JPH09210987A - 物質の発熱性検査方法 - Google Patents
物質の発熱性検査方法Info
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- JPH09210987A JPH09210987A JP8137713A JP13771396A JPH09210987A JP H09210987 A JPH09210987 A JP H09210987A JP 8137713 A JP8137713 A JP 8137713A JP 13771396 A JP13771396 A JP 13771396A JP H09210987 A JPH09210987 A JP H09210987A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 広範囲にわたる物質の発熱性を簡単且つ低コ
ストで検査する。 【解決手段】 物質を血液に接触させ、内因性発熱物の
生成及び遊離を検出する。血液の凝固を遅延又は抑制す
る成分、培養媒体又は生理食塩水を包含する希釈剤を併
用できる。内因性発熱物としてインターレウキン１、イ
ンターレウキン６、腫瘍壊死因子又はプロスタグラジン
Ｅ2を用い得る。
ストで検査する。 【解決手段】 物質を血液に接触させ、内因性発熱物の
生成及び遊離を検出する。血液の凝固を遅延又は抑制す
る成分、培養媒体又は生理食塩水を包含する希釈剤を併
用できる。内因性発熱物としてインターレウキン１、イ
ンターレウキン６、腫瘍壊死因子又はプロスタグラジン
Ｅ2を用い得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、物質の発熱性検査
方法に関する。
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】物質が人体の組織、体液又は細胞に接触
した時に、その物質自体に発熱性があることにより、あ
るいはその物質が発熱性成分を含んでいることにより、
発熱することは良く知られている。そのような潜在的危
険性を有する物質としては、特に血液代剤や血液交換剤
のような、吸入、注射又は注入される製品等の医薬品、
ディスパージョンのような異なる物理相のプラスチッ
ク、化粧品、膜あるいは義歯のような医療用具がある。
栄養剤でさえ発熱性を示す可能性がある。
した時に、その物質自体に発熱性があることにより、あ
るいはその物質が発熱性成分を含んでいることにより、
発熱することは良く知られている。そのような潜在的危
険性を有する物質としては、特に血液代剤や血液交換剤
のような、吸入、注射又は注入される製品等の医薬品、
ディスパージョンのような異なる物理相のプラスチッ
ク、化粧品、膜あるいは義歯のような医療用具がある。
栄養剤でさえ発熱性を示す可能性がある。
【０００３】人体の組織、細胞又は体液との接触によっ
て発熱作用を起こす物質は、通常、その物質が有する発
熱性部分による潜在的内因性起源とは別の、外因性の発
熱作用を起こす物質として定義される。この意味で、後
述する説明では、本発明の発熱性検査方法の対象とし
て、「外因性発熱性物質」又は「外因性発熱作用を有す
る物質」で表される物質が用いられる。
て発熱作用を起こす物質は、通常、その物質が有する発
熱性部分による潜在的内因性起源とは別の、外因性の発
熱作用を起こす物質として定義される。この意味で、後
述する説明では、本発明の発熱性検査方法の対象とし
て、「外因性発熱性物質」又は「外因性発熱作用を有す
る物質」で表される物質が用いられる。
【０００４】発熱性検査の必要性は広く認識されてい
る。安全性を確認し、汚染されている可能性のあるロッ
トを特定するために、動物実験による継続的な個別検査
が法的に求められている。
る。安全性を確認し、汚染されている可能性のあるロッ
トを特定するために、動物実験による継続的な個別検査
が法的に求められている。
【０００５】発熱を起こす物質の中で最も良く説明され
ているのは、グラム陰性微生物の細菌壁から出る内毒
素：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（リポ多糖類：Ｌｉｐｏｐｏｌ
ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ＬＰＳ）である（Ｍｏｌｔ
ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａ
ｖ．Ｒｅｖ．（１９９３）， １７． ２３７−２６
９； Ｔｉｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｓｙｃｈｏ
ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １９９４，
１９， ２０９−２３２； Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｃｒｉ
ｔ．Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，８，
１−１０； Ｚｅｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｒｏｔ
ｈ，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９
３，２８，１０６−１０９）。したがって、一般的に兎
を用いて行われる動物実験を、直接内毒素試験（リムル
ス試験：Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｓｓａｙ，ＬＡＬ）に置き
換えることは自明であった。
ているのは、グラム陰性微生物の細菌壁から出る内毒
素：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ（リポ多糖類：Ｌｉｐｏｐｏｌ
ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ＬＰＳ）である（Ｍｏｌｔ
ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａ
ｖ．Ｒｅｖ．（１９９３）， １７． ２３７−２６
９； Ｔｉｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｓｙｃｈｏ
ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １９９４，
１９， ２０９−２３２； Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｃｒｉ
ｔ．Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，８，
