGTTGAA 3'

Foi adicionado 1 μ9 dos primers anti-sentido, 166A, 526A, ou 917A, a 10 unidades de transcriptase inversa (Biorad), para sintetizar fragmentos cDNA a partir dos RNA isolado como padrão. Os fragmentos de cDNA foram depois amplificados por uma polimerase típica de reacção em cadeia [ Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn G.T., Erlich, H.A., e Arnheim, N. (1985) Science 230, 1350-1354], após ter-se adicionado 1 gg do primer de sentido apropriado, 21S, 71S,

127S, 464S ou 870S.

J

Os fragmentos de cDNA, amplificados pelo método PCR, foram isolados em gel e clonados por ligação de terminação cega no sitio Smal do pUC119 [Vieira, J. e Messing, J. (1987) Methods in Enzymology 153, 3-11] ou no sitio SnaBI do caromideo SB, um derivado do vector de clonagem caromideo 9-42 [Saito, I. e Stark, G. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 8664-8668]. Foram contruidos com sucesso os clones contendo os fragmentos dos cinco dominios virais.

II

A partir de reacção PCR dos isolados japoneses Jl e J7, três clones independentes de cada região C/E, E, E/NS1, NS3, e NS5 , foram sequenciados pelo método de terminação de cadeia dideoxi.

Sequências de todas as regiões excepto da C/E foram isoladas do isolado Jl. Apenas sequências da região C/E foram isoladas a partir do isolado J7. Surpreendentemente, fragmentos isolados de ambos os isolados não são maiores ou menores que o previsto a partir do genoma do HCV1. Contudo, há heterogeneidade entre os clones contendo sequências da mesma região. Consequentemente, uma sequência consensual foi construída para cada um dos dominios, C/E, E, E/NS1, NS3 e NS5como é mostrado respectivamente nas Figuras de 1 a 5. Estas diferenças podem ser explicadas como artefactos que ocorrem ao acaso durante a amplificação PCR [ Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A., e Arnheim, N. (1985) Science 230,

J

1350-1354]. Outra explicação é que está presente, no plasma de um único portador saudável, mais do que um genoma do virus, e que esses genomas são heterogéneos ao nivel dos nucleótidos.

Para clarificar este ponto, foi determinado quantas destas diferenças de nucleótidos levavam a alterações nos aminoácidos, usando a sequência do dominio NS3 do isolado J1 como um exemplo. Das cinco diferenças de nucleótidos, três falham na terceira posição do codâo do aminoácido, e não alteram a sequência dos aminoácidos. Ambas as duas alterações dos nucleótidos restantes, falham a primeira posição do codâo do aminoácido e provocam alteração do aminoácido de treonina para alanina, e de prolina para alanina, os quais são pequenos resíduos de aminoácidos neutros. Similarmente, quando se analisa as diferenças de nucleótidos noutros dominios, encontram-se muitas mutações silenciosas e conservadas. Estes resultados sugerem que as sequências de nucleótidos do genoma do HCV no plasma de um único dador saudável, são heterogéneas ao nivel dos nucleótidos.

Além disso, uma vez que as sequências consensuais para cada um dos fragmentos foi compilada, cada sequência foi comparada com o isolado HCVl nas figuras de 6 até 10. Na figura 6, o fragmento da região C/E do isolado J7 mostra uma homologia de aminoácidos 150/154 , 97,4% e de nucleótidos 512/552, 92,8% com o isolado HCVl. 0 fragmento do dominio E do J1 mostra uma homologia de nucleótidos e aminoácidos ligeiramente mais baixa com o HCVl da Figura 7 de 76,2% e 82,9%, respectivamente. O fragmento do isolado J1 que se sobrepõe aos dominios um, não

estrutural e do envelope, mostra a homologia mais baixa com o HCV1, como se vê na figura 8, em que o isolado J1 tem uma homologia de nucleótidos de 71,5% e uma homologia de aminoácidos de 73,5% com o HCV1. A Figura 9 mostra uma comparação do fragmento do dominio NS3 do Jl com o HCV1. A homologia entre as sequências de nucleótidos é de 79,8%, enquanto a homologia dos aminoácidos entre os isolados é bastante alta, de 92,2% ou 179/194 aminoácidos. A Figura 10 mostra a homologia entre as sequências NS5 do Jl e HCV1. As sequências têm uma homologia de nucleótidos de 84,3% e de aminoácidos de 88,7%.

Os vectores descritos no exemplo acima foram depositados no Patent Microorganism Depository, Instituto de Fermentação, Agência de Tecnologia e Ciência Industrial, 1-3, Higashi 1-choma Tsukuba-chi, Ibaragiken 305, japâo, e serão mantidas ao abrigo do Tratado de Budapeste. Os números de acesso e datas de depósito são listados a seguir, na página 68.

