JPH09216902A - 動的流動系においてｅ−セレクチンに依存する細胞回転および付着を惹起する新規な炭水化物リガンド類（ミエロローリン） - Google Patents
動的流動系においてｅ−セレクチンに依存する細胞回転および付着を惹起する新規な炭水化物リガンド類（ミエロローリン）Info
- Publication number
- JPH09216902A JPH09216902A JP8250776A JP25077696A JPH09216902A JP H09216902 A JPH09216902 A JP H09216902A JP 8250776 A JP8250776 A JP 8250776A JP 25077696 A JP25077696 A JP 25077696A JP H09216902 A JPH09216902 A JP H09216902A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- selectin
- rolling
- adhesion
- cells
- polylactosamine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
- C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】現在公知のＥ−セレクチン・リガンド化合物
は、人体内で現実に起こっているローリング現象を考慮
にいれることなく、せん断応力のない条件下で、選定さ
れ有効とされていた。 【解決手段】少なくとも６個の単糖類を含み、かつ末端
がα２→３シアリル化され、内部が種々のＮ−アセチル
グルコサミン残基においてα１→３フコシル化されてい
るが、該フコシル化は末端から２番目のＮ−アセチルグ
ルコサミン残基単独ではないことを特徴とする非分枝ポ
リラクトサミン。
は、人体内で現実に起こっているローリング現象を考慮
にいれることなく、せん断応力のない条件下で、選定さ
れ有効とされていた。 【解決手段】少なくとも６個の単糖類を含み、かつ末端
がα２→３シアリル化され、内部が種々のＮ−アセチル
グルコサミン残基においてα１→３フコシル化されてい
るが、該フコシル化は末端から２番目のＮ−アセチルグ
ルコサミン残基単独ではないことを特徴とする非分枝ポ
リラクトサミン。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】 １． 発明の分野 本発明は、一般的には、動的流動条件下、Ｅ−セレクチ
ン発現性細胞のローリングおよび接着を惹起する糖鎖を
有する化合物に関するものである。本発明は、より特定
的には、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび
接着を惹起する一群のモノシアロフコガングリオシドの
存在に関するものである。本発明は、白血球および白血
病性細胞に発現された新規な糖質リガンド（「ミエロロ
ーリン」と言う。）が、動的流動条件下、炎症部位の活
性化された内皮細胞に対するＥ−セレクチン依存性ロー
リングおよび接着を仲介するという発見に基づくもので
ある。ミエロローリンは、末端にα２→３シアロシル残
基を有し、末端から２番目のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチ
ルグルコサミン）以外の内部ＧｌｃＮＡｃにα１→３フ
コシル残基を有する、一群の非分枝ポリラクトサミン化
合物である。本発明は、さらにまた、別異のミエロロー
リンの混合物が、動的流動条件下、Ｅ−セレクチン発現
性細胞のローリングおよび接着を惹起する際に、相乗効
果をもたらすという知見に基づく。本明細書において
は、特に断らない限り、「ローリング」という用語は、
単純ローリング、ローリング後接着および接着後ローリ
ングを含み、「接着」という用語は、ローリングを伴わ
ない単純接着を意味するものとする。
ン発現性細胞のローリングおよび接着を惹起する糖鎖を
有する化合物に関するものである。本発明は、より特定
的には、Ｅ−セレクチン発現性細胞のローリングおよび
接着を惹起する一群のモノシアロフコガングリオシドの
存在に関するものである。本発明は、白血球および白血
病性細胞に発現された新規な糖質リガンド（「ミエロロ
ーリン」と言う。）が、動的流動条件下、炎症部位の活
性化された内皮細胞に対するＥ−セレクチン依存性ロー
リングおよび接着を仲介するという発見に基づくもので
ある。ミエロローリンは、末端にα２→３シアロシル残
基を有し、末端から２番目のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチ
ルグルコサミン）以外の内部ＧｌｃＮＡｃにα１→３フ
コシル残基を有する、一群の非分枝ポリラクトサミン化
合物である。本発明は、さらにまた、別異のミエロロー
リンの混合物が、動的流動条件下、Ｅ−セレクチン発現
性細胞のローリングおよび接着を惹起する際に、相乗効
果をもたらすという知見に基づく。本明細書において
は、特に断らない限り、「ローリング」という用語は、
単純ローリング、ローリング後接着および接着後ローリ
ングを含み、「接着」という用語は、ローリングを伴わ
ない単純接着を意味するものとする。
【０００２】
２． 発明の背景 １９８９年以来、現在では「セレクチン」といわれる、
血管または血小板の接着性タンパク質のクローン化は、
白血球に発現される糖質エピトープを同定することに、
焦点を絞った仕事が続き（Varki, A. 1994, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91:7390-7397; Lasky, L.A., 1995,
Ann. Rev. Biochem. 64:113-139 ）、活性化された内
皮細胞上での白血球のセレクチン依存性「ローリング」
および接着、引き続く経内皮遊走の機能がターゲットと
された。この機構が、炎症性反応で中心的な役割を演ず
る（Lasky, L.A., 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113-1
39）。かかるエピトープは、炎症または受傷の後での、
炎症部位への細胞の補充に関係する。現時点では、シア
ロシル−Ｌｅx （ＳＬｅx ）が、Ｅ−セレクチン結合の
ターゲット・エピトープであると、一般的に信じられて
いる。それは、次のような主張に基づく。（ｉ）ヒト白
血球、白血病性白血球および白血病性株細胞（例えば、
ＨＬ６０およびＵ９３７細胞）は、ＳＬｅx を発現する
が、ヒト以外の白血球は発現しない。この主張は、これ
らのタイプの細胞が、ＳＬｅx に直結すると信じられて
いるｍＡｂｓと強い反応性を有することに基づく（Ito
et al.,1994, Glycoconj. J. 11:232-237）。これらの
ＳＬｅx 発現性細胞は、Ｅ−またはＰ−セレクチンを発
現する、活性化された内皮細胞または血小板と接着する
（Phillips et al., 1990, Science 250:1130-1132; Po
lley et al., 1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:62
24-6228）。（ｉｉ）シアロシル・タイプ２鎖を発現す
る、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、
Ｅ−セレクチンと接着しないが、フコシルトランスフェ
ラーゼＩＩＩ ｃＤＮＡを有するこれらの細胞のトラン
スフェクト体は、Ｅ−セレクチンと接着する（Lowe et
al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-17477 ）。（ｉ
ｉｉ）活性化されたＥＣｓに対する、ＳＬｅx 発現性細
胞のＥ−セレクチン依存性接着は、ＳＬｅx ＧＳＬｓを
含有するリポソームまたは末端ＳＬｅx 構造を有するオ
リゴ糖によって抑制される（Phillips et al., 1990, S
cience 250:1130-1132; Polley et al., 1991, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228; Handa et al., 19
91, Biochem. Biophys.Res. Commun. 181:1223-123
0）。
血管または血小板の接着性タンパク質のクローン化は、
白血球に発現される糖質エピトープを同定することに、
焦点を絞った仕事が続き（Varki, A. 1994, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91:7390-7397; Lasky, L.A., 1995,
Ann. Rev. Biochem. 64:113-139 ）、活性化された内
皮細胞上での白血球のセレクチン依存性「ローリング」
および接着、引き続く経内皮遊走の機能がターゲットと
された。この機構が、炎症性反応で中心的な役割を演ず
る（Lasky, L.A., 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113-1
39）。かかるエピトープは、炎症または受傷の後での、
炎症部位への細胞の補充に関係する。現時点では、シア
ロシル−Ｌｅx （ＳＬｅx ）が、Ｅ−セレクチン結合の
ターゲット・エピトープであると、一般的に信じられて
いる。それは、次のような主張に基づく。（ｉ）ヒト白
血球、白血病性白血球および白血病性株細胞（例えば、
ＨＬ６０およびＵ９３７細胞）は、ＳＬｅx を発現する
が、ヒト以外の白血球は発現しない。この主張は、これ
らのタイプの細胞が、ＳＬｅx に直結すると信じられて
いるｍＡｂｓと強い反応性を有することに基づく（Ito
et al.,1994, Glycoconj. J. 11:232-237）。これらの
ＳＬｅx 発現性細胞は、Ｅ−またはＰ−セレクチンを発
現する、活性化された内皮細胞または血小板と接着する
（Phillips et al., 1990, Science 250:1130-1132; Po
lley et al., 1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:62
24-6228）。（ｉｉ）シアロシル・タイプ２鎖を発現す
る、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、
Ｅ−セレクチンと接着しないが、フコシルトランスフェ
ラーゼＩＩＩ ｃＤＮＡを有するこれらの細胞のトラン
スフェクト体は、Ｅ−セレクチンと接着する（Lowe et
al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-17477 ）。（ｉ
ｉｉ）活性化されたＥＣｓに対する、ＳＬｅx 発現性細
胞のＥ−セレクチン依存性接着は、ＳＬｅx ＧＳＬｓを
含有するリポソームまたは末端ＳＬｅx 構造を有するオ
リゴ糖によって抑制される（Phillips et al., 1990, S
cience 250:1130-1132; Polley et al., 1991, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228; Handa et al., 19
91, Biochem. Biophys.Res. Commun. 181:1223-123
0）。
