JPH09196936A - 光学プローブ顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高い位置分解能で顕微観察や電気生理学特性
測定が可能な光学プローブ顕微鏡装置を提供する。 【構成】 試料９００の広域像を観察する光学顕微鏡部
１００と、試料９００の上部に設置される光学プローブ
２１１を有し、試料９００に光を照射する光照射部２１
０を備える試料９００の局所像を観察する走査型近接場
光学顕微鏡部２００と、試料９００中で発生した電流を
導出して記録するパッチクランプ測定部３００と、走査
型近接場光学顕微鏡部２００から得られた試料の局所像
と走査型近接場光学顕微鏡部２００の光の照射位置ごと
にパッチクランプ測定部３００から得られた電気生理学
的情報とを収集し、解析し、記録するとともに、走査型
近接場光学顕微鏡部２００へ照射光の波長指示と走査指
示とを通知する解析部４００とを備える。そして、収納
器５００に収納された水浸状態の試料９００を観察す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞などの電気生
理学的な測定や記録と近接場顕微観察とを同時に行う光
学プローブ顕微鏡装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生細胞の特性の観察にあたって、従来か
らの光学顕微鏡による形態観察に加えて、電気生理学的
特性の観察が注目されている。

【０００３】こうしたパッチクランプ法に代表される電
気生理特性測定記録法と光学的顕微観察法を融合した複
合顕微観察用の装置として、微分干渉顕微鏡の映像をビ
デオとそれに付随する画像強調装置を用いて観察記録す
るビデオ強化型微分干渉顕微鏡にレーザピンセットおよ
びパッチクランプ電流測定装置を組込んだマルチ計測顕
微鏡が提案されている（辰巳他、近接場光学研究グルー
プ第二回研究討論会予稿集 ｐｐ７５−８０、１９９４
年１１月）。

【０００４】このマルチ計測顕微鏡装置では、落射照明
光を集光して試料に照射する第１の対物レンズとして水
浸式で開口数の大きな対物レンズを用いることにより側
方からのパッチ電極の進入を可能とするとともに、Ａｒ
−Ｋｒレーザ光源から出力された波長＝６４３ｎｍの光
を落射蛍光の光路に導入して、第１の対物レンズに試料
を挟んで対向して設置された開口数の大きな第２の対物
レンズで集光して試料に照射してレーザピンセット機能
を実行させる。

【０００５】こうして、この装置では、ビデオ強化型微
分干渉顕微鏡で細胞膜の光学的な映像を捉らえるととも
に、レーザピンセット機能のオン／オフ時における生体
膜電流の変化を観察する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】パッチクランプ法に代
表される電気生理特性測定と光学的顕微観察とを融合し
た複合観察では、精度良く限定された微小な領域からの
電気生理特性の情報を選択性を高くして取得することが
条件となる。

【０００７】この条件に対して、光学プローブとしてレ
ーザピンセットを用いる従来の装置では、 落射蛍光の光路に使用される通常の結像光学系を用い
るレーザピンセットなので、照射径（すなわち、位置分
解能）は、波動としての光の回折効果によって制限さ
れ、その値は理論的にレーザ光の波長の０．６１倍であ
ることが知られている。したがって、分解能は数１００
ｎｍのオーダとなる 落射蛍光の光路にレーザ光を導入し、開口数の大きな
対物レンズで集光し、試料に照射するレーザピンセット
なので、光の作用の及ぶ領域が照射光の光軸方向に限定
できないという問題点があった。

【０００８】また、従来の装置では、分解能が波長程度
の微分干渉顕微鏡を使用するので、形態学的あるいは光
学物性的な試料の態様を波長以下の分解能で観察できな
い。

【０００９】本発明は、上記を鑑みてなされたものであ
り、高い位置分解能で顕微観察や電気生理学特性測定が
可能な光学プローブ顕微鏡装置を提供することを目的と
する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１の光学プローブ
顕微鏡装置は、（ａ）試料の広域像を観察する光学顕微
鏡部と、（ｂ）試料の上部に設置された光学プローブを
有し、試料に光を照射する光照射部を備え、試料の局所
像を観察する走査型近接場光学顕微鏡部と、（ｃ）試料
中の単一の生細胞あるいは生体膜の微小な領域から生体
膜を横切る電流あるいは膜電位を導出して記録する電気
情報測定部と、（ｄ）走査型近接場光学顕微鏡部から得
られた試料の局所像と、走査型近接場光学顕微鏡部の光
の照射位置ごとに電気情報測定部から得られた電気生理
学的情報とを収集し、記録し、解析するとともに、装置
全体を制御する解析制御部とを備えることを特徴とす
る。

【００１１】ここで、電気情報測定部は、試料の表面
にアクセスするパッチ電極と、パッチ電極を移動させ
るマイクロマニピュレータと、パッチ電極で検出され
た生体電気信号である生体膜を横切る電流信号を入力
し、電圧信号に変換し、増幅して出力する前置増幅器
と、解析制御部からの指示により、シール抵抗の測
定、膜電位固定、または膜電流固定に関する指令信号を
出力する電気信号発生装置と、前置増幅器から出力さ
れた電圧信号を入力し、増幅し、処理して解析制御部へ
向けて出力するとともに、電気信号発生装置から出力さ
れた指令信号を入力し、演算処理して前記前置増幅器へ
向けて出力する主増幅器とを備えることを特徴としても
よい。

