JPH09189701A - 質量感受性バイオセンサー - Google Patents

質量感受性バイオセンサー

Info

Publication number
JPH09189701A
JPH09189701A JP8346799A JP34679996A JPH09189701A JP H09189701 A JPH09189701 A JP H09189701A JP 8346799 A JP8346799 A JP 8346799A JP 34679996 A JP34679996 A JP 34679996A JP H09189701 A JPH09189701 A JP H09189701A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
solid phase
sensor
specific binding
binding partner
coated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP8346799A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3848416B2 (ja
Inventor
Andreas Wiegand
アンドレーアス・ヴイーガント
Madry Norbert
ノルベルト・マドリー
Carsten Dr Schelp
カルステン・シエルプ
Paul Meller
パウル・メラー
Paul Dr Meller
ミヒヤエル・メーレン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG filed Critical Behringwerke AG
Publication of JPH09189701A publication Critical patent/JPH09189701A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3848416B2 publication Critical patent/JP3848416B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 診断および分析方法に使用する、特に診断的
に関連する特異的結合パートナーの免疫化学的検出方法
の提供。 【解決手段】 生物学的流体の試料中の被分析物質の免
疫化学的検出方法であって、第一の特異的結合パートナ
ーが圧電センサーである固相に直接結合しており、そし
て使用するセンサーの表面が測定後適当な溶媒を使用す
る処理により固相が再生されることができるようにコー
トされていることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は診断及び分析の過程において、特
に診断に関連する特異的結合パートナーの免疫化学的検
出のために使用する圧電センサーに関する。圧電センサ
ー自体は例えばDickert等の記述（Chemie in unserer Z
eit（今日の化学）（1994年），28巻（３号），147〜15
2ページ）から既知である。そのようなバイオセンサー
は例えば米国特許第４,２３６,８９３号及び４,７３５,
９０６号にも記述されている。
【０００２】診断的に関連する分子（被分析物質）の検
出に使用することができるようなバイオセンサーは、一
般に検出される分子に特異的な結合パートナーでコート
されており、それによりこれらの分子を選択的に結合す
ることができる表面を持つ変換器からなる。圧電石英結
晶が通常変換器として使用される。石英結晶が対応する
電子回路に組み込まれると、それは特定の共振周波数で
共振する。そこで検出される分子が蓄積されると、共振
周波数は変化する。そのような電子回路は例えばＤＥ−
Ａ ３９ ２０ ０５２の記述から当業者に知られてい
る。
【０００３】これらの既知のバイオセンサーは既に上に
述べた目的を部分的には達成している。しかしながら、
使用される方法例えば抗体がシラン誘導体により石英表
面に結合される方法の場合、一方で、抗体を石英表面に
結合する方法は極めて手がかかり且つ再現性に乏しく、
他方、検出される抗原と抗体との間の結合を破壊し、そ
して結合した抗原を分離する意図で反応物溶液で処理す
ることによりセンサー表面を再使用可能にするための方
法はそれ自体再現性に乏しく、そしてセンサー表面上で
抗体の抑制されない破壊という結果になることが分かっ
ている。
【０００４】Davis等の報告書（Anal.Chem.(1989年)，6
1巻（11号），1227〜1230ページ）は変換器に金をコー
トし、この層にプロテインＡを結合することが可能であ
ると説明している。これにより、プロテインＡは診断的
に関連する分子の検出のため抗体と可逆的に結合するこ
とができる。著者自身が説明しているように、プロテイ
ンＡコーティングはシグナルを強く変更し、測定を全部
にわたって妨害する。 従って、本発明の目的は特異的結合パートナーでコート
することが簡単であり、同時に特異的反応が起こった後
簡単で信頼性をもって再生することができる分析及び診
断の過程に使用するバイオセンサーを提案することであ
る。
【０００５】本発明により、この目的はセンサーを貴金
属好ましくは金でコートし、そして特異的結合パートナ
ーをこのコーティングに結合しうることによって達成さ
れる。特異的結合パートナーはこのようにコートしたバ
イオセンサーから、例えばＤＥ ４４ ３６ ９１０に開
示された試薬を使用して分離することができる。
【０００６】変換器の態様又は被分析物質の蓄積による
変化が測定シグナルに変換される仕方は本発明にとって
本質的なことではない。本発明は二つの手動的方法、例
えばセンサーを試料に浸漬する方法、及び自動分析器に
よる方法に使用することができる。
【０００７】原則として、本発明の方法は次のように実
行することができる。すなわち、適当な電子回路（例え
ば Sensotec 社が販売する）に組み込まれた市販の金を
コートした圧電結晶に測定する被分析物質に特異的な結
合パートナーをコートする。そのような特異的結合パー
トナーは、例えばモノクローナル又はポリクローナル抗