【０００３】これらの観察は、ＳＬｅx が、Ｅ−セレク
チンと結合するエピトープであるというアイデアの受け
容れを、元気づけることになった。Ｅ−およびＰ−セレ
クチンは、また、ＳＬｅx の位置異性体である、ＳＬｅ
a とも結合する（Handa et al., 1991, Biochem. Bioph
ys. Res. Commun. 181:1223-1230; Berg et al., 1991,
J. Biol. Chem. 266:14869-14872; Takada et al., 19
91, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:713-719
）。しかしながら、ＳＬｅa は、白血球には存在せ
ず、造血細胞のためのセレクチンの生理的エピトープで
あるとは考えられていない。これまで、好中球およびＨ
Ｌ６０細胞に存在する、ＳＬｅx 含有ガングリオシドの
系統的特徴付けは行われていないし、ＳＬｅx が、正常
な若しくは白血病性白血球またはこれらに由来する株細
胞の、Ｎ−結合またはＯ−結合糖タンパク質側鎖中に存
在する主要なエピトープであることを、明白に実証する
ものもない。
チンと結合するエピトープであるというアイデアの受け
容れを、元気づけることになった。Ｅ−およびＰ−セレ
クチンは、また、ＳＬｅx の位置異性体である、ＳＬｅ
a とも結合する（Handa et al., 1991, Biochem. Bioph
ys. Res. Commun. 181:1223-1230; Berg et al., 1991,
J. Biol. Chem. 266:14869-14872; Takada et al., 19
91, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:713-719
）。しかしながら、ＳＬｅa は、白血球には存在せ
ず、造血細胞のためのセレクチンの生理的エピトープで
あるとは考えられていない。これまで、好中球およびＨ
Ｌ６０細胞に存在する、ＳＬｅx 含有ガングリオシドの
系統的特徴付けは行われていないし、ＳＬｅx が、正常
な若しくは白血病性白血球またはこれらに由来する株細
胞の、Ｎ−結合またはＯ−結合糖タンパク質側鎖中に存
在する主要なエピトープであることを、明白に実証する
ものもない。
【０００４】好中球が仲介しかつＥ−セレクチン依存性
の肺疾患に罹ったラットの、ＩｇＧ免疫複合体モデルに
おいて、ＳＬｅx が、炎症性血管損傷に対して保護的な
効果を有することが報告されている（Mulligan et al.,
1993, J. Exp. Med. 178:623-631 ）。
の肺疾患に罹ったラットの、ＩｇＧ免疫複合体モデルに
おいて、ＳＬｅx が、炎症性血管損傷に対して保護的な
効果を有することが報告されている（Mulligan et al.,
1993, J. Exp. Med. 178:623-631 ）。
【０００５】しかし、次のような報告もある。すなわ
ち、ヒト好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）に関する、抗
体による免疫染色の結果およびプレートに固定したＥ−
またはＰ−セレクチンに対する間接的な結合アッセイの
結果によれば、ヒトＰＭＮおよび前骨髄球性白血病ＨＬ
６０細胞だけが、ＳＬｅx および他のラクト系エピトー
プ、例えば、Ｌｅx またはＬｅy を発現し、他の哺乳動
物のＰＭＮ、例えば、ヒヒ、オナガザル科マカック属、
ブタ、ウサギ、ラット、モルモットおよびハムスターの
ＰＭＮは、発現しないという（Ito et al., 1994, Glyc
oconj. J. 11:232-237）。また、マウスの腎臓およびマ
ウス白血球から得られたＥ−セレクチン・リガンド糖鎖
は、次のように同定されている（Osanai et al., 1996,
Biochem.Biophys. Res. Commun. 218:610-615 ）。
ち、ヒト好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）に関する、抗
体による免疫染色の結果およびプレートに固定したＥ−
またはＰ−セレクチンに対する間接的な結合アッセイの
結果によれば、ヒトＰＭＮおよび前骨髄球性白血病ＨＬ
６０細胞だけが、ＳＬｅx および他のラクト系エピトー
プ、例えば、Ｌｅx またはＬｅy を発現し、他の哺乳動
物のＰＭＮ、例えば、ヒヒ、オナガザル科マカック属、
ブタ、ウサギ、ラット、モルモットおよびハムスターの
ＰＭＮは、発現しないという（Ito et al., 1994, Glyc
oconj. J. 11:232-237）。また、マウスの腎臓およびマ
ウス白血球から得られたＥ−セレクチン・リガンド糖鎖
は、次のように同定されている（Osanai et al., 1996,
Biochem.Biophys. Res. Commun. 218:610-615 ）。
【０００６】
【化９】 および
【化１０】
【０００７】これらの報告は、人類以外の哺乳動物のセ
レクチン・リガンドがＳＬｅx ではないことを示した。
また、動物モデルを使用して得られている、抗炎症効果
のこれまで公認の成果も、疑問視されるに至った。
レクチン・リガンドがＳＬｅx ではないことを示した。
また、動物モデルを使用して得られている、抗炎症効果
のこれまで公認の成果も、疑問視されるに至った。
【０００８】さらに、次のような開示もある。生体外
で、活性化された内皮細胞に、次式の糖脂質
で、活性化された内皮細胞に、次式の糖脂質
【０００９】
【化１１】 を含むリポソームを添加し、さらにＨＬ６０細胞を添加
すると、活性化された内皮細胞に対するＨＬ６０細胞の
結合が選択的にブロックされる（WO91/19501およびWO91
/19502）。
すると、活性化された内皮細胞に対するＨＬ６０細胞の
結合が選択的にブロックされる（WO91/19501およびWO91
/19502）。
【００１０】さらに、次のような報告もある。慢性骨髄
性白血病の患者の白血球から抽出される糖脂質は、ポリ
塩化ビニル製マイクロタイター・ウェルに吸収される
か、ＴＬＣプレート上で分離され、内皮白血球接着分子
−１（ＥＬＡＭ−１）発現性ＣＯＳ細胞との結合により
スクリーニングされ、構造解析により、次式の糖脂質
性白血病の患者の白血球から抽出される糖脂質は、ポリ
塩化ビニル製マイクロタイター・ウェルに吸収される
か、ＴＬＣプレート上で分離され、内皮白血球接着分子
−１（ＥＬＡＭ−１）発現性ＣＯＳ細胞との結合により
スクリーニングされ、構造解析により、次式の糖脂質
【００１１】
【化１２】 が検出された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1138-1
142 [1991]）。
142 [1991]）。
【００１２】さらに、Ｓｔｒｏｕｄらの報告（Biochem.
Biophys. Res. Commun. 209:777-787 [1995] ）によれ
ば、固形腫瘍細胞および組織に共通して見出される、次
式の糖脂質
Biophys. Res. Commun. 209:777-787 [1995] ）によれ
ば、固形腫瘍細胞および組織に共通して見出される、次
式の糖脂質
【００１３】
【化１３】
【化１４】 および
【化１５】 は、ヒト好中球およびＨＬ６０細胞には存在せず、次式
の糖脂質
の糖脂質
【００１４】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】 および
【化２０】 が、ヒト好中球およびＨＬ６０細胞から抽出され、ＴＬ
Ｃ上で展開し、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞と接触
させて接着検定したところ、これらの細胞は、ごく少量
の＃５を含む糖脂質＃４と接着することが判明した。
Ｃ上で展開し、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞と接触
させて接着検定したところ、これらの細胞は、ごく少量
の＃５を含む糖脂質＃４と接着することが判明した。
【００１５】一方、血管内皮細胞上のセレクチンと、白
血球のオリゴ糖リガンドとの間のローリング・タイプの
接着が、炎症反応の開始に関与していることから、内皮
上での白血球のローリングを抑制することによって、白
血球の炎症組織部位への浸潤および活性化された好中球
による内皮の局部的損傷が防げるのではないかと、期待
されている（Lasky, 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113
-139）。
血球のオリゴ糖リガンドとの間のローリング・タイプの
接着が、炎症反応の開始に関与していることから、内皮
上での白血球のローリングを抑制することによって、白
血球の炎症組織部位への浸潤および活性化された好中球
による内皮の局部的損傷が防げるのではないかと、期待
されている（Lasky, 1995, Ann. Rev. Biochem. 64:113
-139）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】現在公知のＥ−セレク
チン・リガンド化合物は、人体内で現実に起こっている
上記のローリング現象を考慮にいれることなく、せん断
応力のない条件下で、選定され有効とされていた。従っ
て、これらの化合物は、真のＥ−セレクチン・リガンド
物質ではないかも知れない。これらの化合物では、生体
内で活性化された、Ｅ−セレクチン発現性細胞、例え
ば、内皮上でのＥ−セレクチン依存性ローリングおよび
接着を制御できないばかりか、ヒト炎症の特異的制御も
できないかも知れない。
チン・リガンド化合物は、人体内で現実に起こっている
上記のローリング現象を考慮にいれることなく、せん断
応力のない条件下で、選定され有効とされていた。従っ
て、これらの化合物は、真のＥ−セレクチン・リガンド
物質ではないかも知れない。これらの化合物では、生体
内で活性化された、Ｅ−セレクチン発現性細胞、例え
ば、内皮上でのＥ−セレクチン依存性ローリングおよび
接着を制御できないばかりか、ヒト炎症の特異的制御も
できないかも知れない。
【００１７】ある報告では、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨ
Ｏ細胞は、卵レシチンのホスファチヂルコリン（ＰＣと
略称する）によってＳＬｅx を固定した固相上、０．７
３ｄｙｎｅ／ｃｍ2 のせん断応力下で、ぎこちなく転が
ったという。この実験で使用した固相は、３μｌのＳＬ
ｅx （４μｇ／ｍｌのＰＣを含む２０：１のメタノー
ル：ブタノール溶液中に、１μｇ／ｍｌの濃度で溶解し
た）を、直径４ｍｍの面積に加え、乾燥して調製された
が、該固相に加えた量に対して、１５％のＳＬｅx をＰ
Ｃによって該固相に固定した（J. Immunol. 154:5356-5
366 (1995)）。しかし、上述のごとく、ヒト好中球に存
在しないＳＬｅx であるから、ヒト炎症を安全かつ特異
的に制御することはできないかも知れない。
Ｏ細胞は、卵レシチンのホスファチヂルコリン（ＰＣと
略称する）によってＳＬｅx を固定した固相上、０．７
３ｄｙｎｅ／ｃｍ2 のせん断応力下で、ぎこちなく転が
ったという。この実験で使用した固相は、３μｌのＳＬ
ｅx （４μｇ／ｍｌのＰＣを含む２０：１のメタノー
ル：ブタノール溶液中に、１μｇ／ｍｌの濃度で溶解し
た）を、直径４ｍｍの面積に加え、乾燥して調製された