III

Um clone HCV/J1, Jl-1519, foi isolado usando as técnicas essenciais descritas seguir. Contudo, os primers usados no isolamento foram J159S e 199A. As sequências dos primers oligoméricos J159S e 199A, que se seguem, foram baseados no Jl-1216 e no HCVl.

J159S 5' ACT GCC CTG AAC TGC AAT GA 3'

199A 5' AAT CCA GTT GAG TTC ATC CA 3'

O clone Jl-1519 é composto por uma sequência de cDNA do HCV, de 367 nucleótidos, que englobam a maior parte da metade 5'

J da região NS1 e que sobrepõe a região E do clone, Jl-1216, por 31 nucleótidos. Três clones independentes englobando esta região foram sequenciados; as sequências nesta região, obtidas a partir dos três clones, eram idênticas. A sequência do cDNA do HCV no Jl-1216 (mostrado na figura como Jl), e os aminoâcidos ai codificados, (mostrados por cima da sequência de nucleótidos) são mostrados na Figura 13. A Figura 13 também mostra as diferenças das sequências entre Jl-1216 na região comparável, do protótipo do cDNA do HCV1 ( indicado na figura como PT), e as alterações resultantes nos aminoâcidos codificados. A homologia entre o Jl1216 e o cDNA do HCV1 é aproximadamente 70% ao nivel de nucleótidos, e cerca de 75% ao nivel de aminoâcidos.

Uma composição das sequências, da suposta parte central até à região NS1 do isolado Jl, é mostrado na figura 14; também mostra os aminoâcidos codificados na sequência Jl. A variação da sequência do protótipo do HCV1 é indicada pela linha por baixo da sequência de nucleótidos do Jl; a linha a tracejado indica sequências homólogas. Os aminoâcidos não homólogos codificados na sequência do protótipo do HCV1 são mostrados por baixo da sequência de nucleótidos do HCV1.

material clonado contendo o cDNA do HCV Jl/1519 (pSl-1519) foi conservado em DH5a, e depositado com a Patent Microorganism Depository.

IV

Várias regiões do isolado Jl, incluindo a região C200C100 da suposta região NS3-NS4 ( que inclui a região que codifica

J

o polipéptido 5-1-1 no HSV1 ( ver Pub EPO No 318.216), e a suposta região NS1-E, foram amplificadas usando o método PCR. A região C200-C100 inclui os nucleótidos de 3799 a 5321 do protótipo do HCV1. 0 RNA foi extraído como se descreve abaixo, exceptuando a extracção que foi com tiocianato de guanidina na presença de proteinase K e dodecilsulfato de sódio (SDS) (Maniatis (1982), supra). 0 RNA foi transcrito para o cDNA do HCV, por incubação numa reacção de 25 μΐ, composta por 1 μΜ de cada primer, 40 unidades de inibidor de RNAase (RNASIN), 5 unidades de transcriptase inversa AMV, e sais e tampão necessários para a reacção. A amplificação de um segmento do cDNA do HCV a partir de uma região designada, foi realizada utilizando pares de primers 16-meros de oligómeros sintéticos. A amplificação PCR foi conseguida em três etapas (PCR I, PCR II, e PCR III). A segunda e terceira etapas da amplificação PCR (PCR II), utilizaram diferentes conjuntos de primers PCR; a primeira reacção PCR foi diluida 10 vezes, e múltiplas fases de amplificação PCR foram levadas a cabo com os novos primers, de modo que, por último, para cima de 50% do produto da primeira reacção PCR (PCR I) foram re-amplifiçados. Os primers usados para a amplificação das regiões foram os seguintes. Estes iniciadores , com excepção do J1C200-3 que foi derivado da sequência isolada do Jl, foram derivados da sequência do protótipo do HCV1.

Í1

J

Primers¹¹ para amplificação da região 5-1-1 do NS3-NS4

PCR I

511/16A ( sentido, derivado dos nucleótidos começando no número 1528 do HCV1)

5' AAC AGG CTG CGT GGT C 3'

511/16B ( anti-sentido, derivado do nucleótido terminando no 5260 do HCV1)

5' AGT TGG TCT GGA CAG C 3'

PCR II

511/35A (sentido, derivado da porção do HCV dos nucleótidos começando no número 5057 do HSV1; o sitio de enzima de restrição está sublinhado)

5’ CTTGAATTC TCG TCT TGT CCG GGA AGC CGG CAA TC 3’

511/35B (anti-sentido, derivado da porção do HCV dos nucleótidos terminando no número 5233 do HSV1; o sitio de enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC CCT CTG CCT GAC GGG ACG CGG TCT GC 3'

PCR III

511/35A (ver supra)

VSNrc7 ( anti-sentido, derivado dos nucleótidos terminando no número 5804 do HSV1)

5' GTA GTG CGT GGG GGA AAC AT 3'

Primers para amplificação da região NS1/E

PCR I

J1(E2)3 ( sentido, derivado da porção do HCV dos nucleótidos começando no número 953 do HSV1, está sublinhado o