体又は抗体断片、レクチン又は抗原でよい。コーティン
グ時間は５分〜数時間、好ましくは１０〜１２０分であ
る。コーティング後、センサー表面を洗浄用緩衝液で洗
いすすぐ。洗浄用緩衝液は好ましくは洗浄剤を含有す
る。この特異的コーティングには、非特異的結合を防ぐ
ため、場合により、さらに非特異的コーティング例えば
ＢＳＡ又は不活性化ＰＯＤをコートしてよい。このよう
な方法はそれ自体当業者に既知である。洗浄操作はその
ような非特異的コーティングの後に行ってもよい。
【０００８】コートしたセンサーは試料と一緒にインキ
ュベートするが、これは例えば試料に浸漬するか又はセ
ンサー表面に塗布して実行することが可能である。さら
に別の有利な実施態様は測定を連続的流動条件下で実行
しうるようにセンサー表面が設計されているそれであ
る。それぞれのセンサーについてその適用に対してどの
設計にすべきかの決定は当業者にとって容易なことであ
る。
【０００９】被分析物質が特異的結合パートナーと反応
した結果である測定される量例えば共振周波数は電子回
路を変更することにより測定される。結合した被分析物
質の量は、例えば参照曲線との対比により得られる測定
される量の変化から導き出すことができる。この手順は
集団単位で直接測定するためにも適している。測定され
る量の変化を求めるため、例えば特異的結合パートナー
でコートされていない参照電極を使用することができ
る。試料とのインキュベーション終了後、さらに洗浄操
作を置くのが好都合である。試料とのインキュベーショ
ンは１〜１００分、特に５〜６０分間実行するのが有利
であり、そして１０〜３０分がもっとも有利である。
【００１０】再生はＤＥ ４４ ３６ ９１０に記述され
ているように実行することができる。固相として貴金属
特に金を使用する場合のこの操作は、特定の還元剤又は
酸化剤例えば水素化ホウ素ナトリウム又はテトラブチル
アンモニウムヒドロキシドを固相として、洗浄剤を添加
するか又はしないで再生のために使用する。次の例証的
具体例は本発明を説明するためであって、それに何らの
制限を加えようとするものではない。
【００１１】実施例 ヒトＩｇＥの定量的測定 支持体：テフロン環（外径３６mm）の中にはめこんだSe
nsotec社から入手の金をコートした圧電結晶。金表面直
径：９mm，金表面積：１４mm2 。 コーティング：抗ヒトＩｇＥ（ウサギ）ポリクローナル
抗体の５０μlをセンサーに塗布する。抗体濃度は５μg
／mlである。この溶液はその他にリン酸ナトリウム７５
mM，NaCl ７５mM，Na2SO4 １００ｇ／ｌを含有する。pH
は６.０である。抗体溶液は３７℃で１時間又は室温で
一晩静置する。 洗浄段階：上清を除き、センサーをそれぞれ２５０μl
の洗浄用緩衝液で５回洗いすすぐ。この洗浄用緩衝液は
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）
５０mM及びクエン酸５０mMからなるpH７.４の溶液であ
る。
【００１２】後続するコーティング：不活性化したペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）５０μlをセンサーに塗布す
る。ＰＯＤ濃度は１ｇ／ｌである。この溶液はその他に
リン酸ナトリウム７５mM，NaCl７５mM，Na2SO4 １００
ｇ／ｌを含有する。pHは６.０である。ＰＯＤ溶液は３
７℃で１時間又は室温で一晩静置する。 洗浄段階：上清を除き、センサーをそれぞれ２５０μl
の洗浄用緩衝液で５回洗いすすぐ。この洗浄用緩衝液は
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）
５０mM及びクエン酸５０mMからなるpH７.４の溶液であ
る。
【００１３】試料のインキュベーション：所定量のＩｇ
Ｅを含有するヒト血清５０μlをセンサーに塗布し、３
７℃で３０分間インキュベートする。 洗浄段階：上清を除き、センサーをそれぞれ２５０μl
の洗浄用緩衝液（リン酸ナトリウム５mM，NaCl ８５m
M，ツイーン２０１ｇ／ｌ，フェノール０.５ｇ／ｌ，pH
６.５）で５回洗いすすぐ。
【００１４】固相の再生：２０重量％テトラブチルアン
モニウムヒドロキシド溶液２５０μlをセンサーに塗布
し、３７℃で１時間インキュベートする。 洗浄段階：上清を除いた後、センサーを脱イオン水で５
回洗いすすぐ。
【００１５】２回目の再生：１重量％NaBH4溶液２５０
μlをセンサー上で、室温で１５分間インキュベートす
る。この溶液はその他に２−（シクロ−ヘキサアミノ）
エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）５０mMを含有する。pHは
１０.０である。 洗浄段階：上清を除いた後、センサーを脱イオン水で３
回そしてリン酸緩衝生理食塩水（pH７.２）で３回洗い
すすぐ。
【００１６】結果1)： １．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝８２９ａＵ2) ２．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝５７６ａＵ ３．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝６２３ａＵ ４． ０IU／mlのヒトIgEの測定＝１９ａＵ ５．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝７６７ａＵ ６．１００IU／mlのヒトIgEの測定(対照＝非特異的コー
ティング抗体)＝１４aU 1) ｎ＝２の平均 2) 任意の単位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノルベルト・マドリー ドイツ連邦共和国35041マルブルク．ヘー エンヴエーク68 (72)発明者 カルステン・シエルプ ドイツ連邦共和国35041マルブルク．リン デンヴエーク39 (72)発明者 パウル・メラー ドイツ連邦共和国35041マルブルク．ヴエ ーアアカー４ (72)発明者 ミヒヤエル・メーレン ドイツ連邦共和国35041ヴエーアスハウゼ ン．ツム・プフアフエングルント７