【００１２】また、電気情報測定部は、試料の内部に
アクセスする微小電極と、微小電極を移動させるマイ
クロマニピュレータと、微小電極で検出された生体電
気信号を入力し、増幅して出力する前置増幅器と、前
置増幅器から出力された電圧信号を入力し、増幅し、処
理して解析制御部へ向けて出力するとともに、電気信号
発生装置から出力された指令信号を入力し、演算処理し
て前置増幅器へ向けて出力する主増幅器とを備えること
を特徴としてもよい。

【００１３】ここで、微小電極として、ガラス微小電
極、および、金属微小電極のいずれか一方を好適に採
用できる。

【００１４】また、光学顕微鏡部では、コントラスト増
強が可能な、ホフマンモジュレーションシステム、位相
差顕微鏡、または微分干渉顕微鏡を好適に使用できる。

【００１５】また、光照射部は、波長可変レーザを備え
ることとしてもよいし、また、白色光源と、白色光
源から出力された白色光を分光出力する分光器と、分
光器から出力された光の全波長成分の中から特定の波長
成分の光を選択して出力する光選択器とを備えることと
してもよい。

【００１６】請求項１の光学プローブ顕微鏡装置では、
まず、光学顕微鏡部で試料の広域像を得る。引き続き、
こうして得られる試料の広域像に基づいて、多次元マイ
クロマニピュレータなどを用い、電極先端を、目標とす
る細胞などの生体試料の特定の位置に接近・接触させ、
あるいは試料内部に侵入させる。

【００１７】パッチクランプ法を用いる場合には、パッ
チ電極先端を目標とする細胞などの生体試料の特定の位
置に接近・接触させ、ギガオーム（ＧΩ）シールを形成
させる。このとき、ギガオーム（ＧΩ）シールの形成ま
での過程を電気的にモニタするため、シール抵抗の測
定、膜電位固定または膜電流固定するための指令パルス
信号を主増幅器を介して前置増幅器に出力するために、
解析制御部の制御を受ける電気信号発生器（パルスジェ
ネレータ）を用いてもよい。

【００１８】微小電極法を用いる場合には、ガラス微小
電極あるいは金属微小電極からなる微小電極の先端を目
標とする細胞などの生体試料の特定の位置から侵入させ
る。そして、接近から侵入までの過程を微小電極で検出
した電気信号を前置増幅器および主増幅器を介して電気
的にモニタする。なお、生細胞であることの確認のた
め、指令パルス信号を主増幅器を介して前置増幅器に出
力するために、解析制御部の制御を受ける電気信号発生
器（パルスジェネレータ）を用いてもよい。

【００１９】次に、走査型近接場光学顕微鏡部の光学プ
ローブを、光学顕微鏡部で得られる試料の広域像を観察
しながら、目標とする細胞などの生体試料上の位置に移
動する。引き続き、光学プローブの先端を試料表面の近
接場領域である初期位置まで接近させる。光学プローブ
の近接場領域への移動にあたっては、ノンコンタクト走
査型顕微鏡モードまたはシィアフォースノンコンタクト
走査型顕微鏡モードなどの方式を好適に使用できる。

【００２０】こうして、試料の観察にあたっての幾何学
的配置が完了し、光学的顕微観察および電気生理学的特
性測定の準備が整う。

【００２１】まず、光照射部で発生した照射光を初期位
置に設定された光学プローブを介して照射する。ここ
で、光学プローブを介して試料に照射される照射光は非
放射光であるエバネセント光であり、結像のためのレン
ズなどを用いないので、レンズの開口による回折の制限
を受けず、位置分解能が光学プローブの先端の開口径の
みで決定される。この結果、光学プローブの先端の径を
数１０ｎｍとし、光学プローブと試料との距離を近接場
領域となる数１０ｎｍとすれば、照射光の波長の数１０
分の１〜数１００分の１の分解能で、試料の微細な形状
や構造、あるいは微小領域における光学的な特性が観察
できる。こうして観察される試料の局所像は解析制御部
に通知される。

【００２２】また、光の照射によって発生した試料内の
電気生理学的変化に伴う生体膜を横切る電流あるいは膜
電位の変化は、電極から導出されて電気情報測定部で測
定され、測定結果が解析制御部に通知される。なお、電
極で導出された電流あるいは膜電位は、前置増幅器内の
電流−電圧変換器により電圧信号に変換するとともに、
微小信号なので増幅、演算、電流雑音の低減などの処理
を行う主増幅器を介して解析制御部に通知することが好
ましい。

【００２３】解析制御部は、走査型近接場光学顕微鏡部
から通知された試料の局所像情報と、電気情報測定部か
ら通知された電気生理学的特性情報を収集し、初期位置
情報とともに格納する。なお、解析制御部は、主増幅
器、電気信号発生装置（パルスジェネレータ）、光照射
部の作動（照射・走査条件）を制御することとすること
もできる。

【００２４】次に、解析制御部は、走査型近接場光学顕
微鏡部に走査を指示する。そして、走査位置ごとに、上
記と同様にして、試料の局所像情報と電気生理学的情報
とを収集し、走査位置情報とともに格納する。

【００２５】走査にあたって、近接場領域内での走査を
確保するためには、コンスタントハイトモード制御、ノ
ンコンタクト走査型顕微鏡モード制御、またはシィアフ
ォースノンコンタクト走査型顕微鏡モード制御などの方
式を好適に使用できる。

【００２６】走査、情報収集、および情報格納の完了
後、解析制御部は格納情報に基づいて、試料の走査領域
全体の光学像情報や光照射位置に応じた電気生理学的特
性情報を解析し、顕微観察像と生体電気反応とを対応さ
せて再構成して表示や記録などを行う。この結果、多元
的な試料の観察ができる。