が、該固相に加えた量に対して、１５％のＳＬｅx をＰ
Ｃによって該固相に固定した（J. Immunol. 154:5356-5
366 (1995)）。しかし、上述のごとく、ヒト好中球に存
在しないＳＬｅx であるから、ヒト炎症を安全かつ特異
的に制御することはできないかも知れない。
【００１８】最近では、静的条件下でＥ−セレクチンと
結合する（または結合しない）、ＨＬ６０細胞およびヒ
ト好中球の、モノシアロガングリオシドの特性について
の報告がある（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 209:777-787; Stroud et al., 1996,
Biochemistry 35:758-769 ）。ＳＬｅx 構造はなく、内
部フコシル化を有しまたは有せず、ポリ−ＬａｃＮＡｃ
（Ｎ−アセチルラクトサミン）コア構造として１０糖以
下の単糖単位を有する（Stroud et al., 1996,Biochemi
stry 35:758-769）。Ｅ−セレクチン結合性フラクショ
ンは、全て、末端のＧａｌ（ガラクトース）がα２→３
シアリル化され、末端から２番目以外の内部ＧｌｃＮＡ
ｃが２またはそれ以上α１→３フコシル化されていた
（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm
un. 209:777-787; Stroud et al.,1996, Biochemistry
35:770-778 ）。これらの結合性フラクションは、「ミ
エログリカン」と総称された。内部ＧｌｃＮＡｃがα１
→３フコシル化され、ＳＬｅx 末端を有するポリ−Ｌａ
ｃＮＡｃの極小成分もあった。ヒト好中球およびＨＬ６
０細胞の主要なＥ−セレクチン結合部位は、ミエログリ
カン・タイプであって、ＳＬｅx 含有グリカンではない
と結論された。実験したミエログリカンまたはポリ−Ｌ
ａｃＮＡｃ・ＳＬｅx 構造は、いずれもＰ−セレクチン
結合を示さなかった（Stroud et al., 1996, Biochemis
try 35:758-769; Stroud et al., 1996,Biochemistry 3
5:770-778）。
結合する（または結合しない）、ＨＬ６０細胞およびヒ
ト好中球の、モノシアロガングリオシドの特性について
の報告がある（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 209:777-787; Stroud et al., 1996,
Biochemistry 35:758-769 ）。ＳＬｅx 構造はなく、内
部フコシル化を有しまたは有せず、ポリ−ＬａｃＮＡｃ
（Ｎ−アセチルラクトサミン）コア構造として１０糖以
下の単糖単位を有する（Stroud et al., 1996,Biochemi
stry 35:758-769）。Ｅ−セレクチン結合性フラクショ
ンは、全て、末端のＧａｌ（ガラクトース）がα２→３
シアリル化され、末端から２番目以外の内部ＧｌｃＮＡ
ｃが２またはそれ以上α１→３フコシル化されていた
（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm
un. 209:777-787; Stroud et al.,1996, Biochemistry
35:770-778 ）。これらの結合性フラクションは、「ミ
エログリカン」と総称された。内部ＧｌｃＮＡｃがα１
→３フコシル化され、ＳＬｅx 末端を有するポリ−Ｌａ
ｃＮＡｃの極小成分もあった。ヒト好中球およびＨＬ６
０細胞の主要なＥ−セレクチン結合部位は、ミエログリ
カン・タイプであって、ＳＬｅx 含有グリカンではない
と結論された。実験したミエログリカンまたはポリ−Ｌ
ａｃＮＡｃ・ＳＬｅx 構造は、いずれもＰ−セレクチン
結合を示さなかった（Stroud et al., 1996, Biochemis
try 35:758-769; Stroud et al., 1996,Biochemistry 3
5:770-778）。
【００１９】
３． 本発明の要約 本発明は、一般的には、動的流動条件下において、糖鎖
でコートした表面上でＥ−セレクチン発現性細胞のロー
リングおよび接着を可能にする該糖鎖を有する実質的に
純粋な化合物に関するものである。該動的流動条件と
は、人体内において発生する生理的せん断応力、例え
ば、血流によって生ずるせん断応力と同等な条件のこと
である。本発明化合物は、好ましくはヒト好中球または
それに類する細胞に存在する糖鎖を有するものである。
でコートした表面上でＥ−セレクチン発現性細胞のロー
リングおよび接着を可能にする該糖鎖を有する実質的に
純粋な化合物に関するものである。該動的流動条件と
は、人体内において発生する生理的せん断応力、例え
ば、血流によって生ずるせん断応力と同等な条件のこと
である。本発明化合物は、好ましくはヒト好中球または
それに類する細胞に存在する糖鎖を有するものである。
【００２０】本発明は、特に、実質的に純粋なミエロロ
ーリン、ミエロローリン疑似物または該化合物群を含む
組成物に関するものである。ミエロローリンは、次の一
群のＳＬｅx 非含有構造Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙに
よって具現され、該構造は末端がα２→３シアリル化さ
れ、内部が末端から２番目のＧｌｃＮＡｃを除いた、種
々のＧｌｃＮＡｃ残基においてフコシル化されている、
非分枝ポリラクトサミンである。
ーリン、ミエロローリン疑似物または該化合物群を含む
組成物に関するものである。ミエロローリンは、次の一
群のＳＬｅx 非含有構造Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙに
よって具現され、該構造は末端がα２→３シアリル化さ
れ、内部が末端から２番目のＧｌｃＮＡｃを除いた、種
々のＧｌｃＮＡｃ残基においてフコシル化されている、
非分枝ポリラクトサミンである。
【００２１】
【化２１】 式中、→は共有結合を示し；ＲおよびＲ’はそれぞれＨ
原子、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖（但し、Ｒ’のオ
リゴ糖はいかなるラクトサミン残基も有しない）、セラ
ミド残基、置換若しくは非置換のアリール基、炭素原子
数１〜１０のアルキル、アルケニル若しくはヒドロキシ
アルキル基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそれ
らの共有結合した化合物である。
原子、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖（但し、Ｒ’のオ
リゴ糖はいかなるラクトサミン残基も有しない）、セラ
ミド残基、置換若しくは非置換のアリール基、炭素原子
数１〜１０のアルキル、アルケニル若しくはヒドロキシ
アルキル基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそれ
らの共有結合した化合物である。
【００２２】ミエロローリン含有構造、特にガングリオ
シドとして人体中に存在するものは、Ｅ−セレクチン発
現性細胞上にミエロローリンが惹起したローリングおよ
び接着をブロックする抗体と同様に、炎症性反応、特に
慢性関節リウマチ、腎疾患および肝炎などの慢性状態を
抑制する有用な試薬である。
シドとして人体中に存在するものは、Ｅ−セレクチン発
現性細胞上にミエロローリンが惹起したローリングおよ
び接着をブロックする抗体と同様に、炎症性反応、特に
慢性関節リウマチ、腎疾患および肝炎などの慢性状態を
抑制する有用な試薬である。
【００２３】ミエロローリンの混合物の方が、単一分子
種よりむしろ、Ｅ−セレクチン発現性細胞のより強いロ
ーリングおよび接着を惹起する。従って、ミエロローリ
ンの混合物は、炎症性反応抑制に特に有用な試薬であ
る。
種よりむしろ、Ｅ−セレクチン発現性細胞のより強いロ
ーリングおよび接着を惹起する。従って、ミエロローリ
ンの混合物は、炎症性反応抑制に特に有用な試薬であ
る。
【００２４】本発明は、Ｅ−セレクチン発現性細胞が、
ミエロローリン含有ガングリオシドでコートした表面に
接着しローリングしたという、驚くべき発見に基づくも
のである。
ミエロローリン含有ガングリオシドでコートした表面に
接着しローリングしたという、驚くべき発見に基づくも
のである。
【００２５】３．１ 略語および定義 以下の略語は、本明細書全般にわたって用いられる：
ＢＳＡ、ウシの血清アルブミン； ＣＩＤ、衝突活性化
開裂； ＣＨＯ 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細
胞； ＥＣ、内皮細胞； ＥＤＴＡ、エチレンジアミン
テトラ酢酸；ＥＳ−ＭＳ、電子スプレー質量分析法；Ｆ
ＡＢＭＳ、高速原子衝撃質量分析法；Ｆｒ．、フラクシ
ョン； ＧＳＬ、スフィンゴ糖脂質； Ｉｇ、免疫グロ
ブリン； ＩＨＷ、イソプロパノール／ヘキサン／水；
ｍＡｂ、モノクローナル抗体； ＭＦＩ、平均蛍光強
度； ＮＭＲ、核磁気共鳴； ＰＬＡ、ポリラクトサミ
ン； ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水； Ｓｄｉｙ2 ま
たはＳＬｅx −Ｌｅx、シアロシルＬｅx −Ｌｅx ；
ＳＬｅx 、シアロシル−Ｌｅx ； ＳＬｅa 、シアロシ
ル−Ｌｅa ； Ｓｔｒ．、構造（類）； ＴＬＣ、薄層
クロマトグラフィー。糖脂質の略語は、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ生化学命名委員会の勧告（Lipids 12:455-463, 197
7 ）に従った；しかし、接尾語−ＯｓｅＣｅｒは、−Ｃ
ｅｒに短縮した。特に、シアロシル−Ｌｅx およびシア
ロシルＬｅx −Ｌｅx は以下の構造を有する：
ＢＳＡ、ウシの血清アルブミン； ＣＩＤ、衝突活性化
開裂； ＣＨＯ 細胞、チャイニーズハムスター卵巣細
胞； ＥＣ、内皮細胞； ＥＤＴＡ、エチレンジアミン
テトラ酢酸；ＥＳ−ＭＳ、電子スプレー質量分析法；Ｆ
ＡＢＭＳ、高速原子衝撃質量分析法；Ｆｒ．、フラクシ
ョン； ＧＳＬ、スフィンゴ糖脂質； Ｉｇ、免疫グロ
ブリン； ＩＨＷ、イソプロパノール／ヘキサン／水；
ｍＡｂ、モノクローナル抗体； ＭＦＩ、平均蛍光強
度； ＮＭＲ、核磁気共鳴； ＰＬＡ、ポリラクトサミ
ン； ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水； Ｓｄｉｙ2 ま
たはＳＬｅx −Ｌｅx、シアロシルＬｅx −Ｌｅx ；
ＳＬｅx 、シアロシル−Ｌｅx ； ＳＬｅa 、シアロシ
ル−Ｌｅa ； Ｓｔｒ．、構造（類）； ＴＬＣ、薄層
クロマトグラフィー。糖脂質の略語は、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ生化学命名委員会の勧告（Lipids 12:455-463, 197
7 ）に従った；しかし、接尾語−ＯｓｅＣｅｒは、−Ｃ
ｅｒに短縮した。特に、シアロシル−Ｌｅx およびシア
ロシルＬｅx −Ｌｅx は以下の構造を有する：
【００２６】
【化２２】 上記式に示すように、糖内のグリコシド−ＯＨの位置を
示す数字「１」および隣接糖との結合を示す矢印は、別
に表示しない限り、本明細書中では、簡略化の目的から
省略した。
示す数字「１」および隣接糖との結合を示す矢印は、別
に表示しない限り、本明細書中では、簡略化の目的から