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的流体の試料中の被分析物質の免
    疫化学的検出方法であって、第一の特異的結合パートナ
    ーが圧電センサーである固相に直接結合しており、そし
    て使用するセンサーの測定表面が測定後適当な溶媒を使
    用する処理により固相が再生されることができるように
    コートされている前記方法。
  2. 【請求項２】 固相が貴金属好ましくは金でコートされ
    ている請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 第一の特異的結合パートナーが免疫グロ
    ブリン又は免疫グロブリンの断片である請求項１又は２
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】 固相が、反応が起こった後第一の特異的
    結合パートナーを試薬により固相から分離することによ
    り再生される請求項１〜３の少なくとも一項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 試薬が還元剤を含有する請求項４記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 試薬が酸化剤を含有する請求項４記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 試薬がＮａＢＨ4を含有する請求項４記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 試薬がテトラブチルアンモニウムヒドロ
    キシドを含有する請求項４記載の方法。
  9. 【請求項９】 請求項１記載の方法において、貴金属か
    らなる再生可能な固相の使用。
JP34679996A 1995-12-27 1996-12-26 質量感受性バイオセンサー Expired - Fee Related JP3848416B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19548376A DE19548376A1 (de) 1995-12-27 1995-12-27 Massensensitive Biosensoren
DE19548376:6 1995-12-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH09189701A true JPH09189701A (ja) 1997-07-22
JP3848416B2 JP3848416B2 (ja) 2006-11-22

Family

ID=7781176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP34679996A Expired - Fee Related JP3848416B2 (ja) 1995-12-27 1996-12-26 質量感受性バイオセンサー

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6087187A (ja)
EP (1) EP0781999B1 (ja)
JP (1) JP3848416B2 (ja)
AT (1) ATE206522T1 (ja)
AU (1) AU7549896A (ja)
CA (1) CA2193318C (ja)
DE (2) DE19548376A1 (ja)
ES (1) ES2164822T3 (ja)
MX (1) MX9606584A (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407814B2 (en) 2000-08-09 2008-08-05 California Institute Of Technology Active NEMS arrays for biochemical analyses
KR101109082B1 (ko) * 2010-03-16 2012-01-31 (주)나노스토리지 재사용이 가능한 바이오칩 및 그 사용방법

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6289286B1 (en) * 1998-05-29 2001-09-11 Biacore Ab Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith
SE512994C2 (sv) * 1998-09-24 2000-06-12 Biosensor Applic Sweden Ab Biosensorcellanordning och dess användning
SG93209A1 (en) * 1999-07-05 2002-12-17 Inst Of Molecular Agrobiology A novel immuno-diagnostic test method for veterinary disease
AU2001292884A1 (en) * 2000-09-20 2002-04-02 Molecular Reflections Microfabricated ultrasound array for use as resonant sensors
WO2004082363A2 (en) * 2003-03-17 2004-09-30 Michael Nerenberg Sensor assembly and methods of making and using same
US7888134B2 (en) 2003-06-05 2011-02-15 Oakland University Immunosensors: scFv-linker design for surface immobilization
US7464580B2 (en) * 2005-09-26 2008-12-16 Oakland University Ionic liquid high temperature gas sensors
US8375768B2 (en) * 2006-03-30 2013-02-19 Oakland University Ionic liquid thin layer sensor for electrochemical and/or piezoelectric measurements
US7886577B2 (en) 2006-03-30 2011-02-15 Oakland University Devices with surface bound ionic liquids and method of use thereof
US8088596B2 (en) * 2006-10-10 2012-01-03 Oakland University Method of microorganism detection using carbohydrate and lectin recognition
US20100238035A1 (en) * 2009-03-19 2010-09-23 Tangidyne Corporation Detection device and method for detecting analyte
EP2630479B1 (en) 2010-10-20 2020-04-08 Qorvo US, Inc. Apparatus and method for measuring binding kinetics and concentration with a resonating sensor

