JPH09206092A - Ｂｃｇ菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法及び遅延型過敏反応測定用試薬 - Google Patents
Ｂｃｇ菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法及び遅延型過敏反応測定用試薬Info
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- JPH09206092A JPH09206092A JP8034209A JP3420996A JPH09206092A JP H09206092 A JPH09206092 A JP H09206092A JP 8034209 A JP8034209 A JP 8034209A JP 3420996 A JP3420996 A JP 3420996A JP H09206092 A JPH09206092 A JP H09206092A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＢＣＧ菌を短期培養した使用済培養液が大量
に産業廃棄物として、産生されることに着目し、これを
出発物質として、ＢＣＧ菌が前記培養液中に排出した有
用蛋白質を効率よく回収する方法及びその回収した蛋白
質を試薬として提供すること。 【解決手段】 前記使用済培養液を４０℃乃至４５℃に
加温して、先ず、ＢＣＧ菌体と分子量の小さい培養液成
分を順次濾別し濃縮蛋白質にする。次にフェニルセファ
ロースＣＬ−４Ｂカラムによるアフィニティ精製を行な
う。次に尿素使用ＤＥＡＥ−セファロースカラムにより
精製する。更にセファクリルＳ２００ＨＲカラムにより
精製する。最後に尿素不使用ＤＥＡＥ−セファロースＣ
Ｌ−６Ｂカラムで精製し、目的の蛋白質を得る。またこ
れを用いた試薬とする。
に産業廃棄物として、産生されることに着目し、これを
出発物質として、ＢＣＧ菌が前記培養液中に排出した有
用蛋白質を効率よく回収する方法及びその回収した蛋白
質を試薬として提供すること。 【解決手段】 前記使用済培養液を４０℃乃至４５℃に
加温して、先ず、ＢＣＧ菌体と分子量の小さい培養液成
分を順次濾別し濃縮蛋白質にする。次にフェニルセファ
ロースＣＬ−４Ｂカラムによるアフィニティ精製を行な
う。次に尿素使用ＤＥＡＥ−セファロースカラムにより
精製する。更にセファクリルＳ２００ＨＲカラムにより
精製する。最後に尿素不使用ＤＥＡＥ−セファロースＣ
Ｌ−６Ｂカラムで精製し、目的の蛋白質を得る。またこ
れを用いた試薬とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明はＢＣＧ菌短期培養
液よりＢＣＧ菌が排出した蛋白質より有用な蛋白質を単
離する方法及びこの方法により、単離された蛋白質を主
剤とする試薬に関する。
液よりＢＣＧ菌が排出した蛋白質より有用な蛋白質を単
離する方法及びこの方法により、単離された蛋白質を主
剤とする試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＢＣＧ菌を５週間乃至１０週間の
長期培養した少量の培養液より、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７
０を単離する方法は永井らによって、ＤＥＡＥセファデ
ックスＡ−５０、及びＤＥＡＥセファロースを用いて、
単離する方法が１９８６年４月アメリカン・ソサイエテ
ィ・フォ・マイクロバイオロジィ発行、インフェクション
・アンド・イムニテイ(American Society for Microbiolo
gy）、Vol.52,No.1 p293〜302に発表されている。また
遺伝子工学を用い前記のＭＰＢ６４蛋白質を製造する方
法は、特開平１−２４７０９４特許公開公報によって知
られている。
長期培養した少量の培養液より、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７
０を単離する方法は永井らによって、ＤＥＡＥセファデ
ックスＡ−５０、及びＤＥＡＥセファロースを用いて、
単離する方法が１９８６年４月アメリカン・ソサイエテ
ィ・フォ・マイクロバイオロジィ発行、インフェクション
・アンド・イムニテイ(American Society for Microbiolo
gy）、Vol.52,No.1 p293〜302に発表されている。また
遺伝子工学を用い前記のＭＰＢ６４蛋白質を製造する方
法は、特開平１−２４７０９４特許公開公報によって知
られている。
【０００３】然し乍ら、前者の方法は出発物質が長期培
養の培養液であり、量も極めて少ない。また後者のもの
は、宿主にＭＰＢ６４遺伝子を組み込んで、宿主を培養
した後、宿主よりＭＰＢ６４を取り出す方法であり、そ
の操作は極めて煩瑣である。
養の培養液であり、量も極めて少ない。また後者のもの
は、宿主にＭＰＢ６４遺伝子を組み込んで、宿主を培養
した後、宿主よりＭＰＢ６４を取り出す方法であり、そ
の操作は極めて煩瑣である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この発明はＢＣＧ菌を
培養中に前記菌体が菌体外に排出する３００種類にも達
する蛋白質の中より、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０などで代
表される有用蛋白質を分離するための方法であり、大量
のこれら蛋白質を能率よく単離する方法を市場に提供
し、併せて、この単離した蛋白質を主剤とする遅延型過
敏反応測定用試薬を市場に提供するためである。
培養中に前記菌体が菌体外に排出する３００種類にも達
する蛋白質の中より、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０などで代
表される有用蛋白質を分離するための方法であり、大量
のこれら蛋白質を能率よく単離する方法を市場に提供
し、併せて、この単離した蛋白質を主剤とする遅延型過
敏反応測定用試薬を市場に提供するためである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記の課題を達成するた
めに、この方法発明はＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培
養液を性質のことなるカラムを用い、前記出発物質を装
填し、緩衝液により溶出して、順次複数箇に分画し、こ
の中より単離すべき蛋白質を含む分画を選択し、この分
画液を濃縮した後透析するカラム精製方法を、異なる性
質のカラムを用い異なる成分を含有する緩衝液により前
記同様のカラム精製方法を少なくとも２回行い、蛋白質
を精製する方法において、前記カラム精製方法の前処理
として、前記使用済み培養液を４０乃至４５℃に加温
し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を除去
し、次いで分子量約５０００以下の蛋白質及び培養液成
分を濾別除去し、前記使用済み培養液を濃縮し、次い
で、この濃縮液に硫酸アンモニウム（以下単にＡＳ）を
６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離によ
り蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給
することを特徴とするＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培
養液より蛋白質を単離する方法とする。
めに、この方法発明はＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培
養液を性質のことなるカラムを用い、前記出発物質を装
填し、緩衝液により溶出して、順次複数箇に分画し、こ
の中より単離すべき蛋白質を含む分画を選択し、この分
画液を濃縮した後透析するカラム精製方法を、異なる性
質のカラムを用い異なる成分を含有する緩衝液により前
記同様のカラム精製方法を少なくとも２回行い、蛋白質
を精製する方法において、前記カラム精製方法の前処理
として、前記使用済み培養液を４０乃至４５℃に加温
し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を除去
し、次いで分子量約５０００以下の蛋白質及び培養液成
分を濾別除去し、前記使用済み培養液を濃縮し、次い
で、この濃縮液に硫酸アンモニウム（以下単にＡＳ）を
６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離によ
り蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給
することを特徴とするＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培
養液より蛋白質を単離する方法とする。
【０００６】前記の課題を達成するために、前記ＢＣＧ
菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方
法の前記カラム精製方法の二番目の段階のカラム精製方
法において、カラムとして、ＤＥＡＥセファロースＣＬ
−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿
素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍ
ｌで平衡化して、カラム精製方法の前処理後の蛋白質を
供給し、前記と同一の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００
ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第
に高めながら濃度の低い方から順に供給し、溶出速度を
０．５ｍｌ／分として、数区分に分画し、目的蛋白質を
含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質を濃
縮し、次いで透析する過程において前記尿素を分離する
方法であることを特徴とすることが好ましい。
菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方
法の前記カラム精製方法の二番目の段階のカラム精製方
法において、カラムとして、ＤＥＡＥセファロースＣＬ
−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿
素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍ
ｌで平衡化して、カラム精製方法の前処理後の蛋白質を
供給し、前記と同一の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００
ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第
に高めながら濃度の低い方から順に供給し、溶出速度を
０．５ｍｌ／分として、数区分に分画し、目的蛋白質を
含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質を濃
縮し、次いで透析する過程において前記尿素を分離する
方法であることを特徴とすることが好ましい。
【０００７】また前記の課題を達成するために、この方
法発明は、 ａ．第１段階（前処理工程） ＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液を４０乃至４５℃
に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を
除去し、次いで分子量約５０００以下の蛋白質及び培養
液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を１／２００
乃至１／３５０に濃縮し、次いで、この濃縮液にＡＳを
６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離によ
り蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給
する ｂ．カラム精製工程
法発明は、 ａ．第１段階（前処理工程） ＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液を４０乃至４５℃
に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を
除去し、次いで分子量約５０００以下の蛋白質及び培養
液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を１／２００
乃至１／３５０に濃縮し、次いで、この濃縮液にＡＳを
６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離によ
り蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給
する ｂ．カラム精製工程
【０００８】第２段階 第１段階による蛋白質をフェニル・セファロースＣＬ−
４Ｂカラム（直径２５ｍｍ、容積８０ｍｌ）に装填し、
ＡＳを含む１０ｍＭトリス塩酸（ＨＣｌ）緩衝液を、前
記ＡＳ濃度を順に５００ｍＭのＡＳ含有のものから全く
含まないものまで段階的乃至連続的に濃度を低めながら
全量で４５０乃至６００ｍｌをＡＳ濃度の高い方から供
給し、溶出液を順次１０ｍｌずつ分画する。各分画より
１０μｌずつサンプリングしたものにバイオ−ラッドプ
ロテインアッセイ試薬５０μｌを混合し、吸光度を測定
し、溶出パターンを求め、更に電気泳動により、目的の
分子量の蛋白質が含まれる分画を選択し、この分画の溶
出液を濃縮し、更に透析する。
４Ｂカラム（直径２５ｍｍ、容積８０ｍｌ）に装填し、
ＡＳを含む１０ｍＭトリス塩酸（ＨＣｌ）緩衝液を、前
記ＡＳ濃度を順に５００ｍＭのＡＳ含有のものから全く
含まないものまで段階的乃至連続的に濃度を低めながら
全量で４５０乃至６００ｍｌをＡＳ濃度の高い方から供
給し、溶出液を順次１０ｍｌずつ分画する。各分画より
１０μｌずつサンプリングしたものにバイオ−ラッドプ
ロテインアッセイ試薬５０μｌを混合し、吸光度を測定
し、溶出パターンを求め、更に電気泳動により、目的の
分子量の蛋白質が含まれる分画を選択し、この分画の溶
出液を濃縮し、更に透析する。
【０００９】第３段階 前記第２段階で濃縮した液を、３Ｍ尿素で平衡化したＤ
ＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍｍ、
容量７５ｍｌ）を用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌ
の含有濃度を連続的に高めながら供給し、溶出速度を
０．５ｍｌ／分として、溶出液を分画する。次いで第２
段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目
的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分
画蛋白質を濃縮し、濃縮蛋白質液とする。
ＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍｍ、
容量７５ｍｌ）を用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌ
の含有濃度を連続的に高めながら供給し、溶出速度を
０．５ｍｌ／分として、溶出液を分画する。次いで第２
段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目
的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分
画蛋白質を濃縮し、濃縮蛋白質液とする。
【００１０】第４段階 前段階で得られた濃縮蛋白質液を１０％エチレングリコ
ール（ＥＧ）及び０．３ＭのＮａＣｌを含む５００ｍｌ
の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したセファ
クリルＳ２００ＨＲカラムを用い、平衡化に用いたのと
同じ緩衝液で溶出し、順次分画する。次いで第３段階と
同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目的の蛋
白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白
質を濃縮し、透析し濃縮蛋白質液とする。
ール（ＥＧ）及び０．３ＭのＮａＣｌを含む５００ｍｌ
の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したセファ
クリルＳ２００ＨＲカラムを用い、平衡化に用いたのと
同じ緩衝液で溶出し、順次分画する。次いで第３段階と
同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目的の蛋
白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白
質を濃縮し、透析し濃縮蛋白質液とする。
【００１１】第５段階 第４段階の濃縮蛋白質液を尿素を含まないＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラムを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．７）５００ｍｌで平衡化したものを用
い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）にＮ
ａＣｌを５０ｍＭ乃至１００ｍＭまで連続的に濃度を上
昇させた溶出液で溶出し、順次分画する。次ぎに前段階
と同様の方法により分画を選択し、濃縮及び透析し、目
的の蛋白質を得る。以上第１段階乃至第５段階よりなる
ことを特徴とするＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液
より蛋白質を単離する方法とする。
ァロースＣＬ−６Ｂカラムを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．７）５００ｍｌで平衡化したものを用
い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）にＮ
ａＣｌを５０ｍＭ乃至１００ｍＭまで連続的に濃度を上
昇させた溶出液で溶出し、順次分画する。次ぎに前段階
と同様の方法により分画を選択し、濃縮及び透析し、目
的の蛋白質を得る。以上第１段階乃至第５段階よりなる
ことを特徴とするＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液
より蛋白質を単離する方法とする。
【００１２】前記の課題を達成するために、前記ＢＣＧ
菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方