省略した。
【００２７】４． 本発明の詳細な説明 本発明は、実質的に純粋なミエロローリン、疑似物およ
びそれらの組成物を提供するものである。本発明は、さ
らに種々の疾患の根元をなす細胞相互作用を抑制するた
めに、ミエロローリン、疑似物およびそれらの組成物並
びに抗ミエロローリン抗体の使用方法を提供するもので
ある。ミエロローリンは、動物細胞から単離することが
できる。ミエロローリンおよび疑似物は、人工的に合成
することも可能である。ミエロローリンは、表面をコー
トすると、該表面上で動的流動条件下において、Ｅ−セ
レクチン発現性細胞のローリング、接着および流れを惹
起する能力を有する。
びそれらの組成物を提供するものである。本発明は、さ
らに種々の疾患の根元をなす細胞相互作用を抑制するた
めに、ミエロローリン、疑似物およびそれらの組成物並
びに抗ミエロローリン抗体の使用方法を提供するもので
ある。ミエロローリンは、動物細胞から単離することが
できる。ミエロローリンおよび疑似物は、人工的に合成
することも可能である。ミエロローリンは、表面をコー
トすると、該表面上で動的流動条件下において、Ｅ−セ
レクチン発現性細胞のローリング、接着および流れを惹
起する能力を有する。
【００２８】本発明のミエロローリンおよび疑似物は、
適切な手順により選別することができる。それにはＶ手
順が含まれ、該手順は、ヒト好中球またはそれと類似し
た他の細胞が発現したガングリオシドのようなプローブ
物質を固相に固定し、これにヒトの体内で起こりうるせ
ん断応力下で、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のよう
な、Ｅ−セレクチン発現性細胞を添加し、単位時間内に
おける該固相上での該細胞のローリング、接着および流
れを観察し、かつ、その結果として、ローリングを惹起
する物質を選別することを含む。ヒトの体内で起こりう
るせん断応力とは、好ましくはヒト血流によって生ずる
せん断応力を意味し、好ましい範囲としては、０．８〜
１２ｄｙｎｅ／ｃｍ2 が挙げられる。
適切な手順により選別することができる。それにはＶ手
順が含まれ、該手順は、ヒト好中球またはそれと類似し
た他の細胞が発現したガングリオシドのようなプローブ
物質を固相に固定し、これにヒトの体内で起こりうるせ
ん断応力下で、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のよう
な、Ｅ−セレクチン発現性細胞を添加し、単位時間内に
おける該固相上での該細胞のローリング、接着および流
れを観察し、かつ、その結果として、ローリングを惹起
する物質を選別することを含む。ヒトの体内で起こりう
るせん断応力とは、好ましくはヒト血流によって生ずる
せん断応力を意味し、好ましい範囲としては、０．８〜
１２ｄｙｎｅ／ｃｍ2 が挙げられる。
【００２９】ミエロローリンまたは疑似物は、ガラス・
スライドに固定されたポリスチレン・ビーズ上に接着す
ることができる。該ポリスチレン・ビーズは、次いで平
行層流チャンバー・アッセンブリー中に設置して、所定
のせん断応力の動的流動条件下における、Ｅ−セレクチ
ン発現性細胞のローリングおよび接着の測定に用いる。
使用する装置は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood
75:227 ）に記載されているものと同様のものであって
もよい。
スライドに固定されたポリスチレン・ビーズ上に接着す
ることができる。該ポリスチレン・ビーズは、次いで平
行層流チャンバー・アッセンブリー中に設置して、所定
のせん断応力の動的流動条件下における、Ｅ−セレクチ
ン発現性細胞のローリングおよび接着の測定に用いる。
使用する装置は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood
75:227 ）に記載されているものと同様のものであって
もよい。
【００３０】本発明によれば、ミエロローリンは、下記
の構造を有し、それは、少なくとも６個の単糖類（３個
のラクトサミン繰り返し単位が示されている）からな
り、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が、末端
から２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基単独の場合
を除き、種々のＮ−アセチルグルコサミン残基において
α１→３フコシル化されている、一群の非分枝ポリラク
トサミンを包含する。
の構造を有し、それは、少なくとも６個の単糖類（３個
のラクトサミン繰り返し単位が示されている）からな
り、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が、末端
から２番目のＮ−アセチルグルコサミン残基単独の場合
を除き、種々のＮ−アセチルグルコサミン残基において
α１→３フコシル化されている、一群の非分枝ポリラク
トサミンを包含する。
【００３１】
【化２３】 式中、各Ｒ1 は、独立に、−ＯＨおよびα１→３フコー
ス（Ｃ6 Ｈ12Ｏ5 ）から選択される。但し、少なくとも
１個のＲ1 はα１→３フコースであるものとする。
ス（Ｃ6 Ｈ12Ｏ5 ）から選択される。但し、少なくとも
１個のＲ1 はα１→３フコースであるものとする。
【００３２】ミエロローリンの具体例としては、以下の
構造を有する化合物を含む。
構造を有する化合物を含む。
【００３３】
【化２１】式中、→は共有結合を示し； ＲおよびＲ’
は、それぞれＨ原子、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖
（いかなるラクトサミン残基も有しないＲ’を除く）、
セラミド残基、置換若しくは非置換のアリール基、炭素
原子数１〜１０のアルキル、アルケニル若しくはヒドロ
キシアルキル基、薬学的に活性な成分、固体担体または
それらの共有結合した化合物である。
は、それぞれＨ原子、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖
（いかなるラクトサミン残基も有しないＲ’を除く）、
セラミド残基、置換若しくは非置換のアリール基、炭素
原子数１〜１０のアルキル、アルケニル若しくはヒドロ
キシアルキル基、薬学的に活性な成分、固体担体または
それらの共有結合した化合物である。
【００３４】基ＲおよびＲ’は、上記構造式の還元末端
のＧｌｃＮＡｃと、ジアミン、アミノアルコール、アミ
ノ酸、ペプチドのような適切なスペーサーを介して、共
有結合してもよい。アリール基の置換基としては、炭素
原子数１〜６のアルキル、アルケニルおよびアルキニル
基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基並びにカ
ルボキシル基が挙げられる。複合脂質または単純脂質の
中では、セラミドが最も好ましく、また天然に産するミ
エロローリンの脂質担体でもある。グリセロ脂質は、ジ
アシルグリセロールおよび同類の中性脂質を含む。かか
る脂質中のアシル基の鎖の長さおよび不飽和度は特に限
定されない。
のＧｌｃＮＡｃと、ジアミン、アミノアルコール、アミ
ノ酸、ペプチドのような適切なスペーサーを介して、共
有結合してもよい。アリール基の置換基としては、炭素
原子数１〜６のアルキル、アルケニルおよびアルキニル
基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基並びにカ
ルボキシル基が挙げられる。複合脂質または単純脂質の
中では、セラミドが最も好ましく、また天然に産するミ
エロローリンの脂質担体でもある。グリセロ脂質は、ジ
アシルグリセロールおよび同類の中性脂質を含む。かか
る脂質中のアシル基の鎖の長さおよび不飽和度は特に限
定されない。
【００３５】薬学的に活性な成分は、ＲまたはＲ’を形
成し、以下の非ステロイド系抗炎症性薬剤を含むが、そ
れのみに限定されるものではない：サリチル酸誘導体
（例えば、アスピリン）；アリール酢酸誘導体（例え
ば、インドメタシン）；プロピオン酸誘導体（例えば、
イブプロフェン）；ピラゾロン誘導体（例えば、フェニ
ルブタゾン）；オキシカム誘導体（例えば、ピロキシカ
ム）；およびエピリゾール並びにその類似物などが挙げ
られる。
成し、以下の非ステロイド系抗炎症性薬剤を含むが、そ
れのみに限定されるものではない：サリチル酸誘導体
（例えば、アスピリン）；アリール酢酸誘導体（例え
ば、インドメタシン）；プロピオン酸誘導体（例えば、
イブプロフェン）；ピラゾロン誘導体（例えば、フェニ
ルブタゾン）；オキシカム誘導体（例えば、ピロキシカ
ム）；およびエピリゾール並びにその類似物などが挙げ
られる。
【００３６】本発明は、さらに、以下の構造を有するミ
エロローリン疑似物を提供するものである。該構造は、
少なくとも６個の単糖類からなり、かつ末端がα２→３
シアリル化され、内部が、末端から２番目のＮ−アセチ
ルグルコサミン残基単独の場合を除き、種々のＮ−アセ
チルグルコサミン残基においてα１→３フコシル化され
た、一群の非分枝ポリラクトサミンを包含する。
エロローリン疑似物を提供するものである。該構造は、
少なくとも６個の単糖類からなり、かつ末端がα２→３
シアリル化され、内部が、末端から２番目のＮ−アセチ
ルグルコサミン残基単独の場合を除き、種々のＮ−アセ
チルグルコサミン残基においてα１→３フコシル化され
た、一群の非分枝ポリラクトサミンを包含する。
【００３７】
【化１】式中、Ｒ1 はα１→３フコース、Ｒ2 は−ＯＨ
またはフコースのいずれか一方、ａは２〜６の整数、ｂ
は１〜６の整数を示す。
またはフコースのいずれか一方、ａは２〜６の整数、ｂ
は１〜６の整数を示す。
【００３８】ミエロローリン疑似物の具体例は、以下の
構造を有するものを含む。
構造を有するものを含む。
【００３９】
【化２４】 式中、→は共有結合を示し；Ｒは上記ミエロローリンの
それと同一である。
それと同一である。
【００４０】ミエロローリン疑似物の構造は、ミエロロ
ーリン（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙ）の構造
とは異なり、しかも、ポリラクトサミン鎖に沿って異な
った位置（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の内部ＧｌｃＮＡ
ｃにおける、シアロシル残基（ＳＡ）およびフコシル残
基の、可能な立体的配置によってさらに限定される。ポ
リ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（［３Ｇａｌβ１→４
ＧｌｃＮＡｃβ１→］ｎ ）が、らせん状構造を持って
いることは周知である（Niemann et al., 1978, Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 81:1286-1293; Rees, D.A.,
1975, MTP International Review of Science 5:1-42,
ed. Whelan, W., Butterworths (London) University
Park Press (Baltimore); Atkins et al., 1974, Polym
er 15:263-271 ）。ミエロローリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよ
びＸ、Ｙの疑似物は、立体的配置すなわち、シアル酸の