【００２７】また、照射光の波長を変化させて各波長ご
とに、上記と同様に、走査、情報収集、および情報格納
を行い、試料の走査領域全体の光学像情報や光照射位置
に応じた電気生理学的特性情報を解析し、顕微観察像と
生体電気反応とを対応させて再構成して表示や記録など
を行う。この結果、照射光の波長に応じた多元的な試料
の観察ができる。

【００２８】また、走査を行わずに、固定した位置に光
学プローブを配置し、光の作用の及ぶ範囲を限定しつつ
ピンポイント照明を行い、経時的に情報収集することに
より、このピンポイント照明に対応して生じる試料の光
学的物性の変化や電気生理学的特性の変化を経時的に観
察することもできる。

【００２９】また、走査を行わずに、固定した位置に光
学プローブを配置し、光の作用の及ぶ範囲を限定しつつ
照射光の波長を変化させて、経時的に情報収集すること
により、このピンポイント照明に対応して生じる試料の
光学的物性の変化や電気生理学的特性の変化の波長依存
性を経時的に観察することもできる。

【００３０】請求項５の光学プローブ顕微鏡装置は、
（ａ）試料の広域像を観察する光学顕微鏡部と、（ｂ）
試料の上部に設置された光学プローブを有し、試料に光
を照射する波長可変光照射部を備え、試料の局所像を観
察する走査型近接場光学顕微鏡部と、（ｃ）試料中の単
一の生細胞あるいは生体膜の微小な領域に電気的な刺激
を付与する電気刺激部と、（ｄ）電気刺激部で刺激され
た試料の各走査位置ごとに走査型近接場光学顕微鏡部か
ら得られた試料の局所像を収集し、記録し、解析すると
ともに、装置全体を制御する解析制御部とを備えること
を特徴とする。

【００３１】ここで、電気刺激部は、試料の表面にア
クセスするパッチ電極と、パッチ電極を移動させるマ
イクロマニピュレータと、パッチ電極で検出された生
体電気信号である生体膜を横切る電流信号を入力し、電
圧信号に変換し、増幅して出力するとともに、パッチ電
極を介して前記試料に電気的刺激を付与する電気信号を
出力する前置増幅部と、解析制御部からの指示によ
り、シール抵抗の測定、膜電位固定、または膜電流固定
に関する第１の指令信号および試料に電気的刺激を付与
に関する第２の指令信号を出力する電気信号発生装置
と、増幅器から出力された電圧信号を入力し、増幅
し、処理して解析制御部へ向けて出力するとともに、電
気信号発生装置から出力された第１の指令信号および第
２の指令信号を入力し、演算処理して前置増幅器へ向け
て出力する主増幅部とを備えることを特徴としてもよ
い。

【００３２】また、電気刺激部は、試料の内部にアク
セスする微小電極と、微小電極を移動させるマイクロ
マニピュレータと、微小電極で検出された生体電気信
号を入力し、増幅して出力するとともに、微小電極を介
して試料に電気的刺激を付与する電気信号を出力する前
置増幅部と、解析制御部からの指示により、試料に電
気的刺激を付与に関する指令信号を出力する電気信号発
生装置と、前置増幅器から出力された電圧信号を入力
し、増幅し、処理して解析制御部へ向けて出力するとと
もに、電気信号発生装置から出力された指令信号を入力
し、演算処理して前置増幅器へ向けて出力する主増幅部
とを備えることを特徴としてもよい。

【００３３】ここで、微小電極として、ガラス微小電
極、および、金属微小電極のいずれか一方を好適に採
用できる。

【００３４】また、光学顕微鏡部では、コントラスト増
強が可能な、ホフマンモジュレーションシステム、位相
差顕微鏡、または微分干渉顕微鏡を好適に使用できる。

【００３５】また、光照射部は、波長可変レーザを備え
ることとしてもよいし、また、白色光源と、白色光
源から出力された白色光を分光出力する分光器と、分
光器から出力された光の全波長成分の中から特定の波長
成分の光を選択して出力する光選択器とを備えることと
してもよい。

【００３６】請求項５の光学プローブ顕微鏡装置では、
まず、光学顕微鏡部で試料の広域像を得る。引き続き、
こうして得られる試料の広域像に基づいて、多次元マイ
クロマニピュレータなどを用い、電極先端を、目標とす
る細胞などの生体試料の特定の位置に接近・接触させ、
あるいは試料内部に侵入させる。

【００３７】パッチクランプ法を用いる場合には、パッ
チ電極先端を目標とする細胞などの生体試料の特定の位
置に接近・接触させ、ギガオーム（ＧΩ）シールを形成
させる。このとき、ギガオーム（ＧΩ）シールの形成ま
での過程を電気的にモニタするため、シール抵抗の測
定、膜電位固定および膜電流固定するための指令パルス
信号を主増幅器を介して前置増幅器に出力するために、
解析制御部の制御を受ける電気信号発生器（パルスジェ
ネレータ）を用いてもよい。

【００３８】微小電極法を用いる場合には、ガラス微小
電極あるは金属微小電極からなる微小電極の先端を目標
とする細胞などの生体試料の特定の位置から侵入させ
る。そして、接近から侵入までの過程を微小電極で検出
した電気信号を前置増幅器および主増幅器を介して電気
的にモニタする。なお、生細胞であることの確認のた
め、指令パルス信号を主増幅器を介して前置増幅器に出
力するために、解析制御部の制御を受ける電気信号発生
器（パルスジェネレータ）を用いてもよい。