J sitio do enzima de restrição)

5' CTTAGAATTC TGG CAT GGG ATA TGA TGA TG 3'

J1(E)4 (sentido, derivado da porção do HCV dos nucleótidos começando no número 1087 do HSV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTAGAATTC TCC ATG GTG GGG AAC TGG GC 3'

Jlrcl2 (anti-sentido, derivado da porção do HCV dos nucleótidos terminando no número 1995 do HSV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC TAA CGG GCT GAG CTC GGA 3'

Jlrcl3 (anti-sentido, derivado da porção do HCV dos nucleótidos terminando no número 1941 do HSV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTAGAATTC CGT CCA GTT GCA GGC AGC TTC 3'

PCR II

Jlrcl3( ver supra)

J1IZ-1 (sentido, a porção do HCV é derivada dos nucleótidos começando no número 1641 do HCV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC CAA CTG GTT CGG CTG TAC A 3'

J1IZ-2 (sentido, a porção do HCV é derivada dos nucleótidos começando no número 1596 do HCVl,o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5'TGA GAC GGA CGT GCT GCT CCT 3'

Iniciadores para a região C200-C100 da região NS3-NS4

PCR I

J

J1C200-1 (sentido, derivado dos nucleótidos começando no número 3478 do HCV1)

5' TCC TAC TTG AAA GGC TC 3'

J1C200-3 (anti-sentido, derivado dos nucleótidos terninando no número 4402 do HCV1)

5' GGA TCC AAG CTG AAA TCG AC 3'

Jlrc52 (anti-sentido, a porção do HCV derivada dos nucleótidos terminando no número 5853 do HCV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTAGAATTC GAG GCT GCT GAG ATA GGC AGT 3'

511/16A (Ver acima).

PCR II

J1C200-2 (sentido, a porção do HCV derivada dos nucleótidos começando no número 3557 do HCV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC CCC GTG GAG TGG CTA AGG CGG TGG ACT 3'

J1C200-4 (anti-sentido, a porção do HCV derivada dos nucleótidos terminando no número 4346 do HCV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC TCG AAG TCG CCG GTA TAG CCG GTC ATG 3'

511/35A (ver acima)

Jlrc51 (anti-sentido, a porção do HCV derivada dos nucleótidos terminando no número 5826 do HCV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTAGAATTC GGC AGC TGC ATC GCT CTC CGG CAC 3'

Os cDNAS do HCV amplificados foram, quer sequenciados

J

directamente sem clonagem, quer e/ou clonados. A sequenciação foi conseguida usando uma técnica PCR assimétrica, essencialmente como foi descrita em Shyamala e Ames, J. Bacteriology 171:1602 (1989). Nesta técnica, a amplificação do cDNA é realizada sem uma concentração limitante de um dos iniciadores (usualmente numa razão de cerca de 1:50 ), de modo a obter amplificação preferencial de uma cadeia. A cadeia amplificada é, preferencialmente, depois sequenciada pelo método de terminação de cadeias dideoxi.

Os iniciadores usados para a sequenciação assimétrica pelo método PCR foram os seguintes. Para a região NS1: J11Z-1 e Jlrcl3 (sequenciado com ambos); J11Z-2, Jlrcl3 (confirmado em ambas as cadeias). Para a região NS3-NS4 que inclui a região Nterminal C200-C100, região C-terminal C200-C100, e a região 5-11: J1C200-2 e J1C200-7 ( para a região N-terminal do C200-C100), e J1C200-4 e J1C200-6 ( para a região C-terminal do C200-C100); e 511/35A e hep 4 (para a região 5-1-1). As sequências para o J1C200-2, J1C200-4, e 511/35A são mostradas supra; as sequências do hep 4, J1C200-6, e J1C200-7 são as seguintes.

hep 4 ( derivado dos nucleótidos começando no número 5415 do HCV1)

5' TT GGC TAG TGG TTA GTG GGC TGG TGA CAG 3'

J1C200-6 (porção do HCV derivada dos nucleótidos começando no número 3875 do HCV1, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC CGT ACT CCA CCT ACG GCA AGT TCC TT 3'

J1C200-7 (a porção do HCV derivada dos nucleótidos começando no número 3946 do HCVl, o sitio do enzima de restrição está sublinhado)

5' CTTGAATTC GTG GCA TCC GTG GAG TGG CAC TCG TC 3'

As sequências obtidas pela sequenciaçâo assimétrica da região NS1, a região C200-C100, e a região 5-1-1 são mostradas na Figura 15 e Figura 16, respectivamente. Nas figuras, os aminoácidos codificados na sequência do J1 são mostrados por cima da sequência de nucleótidos do Jl. As diferenças entre a sequência do Jl e a sequência de nucleótidos do prototipo do HCVl é mostrada por baixo da sequência do Jl ( os traços indicam nucleótidos homólogos em ambas as sequências). Os aminoácidos codificados, que são diferentes na sequência do protótipo do HCVl, são indicados por baixo da sequência de nucleótidos do HCVl.

Os cDNAs do HCV da região NS1, a região C200-C100, e da região 5-1-1 foram clonados. Um fragmento com 230 pb e um com 300 pb da suposta região NS1, foram clonados num derivado do vector disponível comercialmente, pGEM-3z, no hospedeiro HB101, e depositados na ATCC como AW-300pb. Os vectores derivados conservam o poli-ligante pGEM-3z original, um gene Amp intacto, e os genes necessários para a replicação em E. coli. Os fragmentos do cDNA do HCV podem ser removidos com Saci e Xbal. Os cDNAs do HCV, contendo fragmentos N-terminal de 770 pb do C200, foram clonados no pMIE no HB101, foram separados 12 clones e depositados na ATCC como AW-770pb-N; o cDNA do HCV pode ser removido do vector com Haell. O fragmento HaelI resultante vai conter o DNA do vector de 300 pb e 250 pb nas extermidades 5' e

S r3', respeetivamente. Os cDNAs do HCV contendo os fragmentos Cterminal de 700 pb do C200 (AW-700 pb-C) foram clonados no M13mpl0 e conservados no DH5a-F' hospedeiro; a clonagem foi efectuada no sitio de poliligação do vector. Os fagos resultantes foram fraccionados, e depositados na ATCC em 11 de Setembro de 1990, como AW-700pb-N ou AW-700pb-C. O cDNA do HCV do equivalente do Jl para a região 5-1-1 do HCV1 foi clonado no sitio mpl9 Rl, e conservado no DH5a-F'. Vários sobrenadantes dos fagos ml3 desta clonagem foram separados e depositados na ATCC como Jl 5-1-1, em 11 de Setembro de 1990. Os cDNAs do HCV podem ser obtidos destes fagos por tratamento com EcoRI. Números de acesso para Jl 5-1-1 e AW-700pb-N ou AW-700pb-C podem ser obtidos telefonando para ATCC para o (301) 881-2600.

O material clonado acima descrito foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC).

V

Um património de cDNA do HCV contendo sequências da suposta região NS1 do isolado Jl foi criado por clonagem direccional no \-gt22. A região NS1 estende-se de cerca do nucleótido 1460 a cerca do nucleótido 2730, usando o sistema de numeração da sequência do ácido nucleico do prototipo do HCV1, em que o nucleótido 1 é o primeiro nucleótido de um codâo de uma metionina de iniciação para a suposta poliproteina. A clonagem foi conseguida usando essencialmente o método descrito por Han e Rutter em GENETIC ENGINEERING, Vol 10 (J.K. Setlow, Ed., Plenum Publishing Co., 1988), com excepção dos iniciadores para a

J

kintese da primeira e segunda cadeias do cDNA do HCV que foram JHC67 e JHC68, respectivamente, e que a fonte de RNA foi o plasma Jl. Neste método , o RNA é extraido com tiocianato de guanidina a baixa temperatura, 0 RNA é depois convertido num cDNA com o comprimento total, que é clonado numa orientação definida relativa ao promotor lacz no X-~fago. Usando este método, os cDNA do HCV do RNA do Jl foram inseridos no sitio Notl do \-gt22. A presença de sequências NS1 no património foi detectada usando, como sonda, Alx54.

A sequência de uma região NS1, a jusante da região mostrada na figura 14, mas que se sobrepõe à região por cerca de nucleótidos, foi determinada usando a técnica de sequenciação assimétrica descrita acima, mas substituindo como iniciadores para a amplificação PCR, Alx 61 e Alx 62. A sequência resultante é mostrada na Figura 17 . (Deve~se notar que a amplificação PCR era de uma região de cerca do nucleótido 1930 a cerca do nucleótido 2340; esta região é também abrangida pela sequência mostrada na Figura 15). As sequências dos iniciadores e sondas usadas para obter o património cDNA do HCV no \-gt22, e para sequenciar a porção da região da NS1 foram as seguintes.

JHC 67

5' GACGC GGCCG CCTCC GTGTC CAGCG CGT 3'

JHC 68

5' CGTGC GGCCG CAAGA CTGCT AGCCG AGGT 3'

ALX 61

5' ACCTG CCACT GTGTA GTGGT CAGCA GTAAC 3'

ALX 62

5' ACGGA CGTCT TCGTC CTTAACAATA CCAGG 3'

ALX 54

5' GAACT TTGCG ATCTG GAAGACAGGG ACAGG 3'

J

Um fragmento de 400 pb do cDNA do HCV J1 derivado da região sequenciada foi clonado no pGEM3z e conservado no HB101; o cDNA do HCV pode ser removido do vector com Saci e Xbal. As células hospedeiras transformadas com o vector (JH-400pb) têm sido depositadas na ATCC.