位置およびフコシル残基の異なった部位に基づいて組み
立てられていると考えられる。フコシル残基の配向およ
びこれとシアル酸位置との関係は最も重要である（第７
図参照）。
ーリン（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＸ、Ｙ）の構造
とは異なり、しかも、ポリラクトサミン鎖に沿って異な
った位置（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の内部ＧｌｃＮＡ
ｃにおける、シアロシル残基（ＳＡ）およびフコシル残
基の、可能な立体的配置によってさらに限定される。ポ
リ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（［３Ｇａｌβ１→４
ＧｌｃＮＡｃβ１→］ｎ ）が、らせん状構造を持って
いることは周知である（Niemann et al., 1978, Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 81:1286-1293; Rees, D.A.,
1975, MTP International Review of Science 5:1-42,
ed. Whelan, W., Butterworths (London) University
Park Press (Baltimore); Atkins et al., 1974, Polym
er 15:263-271 ）。ミエロローリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよ
びＸ、Ｙの疑似物は、立体的配置すなわち、シアル酸の
位置およびフコシル残基の異なった部位に基づいて組み
立てられていると考えられる。フコシル残基の配向およ
びこれとシアル酸位置との関係は最も重要である（第７
図参照）。
【００４１】ミエロローリンは、以下に記載する通り、
ＨＬ６０細胞またはＵ９３７細胞を大規模培養すること
によって製造することが可能である。ミエロローリンお
よび疑似物は、Ｎ−アセチルラクトサミンを重合し、ひ
き続いてシアロシル転移酵素およびフコシルトランスフ
ェラーゼで、それぞれ、α２→３シアリル化およびα１
→３フコシル化することによって大量に合成できる。
ＨＬ６０細胞またはＵ９３７細胞を大規模培養すること
によって製造することが可能である。ミエロローリンお
よび疑似物は、Ｎ−アセチルラクトサミンを重合し、ひ
き続いてシアロシル転移酵素およびフコシルトランスフ
ェラーゼで、それぞれ、α２→３シアリル化およびα１
→３フコシル化することによって大量に合成できる。
【００４２】具体的には、ミエロローリン誘導体は、
（ａ）非還元末端にα２→３シアロシル残基を有し、内
部のＧｌｃＮＡｃにα１→３フコシル残基を有している
が、該フコシル残基が末端から２番目のＧｌｃＮＡｃに
だけではない、非分枝ポリラクトサミンを、直接または
スペーサーを介して、（ｂ）置換若しくは非置換のアリ
ールハライド、１〜１０の炭素原子を有するアルキル、
アルケニル若しくはヒドロキシルアルキルハライド、複
合脂質、単純脂質、オリゴ糖、セラミド、薬学的に活性
な成分、固体担体またはそれらの共有結合した化合物
と、還元末端の糖残基のグリコシル化のような既知方法
を用いて、反応させることによって得ることができる。
（ａ）非還元末端にα２→３シアロシル残基を有し、内
部のＧｌｃＮＡｃにα１→３フコシル残基を有している
が、該フコシル残基が末端から２番目のＧｌｃＮＡｃに
だけではない、非分枝ポリラクトサミンを、直接または
スペーサーを介して、（ｂ）置換若しくは非置換のアリ
ールハライド、１〜１０の炭素原子を有するアルキル、
アルケニル若しくはヒドロキシルアルキルハライド、複
合脂質、単純脂質、オリゴ糖、セラミド、薬学的に活性
な成分、固体担体またはそれらの共有結合した化合物
と、還元末端の糖残基のグリコシル化のような既知方法
を用いて、反応させることによって得ることができる。
【００４３】本発明は、また、第２の細胞（例えば、内
皮細胞または他のＥ−セレクチン発現性細胞）上に発現
されたＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を惹
起するリガンドを発現する第１の細胞（例えば、ヒト好
中球または白血球）を、少なくとも６個の単糖類を含
み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシ
ル化されているが、該フコシル化は、末端から２番目の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基単独ではない、少なくと
も１種の非分枝ポリラクトサミンの、Ｅ−セレクチン依
存性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露するこ
とを含む、細胞相互作用の抑制方法を提供する。
皮細胞または他のＥ−セレクチン発現性細胞）上に発現
されたＥ−セレクチン依存性ローリングおよび接着を惹
起するリガンドを発現する第１の細胞（例えば、ヒト好
中球または白血球）を、少なくとも６個の単糖類を含
み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシ
ル化されているが、該フコシル化は、末端から２番目の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基単独ではない、少なくと
も１種の非分枝ポリラクトサミンの、Ｅ−セレクチン依
存性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露するこ
とを含む、細胞相互作用の抑制方法を提供する。
【００４４】更に、本発明は、第２の細胞（例えば、内
皮細胞または他のＥ−セレクチン発現性細胞）上に発現
されたＥ−セレクチンに依存するローリングおよび接着
を惹起するリガンドを発現する第１の細胞（例えば、ヒ
ト好中球または白血球）を、少なくとも６個の単糖類を
含み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々
のＮ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコ
シル化されているが、該フコシル化は末端から２番目の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基単独ではない、非分枝ポ
リラクトサミンと結合する抗体の、Ｅ−セレクチン依存
性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露すること
を含む、細胞相互作用の抑制方法を提供する。しかも、
該抗体は、生体外での動的流動条件下における上記第１
の細胞と第２の細胞との接着を抑制することによって更
に特徴付けられている。
皮細胞または他のＥ−セレクチン発現性細胞）上に発現
されたＥ−セレクチンに依存するローリングおよび接着
を惹起するリガンドを発現する第１の細胞（例えば、ヒ
ト好中球または白血球）を、少なくとも６個の単糖類を
含み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々
のＮ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコ
シル化されているが、該フコシル化は末端から２番目の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基単独ではない、非分枝ポ
リラクトサミンと結合する抗体の、Ｅ−セレクチン依存
性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露すること
を含む、細胞相互作用の抑制方法を提供する。しかも、
該抗体は、生体外での動的流動条件下における上記第１
の細胞と第２の細胞との接着を抑制することによって更
に特徴付けられている。
【００４５】ＨＬ６０細胞からのミエロローリン調製 ＨＬ６０細胞。 ＨＬ６０細胞は、最初、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取
得し、かつ１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ内で増殖さ
せた。細胞を３７℃の温度で、５％ＣＯ2 の中で維持
し、回転瓶内で２サイクルにわたって拡大して、多量の
細胞を集めた後、遠心分離にかけることによって採取す
る。この方法により培養されたＨＬ６０細胞は、ＣＯ2
培養器の中で継続的に培養されたＨＬ６０細胞と同レベ
ルのＥ−セレクチン結合活性を示した。すなわち、この
方法により回転瓶内で大規模培養しても、Ｅ−セレクチ
ン結合活性を殆ど低下させなかった。概して、１２００
ｍＬのパックされたＨＬ６０細胞は、約４００ｍＬのパ
ックされた部分に分け、各部分は、次節で記載する方法
で抽出した。
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から取
得し、かつ１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ内で増殖さ
せた。細胞を３７℃の温度で、５％ＣＯ2 の中で維持
し、回転瓶内で２サイクルにわたって拡大して、多量の
細胞を集めた後、遠心分離にかけることによって採取す
る。この方法により培養されたＨＬ６０細胞は、ＣＯ2
培養器の中で継続的に培養されたＨＬ６０細胞と同レベ
ルのＥ−セレクチン結合活性を示した。すなわち、この
方法により回転瓶内で大規模培養しても、Ｅ−セレクチ
ン結合活性を殆ど低下させなかった。概して、１２００
ｍＬのパックされたＨＬ６０細胞は、約４００ｍＬのパ
ックされた部分に分け、各部分は、次節で記載する方法
で抽出した。
【００４６】糖脂質抽出。 おおよそ１００ｍＬのパッ
クされたヒト好中球または４００ｍＬのパックされたＨ
Ｌ６０細胞を、ＩＨＷ（５５：２５：２０）の下相の１
０容量を用い、Ｗａｒｉｎｇ混合機の中でホモジナイズ
して抽出した。該抽出物をＷｈａｔｍａｎ＃１フィルタ
ーを通して濾過し、残渣は上記のようにして再抽出し
た。該抽出／濾過手順を、もう一度繰り返し行い、寄せ
集めた濾液はＢｒｉｎｋｍａｎｎ回転減圧蒸発機を使用
して減圧下４０℃の温度で濃縮した。該濃縮抽出物は、
水５００ｍＬを含む３Ｌのクロロフォルム／メタノール
（Ｃ／Ｍ；２：１）中に残渣を溶解させて、Ｆｏｌｃｈ
分配にかけた。該抽出物を激しく振盪した後、２つの半
透明相が現れるまで（約８時間）分離にまかせた。上相
を除去し、下相はＣ／Ｍ／１％ＫＣｌ（１：１０：１
０）を元の容積になるまで添加して、再抽出した。該液
体抽出手順を２度繰り返し、寄せ集めた上相は、回転減
圧蒸発機で濃縮し、水中で再構成し、かつＳｐｅｃｔｒ
ｏｐｏｒ ３透析チューブ（ＭＷ カットオフ＝３５０
０）を使用し、脱イオン水に対して、徹底的に透析し
た。
クされたヒト好中球または４００ｍＬのパックされたＨ
Ｌ６０細胞を、ＩＨＷ（５５：２５：２０）の下相の１
０容量を用い、Ｗａｒｉｎｇ混合機の中でホモジナイズ
して抽出した。該抽出物をＷｈａｔｍａｎ＃１フィルタ
ーを通して濾過し、残渣は上記のようにして再抽出し
た。該抽出／濾過手順を、もう一度繰り返し行い、寄せ
集めた濾液はＢｒｉｎｋｍａｎｎ回転減圧蒸発機を使用
して減圧下４０℃の温度で濃縮した。該濃縮抽出物は、
水５００ｍＬを含む３Ｌのクロロフォルム／メタノール
（Ｃ／Ｍ；２：１）中に残渣を溶解させて、Ｆｏｌｃｈ
分配にかけた。該抽出物を激しく振盪した後、２つの半
透明相が現れるまで（約８時間）分離にまかせた。上相
を除去し、下相はＣ／Ｍ／１％ＫＣｌ（１：１０：１
０）を元の容積になるまで添加して、再抽出した。該液
体抽出手順を２度繰り返し、寄せ集めた上相は、回転減
圧蒸発機で濃縮し、水中で再構成し、かつＳｐｅｃｔｒ
ｏｐｏｒ ３透析チューブ（ＭＷ カットオフ＝３５０
０）を使用し、脱イオン水に対して、徹底的に透析し
た。
【００４７】 陰イオン交換クロマトグ
ラフィー。 透析に続いて、上相抽出物を上記のように
蒸発乾固し、加温（３７℃）と超音波処理の組み合わせ
により、５０ｍＬのＣ／Ｍ／水（３０：６０：８）に溶
解した。不溶性物質は１０分間１０００ｘｇで遠心分離
にかけ除去し、同じ溶媒５０ｍＬを追加して、超音波処
理により再抽出した。上記の遠心分離に引き続いて、寄
せ集められた上清をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
（ベッド・ボリューム３００ｍＬ；酢酸塩型）にかけ、
２ＬのＣ／Ｍ／水（３０：６０：８）で洗浄し、全ての
中性脂質を除去した。該カラムは、５００ｍＬのメタノ
ールで平衡化し、モノシアロガングリオシド・フラクシ
ョンは、２Ｌの０．０５ Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ含有メタノ
ールで溶出した。引き続いてジ−、トリ−、およびポリ
シアロシルガングリオシドの除去を、それぞれ、０．１
５Ｍ、０．４５Ｍおよび１．０ＭのＮＨ4 ＯＡｃによる
段階的溶出によって行った。該溶出ガングリオシド・フ
ラクションを回転減圧蒸発により乾燥し、水に対して透
析し、かつ上記のように乾燥した。
ラフィー。 透析に続いて、上相抽出物を上記のように
蒸発乾固し、加温（３７℃）と超音波処理の組み合わせ
により、５０ｍＬのＣ／Ｍ／水（３０：６０：８）に溶
解した。不溶性物質は１０分間１０００ｘｇで遠心分離
にかけ除去し、同じ溶媒５０ｍＬを追加して、超音波処
理により再抽出した。上記の遠心分離に引き続いて、寄
せ集められた上清をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
（ベッド・ボリューム３００ｍＬ；酢酸塩型）にかけ、
２ＬのＣ／Ｍ／水（３０：６０：８）で洗浄し、全ての
中性脂質を除去した。該カラムは、５００ｍＬのメタノ
ールで平衡化し、モノシアロガングリオシド・フラクシ
ョンは、２Ｌの０．０５ Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ含有メタノ
ールで溶出した。引き続いてジ−、トリ−、およびポリ
シアロシルガングリオシドの除去を、それぞれ、０．１
５Ｍ、０．４５Ｍおよび１．０ＭのＮＨ4 ＯＡｃによる
段階的溶出によって行った。該溶出ガングリオシド・フ
ラクションを回転減圧蒸発により乾燥し、水に対して透
析し、かつ上記のように乾燥した。
【００４８】ＨＬ６０細胞からのモノシアロガングリオ
シドの精製：高性能液体クロマトグラフィー。 該モノ
シアロガングリオシド・フラクションを、１０ｍＬのＩ
ＨＷ中に可溶化し、蒸発用フラスコから１５ｍＬ試験管
へ移した。サンプルは、Ｎ−ＥＶＡＰ（Organomation I
nc. ）を使用し、Ｎ2 下で完全に乾燥し、２ｍＬのＩＨ
Ｗ中で超音波処理により再構成した。該サンプルを、Ｉ
ＨＷ（５５：４０：５）で前もって平衡化した、調製用
イアトロビーズ・カラム（６ＲＳ−８０１０；０．８ｘ
６０ｃｍ；Iatron Laboratories Inc., Kanda/Tokyo, J
apan）上に注入し、かつ、１ｍＬ／分の流速で、ＩＨＷ
５５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配に委ね
た。４ｍＬのフラクションを集めるのに、４００分以上
かかった。各フラクションを、ＨＰＴＬＣプレート上に
スポットし、適正な溶媒系（以下に記載）で展開し、
０．５％オルシノール含有２Ｎ硫酸をスプレーして可視
化し、移動を基準にプールした。ＴＬＣで１つ以上のバ
ンドを含むプールしたフラクションは、Ｎ2 下で乾燥
し、１ｍＬのＩＨＷ中に再溶解し、かつ、半調製用のイ
アトロビーズ・カラム（０．４ｘ６０ｃｍ）上に注入し
た。流速０．５ｍＬ／分で、２００分以上、ＩＨＷ５
５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配を使用し
た。１ｍＬのフラクションを集め、ＨＰＴＬＣの移動を
基準にプールした。ＨＰＴＬＣで単一バンドを含むフラ
クションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ＣａＣｌ2 （５０：５
５：１９）中の移動の順序に従って標識した；すなわ
ち、最も速い移動バンドは＃１と、最も遅いものは＃２
０と標識した。複数バンドを含むフラクションは、調製
用ＨＰＴＬＣにより更に精製した。
シドの精製：高性能液体クロマトグラフィー。 該モノ
シアロガングリオシド・フラクションを、１０ｍＬのＩ
ＨＷ中に可溶化し、蒸発用フラスコから１５ｍＬ試験管
へ移した。サンプルは、Ｎ−ＥＶＡＰ（Organomation I
nc. ）を使用し、Ｎ2 下で完全に乾燥し、２ｍＬのＩＨ
Ｗ中で超音波処理により再構成した。該サンプルを、Ｉ
ＨＷ（５５：４０：５）で前もって平衡化した、調製用
イアトロビーズ・カラム（６ＲＳ−８０１０；０．８ｘ
６０ｃｍ；Iatron Laboratories Inc., Kanda/Tokyo, J
apan）上に注入し、かつ、１ｍＬ／分の流速で、ＩＨＷ
５５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配に委ね
た。４ｍＬのフラクションを集めるのに、４００分以上
かかった。各フラクションを、ＨＰＴＬＣプレート上に
スポットし、適正な溶媒系（以下に記載）で展開し、
０．５％オルシノール含有２Ｎ硫酸をスプレーして可視
化し、移動を基準にプールした。ＴＬＣで１つ以上のバ
ンドを含むプールしたフラクションは、Ｎ2 下で乾燥
し、１ｍＬのＩＨＷ中に再溶解し、かつ、半調製用のイ
アトロビーズ・カラム（０．４ｘ６０ｃｍ）上に注入し
た。流速０．５ｍＬ／分で、２００分以上、ＩＨＷ５
５：４０：５から５５：２５：２０の直線勾配を使用し
た。１ｍＬのフラクションを集め、ＨＰＴＬＣの移動を
基準にプールした。ＨＰＴＬＣで単一バンドを含むフラ
クションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ＣａＣｌ2 （５０：５
５：１９）中の移動の順序に従って標識した；すなわ
ち、最も速い移動バンドは＃１と、最も遅いものは＃２
０と標識した。複数バンドを含むフラクションは、調製
用ＨＰＴＬＣにより更に精製した。
【００４９】高性能薄層クロマトグラフィー。 モノシ
アロガングリオシド・フラクションは、ＨＰＴＬＣによ
っては単一バンドには分離されなかったので、調製用Ｈ
ＰＴＬＣによって分離した。バンド１〜７を含むフラク
ションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ＣａＣｌ2 （５０：４０：
１０）溶媒系中で分離した。バンド８〜１４を含むフラ
クションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ ＣａＣｌ2 （５０：５
５：１９）中で分離した。Ｆｒ．１２および１３は、イ
ソプロパノール／水／ＮＨ4 ＯＨ（６：３．２：１）の
溶媒系を使用して、更に（それぞれ、Ｆｒ．１２−１〜
１２−５および１３−１〜１３−３）に分離した。調製
用ＴＬＣは、５０μＬのサンプルを１０ｘ２０ｃｍＨＰ
ＴＬＣシリカゲル・プレート（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
６０；EM Science, Gibbstown, NJ ）を横切るようにす
じ状に塗布して行い、乾燥し、かつ、適正な溶媒系で展
開した。該プレートは乾燥し、かつ、バンドは、０．０
３％プリムリン含有８０％アセトンをスプレーして可視
化した。該バンドは、ＵＶ光線下において、鉛筆でマー
クした。マークされたバンドは、かみそりの刃を用いて
プレートからかき取り、ガングリオシドは、ＩＨＷ（５
５：２５：２０；２ｍＬ／バンド）中で２０分間、超音
波処理してシリカから抽出した。該シリカは、１０００
ｘｇで１０分間遠心分離にかけて除去し、上記のように
再抽出し、よせ集めた上清は、Ｎ2 下で乾燥した。サン
プルは、５ｍＬのメタノールと５ｍＬの水で順に洗った
後、１ｍＬのＰＢＳに溶かした。それをあらかじめＰＢ
Ｓで平衡化したカラムにかけ、１ｃｃのｔＣ−１８ Ｓ
ｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Waters, Milford, MA ）に
かけることできれいにされた。サンプルを保持させた
ら、該カラムを１０ｍＬの水に続いて１０ｍＬの５０％
メタノールで洗浄し、次いで１０ｍＬの１００％メタノ
ール中に溶出した。該サンプルは、Ｎ2 下で乾燥し、１
ｍＬのＩＨＷ（５５：２５：２０）中に溶解し、次いで
上記したように、ＩＨＷ５５：４０：５から５５：２
５：２０の直線勾配、流速１ｍＬ／分、１００分間かけ
て、イアトロビーズ・カラム（０．４ｘ６０ｃｍ）上に
注入した。１ｍＬのフラクションを集め、オルシノール
−硫酸反応を用いて、ＨＰＴＬＣにより可視化した。オ
ルシノール陽性画分を、構造解析に先だって、プールし
かつＮ2 下で乾燥した。
アロガングリオシド・フラクションは、ＨＰＴＬＣによ
っては単一バンドには分離されなかったので、調製用Ｈ
ＰＴＬＣによって分離した。バンド１〜７を含むフラク
ションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ＣａＣｌ2 （５０：４０：
１０）溶媒系中で分離した。バンド８〜１４を含むフラ
クションは、Ｃ／Ｍ／０．５％ ＣａＣｌ2 （５０：５
５：１９）中で分離した。Ｆｒ．１２および１３は、イ
ソプロパノール／水／ＮＨ4 ＯＨ（６：３．２：１）の
溶媒系を使用して、更に（それぞれ、Ｆｒ．１２−１〜
１２−５および１３−１〜１３−３）に分離した。調製
用ＴＬＣは、５０μＬのサンプルを１０ｘ２０ｃｍＨＰ
ＴＬＣシリカゲル・プレート（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
６０；EM Science, Gibbstown, NJ ）を横切るようにす
じ状に塗布して行い、乾燥し、かつ、適正な溶媒系で展
開した。該プレートは乾燥し、かつ、バンドは、０．０
３％プリムリン含有８０％アセトンをスプレーして可視
化した。該バンドは、ＵＶ光線下において、鉛筆でマー
クした。マークされたバンドは、かみそりの刃を用いて
プレートからかき取り、ガングリオシドは、ＩＨＷ（５
５：２５：２０；２ｍＬ／バンド）中で２０分間、超音
波処理してシリカから抽出した。該シリカは、１０００
ｘｇで１０分間遠心分離にかけて除去し、上記のように
再抽出し、よせ集めた上清は、Ｎ2 下で乾燥した。サン
プルは、５ｍＬのメタノールと５ｍＬの水で順に洗った
後、１ｍＬのＰＢＳに溶かした。それをあらかじめＰＢ
Ｓで平衡化したカラムにかけ、１ｃｃのｔＣ−１８ Ｓ
ｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Waters, Milford, MA ）に