１−１０； Ｚｅｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｒｏｔ
ｈ，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９
３，２８，１０６−１０９）。したがって、一般的に兎
を用いて行われる動物実験を、直接内毒素試験（リムル
ス試験：Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｓｓａｙ，ＬＡＬ）に置き
換えることは自明であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】このような試験には必
然的に制約がある。すなわち、潜在的発熱物として内毒
素しか検出されず、同様に発熱を起こし得る白血球：Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ等のその他の刺激物が検出されない。
また、上記試験は、血液又は血液成分中に存在する、内
毒素と結合する成分により妨害を受ける（Ｈａｒｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１
９９１，１１８，１８６−１９３； Ｅｍａｎｃｉｐａ
ｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，
６０，１９９２，５９６−６０１； Ｒｅａｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，１９９３，１４，
１２５−１２９）。内毒素と結合する成分の中には、リ
ムルス試験においてリポ多糖類の検出を阻止する一方
で、その反対に、主な発熱性反応である白血球との反応
を強化する。血液製品の発熱性検査は必然的に極めて頻
繁に行われるケースである。一方、リムルス試験は極め
て感度が高く、その製品の品質に対応しない不純物によ
り誤って陽性の結果となり易い（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，１９９
０，１１０，３３２−３４０）。
然的に制約がある。すなわち、潜在的発熱物として内毒
素しか検出されず、同様に発熱を起こし得る白血球：Ｌ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ等のその他の刺激物が検出されない。
また、上記試験は、血液又は血液成分中に存在する、内
毒素と結合する成分により妨害を受ける（Ｈａｒｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１
９９１，１１８，１８６−１９３； Ｅｍａｎｃｉｐａ
ｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，
６０，１９９２，５９６−６０１； Ｒｅａｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，１９９３，１４，
１２５−１２９）。内毒素と結合する成分の中には、リ
ムルス試験においてリポ多糖類の検出を阻止する一方
で、その反対に、主な発熱性反応である白血球との反応
を強化する。血液製品の発熱性検査は必然的に極めて頻
繁に行われるケースである。一方、リムルス試験は極め
て感度が高く、その製品の品質に対応しない不純物によ
り誤って陽性の結果となり易い（Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，１９９
０，１１０，３３２−３４０）。
【０００７】一方、兎を用いた動物実験もまた問題があ
る。刺激に対する免疫反応（発熱反応）は、動物種によ
り非常に大きい違いがある。兎が他の哺乳類あるいは人
を代表するか否かは不明である。なぜなら、内毒素の感
度は様々な種において１００００もの因子によって異な
ることが知られているからである。他の発熱性成分につ
いては、そのような比較できる検討がなされていない。
る。刺激に対する免疫反応（発熱反応）は、動物種によ
り非常に大きい違いがある。兎が他の哺乳類あるいは人
を代表するか否かは不明である。なぜなら、内毒素の感
度は様々な種において１００００もの因子によって異な
ることが知られているからである。他の発熱性成分につ
いては、そのような比較できる検討がなされていない。
【０００８】本発明の目的は、広範囲にわたる種々の物
質の発熱性を検出することができる方法を提供すること
にある。この方法は簡単且つ低コストで行える。他の利
点は特に後述する適用例により明らかとなる。
質の発熱性を検出することができる方法を提供すること
にある。この方法は簡単且つ低コストで行える。他の利
点は特に後述する適用例により明らかとなる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題の解決手段は特
許請求の範囲の記載により明らかとなる。
許請求の範囲の記載により明らかとなる。
【００１０】本願の請求項１記載の発明は、物質を血液
に接触させ、内因性発熱物の生成及び遊離を検出するこ
とを特徴とする物質の発熱性検査方法を提供する。
に接触させ、内因性発熱物の生成及び遊離を検出するこ
とを特徴とする物質の発熱性検査方法を提供する。
【００１１】本願の請求項２記載の発明は、血液の凝固
を遅延又は抑制する成分を使用することを特徴とする請
求項１に記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
を遅延又は抑制する成分を使用することを特徴とする請
求項１に記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
【００１２】本願の請求項３記載の発明は、培養媒体又
は生理食塩水等の希釈剤を使用することを特徴とする請
求項１又は２に記載の物質の発熱性検査方法を提供す
る。
は生理食塩水等の希釈剤を使用することを特徴とする請
求項１又は２に記載の物質の発熱性検査方法を提供す
る。
【００１３】本願の請求項４記載の発明は、系内におけ
るインターレウキン１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）
の生成を検出することを特徴とする請求項１ないし３の
いずれかに記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
るインターレウキン１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）
の生成を検出することを特徴とする請求項１ないし３の
いずれかに記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