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4236893A (en) 1979-04-09 1980-12-02 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method for the assay of classes of antigen-specific antibodies
US4735906A (en) 1984-11-28 1988-04-05 Texas A&M University Sensor having piezoelectric crystal for microgravimetric immunoassays
DE3920052A1 (de) 1989-06-20 1991-01-10 Peter Dipl Ing Berg Messsystem zur bestimmung von traeger masse sowie daraus resultierender physikalischer eigenschaften mit hilfe eines auch in betriebsfaellen hoher und/oder variabler daempfung arbeitenden oszillators
US5314830A (en) * 1992-10-30 1994-05-24 University Of New Mexico Immobilized hydrophobically-modified antibodies
DE4436910A1 (de) * 1994-10-15 1996-04-18 Behringwerke Ag Regenerierbare Festphase zur Durchführung spezifischer Bindereaktionen

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407814B2 (en) 2000-08-09 2008-08-05 California Institute Of Technology Active NEMS arrays for biochemical analyses
US8329452B2 (en) 2000-08-09 2012-12-11 California Institute Of Technology Active NEMS arrays for biochemical analyses
KR101109082B1 (ko) * 2010-03-16 2012-01-31 (주)나노스토리지 재사용이 가능한 바이오칩 및 그 사용방법

Also Published As

Publication number Publication date
US6087187A (en) 2000-07-11
JP3848416B2 (ja) 2006-11-22
DE59607825D1 (de) 2001-11-08
CA2193318C (en) 2005-11-22
CA2193318A1 (en) 1997-06-28
EP0781999A1 (de) 1997-07-02
AU7549896A (en) 1997-07-03
ES2164822T3 (es) 2002-03-01
MX9606584A (es) 1997-06-28
ATE206522T1 (de) 2001-10-15
EP0781999B1 (de) 2001-10-04
DE19548376A1 (de) 1997-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3848416B2 (ja) 質量感受性バイオセンサー
US7993854B2 (en) Detection and quantification of biomarkers via a piezoelectric cantilever sensor
US4314821A (en) Sandwich immunoassay using piezoelectric oscillator
Suleiman et al. Recent developments in piezoelectric immunosensors. A review
US6235488B1 (en) Surface preparation for chemical-specific binding
Skládal et al. Piezoelectric biosensors for real-time monitoring of hybridization and detection of hepatitis C virus
EP0026215A1 (en) METHOD FOR DETERMINING CLASSES OF SPECIFIC ANTIGEN ANTIBODIES.
JPH10504100A (ja) 溶液内の所定の化学試料を検出するセンサ及び方法
JPH11510247A (ja) 液体培地中の分析物の測定
MXPA96006584A (es) Biosensores sensibles a masas
KR20180096981A (ko) 신경퇴행성 장애의 진단을 위한 정보 제공 방법
EP2589962A1 (en) Highly sensitive method of assaying troponin i
Hianik et al. EQCM biosensors based on DNA aptamers and antibodies for rapid detection of prions
EP0416730B1 (en) Substrate preparation for chemical-species-specific binding
KR20080114685A (ko) 분자 상호작용을 특징화하는 방법
WO2016044055A1 (en) Thin film bulk acoustic resonator with signal enhancement
JPH01203962A (ja) 免疫化学的測定法
AU703940B2 (en) Regenerable solid phase for carrying out specific binding reactions
KR19980052913A (ko) 질량 민감성 바이오센서
Pohanka QCM Biosensor for Label Free Detection and Quantification of Fibrinogen
JPH07260782A (ja) ヒト血清アルブミンの測定方法
EP0970374A1 (en) Biosensor for cells
KR20100008944A (ko) 금 나노입자에 의한 신호증폭 원리의 수정진동자면역센서를 이용한 ｃ-반응성 단백의 초고감도 측정방법
JP2690849B2 (ja) 水晶振動子式バイオセンサの製法及び水晶振動子式バイオセンサ
JP2647790B2 (ja) 水晶振動子式バイオセンサの製法及び水晶振動子式バイオセンサ

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050628

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20050928

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20051007

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051228

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20060801

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20060825

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090901

Year of fee payment: 3

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090901

Year of fee payment: 3

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090901

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100901

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110901

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110901

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120901

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130901

Year of fee payment: 7

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees