JPH09201189A

JPH09201189A - 植物細胞培養方法

Info

Publication number: JPH09201189A
Application number: JP8012296A
Authority: JP
Inventors: Kenji Sato; 健治佐藤
Original assignee: Ishikawajima Harima Heavy Industries Co Ltd
Current assignee: IHI Corp
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1997-08-05

Abstract

(57)【要約】【課題】植物細胞を連続培養し代謝生産物の生産効率
を高めることが可能な植物細胞培養方法の提供。【解決手段】植物細胞を入れた培養槽１内に、液体培
地を連続的または断続的に供給し、かつ該植物細胞を透
過させないフィルター８を通して該培地を排出しつつ、
植物細胞の増殖と二次代謝物生成とを同一培養槽内で連
続的に行うことを特徴とする植物細胞培養方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はイチゴなどの植物細
胞を培養し、アントシアニンなどの代謝生産物を生産す
る植物細胞培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、植物の細胞を液体培地中で培
養し、大量の細胞を短時間で生産し、培養細胞中の有用
な代謝生産物を得る植物細胞培養方法が知られている。
この植物細胞培養方法の１つとして、イチゴの細胞を液
体培地中で培養し、培養細胞中にアントシアニンを製造
する方法がある。このイチゴ細胞を用いたアントシアニ
ンの製造においては、イチゴ細胞を増殖させるのに適し
た培地と、培養細胞中に二次代謝生産物であるアントシ
アニンを生成させるのに適した培地とでは成分が異な
り、それらは両立しないことから、従来のアントシアニ
ンの製造は、培養に適した細胞を、イチゴ細胞を増殖さ
せるのに適した培地（増殖用培地）に入れて、増殖優先
で回分培養し、アントシアニンを生産させるか、あるい
は培養細胞をアントシアニンを生成させるのに適した培
地に移して蓄積量優先で回分培養し、細胞内にアントシ
アニンを生成させる方法が一般的である。なお、アント
シアニン生産には光条件も重要であり、アントシアニン
生産には2500 lux以上の光を照射する必要がある。800
lux以下ではイチゴ細胞はアントシアニンを生産しな
い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記イ
チゴ細胞を増殖させるのに適した培地は、イチゴ細胞の
増殖率が高いものの、細胞重量当りのアントシアニン生
産量は少なく、またアントシアニンを生成させるのに適
した培地では、イチゴ細胞の増殖抑制が起こり細胞重量
の増加量が低いために、両者ともトータルのアントシア
ニン生産量を大きくできず、アントシアニンの生産効率
が低いという問題があった。

【０００４】本発明は前記事情に鑑みてなされたもの
で、植物細胞を連続培養し、二次代謝生産物の生産効率
を高めることが可能な植物細胞培養方法の提供を目的と
している。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の請求項１に係る
発明は、細胞の増殖速度を、細胞が増殖するとともに該
細胞内に二次代謝物が蓄積されるような至適増殖速度に
コントロールして培養することを特徴とする植物細胞培
養方法である。請求項２に係る発明は、植物細胞を入れ
た培養槽内に、液体培地を連続的または断続的に供給
し、かつ該植物細胞を透過させないフィルターを通して
該培地を排出しつつ、植物細胞の増殖と二次代謝物生成
とを同一培養槽内で連続的に行うことを特徴とする植物
細胞培養方法である。請求項３に係る発明は、前記液体
培地が、増殖用培地と比べ、栄養成分又は植物成長調整
物質の濃度を低下させたものであることを特徴とする請
求項２記載の植物細胞培養方法である。請求項４に係る
発明は、前記液体培地が、増殖用培地と比べ、浸透圧を
高めたものであることを特徴とする請求項２記載の植物
細胞培養方法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明は、イチゴ細胞などの植物
細胞を、液体培地中で増殖させ、細胞中に生成するアン
トシアニンなどの代謝生産物を得る植物細胞培養方法に
適用される。植物細胞としては、イチゴに限らず有用な
代謝生産物を生成可能な植物細胞を用いることができ、
例えば、ニンジン細胞によるカロチンの生産、朝鮮ニン
ジン細胞による薬効成分の生産、トマト細胞によるリコ
ピンの生産、天然色素生成細胞による色素生産などに適
用が可能である。

【０００７】一般に植物細胞による二次代謝物の生産
は、増殖の停止とともに起こることが多い。即ち、植物
細胞の培養における細胞量と二次代謝物生産量とを時間
の経過に従って比較すると、細胞量が増大する増殖期に
は二次代謝物生産量は殆ど増加せず、細胞量の増加が停
止した後で二次代謝物生産量が増大することが多い。し
かし、増殖期に二次代謝物を生産する例もある。一般に
アントシアニン生産は前者のパターンとされているが、
イチゴ細胞によるアントシアニン生産は後者に属してい
る。このように増殖しつつアントシアニンを生産する細
胞はイチゴ細胞以外は見当たらない。しかし、増殖しな
がらアントシアニン生産が可能であるとはいえ、増殖を
優先する培地では細胞当りの生産量が小さい（例えば比
増殖速度０．３日^-1の培地）ことから、本発明者は、ア
ントシアニン生産には好適な増殖速度があるものと確信
し、アントシアニン生産に好適な増殖速度を検討した。

【０００８】本発明者は、イチゴ細胞を培養する際に、
培地中の成分の量に応じて、細胞の増殖率と代謝生産物
（アントシアニン）の含有量との変化を調べる過程にお
いて、培地中の栄養成分またはオーキシン等の植物成長
調整物質の含有量を変化させた培地を用いて細胞を培養
した時、通常の培地で細胞を培養した場合に比べ、細胞
の増殖率は多少落ちるが、細胞中にアントシアニンが生
成した細胞を大量に生産し得る組成があることを見出し
た。

【０００９】更に種々の条件で研究を重ねた結果、細胞
の比増殖速度を所定の範囲に保った条件下で培養を行う
ことによって、細胞中に高濃度にアントシアニンが生成
した細胞を生産でき、従来法よりもアントシアニン生産
効率を良くできることが判った。しかも、培地を連続的
に或いは断続的に供給することで、アントシアニン生産
に好適な比増殖速度を保ちながら細胞を増殖させ、アン
トシアニンの生産性の高い細胞を高密度化させる効率的
な連続培養が可能である。

【００１０】本発明を実施する際に用いる液体培地とし
ては、ＭＳ培地などの通常の植物組織培養で用いられる
基本培地をベースとし、それに２，４−ジクロロフェノ
キシ酢酸（２，４−Ｄ）や６−ベンジルアデニン（Ｂ
Ａ）などの植物成長調整物質、ショ糖などを適宜に添加
した培地が用いられ、細胞増殖に適した培地に比べ、
栄養成分又は植物成長調整物質の含有量を低くした、又
は浸透圧を高めた、ことを特徴としている。

【００１１】の特徴を有する培地では、（ａ）リン
酸、（ｂ）窒素源、（ｃ）植物成長調整物質のうちのい
ずれかの濃度を、細胞増殖に適した増殖優先の培地（増
殖用培地）よりも減少させることにより、細胞の比増殖
速度を所定の範囲とすることができる。また、の特徴
を有する培地は、栄養成分や植物成長調整物質の含有量
は細胞増殖に適した培地と同じとし、その培地中に浸透
圧を高める物質を添加して用いる。液体培地の浸透圧を
高めるために培地中に添加される物質は、培養細胞に悪
影響を与えず、安価なものが使用され、マンニトール、
グリセリン、デキストリンなどの糖類、ポリエチレング
リコール、或いは塩化カルシウムなどの塩類などが使用
可能であり、特にマンニトール、ソルビトールが好適に
使用される。植物細胞はマンニトールやソルビトールを
炭素源として利用できないため、培養を通してそれらの
濃度が変化することがなく浸透圧調整剤として適してい
る。

【００１２】前記又はの特徴を有する培地（以下、
両用培地という）は、増殖用培地と比べて細胞の増殖速
度が低いが、得られる細胞中のアントシアニン含有量が
高くなり、フィルターを介した連続培養によって細胞の
高濃度化が達成され、従来法に比べアントシアニン生産
効率が高くなる。

【００１３】前記両用培地を用いてイチゴ細胞を培養す
る場合、培地のリン酸濃度を変化させたり、培地の供給
速度を変化させることで、細胞の比増殖速度を好適な一
定値例えば０．１０〜０．３日^-1、好ましくは０．２〜
０．３日^-1程度に維持することができる。また、培養槽
に、培養細胞が透過しないフィルターを通して連続的ま
たは断続的に前記両用培地を供給しつつ培養を行うこと
によって、細胞を同じ培養槽内で連続培養することがで
きるとともに、培養細胞の高密度化、すなわち高密度培
養が可能となり、培養を終了した細胞の回収が容易とな
る。また、培養槽の小型を図ることができる。そこで、
本発明では、イチゴ細胞などの植物細胞を入れた培養槽
内に、該細胞を透過させないフィルターを通して連続的
または断続的に前記両用培地を供給しつつ培養を行う。

【００１４】図１は、本発明方法の実施に好適な培養装
置の一例を示すものである。この培養装置は、培養槽１
と、その開口に装着された蓋２と、培養槽１内に挿入配
置された培地供給ライン３、通気ライン４、培地吸引ラ
イン５及び攪拌用のプロペラシャフト６と、培養槽１内
のガスを排気する排気ライン７と、培地吸引ライン５の
先端に設けられたフィルター８とを主要な構成要素とし
て備えている。培地吸引ライン５は蓋２外部で分岐さ
れ、一方はローラーポンプ等の図示略の吸引手段に接続
され、他方は通気ライン４に接する逆洗ライン９になっ
ている。その逆洗ライン９と通気ライン４には、それぞ
れピンチコック10,11が設けられている。またプロペラ
シャフト６は、蓋２外部でモータ等の駆動手段に接続さ
れ、その回転駆動によって所望の回転速度で回転し、培
養槽１内の細胞と両用培地１２を攪拌する。

【００１５】図２は、培地吸引ライン５の先端に設けら
れたフィルター８を示すものである。このフィルター８
は、ステンレスメッシュからなる内筒１３とそれよりも
径の大きい外筒１４とを重ねて円筒とし、培養槽１内の
細胞の透過を防ぎつつ、内筒１２と外筒１３とを通過し
た培地のみを培地吸引ライン５に送るようになってい
る。なお、内筒１３と外筒１４の材質はステンレスメッ
シュに限定されることなく、合成樹脂メッシュであって
も良い。

【００１６】この培養装置を用いたイチゴ細胞の培養を
説明する。使用するイチゴ細胞は、イチゴから無菌的に
採取した細胞をオーキシン等の植物成長調整物質を含む
固体培地上で培養して得られたカルス細胞やそれを継代
培養して得られた培養細胞などが用いられる。この細胞
を無菌的に培養槽１内の両用培地中に移し、通気ライン
４を通して無菌空気を供給するとともに、プロペラシャ
フト６を回転させて攪拌しつつ、培地供給ライン３を通
して培養槽１内に連続的に或いは断続的に両用培地を供
給する。培養槽１内の空気は排気ライン７を通して抜き
出す。培養槽１内の両用培地は、フィルター８を通して
培地吸引ライン５から抜き出される。培養継続中、フィ
ルター８に培養細胞が詰まらないように、断続的にピン
チコック１０を開け、空気の一部を逆洗ライン９から培
地吸引ライン５に供給しフィルター８から放出させ、フ
ィルター８を逆洗する。

【００１７】培養槽１内の培養細胞は増殖し、フィルタ
ー８を通って外部に出されることがないので、次第に培
養細胞は高密度となる。この培養において、前記両用培
地を用い、細胞の比増殖速度を０．１０〜０．３日^-1と
して連続培養を行うことにより、アントシアニン含有量
が高い細胞を増殖させることができ、トータルのアント
シアニン生産量が高められるので、従来法に比べアント
シアニン生産効率が高くなる。

【００１８】図３は本発明方法の実施に好適な培養装置
の他の例を示すものである。この培養装置は、図１に示
した培養装置とほぼ同様の構成要素を備えて構成され、
同じ構成要素には同一符号を付してある。この例による
培養装置は、プロペラシャフト６を中空の管とし、その
一部にステンレスメッシュよりなるメッシュ管１５を取
付け、このメッシュ管１５を通して培地のみを吸引して
培地供給ライン５に送るように構成されている。また、
この装置では培養槽１の側部に細胞と培地１２を抜き出
すための抜き取りライン１６を設けている。図３に示し
た培養装置においても、図１の培養装置とほぼ同様の操
作によってイチゴ細胞の連続培養が可能である。

【００１９】このように、本発明による植物細胞培養方
法は、植物細胞を入れた培養槽内に、液体培地を連続的
または断続的に供給し、かつ該植物細胞を透過させない
フィルターを通して該培地を排出しつつ、植物細胞の増
殖と二次代謝物生成とを同一培養槽内で連続的に行うこ
とによって、代謝生産物の含有量の高い培養細胞を高密
度で得ることができ、アントシアニンなどの代謝生産物
の生産効率を向上させることができる。また、植物細胞
を同じ培養槽内で連続培養することができるとともに、
培養細胞の高密度化、すなわち高密度培養が可能とな
り、培養を終了した細胞の回収が容易となる。また、培
養槽の小型化を図ることができる。

【００２０】

【実施例】イチゴの培養細胞を用い、細胞増殖に適した
培地に比べ、栄養成分又は植物成長調整物質の含有量を
低くした培地、又は浸透圧を高めた培地の各種の培地で
培養し、細胞の比増殖速度と二次代謝生産物（アントシ
アニン）の生産量の関係を調べた。

【００２１】・使用細胞四季成イチゴ（Fragaria ananassa, "shikinari"）の茎
頂を無菌的に採取し、２，４−Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ、ベ
ンジルアデニン（ＢＡ）０．１ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ
／Ｌを添加した固体培地に置床し、培養して形成された
カルスから得られた細胞を用い、この細胞を800Lux下、
液体培地で培養し、増殖させて以下の実験に用いた。・使用培地硝酸アンモニウム濃度を規定の１／４（５．１５ｍＭ）
とした以外は、ＭＳ培地と同じ成分である低窒素源ＭＳ
培地に、１．０ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄと０．１ｍｇ／Ｌ
のＢＡを添加した液体培地（ショ糖６０ｇ／Ｌを含む）
を基本とし、この培地中のリン酸濃度（実験１）、全窒
素（Ｎ）源（ＮＨ₄ ⁺＋ＮＯ₃ ^-濃度（実験２）、２，４−
Ｄ濃度（実験３）を変化させた各種の培地、および前記
基本培地にマンニトールを添加（実験４）して浸透圧を
高めた培地を用いた。実験に使用した培地の添加成分を
表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】・培養装置図１に示す培養装置を用いた。２．５Ｌの培養槽１に２
Ｌの培地を入れた。培養槽にはウォータージャケットが
付いており、槽内温度を２５℃に保つように恒温水を循
環させた。また、通気に関しては培養槽内の溶存酸素濃
度（ＤＯ）が４ppmとなるように、マスフローコントロ
ーラーを用いて通気量を制御した。また培養槽を覆うよ
うに光照射ユニットを設置した。・培養条件上記培養細胞を培養槽１内に入れ、約8000 Lux の光照
射、温度２５℃の条件下で２１日間連続培養した。培養
槽１内への培地の供給量は０〜０．５Ｌ／日、プロペラ
シャフトの回転数80〜100r.p.m.とした。