かけることできれいにされた。サンプルを保持させた
ら、該カラムを１０ｍＬの水に続いて１０ｍＬの５０％
メタノールで洗浄し、次いで１０ｍＬの１００％メタノ
ール中に溶出した。該サンプルは、Ｎ2 下で乾燥し、１
ｍＬのＩＨＷ（５５：２５：２０）中に溶解し、次いで
上記したように、ＩＨＷ５５：４０：５から５５：２
５：２０の直線勾配、流速１ｍＬ／分、１００分間かけ
て、イアトロビーズ・カラム（０．４ｘ６０ｃｍ）上に
注入した。１ｍＬのフラクションを集め、オルシノール
−硫酸反応を用いて、ＨＰＴＬＣにより可視化した。オ
ルシノール陽性画分を、構造解析に先だって、プールし
かつＮ2 下で乾燥した。
【００５０】抗体調製 Ｂａｌｂ／ｃマウスは、既に記載されたように、静脈内
または腹腔内いずれかに、ヒト好中球またはＨＬ６０細
胞の繰り返し注射を行い、引き続きサルモネラ・ミネソ
タに吸着させたミエロローリン・フラクションを含むモ
ノシアロガングリオシドの追加接種を行って、免疫する
（Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10511-1
0517; Nudelman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13
942-13951 ）。追加接種の３日後、脾臓細胞を採取し、
かつ、ＮＳ−１と融合し、該ハイブリドーマは、精製ミ
エロローリンでコートした９８−ウェルおよびＳＬｅx
またはシアロシルパラグロボシドでコートしたウェルの
結合実験によりスクリーニングした。ミエロローリンを
コートしたプレートとは特異的に反応するが、ＳＬｅx
またはシアロシルパラグロボシドをコートしたプレート
とは反応しない抗体を分泌するハイブリドーマをクロー
ン化した。ミエロローリンへの特異的反応性をもったリ
クローニングに続くクローンの拡大が必要である。
または腹腔内いずれかに、ヒト好中球またはＨＬ６０細
胞の繰り返し注射を行い、引き続きサルモネラ・ミネソ
タに吸着させたミエロローリン・フラクションを含むモ
ノシアロガングリオシドの追加接種を行って、免疫する
（Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10511-1
0517; Nudelman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13
942-13951 ）。追加接種の３日後、脾臓細胞を採取し、
かつ、ＮＳ−１と融合し、該ハイブリドーマは、精製ミ
エロローリンでコートした９８−ウェルおよびＳＬｅx
またはシアロシルパラグロボシドでコートしたウェルの
結合実験によりスクリーニングした。ミエロローリンを
コートしたプレートとは特異的に反応するが、ＳＬｅx
またはシアロシルパラグロボシドをコートしたプレート
とは反応しない抗体を分泌するハイブリドーマをクロー
ン化した。ミエロローリンへの特異的反応性をもったリ
クローニングに続くクローンの拡大が必要である。
【００５１】治療的投与 本発明の抗炎症性ミエロローリン組成物は、予防的炎症
抑制または発症後炎症緩和の必要のある患者に投与す
る。対象ミエロローリン組成物は、好ましくは薬学的に
許容される担体と共に投与される。例えば、リポソーム
に含ませたり、または適正なデザインを有する担体特異
分子と結合させたりすることができる。その性格は、投
与方法によって異なる。例えば、経口投与には、通常、
固体担体が要求される。すなわち、ミエロローリン疑似
物は、経口投与の時にはそのように構成されるが、一
方、静脈投与時には、通常、液体塩溶液担体またはリポ
ソーム懸濁物が要求される。典型的には、注射可能な組
成物は、液体溶液または懸濁物として調製する。また、
注射に先立って、液体ビヒクルに溶解、または懸濁する
のに好適な固体形態で調製することもできる。該化合物
をリポソーム・ビヒクル中に乳化させてもよいし、また
該活性成分をカプセルで包んだものとしてもよく、より
高い活性を示させるためにはより望ましい。
抑制または発症後炎症緩和の必要のある患者に投与す
る。対象ミエロローリン組成物は、好ましくは薬学的に
許容される担体と共に投与される。例えば、リポソーム
に含ませたり、または適正なデザインを有する担体特異
分子と結合させたりすることができる。その性格は、投
与方法によって異なる。例えば、経口投与には、通常、
固体担体が要求される。すなわち、ミエロローリン疑似
物は、経口投与の時にはそのように構成されるが、一
方、静脈投与時には、通常、液体塩溶液担体またはリポ
ソーム懸濁物が要求される。典型的には、注射可能な組
成物は、液体溶液または懸濁物として調製する。また、
注射に先立って、液体ビヒクルに溶解、または懸濁する
のに好適な固体形態で調製することもできる。該化合物
をリポソーム・ビヒクル中に乳化させてもよいし、また
該活性成分をカプセルで包んだものとしてもよく、より
高い活性を示させるためにはより望ましい。
【００５２】好適なビヒクルとしては、例えば、水、生
理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ル、または類似物、およびそれらの組み合わせが挙げら
れる。加うるに、望むならば、該ビヒクルは、湿潤若し
くは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの補助物質を少量含
有してもよい。かかる投与形態の実際的調製方法は、当
業者には知られており、また明らかとなる。例えば、論
文（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publ
ishing Company, Easton, Pa., 17th edition, 1985 ）
を参照のこと。
理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ル、または類似物、およびそれらの組み合わせが挙げら
れる。加うるに、望むならば、該ビヒクルは、湿潤若し
くは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの補助物質を少量含
有してもよい。かかる投与形態の実際的調製方法は、当
業者には知られており、また明らかとなる。例えば、論
文（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publ
ishing Company, Easton, Pa., 17th edition, 1985 ）
を参照のこと。
【００５３】薬学的に許容される製剤には、例えば、医
薬品級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステア
リン酸マグネシウム、サッカリン・セルローズ・ナトリ
ウム、炭酸マグネシウム、および類似物を含む、種々の
賦形剤を用いることができる。経口組成物は、溶液、懸
濁物、錠剤、ピル、カプセル、持続性徐放製剤、若しく
は粉末の形状で服用される。特に有用なのは、対象ミエ
ロローリン分子を、ＤＭＳＯなど浸透増進剤を含む経皮
組成物の形で、直接投与することである。他の局所製剤
を、皮膚の炎症の処置に、投与することもできる。加う
るに、経粘膜性投与は、胆汁酸塩またはフシジン酸誘導
体などの浸透剤を使用し、必要ならば、追加的な界面活
性剤分子と組み合わせて、実施することもできる。これ
らの製剤は、例えば、座薬、鼻腔スプレーの調製に有用
である。座薬用には、ビヒクル組成物は、ポリアルキレ
ングリコールまたはトリグリセリドなど、慣用の結合剤
および担体を含む。かかる座薬は、約０．５から約１０
％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１％から約２％の範囲内
の、活性成分を含む混合物から形成してもよい。
薬品級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステア
リン酸マグネシウム、サッカリン・セルローズ・ナトリ
ウム、炭酸マグネシウム、および類似物を含む、種々の
賦形剤を用いることができる。経口組成物は、溶液、懸
濁物、錠剤、ピル、カプセル、持続性徐放製剤、若しく
は粉末の形状で服用される。特に有用なのは、対象ミエ
ロローリン分子を、ＤＭＳＯなど浸透増進剤を含む経皮
組成物の形で、直接投与することである。他の局所製剤
を、皮膚の炎症の処置に、投与することもできる。加う
るに、経粘膜性投与は、胆汁酸塩またはフシジン酸誘導
体などの浸透剤を使用し、必要ならば、追加的な界面活
性剤分子と組み合わせて、実施することもできる。これ
らの製剤は、例えば、座薬、鼻腔スプレーの調製に有用
である。座薬用には、ビヒクル組成物は、ポリアルキレ
ングリコールまたはトリグリセリドなど、慣用の結合剤
および担体を含む。かかる座薬は、約０．５から約１０
％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは約１％から約２％の範囲内
の、活性成分を含む混合物から形成してもよい。
【００５４】鼻腔内製剤は、通常、鼻粘膜を刺激せず、
繊毛機能を著しく妨げることもないビヒクルを含有す
る。本発明では、水、生理食塩水または他の既知物質な
どの希釈剤を使用することができる。鼻腔製剤は、ま
た、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなど
（但し、限定するものではない）の保存料を含有しても
よい。鼻粘膜による、対象リガンドの吸収を増進するた
めに、界面活性剤を存在させてもよい。
繊毛機能を著しく妨げることもないビヒクルを含有す
る。本発明では、水、生理食塩水または他の既知物質な
どの希釈剤を使用することができる。鼻腔製剤は、ま
た、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムなど
（但し、限定するものではない）の保存料を含有しても
よい。鼻粘膜による、対象リガンドの吸収を増進するた
めに、界面活性剤を存在させてもよい。
【００５５】典型的には、本発明の組成物は、１％未満
から約９５％の活性成分、好ましくは、１０％から約５
０％を含む。より好ましくは、小児に対しては、約１０
ｍｇから５０ｍｇを、成人に対しては約５０ｍｇから１
０００ｍｇを投与する。投与回数は、患者の反応性に基
づいて、細心の注意で決定される。その他の有効な投与
量は、当業者であれば、投与反応曲線を確定する慣例的
試行を通して、容易に決定することができる。
から約９５％の活性成分、好ましくは、１０％から約５
０％を含む。より好ましくは、小児に対しては、約１０
ｍｇから５０ｍｇを、成人に対しては約５０ｍｇから１
０００ｍｇを投与する。投与回数は、患者の反応性に基
づいて、細心の注意で決定される。その他の有効な投与
量は、当業者であれば、投与反応曲線を確定する慣例的
試行を通して、容易に決定することができる。
【００５６】投与量の決定において、注意しなければな
らないのは、全セレクチン分子を完全にブロックするこ
とは、必ずしも望ましくないことである。正常な炎症過
程が進行するためには、少なくともいくつかの白血球ま
たは好中球が、損傷、感染または疾患が発生している部
位の組織内に運ばれてこなければならない。ブロッキン
グ剤として投与するセレクチン・リガンドの量は、患者
の個別な必要に応じて、かつ、処置される疾患のタイプ
など、種々の要因を考慮した上で注意深く調節しなけれ