Um património cDNA fraccionado foi criado a partir do soro Jl; o património fraccionado abrange o genoma J1 e é identificado como HCV-J1 λ. gt22. 0 património do cDNA fraccionado foi criado por fraccionamento de aliquotas de 11 patrimónios de cDNA individuais, que tinham sido preparados t

usando a técnica de clonagem direccional descrita acima, com excepção dos patrimónios que foram criados a partir de primers que foram concebidos para a produção de cDNA do HCV que abrangem o genoma. Os primers eram derivados da sequência do HCV1, e incluíam JH 67 e JH 68. Os cDNAs do HCV foram inseridos no sitio Notl do X-gt22. O património de cDNA fraccionado, HCV-J1 À gt22, foi depositado na ATCC.

VI

Foi determinada a sequência de uma região de polinucleótidos a montante da representada na Figura 14. Esta região começa no nucleótido -267, em relação ao HCV-1 (ver figura 12) e estende-se por 560 nucleótidos. A sequenciação foi conseguida preparando o cDNA do HCV a partir do RNA extraído do soro Jl, e amplificando o cDNA do HCV usando o método PCR .

RNA foi extraido de ΙΟΟμΙ de soro, seguido de tratamento com proteinase K e dodecilsulfato de sódio (SDS). As amostras foram extraídas com fenol-clorofórmio, o RNA precipitado

J com etanol.

cDNA do HCV do isolado Jl foi preparado desnaturando o RNA precipitado com MeHgOH 0,0ÍM; após 10 minutos à temperatura ambiente, foi adicionado 2-mercaptoetanol para isolar os iões mercúrio. Imediatamente a mistura para a primeira cadeia de sinteses de cDNA foi adicionada, e a incubação continuou durante uma hora a 37°C. As condições para a sintese da cadeia antisentido foram as seguintes: Tris HCl 50 mM, pH 8,3, KC1 75 mM, MgCl2 3 mM, ditiotreitol 10 mM, triofosfato desoxinucleótido 500 μΜ cada, primers r25 de cDNA anti-sentido especifico 250 pmol, 250 unidades de transcriptase inversa MMLV. Para sintetizar a segunda cadeia (sentido), os componentes da reacção de sintese foram adicionados, e incubados durante uma hora a 14°C. Os componentes para a segunda reacção de cadeia de sintese eram os seguintes: Tris HCL 14 mM, pH 8,3 , KCL 68 mM, sulfato de amónia 7,5 mM, MgCl2 3,5 mM, ditiotreitol 2,8 mM, polimerase I de DNA 25 unidades, e uma unidade de RNase H. As reacções foram terminadas pelo aquecimento das amostras a 95°C durante 10 minutos, seguido de arrefecimento no gelo.

cDNA do HCV foi amplificado em duas etapas de PCR. A primeira etapa foi conseguida usando 20 μΐ da mistura do cDNA. As condições para a reacção PCR foram as que se seguem: Tris HCl 10 mM, pH 8,3 , KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,002% de agente gelificante, trifosfatos desoxinucleótidos 200 mM de cada, e 2,5 unidades Amplitaq. 0 ciclo termal do PCR foi como se segue: um minuto a 94°C, um minuto a 50°C, um minuto a 72°C, repetido 40 vezes, seguido de sete minutos a 72°C. A segunda etapa do PCR foi

J conseguida usando primers colocados ( i.e. iniciadores que se ligam a uma região interna do produto amplificado na primeira etapa do PCR), para aumentar a especificidade dos produtos do PCR. Uma percentagem da primeira reacção do PCR foi amplificada essencialmente como na primeira etapa, com excepção dos primers que foram substituidos, e que a segunda etapa de reacção do PCR foi à temperatura de 60°C em vez de 50°C. Os primers usados para a primeira etapa foram ALX90 e rl4. Os primers usados para a segunda etapa do PCR foram rl4 e pl4.

As sequências dos primers para a sintese do cDNA do HCV e para o método PCR foram os seguintes.

r25

5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3' • ALX90

5' CCA TGA ATC ACT CCC CTG TGA GGA ACT A 3' ri4

5' GGG CCC CCAG CTA GGC CGA GA 3' pl4

5' AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC 3'

Os produtos do PCR foram purificados em gel, o material que migrou como tendo cerca de 615 pb foi isolado, e sequenciado por uma modificação do método de terminação de cadeia dideoxi de 32

Sanger, usando P-ATP, como marcador. No método modificado, a replicação da sequência foi iniciada usando P32 e R31 como !'primers; o DNA de cadeia dupla foi fundido durante 3 minutos a 95°C antes da replicação, e a sintese de polinucleótidos com terminação dideoxi marcada foi catalizada pela polimerase Bst (

J obtida da BioRad Corp.), de acordo com as indicações do laboratório. A sequenciação foi realizada usando de 500 ng a 1 gg do produto do PCR por reação de sequenciação.