【００２４】実験１：リン酸濃度の影響培地中のリン酸濃度を図４に示した通り０ｍＭ（無添
加），０．０８ｍＭ，０．１６ｍＭ，０．３１ｍＭ及び
１．２５ｍＭのそれぞれの濃度とした培地を用いてイチ
ゴ細胞を培養し、培養日数毎の細胞濃度、アントシアニ
ン含有量およびアントシアニン収量を調べた。その結果
を図４に示す。図４から明らかなように、培地中のリン
酸濃度に応じて細胞の増加率が異なり、リン酸濃度が低
くなるに従って細胞濃度が低下した。一方、細胞重量当
りのアントシアニン量（アントシアニン含有量）は、リ
ン酸濃度０．１６ｍＭと０．３１ｍＭの培地のものが高
くなり、トータルのアントシアニン収量（培地１Ｌ当り
アントシアニン生産量）は０．３１ｍＭの培地で高くな
った。

【００２５】実験２：窒素源濃度の影響培地中の窒素源濃度を表２に示す通り全窒素として１．
２ｍＭ，１．８ｍＭ，３．６ｍＭ，７．３ｍＭ及び２
９．１ｍＭのそれぞれの濃度とした培地を用いてイチゴ
細胞を培養し、培養日数毎の細胞濃度、アントシアニン
含有量およびアントシアニン収量を調べた。ＭＳ培地に
は窒素源としてＫＮＯ₃とＮＨ₄ＮＯ₃が含まれている。
それぞれが１８．８ｍＭ、２０．６ｍＭ含まれた場合が
通常のＭＳ培地であり、今回使用した低窒素源ＭＳ培地
とは、ＮＨ₄ＮＯ₃のみを１／４とした培地である。ＭＳ
中のＮＨ₄ＮＯ₃を通常の１／４とすることで、増殖には
特に影響なく細胞内のアントシアニン量は大きくなる。
この実験２においてはＮＨ₄ ⁺：ＮＯ₃ ^-の比を一定に保
ち、濃度を変化させた。

【００２６】

【表２】

【００２７】この結果を図５に示す。図５から明らかな
ように、培地中の窒素源濃度に応じて細胞の増加率が異
なり、窒素源濃度が低くなるに従って細胞濃度が低下し
た。一方、細胞重量当りのアントシアニン量（アントシ
アニン含有量）は、窒素源濃度１．８ｍＭで特に高くな
った。

【００２８】実験３：２，４−Ｄ濃度の影響培地中の２，４−Ｄ濃度を図６に示した通り０ｍｇ／Ｌ
（無添加），０．１ｍｇ／Ｌ，０．５ｍｇ／Ｌ及び１．
０ｍｇ／Ｌのそれぞれの濃度とした培地を用いてイチゴ
細胞を培養し、培養日数毎の細胞濃度、アントシアニン
含有量およびアントシアニン収量を調べた。その結果を
図６に示す。図６から明らかなように、培地中の２，４
−Ｄ濃度が低くなるに従って細胞濃度が低下した。一
方、細胞重量当りのアントシアニン量（アントシアニン
含有量）は、２，４−Ｄ濃度０．１ｍｇ／Ｌが高くなっ
た。またトータルの収量では２，４−Ｄ濃度０．５ｍｇ
／Ｌ及び１．０ｍｇ／Ｌが高くなった。

【００２９】図７は、前記実験１〜実験３の結果から細
胞の比増殖速度（日^-1）を算出し、その比増殖速度に対
するアントシアニン含有量とアントシアニン収量とをま
とめたグラフである。この図７のグラフから明らかなよ
うに、アントシアニン収量を高めるための増殖制限因子
としては、培地中のリン酸濃度を変化させるのが好まし
く、それによってアントシアニン含有量、アントシアニ
ン収量の高い培養細胞を得ることが可能である。また、
アントシアニン含有量とアントシアニン収量を高めるの
に好適な培養における比増殖速度は、０．１０〜０．３
日^-1、好ましくは０．２〜０．３日^-1程度であった。

【００３０】実験４：浸透圧の影響前記基本培地（低窒素源ＭＳ培地に、１．０ｍｇ／Ｌの
２，４−Ｄ、０．１ｍｇ／ＬのＢＡ、６０ｇ／Ｌのショ
糖を添加）に、マンニトールを０Ｍ（無添加），０．１
Ｍ，０．２Ｍ，０．４Ｍ及び０．６Ｍとなるように添加
した培地を用いてイチゴ細胞を培養し、培養開始から９
日目の細胞濃度、比増殖速度、アントシアニン含有量、
アントシアニン収量を測定した。その結果を表３に示
す。

【００３１】

【表３】

【００３２】表１の結果から明らかなように、培地にマ
ンニトールを添加して浸透圧を高めることによって、比
増殖速度を変化させることが可能であった。そしてマン
ニトールを０．１Ｍ、及び０．２Ｍ添加した培地を用い
た場合にアントシアニン収量を高めることができた。

【００３３】

【発明の効果】以上説明したように、本発明による植物
細胞培養方法は、植物細胞を液体培地中で増殖させ細胞
中に生成する代謝生産物を得る植物細胞培養方法におい
て、前記細胞の増殖に用いる培地と比べ、細胞重量当り
の代謝生産物生産量が高い液体培地を、該細胞を入れた
培養槽内に該細胞を透過させないフィルターを通して連
続的または断続的に供給しつつ培養を行うことによっ
て、イチゴ細胞などの植物細胞を連続培養することがで
き、代謝生産物の含有量の高い培養細胞を高密度で得る
ことができるので、アントシアニンなどの代謝生産物の
生産効率を向上させることができる。また、植物細胞を
同じ培養槽内で連続培養することができるとともに、培
養細胞の高密度化、すなわち高密度培養が可能となり、
培養を終了した細胞の回収が容易となる。また、培養槽
の小型化を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明方法に好適な培養装置の一例を示
す概略断面図である。

【図２】図２は同じ培養装置の要部の斜視図である。

【図３】図３は本発明方法に好適な培養装置の他の例を
示す概略断面図である。

【図４】図４は本発明の実施例の実験１の結果を示すグ
ラフである。

【図５】図５は本発明の実施例の実験２の結果を示すグ
ラフである。

【図６】図６は本発明の実施例の実験３の結果を示すグ
ラフである。

【図７】図７は本発明の実施例の結果を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

１……培養槽、８……フィルター、１２……植物細胞と
培地、１５……フィルター。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞の増殖速度を、細胞が増殖するとと
もに該細胞内に二次代謝物が蓄積されるような至適増殖
速度にコントロールして培養することを特徴とする植物
細胞培養方法。
【請求項２】植物細胞を入れた培養槽内に、液体培地
を連続的または断続的に供給し、かつ該植物細胞を透過
させないフィルターを通して該培地を排出しつつ、植物
細胞の増殖と二次代謝物生成とを同一培養槽内で連続的
に行うことを特徴とする植物細胞培養方法。
【請求項３】前記液体培地が、増殖用培地と比べ、栄
養成分又は植物成長調整物質の濃度を低下させたもので
あることを特徴とする請求項２記載の植物細胞培養方
法。
【請求項４】前記液体培地が、増殖用培地と比べ、浸
透圧を高めたものであることを特徴とする請求項２記載
の植物細胞培養方法。