【００１４】本願の請求項５記載の発明は、インターレ
ウキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）の生成及び遊
離を検出することを特徴とする請求項１ないし３のいず
れかに記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
ウキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）の生成及び遊
離を検出することを特徴とする請求項１ないし３のいず
れかに記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
【００１５】本願の請求項６記載の発明は、腫瘍壊死因
子（Ｔｕｍｏｒ ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ）の生
成及び遊離を検出することを特徴とする請求項１ないし
３のいずれかに記載の物質の発熱性検査方法を提供す
る。
子（Ｔｕｍｏｒ ＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ）の生
成及び遊離を検出することを特徴とする請求項１ないし
３のいずれかに記載の物質の発熱性検査方法を提供す
る。
【００１６】本願の請求項７記載の発明は、プロスタグ
ランジンＥ2（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ2）の生
成及び遊離を検出すること特徴とする請求項１ないし３
のいずれかに記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
ランジンＥ2（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ2）の生
成及び遊離を検出すること特徴とする請求項１ないし３
のいずれかに記載の物質の発熱性検査方法を提供する。
【００１７】本発明の方法の利点は、特に生物学系の使
用により、人体を発熱物に曝した場合の評価と関係付け
ることができる点にある。測定するパラメーターは内因
性の発熱物である。これらは発熱反応を仲介する免疫系
のメッセンジャー物質であり、発熱物が認識された生体
のメッセージを示すものである。この種の物質は、シト
キン：ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、細胞群刺激因子：ｃｏｌｏ
ｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓあるい
は成長因子：ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓが含まれ
る。
用により、人体を発熱物に曝した場合の評価と関係付け
ることができる点にある。測定するパラメーターは内因
性の発熱物である。これらは発熱反応を仲介する免疫系
のメッセンジャー物質であり、発熱物が認識された生体
のメッセージを示すものである。この種の物質は、シト
キン：ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、細胞群刺激因子：ｃｏｌｏ
ｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓあるい
は成長因子：ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓが含まれ
る。
【００１８】最も重要で有名な内因性発熱物は、タンパ
ク質インターレウキン−１：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−
１（ＩＬ−１）及びインターレウキン−６：Ｉｎｔｅｒ
ｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子：Ｔｕｍ
ｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、さ
らにプロスタグランジンＥ2：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄ
ｉｎ Ｅ2（ＰＧＥ2）のような低分子量の脂質媒介物
質：Ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓがある。例えば、
ＩＬ−１、ＩＬ−６又はＴＮＦの日常試験としては、酵
素結合免疫吸着剤試験：ＥＬＩＳＡ （Ｅｎｚｙｍｅ−
Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａ
ｙ）、ＰＧＥ2の日常試験としては酵素免疫試験：ＥＩ
Ａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）があ
る。
ク質インターレウキン−１：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−
１（ＩＬ−１）及びインターレウキン−６：Ｉｎｔｅｒ
ｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子：Ｔｕｍ
ｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、さ
らにプロスタグランジンＥ2：Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄ
ｉｎ Ｅ2（ＰＧＥ2）のような低分子量の脂質媒介物
質：Ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓがある。例えば、
ＩＬ−１、ＩＬ−６又はＴＮＦの日常試験としては、酵
素結合免疫吸着剤試験：ＥＬＩＳＡ （Ｅｎｚｙｍｅ−
Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａ
ｙ）、ＰＧＥ2の日常試験としては酵素免疫試験：ＥＩ
Ａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）があ
る。
【００１９】発熱物の検出のため、血液から分離された
白血球も生物系を代表し得る。しかし、このようなほと
んどの分離方法は物質の日常試験としては手が掛かりす
ぎる。したがって、この目的のためには、健康な人から
得られた鮮血のように、単体成分を分離しない人あるい
は動物の血液を使用する方が試験を容易に行える。血液
中の白血球は自然な構成体及び環境中に存在しており、
発熱物の発熱作用に影響を与え得る全ての漿液成分が存
在している。
白血球も生物系を代表し得る。しかし、このようなほと
んどの分離方法は物質の日常試験としては手が掛かりす
ぎる。したがって、この目的のためには、健康な人から