Os primers P32 (sentido) e R31 (anti-sentido) eram derivados dos nucleótidos de -137 a -115 e dos nucleótidos 192 a 173, respectivamente, da sequência do HCVl. As sequências dos iniciadores eram as seguintes.

primer P32

5' AAC CCG CTC AAT GCC TGG AGA TT 3' primer R31

5' GGC CGX CGA GCC TTG GGG AT 3' em que X = A ou G

A sequência da região no isolado do Jl que abrange a região não traduzida-5', bem como uma parte da região da suposta parte central é mostrada na Figura 18. Na figura , os aminoácidos codificados na sequência do Jl são mostrados por cima da sequência de nucleótidos. A sequência do protótipo do HCVl é mostrada por baixo da sequência do Jl; os traços indicam homologia de sequências com o Jl. Os aminoácidos diferentes, codificados na sequência do HCVl, são mostrados por baixo da sequência do HCVl.

Um fragmento do cDNA do HCV que é um representante da sequência Jl de 600 pb descrita acima (TC 600pb) foi clonado no pGEM3Z e conservada no HB101 hospedeiro; o fragmento do cDNA do HCV pode ser removido com Saci e Xbal. Este material está depositado na ATCC.

Depósito de Patentes de Microorganismos-depositados

J

Número de Acesso Data do Depósito sob os termos do Tratado de’ Budapeste.

Materiais Depositados

E.coli DH5/pSl-879a (Este clone contém 427 E. coli HB101/pUl-1216c (Este clone contém 351 E. coli HB101/pUl-4652d (Este clone contém 583 E. coli DH5a/pSl-713c (Este clone contém 580 E, coli' DH5a/pS7-28c (Este clone contém 552 E. coli DH5a/pSl-1519

BP-2593 15/9/1989 pb do dominio HS5 do Jl )

BP-2594 15/9/1989 pb do dominio E/NS1 do Jl )

BP-2595 15/9/1989 pb do dominio NS3 do Jl )

BP-2637 1/11/1989 pb do dominio E do Jl )

BP-2638 1/11/1989 pb do dominio C/E do Jl )

BP3081 30/8/1990

Os vectores seguintes descritos nos Exemplos foram depositados na Americam Type Culture Collection (ATCC), 12301 Dr. Parklawn , Rockville, Maryland 20852, e foram atribuídos os seguintes Números de Acesso. Os depósitos foram feitos nos termos do Tratado de Budapeste.

Materiais Depositados

TC-600pb (em E. coli

HB10l/pGEM3Z)

JH-400pb (em E, coli

HB101/pGEM3Z)

AW-300pb (em E, coli

HB101/pGEM3Z)

AW-770pb-N (em E, coli HB101/pMlE)

AW-700pb-C ou AW-700pb-N (em E. coli DH5a-F'/M13mpl0)

Jl 5-1-1 (em E. coli

DH5a-F'/M13mplO)

HCV-J1 ^-gt22

Estes depósitos são

Número de Acesso Data do Deposito

68393	11/9/90
68394	11/9/90
68392	11/9/90
68395	11/9/90
qpsâ·?	n M /7°
	wh
40884	6/9/90

fornecidos para conveniência dos especialistas na area. Estes depósitos nao sao nem uma admissão de que tais depósitos sâo necessários para a prática da presente invenção, nem que concretizações equivalentes nao estão dentro do âmbito da presente divulgação. A disponibilidade pública destes

J depósitos nao é uma licença para fazer, usar ou vender os materiais depositados nesta ou em qualquer outra patente. As sequência de ácidos nucleicos dos materiais depositados sâo incorporados na presente divulgação para referência e controlo, no caso de conflito com qualquer das sequências aqui descritas.

Enquanto que a presente invenção tem sido descrita através de exemplos específicos para beneficio daqueles que trabalham nesta área, o alcance desta invenção não está limitado a concretizações adicionais que serão evidentes dos especialistas na área a partir da presente divulgação.

Claims (42)

1. REIVINDICAÇÕES

   1- Um processo de preparação de uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleótido de, pelo menos, 15 pb, de um isolado de HCV substancialmente homólogo a um isolado seleccionado do grupo Jl e J7, caracterizado pelo facto de a referida sequência de nucleótido ser diferente da sequência de nucleótido do isolado HCV1 do HCV.
2. 2- Um processo de preparação de uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de nucleótido de, pelo menos, 15 pb, codificando uma sequência de aminoãcido do isolado de HCV Jl ou J7, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl ou

   J7 ser diferente da sequência de aminoácido do isolado HCV1 do »

   HCV.

   3- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl ou J7 compreender um

   polipéptido virai substancialmente completo.

   J
3. 4- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido compreender do aminoácido 1 ao aminoácido 115.