【００３９】次に、走査型近接場光学顕微鏡部の光学プ
ローブを、光学顕微鏡部で得られる試料の広域像を観察
しながら、目標とする細胞などの生体試料上の位置に移
動する。引き続き、光学プローブの先端を試料表面の近
接場領域である初期位置まで接近させる。光学プローブ
の近接場領域への移動にあたっては、ノンコンタクト走
査型顕微鏡モードまたはシィアフォースノンコンタクト
走査型顕微鏡モードなどの方式を好適に使用できる。

【００４０】こうして、試料の観察にあたっての幾何学
的配置が完了し、光学的顕微観察および電気生理学的特
性測定の準備が整う。

【００４１】まず、電気刺激部から電極を介して試料に
電流信号または電圧信号を導入するなどして、試料に電
気的刺激を付与する。

【００４２】次に、光照射部で発生した照射光を初期位
置に設定された光学プローブを介して照射する。ここ
で、光学プローブを介して試料に照射される照射光は非
放射光であるエバネセント光であり、結像のためのレン
ズなどを用いないので、レンズの開口による回折の制限
を受けず、位置分解能が光学プローブの先端の開口径の
みで決定される。この結果、光学プローブの先端の径を
数１０ｎｍとし、光学プローブと試料との距離を近接場
領域となる数１０ｎｍとすれば、照射光の波長の数１０
分の１〜数１００分の１の分解能で、試料の微細な形状
や構造、あるいは微小領域における光学的な特性が観察
できる。こうして観察される試料の局所像は解析制御部
に通知される。

【００４３】解析制御部は、走査型近接場光学顕微鏡部
から通知された試料の局所像情報を収集し、初期位置情
報とともに格納する。なお、解析制御部は、主増幅器、
電気信号発生装置（パルスジェネレータ）を制御するこ
ととすることもできる。

【００４４】次に、解析部は、走査型近接場光学顕微鏡
部に走査を指示する。そして、走査位置ごとに、上記と
同様にして、試料の局所像情報を収集し、走査位置情報
とともに格納する。

【００４５】走査にあたって、近接場領域内での走査を
確保するためには、コンスタントハイトモード制御、ノ
ンコンタクト走査型顕微鏡モード制御、またはシィアフ
ォースノンコンタクト走査型顕微鏡モード制御などの方
式を好適に使用できる。

【００４６】走査、情報収集、および情報格納の完了
後、解析制御部は格納情報に基づいて、解析部は、試料
の走査領域全体の光学像情報を解析し、顕微観察像を再
構成して表示や記録などを行う。この結果、電気的刺激
に対する光学的物性の変化の観察ができる。

【００４７】また、照射光の波長を変化させて各波長ご
とに、上記と同様に、走査、情報収集、および情報格納
を行い、試料の走査領域全体の光学像情報を解析し、顕
微観察像を再構成して表示や記録などを行う。この結
果、電気的刺激に対する光学的物性の、照射光の波長に
応じた変化の観察ができる。

【００４８】また、走査を行わずに、固定した位置に光
学プローブを配置し、経時的に情報収集することによ
り、電気的な刺激に対応して生じる試料の光学的物性の
変化を経時的に観察することもできる。

【００４９】また、走査を行わずに、固定した位置に光
学プローブを配置し、光の作用の及ぶ範囲を限定しつつ
照射光の波長を変化させて、経時的に情報収集すること
により、電気的刺激に対応して生じる試料の光学的物性
の変化の波長に応じた経時的観察をすることもできる。

【００５０】また、試料に導入する電流量や波形を変化
させるなど電気的刺激条件を様々に変化させることによ
り、異なる電気的刺激条件に応じた試料の光学的物性の
変化を観察することができる。

【００５１】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の光学プローブ顕微鏡装置の実施の形態を説明する。な
お、図面の説明にあたって同一の要素には同一の符号を
付し、重複する説明を省略する。

【００５２】（第１実施形態）図１は、本発明の光プロ
ーブ顕微鏡装置の第１実施形態の構成図である。この装
置は、近接場顕微鏡機能により高い位置分解能で試料の
光学像を得るとともに、パッチクランプ測定機能により
光刺激による電気生理学的特性の変化を測定する装置で
ある。

【００５３】図１に示すように、この装置は、（ａ）試
料９００の広域像を観察することが可能な光学顕微鏡部
１００と、（ｂ）試料９００の上部に設置される光学プ
ローブ２１１を有し、試料９００に光を照射する波長可
変光照射部２１０と、試料９００からの光を結像し撮像
する撮像部２２０を備え、試料９００の局所像を観察す
る走査型近接場光学顕微鏡部２００と、（ｃ）試料９０
０中の単一の生細胞あるいは生体膜の微小な領域から生
体膜を横切る電流を導出して演算・増幅するパッチクラ
ンプ測定部３００と、（ｄ）走査型近接場光学顕微鏡部
２００から得られた試料の局所像と、走査型近接場光学
顕微鏡部２００の光の照射位置ごとにパッチクランプ測
定部３００から得られた電気生理学的情報とを収集・統
合し、記録し、解析するとともに、走査型近接場光学顕
微鏡部２００へ照射光の波長指示と走査指示とを通知
し、パッチクランプ測定部３００の主増幅器および電気
信号発生装置（パルスジェネレータ）を制御する解析制
御部４００とを備える。そして、保温機能を備えた収納
器５００に収納された水浸状態の試料９００を観察す
る。

【００５４】光学顕微鏡部１００では、ホフマンモジュ
レーションシステム、位相差顕微鏡、または微分干渉顕
微鏡を好適に使用できる。

【００５５】図２は、波長可変光照射部２１０の構成図
である。図２（ａ）は、波長可変光源を、解析制御部４
００から指示された波長の光を出力する波長可変レーザ
２１２で構成した場合を示し、また、図２（ｂ）は、波
長可変光源を、白色光源２１５と、白色光源２１５
から出力された白色光を分光出力する分光器２１６と、
分光器２１６から出力された光の全波長成分の中から
特定の波長成分の光を選択して出力する可動スリット２
１７とで構成した場合を示す。

【００５６】また、光学プローブ２１１は、先端部に数
１０ｎｍの開口を有するガラス管を備える。

【００５７】撮像部２２０は、試料からの光を集める
対物レンズ２２１と、対物レンズ２２１を介した光を
結像させる結像光学系２２２と、結像面に受光面が設
置された撮像器２２３とを備える。

【００５８】パッチクランプ測定部３００は、試料に
アクセスするパッチ電極３１０と、パッチ電極３１０
を移動させる多次元マイクロマニピュレータ３２０と、
パッチ電極３１０で検出された生体電気信号である電
流を電圧信号に変換・増幅して出力する前置増幅器と、
パッチ電極３１０で検出された生体電気信号である生
体膜を横切る電流信号を入力し、電圧信号に変換し、増
幅して出力する前置増幅器３３０と、解析制御部４０
０からの指示により、シール抵抗の測定、膜電位固定、
および膜電流固定に関する指令信号を出力する電気信号
発生装置３８０と、前置増幅器３００から出力された
電圧信号を入力し、増幅し、処理して解析制御部４００
へ向けて出力するとともに、電気信号発生装置３８０か
ら出力された指令信号を入力し、演算処理して前置増幅
器３３０へ向けて出力する主増幅器３４０とを備える。

【００５９】本実施形態の光学プローブ顕微鏡装置で
は、まず、光学顕微鏡部１００で試料の広域像を得る。
引き続き、得られる試料の広域像に基づいて、多次元マ
イクロマニピュレータ３２０を用い、パッチ電極３１０
の先端を、目標とする細胞などの生体試料９００の特定
の位置に接近・接触させる。そして、パッチ電極３１０
の内部を陰圧にして試料９００を吸引し、細胞膜を吸引
侵入させ、ギガオーム（ＧΩ）シールを形成させる（図
３参照）。このとき、ＧΩシールの形成までの過程を電
気的にモニタするため、シール抵抗値の測定、膜電位固
定および膜電流固定するための指令パルスを主増幅器３
４０を介して前置増幅器３３０に出力するために、解析
制御部４００の制御を受けたパルスジェネレータ３８０
を用いる。

【００６０】ＧΩシールの形成を確認した後、電極３１
０の内部に吸引侵入させた細胞膜を破壊してホールセル
記録状態にする（図４参照）。

【００６１】次に、走査型近接場光学顕微鏡部２００の
光学プローブ２１１を、光学顕微鏡部１００で得られる
試料の広域像を観察しながら、目標とする細胞などの生
体試料９００上の位置に移動する。引き続き、３次元マ
イクロマニピュレータを走査して、光学プローブ２１１
の先端を試料９００表面の近接場領域である試料９００
なで数１０ｎｍの距離の初期位置まで接近させる。光学
プローブ２１１の近接場領域への移動にあたっては、ノ
ンコンタクト走査型顕微鏡モードまたはシィアフォース
ノンコンタクト走査型顕微鏡モードなどの方式を好適に
使用できる。

【００６２】こうして、試料９００の観察にあたっての
幾何学的配置が完了し、光学的顕微観察および電気生理
学的測定の準備が整い、電気生理学的特性測定を開始す
る。

【００６３】まず、解析制御部４００は走査型近接場光
学顕微鏡部２００に照射光の波長を通知する。この指示
に応じて、光照射部２１０で発生した照射光を初期位置
に設定された光学プローブ２１１を介して試料９００に
照射する。ここで、光学プローブ２１１を介して試料９
００に照射される照射光は非放射光であるエバネセント
光であり、結像のためのレンズなどを用いないので、レ
ンズの開口による回折の制限を受けず、位置分解能が光
学プローブ２１１の先端の開口径のみで決定される。こ
の結果、光学プローブ２１１の先端の径を数１０ｎｍと
し、光学プローブ２１１先端と試料９００との距離を近
接場領域となる数１０ｎｍとすれば、照射光の波長の数
１０分の１〜数１００分の１の分解能で、試料の微細な
形状や構造、あるいは微小領域における光学的な特性が
観察できる。こうして観察される試料９００の局所像は
解析部４００に通知される。

【００６４】また、光の照射によって発生した試料内の
電気生理学的変化に伴う生体膜を横切る電流および膜電
位の変化は、パッチ電極３１０から導出されてパッチク
ランプ測定部３００で測定され、測定結果が解析制御部
４００に通知される。なお、パッチ電極３１０で導出さ
れた電流・電位は、前置増幅器３３０内の電流電圧変換
器により電圧信号に変換されるが、微小信号なので増
幅、演算、電流雑音の低減などの処理を行う主増幅器３
４０を介して解析制御部４００に通知される。

【００６５】解析制御部４００は、走査型近接場光学顕
微鏡部２００から通知された試料の局所像情報と、パッ
チクランプ測定部３００から通知された電気生理学的特
性情報を収集し、初期位置情報とともに格納する。

【００６６】次に、解析制御部４００は、走査型近接場
光学顕微鏡部２００にＸ−Ｙ走査を指示する。そして、
走査位置ごとに、上記と同様にして、試料９００の局所
像情報と電気生理学的情報とを収集し、走査位置情報と
ともに格納する。