法の第１段階乃至第５段階の方法において、単離する前
記目的蛋白質はＭＰＢ６４であることを特徴とする場合
もある。
菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方
法の第１段階乃至第５段階の方法において、単離する前
記目的蛋白質はＭＰＢ６４であることを特徴とする場合
もある。
【００１３】前記の課題を達成するために、前記ＢＣＧ
菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方
法の第１段階乃至第５段階の方法に於いて、単離する前
記目的蛋白質はＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、
ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５であり、これら内、少なく
とも２種の蛋白質を前記以上第２段階乃至第５段階にお
いて、同時間帯に並行して単離する方法であることを特
徴とする場合もある。
菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方
法の第１段階乃至第５段階の方法に於いて、単離する前
記目的蛋白質はＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、
ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５であり、これら内、少なく
とも２種の蛋白質を前記以上第２段階乃至第５段階にお
いて、同時間帯に並行して単離する方法であることを特
徴とする場合もある。
【００１４】前記の課題を達成するために、この物の発
明は、前記の単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種をその
侭乃至凍結乾燥してあることを特徴とする遅延型過敏反
応測定用試薬。
明は、前記の単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種をその
侭乃至凍結乾燥してあることを特徴とする遅延型過敏反
応測定用試薬。
【００１５】前記の課題を達成するために、この物の発
明は、前記の単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種と軟膏
剤とが混練してあることを特徴とする軟膏状の遅延型過
敏反応測定用試薬。
明は、前記の単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種と軟膏
剤とが混練してあることを特徴とする軟膏状の遅延型過
敏反応測定用試薬。
【００１６】
【発明の作用】請求項１記載の方法発明に於いては、出
発物質として、ＢＣＧ製剤を製造する時に産生されるＢ
ＣＧ菌を短期培養した使用済みの培養液を用い、この中
に前記ＢＣＧ菌より、その菌体外に排出された多種類の
蛋白質中より目的の蛋白質を単離するに先立ち、この使
用済み培養液を４０℃乃至４５℃に加温することによっ
て、培養液の粘稠度が低下し、フィルターで濾過する場
合に、流動性がよくなり、先ず残存するＢＣＧ菌が除か
れ、次いで目的の蛋白質の分子量よりも小さい分子量の
蛋白質及び培養液成分が短時間で濾過される作用があ
る。
発物質として、ＢＣＧ製剤を製造する時に産生されるＢ
ＣＧ菌を短期培養した使用済みの培養液を用い、この中
に前記ＢＣＧ菌より、その菌体外に排出された多種類の
蛋白質中より目的の蛋白質を単離するに先立ち、この使
用済み培養液を４０℃乃至４５℃に加温することによっ
て、培養液の粘稠度が低下し、フィルターで濾過する場
合に、流動性がよくなり、先ず残存するＢＣＧ菌が除か
れ、次いで目的の蛋白質の分子量よりも小さい分子量の
蛋白質及び培養液成分が短時間で濾過される作用があ
る。
【００１７】請求項２記載の方法発明に於いては、請求
項１記載の発明の作用のほか、カラム精製法の２番目に
おいて、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを使用
し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで平衡化して、カ
ラム精製方法の前処理後の蛋白質を供給し、前記と同一
の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液を
ＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第に高めながら濃度の
低い方から順に供給するから、蛋白質に結合もしくは取
り込まれている不純物が尿素と結合して、除去される作
用をなす。またこの段階の直後において、溶出液を透析
することによって、前記尿素は溶出液から除去されて、
単離した短白質を変化させたり、活性を弱める作用は殆
ど起こさせない作用をなす。
項１記載の発明の作用のほか、カラム精製法の２番目に
おいて、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを使用
し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで平衡化して、カ
ラム精製方法の前処理後の蛋白質を供給し、前記と同一
の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液を
ＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第に高めながら濃度の
低い方から順に供給するから、蛋白質に結合もしくは取
り込まれている不純物が尿素と結合して、除去される作
用をなす。またこの段階の直後において、溶出液を透析
することによって、前記尿素は溶出液から除去されて、
単離した短白質を変化させたり、活性を弱める作用は殆
ど起こさせない作用をなす。
【００１８】請求項３記載の発明においては、前記請求
項１及び２記載の発明の作用のほか、前述の第１段階乃
至第５段階によって、ＢＣＧ菌を短期培養した使用済み
の培養液より、目的とする蛋白質を純度高く少なくとも
一種類、単離する作用をなす。殊に第２段階に於いて、
単離すべき蛋白質が２種以上あるときは、複数の分画を
それぞれ独立に選択し、その後の段階に於いては各分画
毎に独立しての精製が可能となる作用をなす。請求項４
記載の発明においては、前記請求項３記載の作用のほ
か、目的蛋白質としてＭＰＢ６４を純度高く単離する作
用をなす。
項１及び２記載の発明の作用のほか、前述の第１段階乃
至第５段階によって、ＢＣＧ菌を短期培養した使用済み
の培養液より、目的とする蛋白質を純度高く少なくとも
一種類、単離する作用をなす。殊に第２段階に於いて、
単離すべき蛋白質が２種以上あるときは、複数の分画を
それぞれ独立に選択し、その後の段階に於いては各分画
毎に独立しての精製が可能となる作用をなす。請求項４
記載の発明においては、前記請求項３記載の作用のほ
か、目的蛋白質としてＭＰＢ６４を純度高く単離する作
用をなす。
【００１９】請求項５記載の発明においては、前記請求
項３記載の作用のほか、目的蛋白質として、ＭＰＢ５
９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ
８５の内の少なくとも２種を第２段階に於いて、それぞ
れ独立して同時に分画され、その後それぞれの分画され
た蛋白質毎に同時平行して、それぞれ純度を高く単離す
る作用をなす。
項３記載の作用のほか、目的蛋白質として、ＭＰＢ５
９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ
８５の内の少なくとも２種を第２段階に於いて、それぞ
れ独立して同時に分画され、その後それぞれの分画され
た蛋白質毎に同時平行して、それぞれ純度を高く単離す
る作用をなす。
【００２０】請求項６記載の発明においては、前記請求
項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、
ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種をその侭乃至
凍結乾燥してあることを特徴とする遅延型過敏反応測定
用試薬であるから、これらの抗体に対して、特異的反応
をする作用をなす。
項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、
ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種をその侭乃至
凍結乾燥してあることを特徴とする遅延型過敏反応測定
用試薬であるから、これらの抗体に対して、特異的反応
をする作用をなす。
【００２１】請求項７記載の発明においては、前記請求
項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、
ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種と軟膏剤とが
混練してあることを特徴とする軟膏状の遅延型過敏反応
測定用試薬であるから、この一部を人間、牛などの動物
の皮膚に塗布することによって、これらの皮膚に長時間
付着でき、これら人間又は動物の前記特定蛋白質に対す
る抗体の有無により、これらの皮膚に発生する炎症乃至
硬化現象を起こしたり、或いは起こさない作用をなす。
項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、
ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの一種と軟膏剤とが
混練してあることを特徴とする軟膏状の遅延型過敏反応
測定用試薬であるから、この一部を人間、牛などの動物
の皮膚に塗布することによって、これらの皮膚に長時間
付着でき、これら人間又は動物の前記特定蛋白質に対す
る抗体の有無により、これらの皮膚に発生する炎症乃至
硬化現象を起こしたり、或いは起こさない作用をなす。
【００２２】請求項８記載の発明においては、之を皮膚
に貼付することが可能となり、前記の請求項７記載の発
明と同様の反応を皮膚に起こさせたり起こさない作用を
為す。
に貼付することが可能となり、前記の請求項７記載の発
明と同様の反応を皮膚に起こさせたり起こさない作用を
為す。
【００２３】
材料と方法 培養液： ソートン（Sauton)合成培養液 使用菌：日本のＢＣＧワクチン製造の種株たるマイコバ
クテリュウム・ボビスＢＣＧ東京（Mycobacterium bov
is ＢＣＧ Tokyo、以下単にＢＣＧ菌と云う)。前記Ｂ
ＣＧ菌を、前記ソートン培地に移植し、通気しないで３
７℃で表面培養した。８日目に培養した菌体をワクチン
製造用として濾過により、集菌した後の使用済み培養液
を集め、出発物質とした。 カラム：ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ，セファクリ
ルＳ２００ＨＲ，セファロースＣＬ−４Ｂ（スエーデ
ン、ウプサラ、ファルマシアＬＫＢ社製）を用いた。
クテリュウム・ボビスＢＣＧ東京（Mycobacterium bov
is ＢＣＧ Tokyo、以下単にＢＣＧ菌と云う)。前記Ｂ
ＣＧ菌を、前記ソートン培地に移植し、通気しないで３
７℃で表面培養した。８日目に培養した菌体をワクチン
製造用として濾過により、集菌した後の使用済み培養液
を集め、出発物質とした。 カラム：ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ，セファクリ
ルＳ２００ＨＲ，セファロースＣＬ−４Ｂ（スエーデ
ン、ウプサラ、ファルマシアＬＫＢ社製）を用いた。
【００２４】サンプル濃縮：ミリポア・ペリコン・カセ
ット・システム（Millipore Pellicon System）ＸＸ
４２ＰＥＬ６０（米国，ＭＡ州，ベッドフォード，ミリ
ポア社製)とアミコン(Amicon)ＹＭ−３メンブレン（mem
brane)(米国、ＭＡ州、アミコンInc.製)を用いた。
ット・システム（Millipore Pellicon System）ＸＸ
４２ＰＥＬ６０（米国，ＭＡ州，ベッドフォード，ミリ
ポア社製)とアミコン(Amicon)ＹＭ−３メンブレン（mem
brane)(米国、ＭＡ州、アミコンInc.製)を用いた。
【００２５】２次元電気泳動(以下単に２Ｄ−Ｅと云
う）：２Ｄ−Ｅとしてはミリポア・インベスティゲータ
ー（Milliporeinvestigator)２−Ｄ電気泳動システムを
用いた。１次元目は５．５％塩基・酸基両性（アンフォ
ライト）混合物を含む９．５Ｍ尿素を用いｐＩ３乃至１
０の範囲，１８０００Ｖ/ｈｒで等電点電気泳動を行っ
た。２次元目は、１２．５％ポリアクリルアミド．ゲル
（polyacrylamide gel)を用い１６０００ｍＷでソディ
ウム・ドデシル・サルフエート−ポリアクリルアミド・
ゲル（Sodium dodecyl sulphate−polyacrylamide g
el)電気泳動(以下単にＳＤＳ−ＰＡＧＥと云う)を行っ
た。
う）：２Ｄ−Ｅとしてはミリポア・インベスティゲータ
ー（Milliporeinvestigator)２−Ｄ電気泳動システムを
用いた。１次元目は５．５％塩基・酸基両性（アンフォ
ライト）混合物を含む９．５Ｍ尿素を用いｐＩ３乃至１
０の範囲，１８０００Ｖ/ｈｒで等電点電気泳動を行っ
た。２次元目は、１２．５％ポリアクリルアミド．ゲル
（polyacrylamide gel)を用い１６０００ｍＷでソディ
ウム・ドデシル・サルフエート−ポリアクリルアミド・
ゲル（Sodium dodecyl sulphate−polyacrylamide g
el)電気泳動(以下単にＳＤＳ−ＰＡＧＥと云う)を行っ
た。
【００２６】試薬:ミリポア社製の２−Ｄ電気泳動シス
テム用のものを使用した。ゲルは銀染色試薬(日本,東
京,第一化学薬品株式会社製,)で染色した。分子量の測
定は標準蛋白質(米国,ＣＡ州，リッチモンド,バイオラ
ッド・ラボラトリー製)を用いた。その他の試薬とし
て、特に注意書きのない全ての試薬は和光純薬株式会社
製のものを用いた。
テム用のものを使用した。ゲルは銀染色試薬(日本,東
京,第一化学薬品株式会社製,)で染色した。分子量の測
定は標準蛋白質(米国,ＣＡ州，リッチモンド,バイオラ
ッド・ラボラトリー製)を用いた。その他の試薬とし
て、特に注意書きのない全ての試薬は和光純薬株式会社
製のものを用いた。
【００２７】実施の形態１ 次ぎに請求項１乃至請求項５記載の方法発明を含む実施
の形態を説明する。 第１段階（前処理） 先ず、前記出発物質たる使用済み培養液を８０乃至１０
０リッターを４０℃至４５℃に温めて、No.２の濾紙
（日本，東京，東洋濾紙株式会社製）で濾過し、前記出
発物質中に残存するＢＣＧ菌体を濾別し、続いて４０℃
乃至４５℃状態のまま、ミリポア・ペリコン・カセット
・装置に供給する。、このミリポア・ペリコン・カセッ
トＰＬＣＣ００００５の装置の二つのフィルターはグリ
セリンや他の培地成分のような分子量５０００以下の小
さい分子を除くために用いる。このようにして、最初の
出発物質を３００乃至４００ｍｌに濃縮する。この濃縮
は時間を節約するために数区分に分け複数箇の前記ミリ
ポア・ペリコン・カセットＰＬＣＣ００００５を用いて
行う場合もある。
の形態を説明する。 第１段階（前処理） 先ず、前記出発物質たる使用済み培養液を８０乃至１０
０リッターを４０℃至４５℃に温めて、No.２の濾紙
（日本，東京，東洋濾紙株式会社製）で濾過し、前記出
発物質中に残存するＢＣＧ菌体を濾別し、続いて４０℃
乃至４５℃状態のまま、ミリポア・ペリコン・カセット
・装置に供給する。、このミリポア・ペリコン・カセッ
トＰＬＣＣ００００５の装置の二つのフィルターはグリ
セリンや他の培地成分のような分子量５０００以下の小
さい分子を除くために用いる。このようにして、最初の
出発物質を３００乃至４００ｍｌに濃縮する。この濃縮
は時間を節約するために数区分に分け複数箇の前記ミリ
ポア・ペリコン・カセットＰＬＣＣ００００５を用いて
行う場合もある。
【００２８】前述の出発物質たる使用済み培養液は前述
の通りの温度の範囲に加温されることにより、粘稠度が
低下し、５０００以下の分子量の小さい分子のフィルタ
ーを通過するのを容易にし、通過時間を短縮するのに役
立つ。濃縮物は更にミリポア・メンブレン・ミリパック
６０（０．２２μｍミリポアＣｏ．，製）で再び濾過
し、完全にＢＣＧ菌体を除去する。
の通りの温度の範囲に加温されることにより、粘稠度が
低下し、５０００以下の分子量の小さい分子のフィルタ
ーを通過するのを容易にし、通過時間を短縮するのに役
立つ。濃縮物は更にミリポア・メンブレン・ミリパック
６０（０．２２μｍミリポアＣｏ．，製）で再び濾過
し、完全にＢＣＧ菌体を除去する。
【００２９】濃縮した培養濾液に硫酸アンモニウムを６
０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させた。この沈殿物混
合液をそのまゝ若しくは冷蔵庫で冷却保存した後、６０
００ｒｐｍで遠心分離法により分離し、上清を除去す
る。この濃縮物の２Ｄ−Ｅ（２次元電気泳動）を図１に
示す。ＢＣＧ菌が分泌する蛋白質は等電点、及び分子量
により多くの独立したスポットとして散らばっている。
例えばＭＰＢ６４（２６ｋＤａ）を矢印で示す。
０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させた。この沈殿物混
合液をそのまゝ若しくは冷蔵庫で冷却保存した後、６０
００ｒｐｍで遠心分離法により分離し、上清を除去す
る。この濃縮物の２Ｄ−Ｅ（２次元電気泳動）を図１に
示す。ＢＣＧ菌が分泌する蛋白質は等電点、及び分子量
により多くの独立したスポットとして散らばっている。
例えばＭＰＢ６４（２６ｋＤａ）を矢印で示す。
【００３０】第２段階（フェニルセファロースによる蛋
白質のアフィニティー（affin)精製) 段階１により得た全蛋白の沈殿物をフェニルセファロー
スＣＬ−４Ｂカラムに装填する。このカラムは硫酸アン
モニウム（ＡＳ）濃度を５００ｍＭから全く含まないも
のまで順次５００ｍＭ ＡＳ：１５０ｍｌ、２００ｍＭ
ＡＳ：５０ｍｌ、１００ｍＭ ＡＳ：１５０ｍｌ、Ａ
Ｓ：なし１２０ｍｌ、と段階毎に減らした１０ｍＭトリ
スＨＣｌ緩衝液を用い室温で溶出した。
白質のアフィニティー（affin)精製) 段階１により得た全蛋白の沈殿物をフェニルセファロー
スＣＬ−４Ｂカラムに装填する。このカラムは硫酸アン
モニウム（ＡＳ）濃度を５００ｍＭから全く含まないも
のまで順次５００ｍＭ ＡＳ：１５０ｍｌ、２００ｍＭ
ＡＳ：５０ｍｌ、１００ｍＭ ＡＳ：１５０ｍｌ、Ａ
Ｓ：なし１２０ｍｌ、と段階毎に減らした１０ｍＭトリ
スＨＣｌ緩衝液を用い室温で溶出した。
【００３１】而して、溶出液を１０ｍｌづつ分画する。
各分画液より、１０μｌづつサンプルを採取し、これと
５倍稀釈したバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）試薬（Pr
otein Assay Bio-Rad）５０μｌを混合し、マイクロプ
レートリーダーで６００ｎｍの吸光度を測定する。その
溶出パターンの例を図２に示す。図２において、例えば
ＭＰＢ６４のピークはＭＰＢが含まれる最も大きな蛋白
のピークの後に現れると、既に発表されているので、Ｍ
ＰＢ６４を精製する場合、ＭＰＢ６４が含まれる分画の
推定は、溶出パターン及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分
子量によるＭＰＢ６４の検出を行い、これらが含まれて
いる分画を選択する。第２段階においては、一つ以上の
分画にわたり、目的の蛋白質があるときは、これら複数
箇の分画を選択する。
各分画液より、１０μｌづつサンプルを採取し、これと
５倍稀釈したバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）試薬（Pr
otein Assay Bio-Rad）５０μｌを混合し、マイクロプ
レートリーダーで６００ｎｍの吸光度を測定する。その
溶出パターンの例を図２に示す。図２において、例えば
ＭＰＢ６４のピークはＭＰＢが含まれる最も大きな蛋白
のピークの後に現れると、既に発表されているので、Ｍ
ＰＢ６４を精製する場合、ＭＰＢ６４が含まれる分画の
推定は、溶出パターン及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分
子量によるＭＰＢ６４の検出を行い、これらが含まれて
いる分画を選択する。第２段階においては、一つ以上の
分画にわたり、目的の蛋白質があるときは、これら複数
箇の分画を選択する。
【００３２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの具体的な方法として
は、グラジエントゲルとして１０乃至２０％ポリアクリ
ルアミドゲルでマルチゲル・キット（日本,東京,日本第
一製薬株式会社製、）を用い４０ｍＡで、標準の蛋白質
例えばＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０と一緒に銀染色試薬で蛋
白質を染色して、標準の蛋白質と対応した蛋白質を含む
分画を選択する。目的の蛋白質例えばＭＰＢ６４を含む
分画をアミコンＹＳ−３メンブレンを通して濃縮する。
は、グラジエントゲルとして１０乃至２０％ポリアクリ
ルアミドゲルでマルチゲル・キット（日本,東京,日本第
一製薬株式会社製、）を用い４０ｍＡで、標準の蛋白質
例えばＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０と一緒に銀染色試薬で蛋
白質を染色して、標準の蛋白質と対応した蛋白質を含む
分画を選択する。目的の蛋白質例えばＭＰＢ６４を含む
分画をアミコンＹＳ−３メンブレンを通して濃縮する。
【００３３】濃縮物はスライド−Ａ−ライザー・カセッ
ト（米国,イリノイ州,ロックフォード,ピアス製、）に
入れ、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で４℃
で一昼夜透析する。透析した原料はミリポア・ミレック
スＧＶフィルター（０．２２μｍ）を通し、蛋白量はロ
ーリー法により定量した。
ト（米国,イリノイ州,ロックフォード,ピアス製、）に
入れ、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で４℃
で一昼夜透析する。透析した原料はミリポア・ミレック
スＧＶフィルター（０．２２μｍ）を通し、蛋白量はロ
ーリー法により定量した。
【００３４】第３段階(尿素を含むＤＥＡＥ−セファロ
ースカラムによる精製） ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍ
ｍ、容積７５ｍｌ）を用い、これを３Ｍ尿素を含む３０
ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで
平衡化した。第２段階からの濃縮物を前記ＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラムに供給し、前記平衡化に用い
たのと同じ成分の緩衝液に濃度勾配をもったＮａＣｌ
（０乃至２００ｍＭ）を加えて溶出する。
ースカラムによる精製） ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍ
ｍ、容積７５ｍｌ）を用い、これを３Ｍ尿素を含む３０
ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで
平衡化した。第２段階からの濃縮物を前記ＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラムに供給し、前記平衡化に用い
たのと同じ成分の緩衝液に濃度勾配をもったＮａＣｌ
（０乃至２００ｍＭ）を加えて溶出する。
【００３５】４℃で１分間に０．５ｍｌの溶出速度とし
て、溶出液をそれぞれ５ｍｌの分画を４６乃至１００分
画する。この各分画を第２段階と同様の方法により、バ
イオラッド試薬を用い６００ｎｍの吸光度を測定する。
その結果は図４に示す通りである。また分画のサンプル
は第２段階と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的の蛋白質例え
ばＭＰＢ６４を検出し、これに対応する分画を選択し、
第２段階と同様に濃縮、透析、及び濾過を行い、目的の
濃縮物を得る。前述の透析の過程において、溶出時に添
加した尿素成分は除去される。蛋白量も前記第３段階と
同様の方法により定量する。
て、溶出液をそれぞれ５ｍｌの分画を４６乃至１００分
画する。この各分画を第２段階と同様の方法により、バ
イオラッド試薬を用い６００ｎｍの吸光度を測定する。
その結果は図４に示す通りである。また分画のサンプル
は第２段階と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的の蛋白質例え
ばＭＰＢ６４を検出し、これに対応する分画を選択し、
第２段階と同様に濃縮、透析、及び濾過を行い、目的の
濃縮物を得る。前述の透析の過程において、溶出時に添
加した尿素成分は除去される。蛋白量も前記第３段階と
同様の方法により定量する。
【００３６】第４段階（セファクリルカラムによる精
製） セファクリルＳ２００ＨＲカラム（直径２５ｍｍ、容積
４５０ｍｌ）を低温で１０％エチレングリコール及び
０．３ＭＮａＣｌを含む５００ｍｌの１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化する。第３段階で
得た濃縮物を前記セファクリルＳ２００ＨＲカラムに供
給し、前記平衡化に用いた同じ緩衝液で１分間に０．５
ｍｌの溶出速度で溶出し、順次分画容器に５ｍｌずつ４
６乃至１００に分画し、各分画からのサンプルを第２段
階のバイオラッド試薬の代わりにＢＣＡ蛋白分析試薬
（米国，イリノイ州，ロックフォード，ピアス社製）を
用い、第３段階と同様の方法により、５６２ｎｍの吸光
度測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥでによって、目的の蛋白質を
検出し、此れに対応する分画を選択する（図４参照）。
製） セファクリルＳ２００ＨＲカラム（直径２５ｍｍ、容積
４５０ｍｌ）を低温で１０％エチレングリコール及び
０．３ＭＮａＣｌを含む５００ｍｌの１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化する。第３段階で
得た濃縮物を前記セファクリルＳ２００ＨＲカラムに供
給し、前記平衡化に用いた同じ緩衝液で１分間に０．５
ｍｌの溶出速度で溶出し、順次分画容器に５ｍｌずつ４
６乃至１００に分画し、各分画からのサンプルを第２段
階のバイオラッド試薬の代わりにＢＣＡ蛋白分析試薬
（米国，イリノイ州，ロックフォード，ピアス社製）を
用い、第３段階と同様の方法により、５６２ｎｍの吸光
度測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥでによって、目的の蛋白質を
検出し、此れに対応する分画を選択する（図４参照）。
【００３７】このときのゲルの染色はＣＢＢで染色した
後、より感度の高い銀染色することが好ましい。目的の
蛋白質を含む分画を集め、アミコンＹＭ−３メンブレン
で濃縮し、４℃で１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．７）中で一昼夜透析する。更にこれを０．４５μｍ
のミリポアフィルターで濾過する。回収した蛋白量はロ
ーリー法で評価する。
後、より感度の高い銀染色することが好ましい。目的の
蛋白質を含む分画を集め、アミコンＹＭ−３メンブレン
で濃縮し、４℃で１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．７）中で一昼夜透析する。更にこれを０．４５μｍ
のミリポアフィルターで濾過する。回収した蛋白量はロ
ーリー法で評価する。
【００３８】第５段階（尿素を含まないＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラムによる精製） 精製の最終段階に於いては、尿素を含まない５０ｍＭの
ＮａＣｌを含む３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．７）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
カラムに、段階４によって回収した蛋白質を供給し、４
℃で５０乃至１００ｍＭの濃度勾配のＮａＣｌを含む５
００ｍｌの３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で、１分間に
０．５ｍｌの溶出速度で溶出し、順次５ｍｌずつ分４６
乃至１００に画する（図５参照）。
ァロースカラムによる精製） 精製の最終段階に於いては、尿素を含まない５０ｍＭの
ＮａＣｌを含む３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．７）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
カラムに、段階４によって回収した蛋白質を供給し、４
℃で５０乃至１００ｍＭの濃度勾配のＮａＣｌを含む５
００ｍｌの３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で、１分間に
０．５ｍｌの溶出速度で溶出し、順次５ｍｌずつ分４６
乃至１００に画する（図５参照）。
【００３９】目的の蛋白質の検出は第３段階と同様の方
法で６００ｎｍの吸光度及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで行う。
前段階同様に目的の蛋白質を含む分画を集め、濃縮し、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で透析
し、ミリポアミレックス−ＧＶフィルター（０．２２μ
ｍミリポアＣｏ．）で濾過する。最終回収蛋白量はロー
リー法で測定する。
法で６００ｎｍの吸光度及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで行う。
前段階同様に目的の蛋白質を含む分画を集め、濃縮し、
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で透析
し、ミリポアミレックス−ＧＶフィルター（０．２２μ
ｍミリポアＣｏ．）で濾過する。最終回収蛋白量はロー
リー法で測定する。
【００４０】前述の実施の形態においては、主として、
ＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０の単離に就いて説明したが、
他の有用な蛋白質を同時に単離する方法も前記請求項１
乃至請求項５の発明に含まれる。これら数種の蛋白質を
単離する場合は、第２段階で数種の蛋白質をそれぞれに
分離した後の単離は各蛋白質毎に並行して、行なうこと
は勿論である。つまり、複数の蛋白質を同時並行的に精
製することになる。
ＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０の単離に就いて説明したが、
他の有用な蛋白質を同時に単離する方法も前記請求項１
乃至請求項５の発明に含まれる。これら数種の蛋白質を
単離する場合は、第２段階で数種の蛋白質をそれぞれに
分離した後の単離は各蛋白質毎に並行して、行なうこと
は勿論である。つまり、複数の蛋白質を同時並行的に精
製することになる。
【００４１】前記の第３段階及び第５段階において、溶
出に使用する緩衝液の添加物の濃度は濃度勾配のあるも
のを説明したが４乃至１０段階に分けた段階的な添加物
の濃度差のものを順次供給する方法もこの実施の形態に
含まれる。
出に使用する緩衝液の添加物の濃度は濃度勾配のあるも
のを説明したが４乃至１０段階に分けた段階的な添加物
の濃度差のものを順次供給する方法もこの実施の形態に
含まれる。
【００４２】実施の形態２ 請求項６記載の物の発明の実施の形態であり、前記の実
施の形態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、
ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５のうちの一種を
そのまま瓶又はアンプルに不活性ガスと共に密封し製品
とする。
施の形態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、
ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５のうちの一種を
そのまま瓶又はアンプルに不活性ガスと共に密封し製品
とする。
【００４３】実施の形態３ 請求項７記載の物の発明の実施の形態であり、実施の形
態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５のうちの一種１５ｍｇ
に対し、リン酸緩衝液２ｍｌに溶解し、これに親水性軟
膏０．５ｇ乃至１．５ｇ及びトラガカントゴム粉末少量
（０．０２乃至０．０５ｇ）とを混合し、内径８ｍｍ乃
至１１ｍｍの扁平容器に密封したもの。前記の各成分、
重量及び容量は一例であって限定的な意味はない。
態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５のうちの一種１５ｍｇ
に対し、リン酸緩衝液２ｍｌに溶解し、これに親水性軟
膏０．５ｇ乃至１．５ｇ及びトラガカントゴム粉末少量
（０．０２乃至０．０５ｇ）とを混合し、内径８ｍｍ乃
至１１ｍｍの扁平容器に密封したもの。前記の各成分、
重量及び容量は一例であって限定的な意味はない。
【００４４】実施の形態４ 請求項８記載の物の発明の実施の形態であり、実施の形
態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５のうちの一種に、リン
酸緩衝液２ｍｌに溶解し、グリセリン１ｍｌ、及び／又
はポリエチレングリコール１０％に混合し、皮膚に貼付
してアレルギー反応をテストするパッチテスト（Patch
・test）用絆創膏又はアルミニウム皿の中に濾紙が入れ
てある前記アルミニウム皿の中に、前記蛋白質よりなる
抗原をたらし、この抗原を含浸した前記濾紙を皮膚に貼
付して使用する所謂フインチャンバーに５乃至２０μｌ
含浸させたものを、プラスチック容器又は気密性袋に密
封したもの
態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ
７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５のうちの一種に、リン
酸緩衝液２ｍｌに溶解し、グリセリン１ｍｌ、及び／又
はポリエチレングリコール１０％に混合し、皮膚に貼付
してアレルギー反応をテストするパッチテスト（Patch
・test）用絆創膏又はアルミニウム皿の中に濾紙が入れ
てある前記アルミニウム皿の中に、前記蛋白質よりなる
抗原をたらし、この抗原を含浸した前記濾紙を皮膚に貼
付して使用する所謂フインチャンバーに５乃至２０μｌ
含浸させたものを、プラスチック容器又は気密性袋に密
封したもの
【００４５】
【発明の効果】請求項１記載の発明においては、ＢＣＧ
菌培養後の使用培養液の利用であるから、産業廃棄物の
有効利用であり、前記使用済み培養液を４０°乃至４５
°に加温することによって、この培養液の粘稠が著しく
低下するため、濾紙を通り易くなり、処理時間が短くな
り、殊に使用済培養液に含まれる粘稠度の高いグリセー
ルが除去され、以後の取扱が容易になる。またこの程度
の加温では蛋白質の力価の劣化を来さない。
菌培養後の使用培養液の利用であるから、産業廃棄物の
有効利用であり、前記使用済み培養液を４０°乃至４５
°に加温することによって、この培養液の粘稠が著しく
低下するため、濾紙を通り易くなり、処理時間が短くな
り、殊に使用済培養液に含まれる粘稠度の高いグリセー
ルが除去され、以後の取扱が容易になる。またこの程度
の加温では蛋白質の力価の劣化を来さない。
【００４６】請求項２記載の発明においては、ＤＥＡＥ
セフアロースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として
３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）で平衝化した後、同様の尿素を含む緩衝液にＮ
ａＣｌを０から２００ｍＭまで濃度を次第に高めなが
ら、濃度の低い方から順に供給して、目的の蛋白質を溶
出することによって、蛋白質に結合若しくは取り囲まれ
ている不純物が除去され、また、溶出中において、溶出
液の中性を保持し、かつその直後の透析及び濾別によ
り、前記尿素は精製蛋白質から除去され、蛋白質に尿素
による非可逆的な変性をもたらす影響を最小限に抑制す
る。
セフアロースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として
３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）で平衝化した後、同様の尿素を含む緩衝液にＮ
ａＣｌを０から２００ｍＭまで濃度を次第に高めなが
ら、濃度の低い方から順に供給して、目的の蛋白質を溶
出することによって、蛋白質に結合若しくは取り囲まれ
ている不純物が除去され、また、溶出中において、溶出
液の中性を保持し、かつその直後の透析及び濾別によ
り、前記尿素は精製蛋白質から除去され、蛋白質に尿素
による非可逆的な変性をもたらす影響を最小限に抑制す
る。
【００４７】請求項３記載の方法においては、前記請求
項１及び請求項２記載の発明の効果の外、第２段階の方
法を採用することにより、有用な蛋白質を一種又は二種
以上の蛋白質に分画することができる。更に、第３段階
以降の方法により、それぞれの蛋白質の純度を向上させ
る効果を有する。それぞれ単離された蛋白質は標準の蛋
白質と比較して、同一のものと同定され、純度も標準の
ものと同程度のものがそれぞれ得られる。