ばならない。
らないのは、全セレクチン分子を完全にブロックするこ
とは、必ずしも望ましくないことである。正常な炎症過
程が進行するためには、少なくともいくつかの白血球ま
たは好中球が、損傷、感染または疾患が発生している部
位の組織内に運ばれてこなければならない。ブロッキン
グ剤として投与するセレクチン・リガンドの量は、患者
の個別な必要に応じて、かつ、処置される疾患のタイプ
など、種々の要因を考慮した上で注意深く調節しなけれ
ばならない。
【００５７】本発明の抗炎症性組成物が、ミエロローリ
ンに対する抗体である場合、薬学的に許容される希釈剤
を採用することができ、該抗体は、ヒト型にされるべき
であり、かつ、Ｆａｂフラグメント化されるべきであ
る。採用される特定の薬学的に許容される希釈剤は、そ
れらに対して決定的ではない。かかる希釈剤の例として
は、生理的食塩水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、ビタミン・カ
クテルおよびアミノ酸ビタミン・カクテルなどが挙げら
れる。
ンに対する抗体である場合、薬学的に許容される希釈剤
を採用することができ、該抗体は、ヒト型にされるべき
であり、かつ、Ｆａｂフラグメント化されるべきであ
る。採用される特定の薬学的に許容される希釈剤は、そ
れらに対して決定的ではない。かかる希釈剤の例として
は、生理的食塩水、Ｒｉｎｇｅｒの溶液、ビタミン・カ
クテルおよびアミノ酸ビタミン・カクテルなどが挙げら
れる。
【００５８】本発明の抗体の、投与さるべき薬学的有効
量は、処置する患者の年齢、体重および性別によって変
わる。一般に、薬学的有効量は、１回の注射につき、約
１．０〜５．０μｇ／１００ｇ体重である。一般に、５
から１０回の抗体の注射が使用されるが、本発明はそれ
のみに限定されるものではない。
量は、処置する患者の年齢、体重および性別によって変
わる。一般に、薬学的有効量は、１回の注射につき、約
１．０〜５．０μｇ／１００ｇ体重である。一般に、５
から１０回の抗体の注射が使用されるが、本発明はそれ
のみに限定されるものではない。
【００５９】本発明の化合物は、広い範囲の疾患、例え
ば、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症などの、自己
免疫疾患の処置に有用である。本発明の組成物は、組織
損傷、腫張、炎症および／または苦痛、特にＥ−セレク
チンが仲介する慢性炎症性状態を引き起こす程度に、白
血球の組織内蓄積を起こし、人体に免疫システムがはた
らいているのであれば、いかなる疾患状態の処置にも適
応することができる。
ば、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症などの、自己
免疫疾患の処置に有用である。本発明の組成物は、組織
損傷、腫張、炎症および／または苦痛、特にＥ−セレク
チンが仲介する慢性炎症性状態を引き起こす程度に、白
血球の組織内蓄積を起こし、人体に免疫システムがはた
らいているのであれば、いかなる疾患状態の処置にも適
応することができる。
【００６０】本発明の製剤は、心臓発作を惹起する急性
炎症状態に起因する組織損傷の好ましくない残効を防止
するために、投与することもできる。これには、Ｐ−セ
レクチン阻害剤またはＰ−セレクチン・リガンドの併用
が、特に好ましい。何故なら、Ｅ−セレクチンではな
く、Ｐ−セレクチンが、心臓発作または発作などの急性
炎症反応において、重要な役割をするからである。心臓
発作が起り、抗凝固剤または血栓溶解剤（例えば、ｔＰ
Ａ）を適用することなどで、患者が回復した場合、凝血
塊ができた内皮の表層は、しばしば損傷をうけている。
抗血栓剤が凝血塊を除去すると、酸素を奪われた、凝血
塊下の損傷を受けた組織および内皮表層の他の損傷を受
けた組織は、活性化してくる。該活性化された内皮細胞
は、細胞が損傷を受けて数時間もすると、一種のセレク
チンであるＥＬＡＭ−１受容体を合成する。該受容体
は、血管内に広がり、白血球細胞の表面上の糖脂質リガ
ンド分子と接着する。大量の白血球細胞が、すばやく捕
捉され、活性化された内皮細胞部位を取り囲む組織内に
運ばれて、炎症、腫張および壊死に至り、患者の生存の
可能性を低下させる。
炎症状態に起因する組織損傷の好ましくない残効を防止
するために、投与することもできる。これには、Ｐ−セ
レクチン阻害剤またはＰ−セレクチン・リガンドの併用
が、特に好ましい。何故なら、Ｅ−セレクチンではな
く、Ｐ−セレクチンが、心臓発作または発作などの急性
炎症反応において、重要な役割をするからである。心臓
発作が起り、抗凝固剤または血栓溶解剤（例えば、ｔＰ
Ａ）を適用することなどで、患者が回復した場合、凝血
塊ができた内皮の表層は、しばしば損傷をうけている。
抗血栓剤が凝血塊を除去すると、酸素を奪われた、凝血
塊下の損傷を受けた組織および内皮表層の他の損傷を受
けた組織は、活性化してくる。該活性化された内皮細胞
は、細胞が損傷を受けて数時間もすると、一種のセレク
チンであるＥＬＡＭ−１受容体を合成する。該受容体
は、血管内に広がり、白血球細胞の表面上の糖脂質リガ
ンド分子と接着する。大量の白血球細胞が、すばやく捕
捉され、活性化された内皮細胞部位を取り囲む組織内に
運ばれて、炎症、腫張および壊死に至り、患者の生存の
可能性を低下させる。
【００６１】心臓発作に起因する外傷を患っている患者
の治療に加え、急性肉体的外傷を患う患者の治療にも、
本発明の製剤を使用し、ひどい外傷にさらされている肉
体部位に後遺する炎症および腫張を和らげることができ
る。本発明の製剤を使用して治療しうる、その他の状態
には、様々なタイプの関節炎および成人呼吸窮迫症候群
が含まれる。当業者は、本発明明細書を読めば、本発明
の製剤を投与することによって治療および／または緩和
される、その他の疾患状態および／または症状が何かを
認識するであろう。
の治療に加え、急性肉体的外傷を患う患者の治療にも、
本発明の製剤を使用し、ひどい外傷にさらされている肉
体部位に後遺する炎症および腫張を和らげることができ
る。本発明の製剤を使用して治療しうる、その他の状態
には、様々なタイプの関節炎および成人呼吸窮迫症候群
が含まれる。当業者は、本発明明細書を読めば、本発明
の製剤を投与することによって治療および／または緩和
される、その他の疾患状態および／または症状が何かを
認識するであろう。
【００６２】（１）ミエロローリン：（Ａ）Ｆｒ．１０
−２、（Ｂ）Ｆｒ．１０−１とＦｒ．１０−２の混合
物、または（Ｃ）Ｆｒ．１４、および（２）薬学的に許
容できる担体、例えば、但し、限定されないが：（Ｄ）
ポリアルキレングリコール、（Ｅ）トリグリセリド、
（Ｆ）脂肪油、（Ｇ）合成脂肪酸エステル、（Ｈ）リポ
ソーム、（Ｉ）カルボキシメチルセルロース、（Ｊ）ソ
ルビトール、または（Ｋ）デキストランを含有する種々
の組成物は、例えば、関節炎、慢性関節リウマチ、多発
性硬化症など（但し、限定されない）の炎症性疾患を患
う患者に、治療上有効量が投与される。
−２、（Ｂ）Ｆｒ．１０−１とＦｒ．１０−２の混合
物、または（Ｃ）Ｆｒ．１４、および（２）薬学的に許
容できる担体、例えば、但し、限定されないが：（Ｄ）
ポリアルキレングリコール、（Ｅ）トリグリセリド、
（Ｆ）脂肪油、（Ｇ）合成脂肪酸エステル、（Ｈ）リポ
ソーム、（Ｉ）カルボキシメチルセルロース、（Ｊ）ソ
ルビトール、または（Ｋ）デキストランを含有する種々
の組成物は、例えば、関節炎、慢性関節リウマチ、多発
性硬化症など（但し、限定されない）の炎症性疾患を患
う患者に、治療上有効量が投与される。
【００６３】
５． 実施例 我々は、先に、好中球およびヒト前骨髄球性白血病ＨＬ
６０細胞に、末端にα２→３シアリル化を、また内部の
種々の（但し、末端から２番目ではない）ＧｌｃＮＡｃ
残基にα１→３フコシル化を有するポリラクトサミン・
ガングリオシドの存在を探知した。我々は、該ガングリ
オシドの糖鎖を有するこれらの化合物を、「ミエロロー
リン」と総称する。対照的に、ポリラクトサミン鎖の内
部α１→３フコシル化を有しない決定基であるＳＬｅx
−Ｌｅx は、かかる細胞には欠如している。本試験にお
いて、我々は、Ｅ−セレクチン発現性細胞の接着および
ローリングを惹起するミエロローリン（Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｘ、Ｙ、上記）系列の活性について検討した。接着
試験は、静的および動的流動の両条件下で行った。それ
に対して、ガングリオシドをコートした表面でのＥ−セ
レクチン発現性細胞のローリング試験は、動的流動条件
下で行った。
６０細胞に、末端にα２→３シアリル化を、また内部の
種々の（但し、末端から２番目ではない）ＧｌｃＮＡｃ
残基にα１→３フコシル化を有するポリラクトサミン・
ガングリオシドの存在を探知した。我々は、該ガングリ
オシドの糖鎖を有するこれらの化合物を、「ミエロロー
リン」と総称する。対照的に、ポリラクトサミン鎖の内
部α１→３フコシル化を有しない決定基であるＳＬｅx
−Ｌｅx は、かかる細胞には欠如している。本試験にお
いて、我々は、Ｅ−セレクチン発現性細胞の接着および
ローリングを惹起するミエロローリン（Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｘ、Ｙ、上記）系列の活性について検討した。接着
試験は、静的および動的流動の両条件下で行った。それ
に対して、ガングリオシドをコートした表面でのＥ−セ
レクチン発現性細胞のローリング試験は、動的流動条件
下で行った。
【００６４】本試験から、以下のことが結論される。Ｓ
Ｌｅx を含む構造は、ローリングを惹起せず、好中球お
よびＨＬ６０細胞には事実上存在せず、かつ、好中球の
ローリング、接着および浸潤に何らの生理的役割を演じ
ない。好中球のローリング、接着および浸潤を惹起する
原因になるのは、ＳＬｅx を含む構造ではなく、むしろ
「ミエロローリン」（すなわち、末端のα２→３シアリ
ル化および内部のフコシル化［末端から２番目のＧｌｃ
ＮＡｃ残基単独の場合を除いた、種々のＧｌｃＮＡｃ残
基において］を有する非分枝ポリラクトサミン）と総称
される一群のＳＬｅx を含まない構造である。種々のタ
イプのミエロローリンは、混合物において、ミエロロー
リンの単一分子と比較して、相乗的なＥ−セレクチン依
存性ローリングおよび接着を惹起する。ミエロローリン
は、ＨＬ６０細胞およびヒト白血球の主要グリカンおよ
びガングリオシドである。ミエロローリン機能のブロッ
キングは、Ｅ−セレクチン依存性ローリングおよび接着
を惹起する、ミエロローリンに含まれる最小必要構造に
よって達成される。ミエロローリンの糖鎖に対して、非
常に特異的な抗体は、ただちに調製し、選別し、かつ、
抗炎症性薬品調製に使用することができる。
Ｌｅx を含む構造は、ローリングを惹起せず、好中球お
よびＨＬ６０細胞には事実上存在せず、かつ、好中球の
ローリング、接着および浸潤に何らの生理的役割を演じ
ない。好中球のローリング、接着および浸潤を惹起する
原因になるのは、ＳＬｅx を含む構造ではなく、むしろ
「ミエロローリン」（すなわち、末端のα２→３シアリ
ル化および内部のフコシル化［末端から２番目のＧｌｃ
ＮＡｃ残基単独の場合を除いた、種々のＧｌｃＮＡｃ残
基において］を有する非分枝ポリラクトサミン）と総称
される一群のＳＬｅx を含まない構造である。種々のタ
イプのミエロローリンは、混合物において、ミエロロー
リンの単一分子と比較して、相乗的なＥ−セレクチン依
存性ローリングおよび接着を惹起する。ミエロローリン
は、ＨