ES2208705T3 - Procedimiento de investigacion de pirogenos. - Google Patents
Procedimiento de investigacion de pirogenos.Info
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Abstract
PARA LA INVESTIGACION DE SUSTANCIAS SOBRE EFECTO PIROGENICO SE PONEN EN CONTACTO PREPARACIONES CON LAS SUSTANCIAS A SER PROBADAS Y A CONTINUACION SE PRUEBAN LAS PREPARACIONES EN BASE A LA FORMACION PIROGENICA ENDOGENA.
Description
Procedimiento de investigación de pirógenos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de investigación de sustancias con efectos
pirogénicos.
Se sabe que existe riesgo de efectos pirogénicos
en sustancias que entran en contacto con tejidos, fluidos
corporales y células humanas, en parte debido a que ellas mismas
como tales son pirogénicas, y en parte porque contienen componentes
pirogénicos. Entre las sustancias con este potencial de riesgo se
encuentran especialmente algunos medicamentos, sobre todo productos
de inhalación, inyección e infusión, incluidos los materiales de
expansores plasmáticos y de plasmaféresis, plásticos de los más
diversos estados de agregación, formas y funciones, incluidas
dispersiones y materiales como membranas y prótesis, así como
productos cosméticos. Incluso algunos productos alimenticios pueden
entrañar peligro por los pirógenos. Las sustancias que producen
efectos pirogénicos al entrar en contacto con tejidos, células o
fluidos corporales humanos se denominan normalmente sustancias con
efectos pirogénicos exógenos, independientemente de la posible
procedencia endógena del componente con efecto pirogénico de la
sustancia en cuestión. En lo sucesivo, se entenderá así también el
concepto de pirógenos exógenos y/o sustancias con efectos
pirogénicos exógenos, cuya investigación es objetivo de la presente
invención.
La problemática de la detección de pirógenos es
conocida. La seguridad del producto es una necesidad urgente y ello
hace necesario, para poder reconocer también lotes contaminados
excepcionalmente, la realización constante de pruebas individuales
con animales de experimentación.
El componente más importante que produce fiebre
es la endotoxina (lipopolisacárido, LPS) de la pared bacteriana de
gérmenes Gram negativos (Moltz, H., Neurosci. Biobehav. Rev.
(1993), 17, pp. 237-269; Tilders y col.,
Psychoneuroendocrinology, 1994, 19, pp. 209-232;
Rothwell, Crit.Rev.Neurobiol., 1994, 8, pp. 1-10;
Zeisberger y Roth, Neuropsychobiology, 1993, 28, pp.
106-109). Por ello, es natural que se haya tendido a
sustituir la experimentación con animales, que por lo general suele
realizarse con conejos, por la detección directa de endotoxina
(ensayo de limulus, LAL). Este procedimiento es limitado por
naturaleza: sólo se detectan endotoxinas como desencadenantes
potenciales de la fiebre; otros estímulos de los leucocitos que
también provocan fiebre se sustraen a la detección. El ensayo es muy
propenso a errores frente a componentes aglutinantes de endotoxina,
como aparecen en abundancia, por ejemplo, en la sangre y en los
componentes de sangre (Harris y col., J.Lab.Clin.Med., 1991, 118,
pp. 186-193; Emancipator y col., Infect. Immun.,
60, 1992, pp. 596-601); Read y col., Eur.Herat J.,
1993, 14, pp. 125- 129); algunos de estos componentes aglutinantes
de endotoxina obstaculizan la medición de lipopolisacárido en el
ensayo de limulus, mientras que por el contrario intensifican la
reacción con los leucocitos, es decir, la verdadera reacción
pirogénica primaria. Sin embargo, es precisamente la detección de
pirógenos en productos de sangre el caso más frecuente de aplicación
de la prueba. El ensayo de limulus es tan sensible que una
contaminación muy ligera, que sea irrelevante para la calidad del
producto, puede conducir con mucha facilidad a detecciones erróneas
(Fujiwara y col., Yakugaku Zasshi, 1990, 110, pp.
332-340).
Por otra parte, la experimentación con conejos
tampoco está libre de problemas. La respuesta inmunológica (fiebre)
a un estímulo dado se diferencia considerablemente de unas especies
a otras. La representatividad del caso del conejo para el ser
humano, incluso para otros animales, es absolutamente cuestionable,
puesto que la sensibilidad a la endotoxina de distintas especies
puede variar en torno a un factor de 10.000. Sobre otros componentes
pirogénicos no existen investigaciones comparables. El documento EP
0 603 061 da a conocer un procedimiento para la investigación del
efecto pirogénico de una sustancia en una solución médica y
biológica.
El objetivo de la presente invención es ofrecer
un procedimiento que permita reconocer sustancias pirogénicas en un
ancho de banda amplio. El procedimiento deberá poder realizarse de
manera sencilla y sin elevados costes. De lo expuesto se derivan
también otros objetivos, especialmente de las ventajas
mencionadas.
La solución del objetivo planteado se logra
siguiendo el camino trazado claramente en las reivindicaciones.