項１及び請求項２記載の発明の効果の外、第２段階の方
法を採用することにより、有用な蛋白質を一種又は二種
以上の蛋白質に分画することができる。更に、第３段階
以降の方法により、それぞれの蛋白質の純度を向上させ
る効果を有する。それぞれ単離された蛋白質は標準の蛋
白質と比較して、同一のものと同定され、純度も標準の
ものと同程度のものがそれぞれ得られる。
【００４８】その他、前記に例示していないが、前記の
使用済み濾液に含まれる他の防御抗原物質、ツベルクリ
ン（tuberculn)、またミコバクテリア(mycobacteria)の
共通抗原などを含む他のミコバクテリア抗原の精製にも
適用し得る
使用済み濾液に含まれる他の防御抗原物質、ツベルクリ
ン（tuberculn)、またミコバクテリア(mycobacteria)の
共通抗原などを含む他のミコバクテリア抗原の精製にも
適用し得る
【００４９】請求項４項記載の発明においては、請求項
１乃至請求項３の効果の外単離する蛋白質がＭＰＢ６４
であるから、単離されたＭＰＢ６４は、他のＭＰＢ７０
と組み合わせて、結核の感染及びＢＣＧ陽性を区別して
判断し得ることができる。
１乃至請求項３の効果の外単離する蛋白質がＭＰＢ６４
であるから、単離されたＭＰＢ６４は、他のＭＰＢ７０
と組み合わせて、結核の感染及びＢＣＧ陽性を区別して
判断し得ることができる。
【００５０】請求項５記載の発明においては、請求項１
乃至請求項４記載の効果の外単離する蛋白質がＭＰＢ５
９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８
５のうちの２種以上の蛋白質を第２段階乃至第５段階の
方法により同時間帯に並行して行なう方法であるから、
単一の出発物質から有効に２種以上の蛋白質を効率よ
く、それぞれ単離できる効果を有する。
乃至請求項４記載の効果の外単離する蛋白質がＭＰＢ５
９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８
５のうちの２種以上の蛋白質を第２段階乃至第５段階の
方法により同時間帯に並行して行なう方法であるから、
単一の出発物質から有効に２種以上の蛋白質を効率よ
く、それぞれ単離できる効果を有する。
【００５１】請求項６記載の発明においては、前述の通
りの構成であるからＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７
０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５がそれぞれ単味で密封さ
れたものであるから従来のツベルクリン反応試薬と同様
に適宜の稀釈剤で稀釈して、人間及び動物の皮膚に塗布
又は皮内注射などに使用できる。また適宜の親水性軟膏
剤、グリセリン、ポリエチレングリコールなどと混練し
て、軟膏として皮膚に塗布して反応試薬として使用する
ことも容易にできる。請求項７記載の発明においては、
請求項６記載の発明の効果の外既に軟膏となっているか
ら取扱いが容易で、皮膚に長時間塗着させ易い。請求項
８記載の発明においては、請求項８記載の効果の外更に
絆創膏になっているから、そのまま皮膚に貼付できる。
りの構成であるからＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７
０、ＭＰＢ８０及びＭＰＢ８５がそれぞれ単味で密封さ
れたものであるから従来のツベルクリン反応試薬と同様
に適宜の稀釈剤で稀釈して、人間及び動物の皮膚に塗布
又は皮内注射などに使用できる。また適宜の親水性軟膏
剤、グリセリン、ポリエチレングリコールなどと混練し
て、軟膏として皮膚に塗布して反応試薬として使用する
ことも容易にできる。請求項７記載の発明においては、
請求項６記載の発明の効果の外既に軟膏となっているか
ら取扱いが容易で、皮膚に長時間塗着させ易い。請求項
８記載の発明においては、請求項８記載の効果の外更に
絆創膏になっているから、そのまま皮膚に貼付できる。
【００５２】実験例１ 実施の形態１の方法により、８日間ＢＣＧ菌を培養した
直後の培養液１００リッターを用い、ＭＰＢ６４を単離
した場合最終の第５段階において、単離したＭＰＢ６４
を５ｍｇ得た。而して、得られたＭＰＢ６４及びＭＰＢ
７０をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＭＰＢ６４及び抗Ｍ
ＰＢ７０抗体を用いたイムノブロッテイング法で試験し
たところ、それぞれ標準ＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０と同
じ反応を示した。
直後の培養液１００リッターを用い、ＭＰＢ６４を単離
した場合最終の第５段階において、単離したＭＰＢ６４
を５ｍｇ得た。而して、得られたＭＰＢ６４及びＭＰＢ
７０をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＭＰＢ６４及び抗Ｍ
ＰＢ７０抗体を用いたイムノブロッテイング法で試験し
たところ、それぞれ標準ＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０と同
じ反応を示した。
【００５３】実験例２ また、実施の態様１によりＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０と
をそれぞれ単離し、この二種の蛋白質を組み合わせて、
それぞれ結核菌に感染させたモルモット及びＢＣＧ菌を
接種したモルモットを用意して実験したところ、ＢＣＧ
接種によりツベルクリン陽転したモルモットはＭＰＢ６
４及びＭＰＢ７０に対して陽性の反応を示し、結核菌に
感染したものはＭＰＢ６４に対しては陽性であるが、Ｍ
ＰＢ７０に対しては陰性であった。以上の結果から結核
感染かＢＣＧ陽転かが容易に判別できた。
をそれぞれ単離し、この二種の蛋白質を組み合わせて、
それぞれ結核菌に感染させたモルモット及びＢＣＧ菌を
接種したモルモットを用意して実験したところ、ＢＣＧ
接種によりツベルクリン陽転したモルモットはＭＰＢ６
４及びＭＰＢ７０に対して陽性の反応を示し、結核菌に
感染したものはＭＰＢ６４に対しては陽性であるが、Ｍ
ＰＢ７０に対しては陰性であった。以上の結果から結核
感染かＢＣＧ陽転かが容易に判別できた。
【００５４】実験例３ ＭＰＢ５９はツベルクリン反応と同様の効果があり、Ｍ
ＰＢ８０及びＭＰＢ８５についてはこれを含む蛋白質に
対し、アレルギーがあるか否かのテストに使用できた。
これの実験より人及び牛の結核感染の判断に有効に使用
し得るものである。
ＰＢ８０及びＭＰＢ８５についてはこれを含む蛋白質に
対し、アレルギーがあるか否かのテストに使用できた。
これの実験より人及び牛の結核感染の判断に有効に使用
し得るものである。
【図１】２Ｄ−Ｅ（２次元電気永動）による各種蛋白質
の等電点、分子量の分布図である。
の等電点、分子量の分布図である。
【図２】第２段階における各分画の蛋白量による吸光度
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
【図３】第３段階における各分画の蛋白量による吸光度
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
【図４】第４段階における各分画の蛋白量による吸光度
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
【図５】第５段階における各分画の蛋白量による吸光度
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を
示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 芳賀 伸治 神奈川県川崎市高津区梶ケ谷３丁目８番40 号 (72)発明者 永井 定 大阪府豊中市上野西４丁目５番54号
Claims (8)
- 【請求項１】ＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液を性
質のことなるカラムを用い、前記出発物質を装填し、緩
衝液により溶出して、順次複数箇に分画し、この中より
単離すべき蛋白質を含む分画を選択し、この分画液を濃
縮した後透析するカラム精製方法を、異なる性質のカラ
ムを用い異なる成分を含有する緩衝液により前記同様の
カラム精製方法を少なくとも２回行い、目的の蛋白質を
精製する方法において、 前記カラム精製方法の前処理として、前記使用済み培養
液を４０乃至４５℃に加温し、これを濾紙により、先ず
残存ＢＣＧ東京菌を除去し、次いで分子量約５０００以
下の蛋白質及び培養液成分を濾別除去し、前記使用済み
培養液を濃縮し、 次いで、この濃縮液に硫酸アンモニウム（以下単にＡ
Ｓ）を６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分
離により前記全蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を
次工程に供給することを特徴とするＢＣＧ菌短期培養後
の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法。 - 【請求項２】前記カラム精製方法の２番目の段階のカラ
ム精製方法において、カラムとして、ＤＥＡＥセファロ
ースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として、３Ｍ
（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）５００ｍｌで平衡化して、カラム精製方法の前処理
後の蛋白質を供給し、前記と同一の緩衝液にＮａＣｌを
０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を
連続的に次第に高めながら濃度の低い方から順に供給
し、溶出速度を０．５ｍｌ／分として、数区分に分画
し、目的蛋白質を含む分画を選択し、 次いで、選択された分画蛋白質を濃縮し、次いで透析す
る過程において前記尿素を分離する方法であることを特
徴とするＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液より蛋白
質を単離する方法。 - 【請求項３】ａ．第１段階（前処理工程） ＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液を４０乃至４５℃
に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を
除去し、次いで分子量約５０００以下の蛋白質及び培養
液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を１／２００
乃至１／３５０に濃縮し、次いで、この濃縮液にＡＳを
６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離によ
り蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給
する。 ｂ．カラム精製工程 第２段階 第１段階による蛋白質をフェニル・セファロースＣＬ−
４Ｂカラム（直径２５ｍｍ、容積８０ｍｌ）に装填し、
ＡＳを含む１０ｍＭトリス塩酸（ＨＣｌ）緩衝液を、前
記ＡＳ濃度を順に５００ｍＭのＡＳ含有のものから、全
く含まないものまで段階的乃至連続的にＡＳ濃度を低め
ながら、全量で４５０乃至６００ｍｌ供給し、溶出液を
順次１０ｍｌずつ分画する。各分画より１０μｌずつサ
ンプリングしたものにバイオ−ラッドプロテインアッセ
イ試薬５０μｌを混合し、吸光度を測定し、溶出パター
ンを求め、更に電気泳動により、目的の分子量の蛋白質
が含まれる分画を選択し、この分画の溶出液を濃縮し、
更に透析する。 第３段階 前記第２段階で濃縮した液を、３Ｍ尿素で平衡化したＤ
ＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍｍ、
容量７５ｍｌ）を用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌ
の含有濃度を連続的に高めながら供給し、溶出速度を
０．５ｍｌ／分として、溶出液を分画する。次いで第２
段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求めて、
目的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された
分画蛋白質を濃縮・透析し、濃縮蛋白質液とする。 第４段階 前段階で得られた濃縮蛋白質液を１０％エチレングリコ
ール（ＥＧ）０．３Ｍ及びＮａＣｌを含む５００ｍｌの
１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したセファク
リルＳ２００ＨＲカラムを用い、平衡化に用いたのと同
じ緩衝液で溶出し、順次分画する。次いで第３段階と同
様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目的の蛋白
質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質
を濃縮し、透析し濃縮蛋白質液とする。 第５段階 第４段階の濃縮蛋白質液を尿素を含まないＤＥＡＥセフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラムを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．７）５００ｍｌで平衡化したものを用
い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）にＮ
ａＣｌを５０ｍＭ乃至１００ｍＭまで連続的に濃度を上
昇させた溶出液で溶出し、順次分画する。次ぎに前段階
と同様の方法により分画を選択し、濃縮及び透析し、目
的の蛋白質を得る。以上第１段階乃至第５段階よりなる
ことを特徴とするＢＣＧ菌短期培養後の使用済み培養液
より蛋白質を単離する方法。 - 【請求項４】前記目的蛋白質はＭＰＢ６４であることを
特徴とする請求項３記載の発明のＢＣＧ培養後の使用済
み培養液より蛋白質を単離する方法。 - 【請求項５】前記目的蛋白質はＭＰＢ５９、ＭＰＢ６
４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５であり、
これら内、２種以上の蛋白質を前記以上第２段階乃至第
５段階において、同時間帯に並行して単離する方法であ
ることを特徴とするＢＣＧ培養後の使用済み培養液より
蛋白質を単離することを特徴とする請求項３記載の発明
のＢＣＧ培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する
方法。 - 【請求項６】前記請求項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰ
Ｂ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のう
ちの一種をその侭乃至凍結乾燥してあることを特徴とす
る遅延型過敏反応測定用試薬。 - 【請求項７】前記請求項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰ
Ｂ６４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のう
ちの一種と軟膏剤とが混合してあることを特徴とする軟
膏状の遅延型過敏反応測定用試薬。 - 【請求項８】請求項４で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６
４、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８０、及びＭＰＢ８５のうちの
一種１５ｍｇに対し、リン酸緩衝液２ｍｌの割合で溶解
し、親水性軟膏剤１ｇ及びトラガカントゴム粉末０．０
４ｇの割合で混合したものに更にグリセリン１ｍｌの割
合で混合したものがパッチテスト用絆創膏に含浸させて
あることを特徴とする遅延型過敏反応測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03420996A JP3624389B2 (ja) | 1996-01-30 | 1996-01-30 | Ｂｃｇ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03420996A JP3624389B2 (ja) | 1996-01-30 | 1996-01-30 | Ｂｃｇ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09206092A true JPH09206092A (ja) | 1997-08-12 |
| JP3624389B2 JP3624389B2 (ja) | 2005-03-02 |
Family
ID=12407780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03420996A Expired - Fee Related JP3624389B2 (ja) | 1996-01-30 | 1996-01-30 | Ｂｃｇ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3624389B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6979450B2 (en) | 1998-02-06 | 2005-12-27 | Japan Bcg Laboratory | Method and compositions for detection and diagnosis of infectious diseases |
-
1996
- 1996-01-30 JP JP03420996A patent/JP3624389B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6979450B2 (en) | 1998-02-06 | 2005-12-27 | Japan Bcg Laboratory | Method and compositions for detection and diagnosis of infectious diseases |
| US7655218B2 (en) | 1998-02-06 | 2010-02-02 | Japan Bcg Laboratory | Methods and compositions for detection and diagnosis of infectious diseases |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3624389B2 (ja) | 2005-03-02 |
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