【００６７】走査にあたって、近接場領域内での走査を
確保するためには、コンスタントハイトモード制御、ノ
ンコンタクト走査型顕微鏡モード制御、またはシィアフ
ォースノンコンタクト走査型顕微鏡モード制御などの方
式を好適に使用できる。なお、水侵状態の試料を観察対
象とする場合には、コンスタントハイトモード制御によ
る走査が特に好適である。

【００６８】次いで、解析制御部４００は走査型近接場
光学顕微鏡部２００に照射光の波長の変更を通知する。
そして、上記と同様にして、指定波長についての試料９
００の局所像情報と電気生理学的情報とを収集し、走査
位置情報とともに格納する。

【００６９】以後、観察目的とした照射光波長のすべて
について、上記と同様にして、試料９００の局所像情報
と電気生理学的情報とを収集し、走査位置情報とともに
格納する。

【００７０】走査、情報収集、および情報格納の完了
後、解析制御部４００は格納情報に基づいて、試料９０
０の走査領域全体の光学像情報や光照射位置に応じた電
気生理学的特性情報を解析し、顕微観察像と生体電気反
応とを対応させて再構成して表示や記録などを行う。

【００７１】なお、本実施形態の装置を用いて、走査を
行わずに、固定した位置に光学プローブ２１１を配置
し、光の作用の及ぶ範囲を限定しつつピンポイント照明
を行い、経時的に情報収集することにより、このピンポ
イント照明に対応して生じる試料の光学的物性の変化や
電気生理学的特性の変化を経時的に観察することもでき
る。

【００７２】また、本実施形態の装置を用いて、走査を
行わずに、固定した位置に光学プローブ２１１を配置
し、光の作用の及ぶ範囲を限定しつつ照射光の波長を変
化させて、経時的に情報収集することにより、このピン
ポイント照明に対応して生じる試料の光学的物性の変化
や電気生理学的特性の変化の波長依存性を経時的に観察
することもできる。

【００７３】また、本実施形態の装置を用いて、照射光
の波長種を１つにして観察することもできる。

【００７４】また、本実施形態ではパッチ電極を使用し
たが、パッチ電極に代えてガラス微小電極や金属微小電
極の試料内へ侵入させる微小電極などを使用しても、本
実施形態と同様にして、高い位置分解能で試料の光学的
態様と、光刺激位置による電気生理学的態様の変化を観
察することができる。

【００７５】なお、微小電極を使用する場合には、パッ
チ電極の場合におけるＧΩシールの形成は必要ない。ま
た、生細胞であることの確認を行わない場合には、電気
信号発生装置であるパルスジェネレータは構成から除く
ことが可能である。

【００７６】（第２実施形態）図５は、本発明の光プロ
ーブ顕微鏡装置の第２実施形態の構成図である。この装
置は、電気的な刺激を与えた試料の態様を、近接場顕微
鏡機能により高い位置分解能で試料の光学像を観察する
装置である。

【００７７】図５に示すように、本実施形態の装置は、
（ａ）試料９００の広域像を観察する可能な光学顕微鏡
部１００と、（ｂ）試料９００の上部に設置される光学
プローブ２１１を有し、試料に光を照射する光照射部２
１０を備え、試料９００の局所像を観察する走査型近接
場光学顕微鏡部２００と、（ｃ）試料９００中の単一の
生細胞あるいは生体膜の微小な領域から試料に電気的な
刺激を付与するパッチクランプ刺激部３５０と、（ｄ）
パッチクランプ刺激部３５０で刺激された試料９００の
各走査位置ごとに走査型近接場光学顕微鏡部２００から
得られた試料の局所像を収集し、記録し、解析するとと
もに、装置全体を制御する解析制御部４５０とを備え
る。そして、保温機能を備えた収納器５００に収納され
た水侵状態の試料を観察する。

【００７８】光学顕微鏡部１００では、第１実施形態と
同様に、ホフマンモジュレーションシステム、位相差顕
微鏡、または微分干渉顕微鏡を好適に使用できる。

【００７９】パッチクランプ刺激部３５０は、試料に
アクセスするパッチ電極３６０と、パッチ電極３６０
を移動させる多次元マイクロマニピュレータ３７０と、
パッチ電極３６０で検出された生体電気信号である生
体膜を横切る電流信号を入力し、電圧信号に変換し、増
幅して出力するとともに、パッチ電極を介して試料に電
気的刺激を付与する電気信号を出力する前置増幅部３３
５と、解析制御部４５０からの指示により、シール抵
抗の測定、膜電位固定、および膜電流固定に関する第１
の指令信号および試料に電気的刺激を付与に関する第２
の指令信号を出力する電気信号発生装置３８５と、前
置増幅部３３５から出力された電圧信号を入力し、増幅
し、処理して解析制御部４５０へ向けて出力するととも
に、電気信号発生装置３８５から出力された第１の指令
信号および第２の指令信号を入力し、演算処理して前置
増幅部３３５へ向けて出力する主増幅部３４５とを備え
る。

【００８０】本実施形態の光学プローブ顕微鏡装置で
は、試料の観察に先立って、光学顕微鏡部１００で試料
の広域像を得る。引き続き、得られる試料の広域像に基
づいて、多次元マイクロマニピュレータ３７０を用い、
パッチ電極３６０の先端を、目標とする細胞などの生体
試料９００の特定の位置に接近・接触させ、ギガオーム
（ＧΩ）シールを形成させ、第１実施形態と同様にホー
ルセル状態とする。