得られた鮮血のように、単体成分を分離しない人あるい
は動物の血液を使用する方が試験を容易に行える。血液
中の白血球は自然な構成体及び環境中に存在しており、
発熱物の発熱作用に影響を与え得る全ての漿液成分が存
在している。
【００２０】特に利点となるのは、本発明における反応
に影響を与えたり失敗させたりすることなく、最終濃度
０．３８％のクエン酸塩：Ｃｉｔｒａｔｅ又はヘパリ
ン：Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｅｐａｒｉｎａ
ｔｅ）のような血液の凝固を遅延又は抑制する成分を、
培養期間中に血液に添加することができることである。
に影響を与えたり失敗させたりすることなく、最終濃度
０．３８％のクエン酸塩：Ｃｉｔｒａｔｅ又はヘパリ
ン：Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｈｅｐａｒｉｎａ
ｔｅ）のような血液の凝固を遅延又は抑制する成分を、
培養期間中に血液に添加することができることである。
【００２１】血液を例えば細胞培養媒体で希釈したり、
生理食塩水で初期濃度の２０％まで希釈するのが有用で
あることがわかっている。実験機器などの器材や、抗血
栓剤：ａｎｔｉ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓや希薄剤など
の添加物は、発熱を起こさないものである必要があるこ
とは言うまでもない。培養中は、ペニシリン：ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｎ、ストレプトマイシン：ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｉｎ、クロランファニコル：ｃｈｌｏｒａｍｐｈａ
ｎｉｃｏｌ、アンホテリシン：ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉ
ｎあるいはこれらの組合わせなどの予防用の抗生物質も
存在させることができ、これにより関係する汚染が排除
される必要がある。
生理食塩水で初期濃度の２０％まで希釈するのが有用で
あることがわかっている。実験機器などの器材や、抗血
栓剤：ａｎｔｉ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓや希薄剤など
の添加物は、発熱を起こさないものである必要があるこ
とは言うまでもない。培養中は、ペニシリン：ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｎ、ストレプトマイシン：ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｉｎ、クロランファニコル：ｃｈｌｏｒａｍｐｈａ
ｎｉｃｏｌ、アンホテリシン：ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉ
ｎあるいはこれらの組合わせなどの予防用の抗生物質も
存在させることができ、これにより関係する汚染が排除
される必要がある。
【００２２】内因性発熱物が遊離する例としては、グラ
ム陰性又はグラム陽性細菌の細菌壁から遊離される前記
４つの内因性発熱物がある。本発明の方法は内毒素に対
して非常に感度が高く、例えばｐｇ／ｍｌの量で内因性
発熱物を遊離させることができ、その血液の提供者にも
依存しない。陽性対照（陽性コントロール）としては、
グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞壁から遊離した内毒
素又はリポテイコイル酸：ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｌ
ａｃｉｄを用いることができる。陰性対照（陰性コント
ロール）としては、発熱物を含まない生理食塩水が使用
される。
ム陰性又はグラム陽性細菌の細菌壁から遊離される前記
４つの内因性発熱物がある。本発明の方法は内毒素に対
して非常に感度が高く、例えばｐｇ／ｍｌの量で内因性
発熱物を遊離させることができ、その血液の提供者にも
依存しない。陽性対照（陽性コントロール）としては、
グラム陰性又はグラム陽性細菌細胞壁から遊離した内毒
素又はリポテイコイル酸：ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｌ
ａｃｉｄを用いることができる。陰性対照（陰性コント
ロール）としては、発熱物を含まない生理食塩水が使用
される。
【００２３】内毒素に誘発される血液からの内因性発熱
物の遊離の時間経過を検出するために、７人の健康な血
液提供者の血液を細胞培養媒体で１対５に希釈し、１０
μｇ／ｍｌのＬＰＳにより刺激した（図１）。３７℃で
の培養後、市販のＥＬＩＳＡを用いて全ての因子を検出
した（データは平均値±平均標準誤差（ＳＥＭ）であ
る。）。一方、刺激しない血液はこれらのどの因子も遊
離しなかった。検出されたＩＬ−１βの量は、６時間後
にプラトー（高原状態）に達した。検出されたＰＧＥ2
の濃度は、培養２４時間経過後まで継続的に増加した。
また、ＩＬ−６のＬＰＳによる誘発量も同様に増加した
（図示してはいないが、４時間後、１０時間後及び２４
時間後に測定した。）。これらの因子とは異なり、ＴＮ
Ｆの遊離はＬＰＳによる刺激後に約１２時間で最大とな
った。２４時間後も大部分のＴＮＦが検出できたので、
この時間を基準培養時間として選択した。
物の遊離の時間経過を検出するために、７人の健康な血
液提供者の血液を細胞培養媒体で１対５に希釈し、１０
μｇ／ｍｌのＬＰＳにより刺激した（図１）。３７℃で
の培養後、市販のＥＬＩＳＡを用いて全ての因子を検出
した（データは平均値±平均標準誤差（ＳＥＭ）であ
る。）。一方、刺激しない血液はこれらのどの因子も遊
離しなかった。検出されたＩＬ−１βの量は、６時間後
にプラトー（高原状態）に達した。検出されたＰＧＥ2
の濃度は、培養２４時間経過後まで継続的に増加した。
また、ＩＬ−６のＬＰＳによる誘発量も同様に増加した
（図示してはいないが、４時間後、１０時間後及び２４
時間後に測定した。）。これらの因子とは異なり、ＴＮ
Ｆの遊離はＬＰＳによる刺激後に約１２時間で最大とな
った。２４時間後も大部分のＴＮＦが検出できたので、
この時間を基準培養時間として選択した。
【００２４】グラム陰性成分の内毒素とグラム陽性成分
のリポテイコイル酸により誘発された、人の血液中の内
因性発熱物の生成の前記刺激物の濃度依存性を検査する
ために、５人の健康な血液提供者の血液を１対５に希釈
し、それぞれ濃縮状態の内毒素（ＬＰＳ）又はリポテイ
コイル酸（ＬＴＡ）の存在下で２４時間培養した。ＥＬ
ＩＳＡによりシトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を検出
し、データを平均値±ＳＥＭで示した（図２）。実際に
は、最も低濃度すなわち１ｐｇ／ｍｌの内毒素で内因性
発熱物がかなり生成したが、ＬＰＳ及びＬＴＡの溶剤は
何の効果も与えなかった。これらのデータは、人の血液
が極めて感度良く反応し、ＬＰＳ及びＬＴＡに濃度依存
することを示している。
のリポテイコイル酸により誘発された、人の血液中の内
因性発熱物の生成の前記刺激物の濃度依存性を検査する
ために、５人の健康な血液提供者の血液を１対５に希釈
し、それぞれ濃縮状態の内毒素（ＬＰＳ）又はリポテイ
コイル酸（ＬＴＡ）の存在下で２４時間培養した。ＥＬ
ＩＳＡによりシトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を検出
し、データを平均値±ＳＥＭで示した（図２）。実際に
は、最も低濃度すなわち１ｐｇ／ｍｌの内毒素で内因性
発熱物がかなり生成したが、ＬＰＳ及びＬＴＡの溶剤は
何の効果も与えなかった。これらのデータは、人の血液
が極めて感度良く反応し、ＬＰＳ及びＬＴＡに濃度依存
することを示している。
【００２５】また、上記以外の免疫刺激物は、上記方法
により内因性発熱物の誘発物質として検出できる。例と
して、熱殺菌されたグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌：
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａ
ｕｒ．））又はその成分（Ｍｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ、リ
ポテイコイル酸：Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ
（ＬＴＡ）、腸毒素：Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ、スト
レプトリジンＯ：Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ Ｏ（ＳＬ
Ｏ））は同様な反応を誘発した（図３）。また、植物成
分である植物性血球凝集素：Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌ
ｕｔｉｎｉｎ又はホルボールエステル：Ｐｈｏｒｂｏｌ
ｅｓｔｅｒなどの他の免疫刺激物も内因的発熱物の遊離
を誘発した。
により内因性発熱物の誘発物質として検出できる。例と
して、熱殺菌されたグラム陽性細菌（黄色ブドウ球菌：
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａ
ｕｒ．））又はその成分（Ｍｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ、リ
ポテイコイル酸：Ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ
（ＬＴＡ）、腸毒素：Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ、スト
レプトリジンＯ：Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ Ｏ（ＳＬ
Ｏ））は同様な反応を誘発した（図３）。また、植物成
分である植物性血球凝集素：Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌ
ｕｔｉｎｉｎ又はホルボールエステル：Ｐｈｏｒｂｏｌ
ｅｓｔｅｒなどの他の免疫刺激物も内因的発熱物の遊離
を誘発した。
【００２６】本発明の方法は、種々の利点を有してい
る。この利点は、外因的発熱物に曝した後に内因性発熱
物が生成する人体の基本反応に基づく。無処理の血液中
には、外因性発熱物と白血球との相互作用に必要な全て
の血液成分が存在している（例えばＬＰＳ結合タンパク
質ＬＢＰ、殺菌性浸透性が高められたタンパク質ＢＰ
Ｉ、可溶性のＣＤ１４、Ｄｅｆｅｎｓｉｎｅｓなど）。
血液中では、人又は動物の細胞は自然な構成体及び環境
の中で存在している。分離された白血球のような人工体
の準備あるいは細胞線：ｃｅｌｌｓ ｌｉｎｅｓの脱分
化はこの方法では行われない。本方法は極めて感度が高
く、例えばｐｇ量のＬＰＳを検出する。さらに、内毒素
以外の広範囲にわたる潜在的発熱物も検出される。この
システムはまた、生体外又は生体内における薬学的解熱
効果も検出することが可能である。
る。この利点は、外因的発熱物に曝した後に内因性発熱
物が生成する人体の基本反応に基づく。無処理の血液中
には、外因性発熱物と白血球との相互作用に必要な全て
の血液成分が存在している（例えばＬＰＳ結合タンパク
質ＬＢＰ、殺菌性浸透性が高められたタンパク質ＢＰ
Ｉ、可溶性のＣＤ１４、Ｄｅｆｅｎｓｉｎｅｓなど）。
血液中では、人又は動物の細胞は自然な構成体及び環境
の中で存在している。分離された白血球のような人工体
の準備あるいは細胞線：ｃｅｌｌｓ ｌｉｎｅｓの脱分
化はこの方法では行われない。本方法は極めて感度が高
く、例えばｐｇ量のＬＰＳを検出する。さらに、内毒素
以外の広範囲にわたる潜在的発熱物も検出される。この
システムはまた、生体外又は生体内における薬学的解熱
効果も検出することが可能である。
【００２７】本方法は、例えば人又は動物の解熱治療の
効果のチェックにも適している。解熱剤、この場合は１
錠のアスピリン（５００ｍｇ）を時間０時に服用した３
人の健康な協力者から採血した。血液を外因性発熱物、
例えば１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで生体内的に刺激したと
ころ、誘発性ＰＧＥ2量は急速に減少し、数時間後には
コントロール値に達した（図４）。このＰＧＥ2量はＥ
ＩＡにより検出された（中間値±ＳＥＭ）。
効果のチェックにも適している。解熱剤、この場合は１
錠のアスピリン（５００ｍｇ）を時間０時に服用した３
人の健康な協力者から採血した。血液を外因性発熱物、
例えば１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで生体内的に刺激したと
ころ、誘発性ＰＧＥ2量は急速に減少し、数時間後には
コントロール値に達した（図４）。このＰＧＥ2量はＥ
ＩＡにより検出された（中間値±ＳＥＭ）。
【００２８】
【実施例】健康な血液提供者の血液のクエン酸塩を、採
血直後に細胞培養液ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｃｈｒ
ｏｍ， Ｂｅｒｌｉｎ）により１対５に希釈した。カル
シウム再沈着による凝固を防止するためにヘパリンを添
加した（最終濃度：２ ＩＥ／ｍｌ］（Ｌｉｑｕｅｍｉ