   5- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl compreender do aminácido 116 ao aminoácido 350. 6- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo

   facto*da sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 351 ao aminoácido 651.
4. 7- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender do -aminoácido 1007 ao aminoácido 1650.
5. 8- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 2100 até ao fim da sequência codificadora.
6. 9- Um processo de preparação de um polipéptido purificado compreendendo uma sequência de aminoácido seleccionado a partir do isolado de HCV, substancialmente homólogo a um isolado seleccionado do grupo consistindo em Jl e J7, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido ser diferente da sequência dos polipéptidos codificados pelo isolado HCV1 do HCV.
7. 10- Um processo de preparação de um polipéptido purificado,

   J conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl ou J7 compreender um epitopo que não é imunologicamente reactivo-cruzado com qualquer epitopo de HCV1.
8. 11- Um processo de preparação de um polipéptido purificado, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido J7 compreender do aminoácido 1 ao aminoácido 115.
9. 12- Um processo de preparação de um polipéptido purificado, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 116 ao aminoácido 350.
10. 13- Um processo de preparação de um polipéptido purificado, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 351 ao aminoácido 651.
11. 14- Um processo de preparação de um polipéptido purificado, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 1007 ao aminoácido 1650.
12. 15- Um processo de preparação de um polipéptido purificado, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 2100 até ao fim da sequência codificadora.
13. 16Um processo de preparação de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácido de um isolado de HCV seleccionado a partir do grupo consistindo em Jl e J7,

    J caracterizado pelo facto de â sequência de aminoâcido Jl ou J7 ser diferente da sequência de aminoâcido do isolado HCV1 do HCV, e sendo o polipéptido imobilizado num suporte sólido.
14. 17- Um processo para detectar a presença de anticorpos antiHCV, numa amostra-teste, caracterizado pelo facto de compreender:

    (a) a incubação da amostra-teste sob condições que permitam a formação de complexos antigénio-anticorpo, com polipéptidos antigénicos compreendendo uma sequência de aminoâcido do isolado de HCV, seleccionado a partir do grupo consistindo em Jl e J7, em que a sequência de aminoâcido é diferente da sequência de aminoâcido do isolado HCV1 do HCV;

    (b) a sequência de aminoâcido Jl e J7 não é imunologicamente reactivo-cruzada com HCV1; e (c) detecção de um complexo antigénio-anticorpo compreendendo o polipéptido antigénico.
15. 18- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoâcido Jl compreender um dominio virai seleccionado do grupo consistindo

    I numa sequência de aminoâcido do aminoâcido 116 ao aminoâcido 350, do aminoâcido 351 ao aminoâcido 651, do aminoâcido 1007 ao aminoâcido 1650, e do aminoâcido 2100 até á sequência codificadora.
16. 19- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoâcido Jl compreender do aminoâcido 1 ao aminoâcido 115.
17. 20- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a amostra-teste compreender sangue

    J humano ou uma fraeção do mesmo.
18. 21- Um processo de preparação de uma composição compreendendo anticorpos anti-HCV que ligam um epitopo de HCV substancialmente livre de anticorpos que não se ligam a um epitopo de HCV, caracterizado pelo facto de:

    (a) um epitopo de HCCV compreender uma sequência de t

    aminoácido de um isolado de HCV, seleccionado do grupo consistindo em Jl e J7;

    (b) a sequência de aminoácido é diferente da sequência de aminoácido do isolado HCVl do HCV; e (c) a sequência de aminoácido Jl ou U7 não é imunologicamente reactivo-cruzada com HCVl.
19. 22- Um processo de preparação de uma composição, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizada pelo facto de os anticorpos anti-HCV serem policlonais.
20. 23- Um processo de preparação de uma composição, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizada pelo facto de os anticorpos anti-HCV serem monoclonais.
21. 24- Um processo para detectar a presença de um polipéptido de HCV, numa amostra-teste, caracterizado pelo facto de compreender:

    (a) a incubação da amostra-teste sob condições que permitem a formação de complexos antigénio-anticorpo com anticorpos anti-HCV que se ligam a um epitopo de HCV, em que:

    (i) o epitopo de HCV compreende uma sequência de aminoácido do isolado de HCV, seleccionado a partir do grupo consistindo em Jl e J7;

    J (ii) a sequência de aminoácido Jl ou J7 é diferente da sequência de aminoácido do isolado HCV1 do HCV; e (iii) a sequência de aminoácido Jl ou J7 nao é imunologicamente reactivo-cruzada com o HCV1; e (b) detecçâo de um complexo antigénio-anticorpo compreendendo os anticorpos anti-HCV.
22. 25- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 24, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender um dominio virai seleccionado a partir do grupo consistindo de uma sequência de aminoácido compreendendo do aminoácido 116 ao aminoácido 350, do aminoácido 351 ao aminoácido 651, do aminoácido 1007 ao aminoácido 1650, e do aminoácido 2100 até ao fim da sequência codificadora.
23. 26- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 24, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido J7 compreender do aminoácido 1 ao aminoácido 115.
24. 27- Um método de detecçâo de polinucleótidos de HCV, numa amostra-teste, caracterizado pelo facto de compreender:

    (a) o fornecimento de uma sonda compreendendo a molécula de DNA da reivindicação 1;

    (b) o contacto da amostra-teste e da sonda sob condições que permitem a formação de um duplex polinucleotidico entre a sonda e o seu complemento, na ausência da formação substancial do duplex polinucleotidico, entre a sonda e as sequências polinucleotidícas não-HCV, presentes na amostra-teste;

    e t

    (c) detecçâo de quaisquer duplexes polinucleotidicos

    J compreendendo a sonda,
25. 28- Um método de produção de um polipéptido recombinante compreendendo uma sequência de aminoácido de HCV, caracterizado pelo facto de compreender;

    (a) o fornecimento de células hospedeiras transformadas por uma estrutura de DNA compreendendo uma sequência de controlo para a célula hospedeira, ligada, operavelmente, a uma sequência codificadora para a célula hospedeira, ligada, de uma forma operável, a uma sequência codificadora codificando uma sequência de aminoácido de um isolado dé HCV, seleccionado do grupo constituído por J1 e J7, em que a sequência de aminoácido J1 ou J7 é diferente da sequência de aminoácido do HCV1 do HCV;

    (b) cultura das células hospedeiras sob condições em que a sequência codificadora é transcrita e traduzida no ) polipéptido recombinante; e (c) recolha do polipéptido recombinante.
26. 29- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, caracterizado pelo facto de compreender a polimerização de nucleótidos para produzir uma sequência de, pelo menos, 15 pb, de um isolado de HCV substancialmente homólogo a um isolado escolhido do grupo J1 e J7, em que a referida sequência nucleotidica é distinta da sequência nucleotidica do isolado HCVl do HCV, e isolando a referida molécula de DNA.
27. 30- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, caracterizado pelo facto de compreender a polimerização de nucleótidos para produzir uma sequência de, pelo menos, 15 pb, codificando uma sequência de aminoácidos do isolado J1 ou J7 do

    J

    HCV , em que a sequência de aminoácido Jl ou J7 é distinta da sequência de aminoácido do isolado HCV1 do HCV, e isolando a »

    referida molécula de DNA.
28. 31- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl ou J7 compreender um polipéptido virai substancialmente completo.
29. 32- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido J7 compreender do aminoácido 1 atê ao aminoácido 115.
30. 33- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 29, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 116 até ao aminoácido 350.
31. 34- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 351 ao aminoácido 651.
32. 35- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido

    1007 ao aminoácido 1650.
33. 36- Um processo de preparação de uma molécula de DNA, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido Jl compreender do aminoácido 2100 até ao fim da sequência codificadora.

    J
34. 37- Um processo de preparação de um polipéptido, caracterizado pelo facto de compreender a polimerização de aminoácidos para produzir um polipéptido possuindo uma sequência substancialmente homóloga à de um polipéptido de HCV de um isolado seleccionado do grupo consistindo em J1 e J1, em que a sequência de aminoácido é distinta da sequência dos polipéptidos codificados pelo isolado HCVl do HCV, e isolando o polipéptido.
35. 38- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido J1 ou J7 compreender um epitopo que não ê imunologicamente reactivocruzado com qualquer epitopo de HCVl.
36. 39- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido J7 compreender do aminoácido 1 ao aminoácido 115.
37. 40- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácido J1 compreender do aminoácido 116 ao aminoácido 350.
38. 41- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos J1 compreender do aminoácido 351 ao aminoácido 651.
39. 42- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido J1

    I compreender do aminoácido 1007 ao aminoácido 1650.
40. 43- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto da sequência de aminoácido J1 compreender do aminoácido 2100 até ao fim da sequência codificadora.

    J
41. 44- Um processo de preparação de um polipéptido imobilizado num substrato sólido, caracterizado pelo facto de compreender:

    (a) o fornecimento de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos de um isolado de HCV seleeeionado do grupo consistindo em Jl e J7, em que a sequência de aminoácidos Jl ou J7 é distinta da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV;

    (b) o fornecimento de um suporte sólido para a imobilização do polipéptido de (a); e (c) a imobilização do polipéptido de (a) com o suporte sólido de (b).
42. 45- Um processo de produção de uma vacina para tratamento do HCV, caracterizado pelo facto de compreender:

    (a) o fornecimento de um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos proveniente de um isolado de HCV seleccionada do grupo consistindo em Jl e J7, em que a sequência de aminoácidos Jl e J7 é distinta da sequência de aminoácidos do isolado HCV1 do HCV, e em que a sequência de HCV é imunogénica; e (b) formulação do polipéptido imunogénico numa dose farmacologicamente eficaz, num excipiente farmaceuticamente aceitável.