【００８１】次に、第１実施形態と同様にして、光学プ
ローブ２１１の先端を試料９００の近接場領域である初
期位置まで接近させる。

【００８２】こうして、試料９００の観察にあたっての
幾何学的配置が完了する。

【００８３】まず、パッチクランプ刺激部３５０からパ
ッチ電極３６０を介して試料９００に電流・電圧信号導
入するなどして、試料９００に電気的刺激を付与する。

【００８４】次に、光照射部２１０で発生した照射光を
初期位置に設定された光学プローブ２１１を介して照射
する。第１実施形態と同様に、光学プローブ２１１を介
して試料９００に照射される照射光は非放射光であるエ
バネセント光であり、結像のためのレンズなどを用いな
いので、レンズの開口による回折の制限を受けず、位置
分解能が光学プローブの先端の開口径のみで決定され
る。この結果、照射光の波長の数１０分の１〜数１００
分の１の分解能で、試料９００の微細な形状や構造、あ
るいは微小領域における光学的な特性が観察できる。観
察された試料９００の局所像は解析制御部４５０に通知
される。

【００８５】解析制御部４５０は、走査型近接場光学顕
微鏡部２００から通知された試料９００の局所像情報を
収集し、初期位置情報とともに格納する。

【００８６】次に、解析制御部４５０は、走査型近接場
光学顕微鏡部２００に走査を指示する。そして、走査位
置ごとに、試料９００の局所像情報を収集し、走査位置
情報とともに格納する。

【００８７】次いで、解析制御部４５０は走査型近接場
光学顕微鏡部２００に照射光の波長の変更を通知する。
そして、上記と同様にして、指定波長についての試料９
００の局所像情報とを収集し、走査位置情報とともに格
納する。

【００８８】以後、観察目的とした照射光波長のすべて
について、上記と同様にして、試料９００の局所像情報
を収集し、走査位置情報とともに格納する。

【００８９】走査、情報収集、および情報格納の完了
後、解析制御部４５０は格納情報に基づいて、試料９０
０の走査領域全体の光学像情報を解析し、顕微観察像を
再構成して表示や記録などを行う。この結果、照射光の
波長に応じた電気的刺激に対する光学的物性の変化の観
察ができる。

【００９０】また、走査を行わずに、固定した位置に光
学プローブ２１１を配置し、経時的に情報収集すること
により、電気的な刺激に対応して生じる試料９００の光
学的物性の変化を経時的に観察することもできる。

【００９１】また、走査を行わずに、固定した位置に光
学プローブ２１１を配置し、光の作用の及ぶ範囲を限定
しつつ照射光の波長を変化させて、経時的に情報収集す
ることにより、電気的刺激に対応して生じる試料９００
の光学的物性の変化の波長に応じた経時的観察をするこ
ともできる。

【００９２】また、試料９００に導入する電流量や波形
を変化させるなど電気的刺激条件を様々に変化させるこ
とにより、異なる電気的刺激条件に応じた試料の光学的
物性の変化を観察することができる。

【００９３】また、本実施形態ではパッチ電極を使用し
たが、第１実施形態と同様に、パッチ電極に代えてガラ
ス微小電極や金属微小電極などの試料内へ侵入させる微
小電極を使用しても、本実施形態と同様にして、電気的
刺激による試料の態様の変化を高い位置分解能で観察す
ることができる。

【００９４】なお、微小電極を使用する場合には、パッ
チ電極の場合におけるＧΩシールの形成は必要ない。

【００９５】

【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、本発明の請
求項１の光学プローブ顕微鏡装置によれば、走査型近接
場光学顕微鏡部によって光学的顕微鏡観察をし、走査型
近接場光学顕微鏡機能に必須の微小開口の光学プローブ
による微小領域への光照射によって生じる電気生理学的
変化を電気情報測定部で測定し、双方の情報を解析部で
統合するので、高い位置分解能で試料の光学的態様と、
光刺激位置による電気生理学的態様の変化を観察するこ
とができる。

【００９６】また、本発明の請求項５の光学プローブ顕
微鏡装置によれば、電気刺激部で電気的に刺激された試
料を走査型近接場光学顕微鏡部によって光学的顕微鏡観
察するので、電気的刺激による試料の態様の変化を高い
位置分解能で観察することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１実施形態の光学プローブ顕微鏡の
構成図である。