ｎR， Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｇｒｅ
ｎｚａｃｈ−Ｗｈｙｌｅｎ）。刺激を同時に添加する
か、又は細胞培養媒体に既に存在させた。次に示す物質
を次に示す最大濃度で用いた：ヒツジ流産菌：Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉからのＬＰＳ
（１０μｇ／ｍｌ）、黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓからの腸毒素Ａ （ＳＥ
Ａ）及び腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）（１μｇ／ｍｌ）、黄色ブ
ドウ球菌からのリポテイコイル酸（ＬＴＡ）（１０μｇ
／ｍｌ）、熱殺菌された黄色ブドウ球菌（０．００１％
細胞ｖ／ｖ）、化膿連鎖球菌：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓによるストレプトリジンＯ
（ＳＬＯ）（２．５単位／ｍｌ）、ムラミルジペプチ
ド：Ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＤＰ）（１
０μｇ／ｍｌ）、植物性血球凝集素：Ｐｈｙｔｏｈｅｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＭ（ＰＨＡ）（１５μｇ／ｍｌ）
及びホルボールエステル：Ｐｈｏｒｂｏｌｅｓｔｅｒ
（ＰＭＡ）（１００ｎＭ）。ＭＤＰ （Ｂａｃｈｅｍ，
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を除くすべての刺激物はＳｉ
ｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）から調達したものも
のである。蓋のないポリプロピレン反応びん（Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ， Ｈａｍｂｕｒｇ）を用い、３７℃で５％
の二酸化炭素のもとで、基準培養時間として２４時間の
培養を行った（Ｗｉｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９１，１３９， ２
３３−２４０）。遠心分離（３００００ｇ、１分）後、
細胞の無い上澄みを除去し、シトキン及びプロスタグラ
ンジンが検出されるまで−８０℃で保管した。
血直後に細胞培養液ＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｃｈｒ
ｏｍ， Ｂｅｒｌｉｎ）により１対５に希釈した。カル
シウム再沈着による凝固を防止するためにヘパリンを添
加した（最終濃度：２ ＩＥ／ｍｌ］（Ｌｉｑｕｅｍｉ
ｎR， Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｇｒｅ
ｎｚａｃｈ−Ｗｈｙｌｅｎ）。刺激を同時に添加する
か、又は細胞培養媒体に既に存在させた。次に示す物質
を次に示す最大濃度で用いた：ヒツジ流産菌：Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｅｑｕｉからのＬＰＳ
（１０μｇ／ｍｌ）、黄色ブドウ球菌：Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓからの腸毒素Ａ （ＳＥ
Ａ）及び腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）（１μｇ／ｍｌ）、黄色ブ
ドウ球菌からのリポテイコイル酸（ＬＴＡ）（１０μｇ
／ｍｌ）、熱殺菌された黄色ブドウ球菌（０．００１％
細胞ｖ／ｖ）、化膿連鎖球菌：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓによるストレプトリジンＯ
（ＳＬＯ）（２．５単位／ｍｌ）、ムラミルジペプチ
ド：Ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＤＰ）（１
０μｇ／ｍｌ）、植物性血球凝集素：Ｐｈｙｔｏｈｅｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＭ（ＰＨＡ）（１５μｇ／ｍｌ）
及びホルボールエステル：Ｐｈｏｒｂｏｌｅｓｔｅｒ
（ＰＭＡ）（１００ｎＭ）。ＭＤＰ （Ｂａｃｈｅｍ，
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を除くすべての刺激物はＳｉ
ｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）から調達したものも
のである。蓋のないポリプロピレン反応びん（Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ， Ｈａｍｂｕｒｇ）を用い、３７℃で５％
の二酸化炭素のもとで、基準培養時間として２４時間の
培養を行った（Ｗｉｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９１，１３９， ２
３３−２４０）。遠心分離（３００００ｇ、１分）後、
細胞の無い上澄みを除去し、シトキン及びプロスタグラ
ンジンが検出されるまで−８０℃で保管した。
【００２９】遊離された媒介物質：Ｍｅｄｉａｔｏｒは
市販のＥＬＩＳＡで測定された。すなわちＩＬ−１、Ｉ
Ｌ−６及びＴＮＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈ． Ｂ
ｉｅｒｍａｎｎ， Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ）の試験
体：Ａｓｓａｙｓにより試験され、ＰＧＥ2はＣａｙｍ
ａｎ（ＳＰＩ−Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ，Ｆｒａｎｃｅ）
の試験体が使用された。
市販のＥＬＩＳＡで測定された。すなわちＩＬ−１、Ｉ
Ｌ−６及びＴＮＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈ． Ｂ
ｉｅｒｍａｎｎ， Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ）の試験
体：Ａｓｓａｙｓにより試験され、ＰＧＥ2はＣａｙｍ
ａｎ（ＳＰＩ−Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ，Ｆｒａｎｃｅ）
の試験体が使用された。
【００３０】
【発明の効果】以上説明した通り本発明によれば、広範
囲にわたる種々の物質の発熱性を簡単且つ低コストで検
査することができる方法を提供することができる。
囲にわたる種々の物質の発熱性を簡単且つ低コストで検
査することができる方法を提供することができる。
【図１】人の血液中における内毒素（ＬＰＳ）誘発によ
る内因性発熱物の生成の経時変化を示すグラフである。
る内因性発熱物の生成の経時変化を示すグラフである。
【図２】人の血液中における内毒素（ＬＰＳ）及びリポ
テイコイル酸（ＬＴＡ）誘発による内因性発熱物の生成
の前記刺激物濃度に対する依存性を示すグラフである。
テイコイル酸（ＬＴＡ）誘発による内因性発熱物の生成
の前記刺激物濃度に対する依存性を示すグラフである。
【図３】種々の刺激物による人の血液中における内因性
発熱物の生成を示すグラフである。
発熱物の生成を示すグラフである。
【図４】アスピリンを服用した人の血液中における内毒
素（ＬＰＳ）誘発によるＰＧＥ2の生成を示すグラフで
ある。
素（ＬＰＳ）誘発によるＰＧＥ2の生成を示すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 596077086 Ｉｍ Ｂｕｃｋｅｎｌｏｈ 19， Ｔｕｂ ｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ (71)出願人 596077097 Ｇｌａｒｎｉｓｃｈｓｔｒａｂｅ 17， Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ (71)出願人 596077101 ディーピーシー・ビエルマン・ジーエムビ ーエッチ ＤＰＣ Ｂｉｅｒｍａｎｎ ＧｍｂＨ ドイツ連邦共和国、バドナウハイム、ホー ヘストラーセ４−８ Ｈｏｈｅ Ｓｔｒａｓｓｅ ４−８， Ｂ ａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ (72)発明者 ヴェンデル、アルブレヒト ドイツ連邦共和国、チュービンゲン、アイ エム・ブケンロホ19 (72)発明者 ハルツング、トーマス ドイツ連邦共和国、コンスタンツ、グラル ニシュストラーベ17
Claims (7)
- 【請求項１】 物質を血液に接触させ、内因性発熱物の
生成及び遊離を検出することを特徴とする物質の発熱性
検査方法。 - 【請求項２】 血液の凝固を遅延又は抑制する成分を使
用することを特徴とする請求項１に記載の物質の発熱性
検査方法。 - 【請求項３】 培養媒体又は生理食塩水等の希釈剤を使
用することを特徴とする請求項１又は２に記載の物質の
発熱性検査方法。 - 【請求項４】 系内におけるインターレウキン１（Ｉｎ
ｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）の生成を検出することを特徴
とする請求項１ないし３のいずれかに記載の物質の発熱
性検査方法。 - 【請求項５】 インターレウキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕ
ｋｉｎ−６）の生成及び遊離を検出することを特徴とす
る請求項１ないし３のいずれかに記載の物質の発熱性検
査方法。 - 【請求項６】 腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏ
ｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）の生成及び遊離を検出すること
を特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の物質
の発熱性検査方法。 - 【請求項７】 プロスタグランジンＥ2（Ｐｒｏｓｔａ
ｇｌａｎｄｉｎ Ｅ2）の生成及び遊離を検出すること
特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の物質の
発熱性検査方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19516247.1 | 1995-05-03 | ||
| DE19516247A DE19516247A1 (de) | 1995-05-03 | 1995-05-03 | Pyrogen-Untersuchungsverfahren |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005031461A Division JP2005181346A (ja) | 1995-05-03 | 2005-02-08 | 物質の発熱性検査方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09210987A true JPH09210987A (ja) | 1997-08-15 |
| JP3667439B2 JP3667439B2 (ja) | 2005-07-06 |
Family
ID=7760985
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13771396A Expired - Lifetime JP3667439B2 (ja) | 1995-05-03 | 1996-05-07 | 物質の発熱性検査方法 |
| JP2005031461A Pending JP2005181346A (ja) | 1995-05-03 | 2005-02-08 | 物質の発熱性検査方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005031461A Pending JP2005181346A (ja) | 1995-05-03 | 2005-02-08 | 物質の発熱性検査方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5891728A (ja) |
| EP (1) | EP0741294B1 (ja) |
| JP (2) | JP3667439B2 (ja) |
| AT (1) | ATE253728T1 (ja) |
| DE (2) | DE19516247A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6696261B2 (en) * | 1999-12-03 | 2004-02-24 | Baxter International Inc. | Pyrogenicity test for use with automated immunoassay systems |
| US6520997B1 (en) | 1999-12-08 | 2003-02-18 | Baxter International Inc. | Porous three dimensional structure |
| DE10118446A1 (de) * | 2001-04-12 | 2002-10-17 | Thomas Hartung | Prüfverfahren zur Untersuchung fließfähiger Medien auf Gehalte an mikrobiellen Toxinen |
| DE10247430A1 (de) * | 2002-10-11 | 2004-04-29 | Fresenius Hemocare Gmbh | Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten |
| EP1787512A1 (en) * | 2005-11-09 | 2007-05-23 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Method for the cryopreservation of human blood |
| KR101352222B1 (ko) * | 2005-12-22 | 2014-02-04 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 의료용 제품에서 비-내독소 발열성 오염물을 보다 잘검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험 |
| EP1837658A1 (en) * | 2006-03-22 | 2007-09-26 | Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe | Cytokine-based pyrogen test |
| WO2009063307A2 (en) * | 2007-11-14 | 2009-05-22 | Bio-Technology General (Israel) Ltd. | Inflammatory activity detection method using il-6 |
| CN101477103B (zh) * | 2009-01-05 | 2012-06-27 | 范能全 | 一种注射剂中致热物质含量的全热原检测方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3944391A (en) * | 1974-12-27 | 1976-03-16 | Preventive Systems, Inc. | In vitro process for detecting endotoxin in a biological fluid |
| US4434237A (en) * | 1982-03-31 | 1984-02-28 | Dinarello Charles A | Human leukocytic pyrogen test for the detection of exogenous fever-producing substances |
| US5474769A (en) * | 1991-03-08 | 1995-12-12 | Sterling Winthrop Inc. | Treatment of microbial infection by monocyte stimulation with interleukin-7 |
| US5344822A (en) * | 1992-08-12 | 1994-09-06 | The Rogosin Institute | Methods useful in endotoxin prophylaxis and therapy |
| FR2699283B1 (fr) * | 1992-12-15 | 1995-03-03 | Medgenix Diagnostic | Test de pyrogénicite et kit de mise en Óoeuvre. |
| US5545623A (en) * | 1994-06-10 | 1996-08-13 | Akira Matsumori | Method of inhibiting secretion of inflammatory cytokines |
| US5550132A (en) * | 1994-06-22 | 1996-08-27 | University Of North Carolina | Hydroxyalkylammonium-pyrimidines or purines and nucleoside derivatives, useful as inhibitors of inflammatory cytokines |
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- 1995-05-03 DE DE19516247A patent/DE19516247A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-04-24 ES ES96106443T patent/ES2208705T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-24 DE DE59610804T patent/DE59610804D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-24 AT AT96106443T patent/ATE253728T1/de active
- 1996-04-24 EP EP96106443A patent/EP0741294B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-02 US US08/643,126 patent/US5891728A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-07 JP JP13771396A patent/JP3667439B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-02-08 JP JP2005031461A patent/JP2005181346A/ja active Pending
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|---|---|
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| JP2005181346A (ja) | 2005-07-07 |
| DE59610804D1 (de) | 2003-12-11 |
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