La ventaja especial de este procedimiento
consiste en el uso de un sistema biológico que ofrece información
relevante sobre la exposición del ser humano. Como parámetros de
medición se emplean los pirógenos endógenos. Estos son sustancias
mensajeras del sistema inmunitario que transmiten la reacción febril
y, por decirlo así, representan la comunicación por parte del
organismo de que ha sido reconocido un pirógeno. Se trata
especialmente, por ejemplo, de citoquinas y/o factores del
crecimiento. Los pirógenos endógenos más importantes conocidos son
las proteínas interleucin-1 (IL-1),
interleucin-6 (IL-6) y el factor de
necrosis tumoral (FNT), así como mediadores lípidos como
prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), cuya detección puede efectuarse,
por ejemplo, para IL-1, IL-6 o FNT
en el ELISA (ensayo inmuno-sorbente ligado a
enzimas) o para PGE_{2}, por ejemplo, con el ensayo EIA (ensayo
inmunoenzimático de enzimas).
Como sistema biológico también podrían usarse
leucocitos aislados de la sangre. La mayor parte de los
procedimientos de aislamiento son, sin embargo, muy costosos para la
prueba rutinaria de sustancias. Por ello, resulta más sencillo usar
para este fin sangre total humana o animal sin separación de
componentes individuales como la sangre fresca obtenida de donantes
humanos sanos. Los leucocitos se encuentran así en su composición y
medio natural. Al mismo tiempo, se encuentran presentes todos los
componentes del suero que podrían ejercer influencia sobre los
efectos de un pirógeno, resultando especialmente ventajoso el hecho
de que puedan añadirse, también durante la incubación, componentes
retardadores o inhibidores de la coagulación como citrato, así, por
ejemplo, en una concentración final de 0,38% o heparina como
heparina Na, por ejemplo, para inhibir la coagulación, sin que estos
componentes perjudiquen o falseen la reacción conforme a la
invención.
También una dilución de la preparación de sangre
total ha demostrado ser muy ventajosa, sobre todo con un medio de
cultivo celular, por ejemplo, una dilución al 20% con una solución
de sal común fisiológica. De ahí, se entiende que todos los
aparatos, como los de laboratorio, y sustancias añadidas, como por
ejemplo inhibidores de la coagulación o diluyentes, deberán estar
lo más libre posible de efectos pirogénicos, así como que también
durante la incubación, en la que por precaución también pueden
estar presentes antibióticos, como por ejemplo penicilina o
estreptomicina, se trabajará en tales condiciones que pueda
descartarse una contaminación rele-
vante.
vante.
Como ejemplo de una liberación de pirógenos
endógenos pueden servir los cuatros pirógenos endógenos mencionados
anteriormente, que se liberan mediante componentes bacterianos de
bacterias Gram negativa y Gram positiva. El procedimiento es
altamente sensible frente a endotoxinas (sólo unos pocos pg/ml
condujeron a la liberación de pirógenos endógenos) y en su mayor
parte independientemente del donante de sangre. Para el control
positivo pueden usarse preparados de paredes bacterianas Gram
positiva y Gram negativa como endotoxina y ácidos lipoteicos, para
el control negativo, por ejemplo, solución de sal común fisiológica
libre de pirógenos.
Para la determinación del curso temporal de la
formación de pirógenos endógenos inducida por endotoxinas en sangre
total, se diluyó la sangre de 7 donantes sanos con un medio de
cultivo celular en una proporción de 1:5 y se estimuló con 10
\mug/ml de LPS (Fig. 1). Tras la incubación (37ºC), todos los
factores se pudieron comprobar con ensayos comercializados ELISA
(valor medio \pm SEM), mientras que la sangre no estimulada no
liberó estos factores. La cantidad hallada de
IL-1\beta alcanzó tras aprox. 6h una meseta,
PGE_{2} aumentó de manera continuada durante un tiempo de
incubación de 24h. Del mismo modo, también aumentó la cantidad
inducida de IL-6 (medida siempre tras 4, 10 y 24h -
datos no mostrados). Por el contrario, la liberación de FNT tras
estimulaciones con LPS muestra su punto más alto transcurridas
aprox. 12h. Sin embargo, dado que también a las 24h sigue estando
presente la mayor parte de la cantidad de FNT, se eligió éste como
tiempo estándar de incu-
bación.
bación.
Para la determinación de la dependencia de la
concentración de la formación inducida por endotoxinas Gram
negativa y ácidos lipoteicos Gram positiva de pirógenos endógenos en
sangre total fue diluida la sangre de 5 donantes sanos en una
proporción de 1:5 e incubada durante 24h en presencia de la
concentración indicada de endotoxinas o ácidos lipoteicos. La
detección de citoquina se realizó con el ensayo ELISA. Los datos
representan valores medios \pm SEM (Fig. 2). La aplicación más
reducida de concentración de LPS de 1 pg/ml ya produjo una formación
significativa de estos pirógenos endógenos, mientras que el añadido
de diluyente LPS o LTA no produjo efectos. Se ha puesto de
manifiesto que la sangre total humana es altamente sensible a LPS y
LTA, así como dependiente de la concentración.
Mediante este procedimiento también se detecta si
otros estímulos inmunológicos, además de los mencionados, liberan
pirógenos endógenos. Así, por ejemplo, también las bacterias Gram
positiva muertas por el calor (Estafilococcus aureus) o sus
componentes (muropéptido, ácidos lipoteicos, enterotoxina,
estreptolisina 0) condujeron a una reacción similar (Fig. 3).
También otros estímulos inmunológicos, como la sustancia de
contenido vegetal fitohemaglutinina o éster de forbol,
desencadenaron una liberación de mediadores equivalente.
El procedimiento ofrece toda una serie de
ventajas. La reacción primaria propia de la formación de pirógenos
endógenos ante la recepción de pirógenos exógenos es sometida a
análisis. Se hallan presentes todos los componentes de la sangre
que, dado el caso, son necesarios para una interacción del pirógeno
exógeno con los leucocitos (por ejemplo, la proteína transportadora
de LPS (LBR), la proteína inductora de la permeabilidad bacteriana
(BPI), CD14 soluble, defensina, etc.). Las células sanguíneas
animales o humanas se encuentran en su mezcla y entorno natural.
Apenas aparecen artefactos de preparación, como en el caso de los
leucocitos aislados, ni de diferenciaciones, como en el caso de las
líneas celulares. El procedimiento es muy sensible (por ejemplo,
cantidades pg de LPS). Se detectan, además de endotoxinas, un gran
número de pirógenos potenciales. También pueden ser examinados
efectos farmacológicos antipiréticos
in-vitro o
ex-vivo.
De este modo, el procedimiento también es
apropiado para examinar los efectos de una terapia antipirética en
seres humanos, pero también los efectos antipiréticos en animales.
Para este fin, en un determinado momento 0, tres personas como
testigo recibieron un medicamento antipirético, en el ejemplo en
cuestión, un comprimido de Aspirina (500 mg) respectivamente,
extrayéndoseles sangre inmediatamente antes, así como
posteriormente en distintos momentos. Efectivamente, la cantidad de
PGE_{2} inducida con un pirógeno exógeno, en el ejemplo con 10
\mug/ml de LPS, se redujo rápidamente como consecuencia de la
administración del medicamento antipirético (Fig. 4) y no se
recuperó hasta algunas horas después. La cantidad de PGE_{2} se
determinó mediante el ensayo EIA (valores medio \pm SEM).
Inmediatamente después de su extracción a
donantes sanos, se diluyó la sangre con citrato con un medio de
cultivo celular RPMI 1640 (Biochrom, Berlín) 1:5. Se añadió
heparina [2 IE/ml como concentración final] al sistema para
descartar una coagulación como consecuencia de la recalcificación.
Al mismo tiempo se añadieron estímulos, o bien fueron dispuestos
previamente en el medio de cultivo celular. Particularmente se
usaron las siguientes sustancias en las concentraciones máximas
indicadas: LPS de salmonella abortus equi [10 \mug/ml],
enterotoxina A (SEA) y B (SEB) de Estafilococcus aureus [1
\mug/ml], ácidos lipoteicos (LTA) de E. aureus [10\mug/ml], E.
aureus muerto por calor [0,001 % células v/v], estreptolisina 0
(SLO) de Estreptococcus piogenes [2,5 unidades/ml],
muramildipéptido (MDP) [10 \mug/ml],, fitohemaglutinina M (PHA)
[15 \mug/ml] y éster de forbol (PMA) [100nM]. Excepto MDP
(Bachem, Heidelberg), todos los estímulos se tomaron de Sigma
(Deisenhofen). Las incubaciones se efectuaron en recipientes de
reacción de polipropileno (Eppendorf, Hamburgo) a 37º C y 5% CO2
durante un tiempo estándar de 24h (Wilson y col., J.Immunol. Meth,
1991, 139, pp. 233-240). Los excedentes celulares
liberados fueron extraídos tras centrifugación (3000g, 1 min) y
conservados a -80ºC hasta la medición de citoquina o
prostaglandina.
Los mediadores liberados fueron medidos con
ensayos comercializados ELISA: IL-1,
IL-6 y FNT fueron determinados con ensayos de R
& D Systema (H. Biermann, Bad Nauheim), mientras que para
PGE_{2} se usó un ensayo de Cayman (SPI-Bio
Europe, Francia).
Claims (4)
1. Procedimiento para la investigación de
sustancias y materiales que entran en contacto con tejidos, fluidos
corporales y células humanas, sobre los distintos orígenes de los
efectos pirogénicos, con los siguientes pasos:
- -
- se pone en contacto las sustancias y materiales que se quieren investigar con un preparado de sangre total humana o animal;
- -
- después se efectúa una incubación del preparado de sangre total en condiciones que posibilitan la formación de pirógenos endógenos, caracterizado porque el preparado de sangre total contiene componentes que retardan o inhiben la coagulación y
- -
- se investiga la formación de citoquinas en el preparado de sangre total así incubado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el preparado de sangre total contiene
un medio de dilución.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque como medio de dilución se usa medio de
cultivo celular o sal común fisiológica.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se prueba
la formación de interleucin-1, -6, FNT y/o
prostaglandina E2.
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