【図２】波長可変光照射部の構成図である。

【図３】ＧΩシールの形成時の試料付近の幾何学的配置
の説明図である。

【図４】ホールセル記録状態での試料付近の幾何学的配
置の説明図である。

【図５】本発明の第２実施形態の光学プローブ顕微鏡の
構成図である。

【符号の説明】

１００…光学顕微鏡部、２００…走査型近接場光学顕微
鏡部、２１０…波長可変光照射部、２１１…光学プロー
ブ、２１２…波長可変レーザ、２１３…白色光源、２１
４…分光器、２１５…スリット、３００…パッチクラン
プ測定部、３１０…パッチ電極、３２０…多次元マイク
ロマニピュレータ、３３０…前置増幅器、３４０…主増
幅器、３５０…パッチクランプ刺激部、３６０…パッチ
電極、３７０…多次元マイクロマニピュレータ、３８
０，３９０…電気信号発生装置、４００，４５０…解析
制御部。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料の広域像を観察する光学顕微鏡部
   と、 前記試料の上部に設置された光学プローブを有し、前記
   試料に光を照射する光照射部を備え、試料の局所像を観
   察する走査型近接場光学顕微鏡部と、 前記試料中の単一の生細胞あるいは生体膜の微小な領域
   から生体膜を横切る電流あるいは膜電位を導出して記録
   する電気情報測定部と、 前記走査型近接場光学顕微鏡部から得られた前記試料の
   局所像と、前記走査型近接場光学顕微鏡部の光の照射位
   置ごとに前記パッチクランプ測定部から得られた電気生
   理学的情報とを収集し、記録し、解析するとともに、装
   置全体を制御する解析制御部と、 を備えることを特徴とする光学プローブ顕微鏡装置。
2. 【請求項２】 前記電気情報測定部は、 前記試料の表面にアクセスするパッチ電極と、 前記パッチ電極を移動させるマイクロマニピュレータ
   と、 前記パッチ電極で検出された生体電気信号である前記生
   体膜を横切る電流信号を入力し、電圧信号に変換し、増
   幅して出力する前置増幅器と、 前記解析制御部からの指示により、シール抵抗の測定、
   膜電位固定、または膜電流固定に関する指令信号を出力
   する電気信号発生装置と、 前記前置増幅器から出力された電圧信号を入力し、増幅
   し、処理して前記解析制御部へ向けて出力するととも
   に、前記電気信号発生装置から出力された前記指令信号
   を入力し、演算処理して前記前置増幅器へ向けて出力す
   る主増幅器と、 を備えることを特徴とする請求項１記載の光学プローブ
   顕微鏡装置。
3. 【請求項３】 前記電気情報測定部は、 前記試料の内部にアクセスする微小電極と、 前記微小電極を移動させるマイクロマニピュレータと、 前記微小電極で検出された生体電気信号を入力し、増幅
   して出力する前置増幅器と、 前記前置増幅器から出力された電圧信号を入力し、増幅
   し、処理して前記解析制御部へ向けて出力するととも
   に、前記電気信号発生装置から出力された前記指令信号
   を入力し、演算処理して前記前置増幅器へ向けて出力す
   る主増幅器と、 を備えることを特徴とする請求項１記載の光学プローブ
   顕微鏡装置。
4. 【請求項４】 前記微小電極は、ガラス微小電極および
   金属微小電極のいずれか一方である、ことを特徴とする
   請求項３記載の光学プローブ顕微鏡装置。
5. 【請求項５】 試料の広域像を観察する光学顕微鏡部
   と、 前記試料の上部に設置された光学プローブを有し、前記
   試料に光を照射する波長可変光照射部を備え、試料の局
   所像を観察する走査型近接場光学顕微鏡部と、 前記試料中の単一の生細胞あるいは生体膜の微小な領域
   に電気的な刺激を付与する電気刺激部と、 前記電気刺激部で刺激された前記試料の各走査位置ごと
   に前記走査型近接場光学顕微鏡部から得られた前記試料
   の局所像を収集し、記録し、解析するとともに、装置全
   体を制御する解析制御部と、 を備えることを特徴とする光学プローブ顕微鏡装置。
6. 【請求項６】 前記電気刺激部は、 前記試料の表面にアクセスするパッチ電極と、 前記パッチ電極を移動させるマイクロマニピュレータ
   と、 前記パッチ電極で検出された生体電気信号である前記生
   体膜を横切る電流信号を入力し、電圧信号に変換し、増
   幅して出力するとともに、前記パッチ電極を介して前記
   試料に電気的刺激を付与する電気信号を出力する前置増
   幅部と、 前記解析制御部からの指示により、シール抵抗の測定、
   膜電位固定、および膜電流固定に関する第１の指令信号
   および前記試料に電気的刺激を付与に関する第２の指令
   信号を出力する電気信号発生装置と、 前記前置増幅部から出力された電圧信号を入力し、増幅
   し、処理して前記解析制御部へ向けて出力するととも
   に、前記電気信号発生装置から出力された前記第１の指
   令信号および前記第２の指令信号を入力し、演算処理し
   て前記前置増幅部へ向けて出力する主増幅部と、 を備えることを特徴とする請求項５記載の光学プローブ
   顕微鏡装置。
7. 【請求項７】 前記電気刺激部は、 前記試料の内部にアクセスする微小電極と、 前記微小電極を移動させるマイクロマニピュレータと、 前記微小電極で検出された生体電気信号を入力し、増幅
   して出力するとともに、前記微小電極を介して前記試料
   に電気的刺激を付与する電気信号を出力する前置増幅部
   と、 前記解析制御部からの指示により、前記試料に電気的刺
   激を付与に関する指令信号を出力する電気信号発生装置
   と、 前記前置増幅部から出力された電圧信号を入力し、増幅
   し、処理して前記解析制御部へ向けて出力するととも
   に、前記電気信号発生装置から出力された前記指令信号
   を入力し、演算処理して前記前置増幅部へ向けて出力す
   る主増幅部と、 を備えることを特徴とする請求項５記載の光学プローブ
   顕微鏡装置。
8. 【請求項８】 前記微小電極は、ガラス微小電極および
   金属微小電極のいずれか一方である、ことを特徴とする
   請求項７記載の光学プローブ顕微鏡装置。
9. 【請求項９】 前記光学顕微鏡部は、ホフマンモジュレ
   ーションシステム、位相差顕微鏡、および微分干渉顕微
   鏡のいずれか１つを備える、ことを特徴とする請求項１
   または５記載の光学プローブ顕微鏡装置。
10. 【請求項１０】 前記光照射部は波長可変レーザを備え
    る、ことを特徴とする請求項１または５記載の光学プロ
    ーブ顕微鏡装置。
11. 【請求項１１】 前記光照射部は、 白色光源と、 前記白色光源から出力された白色光を分光出力する分光
    器と、 前記分光器から出力された光の全波長成分の中から特定
    の波長成分の光を選択して出力する光選択器と、 を備えることを特徴とする請求項１または５記載の光学
    プローブ顕微鏡装置。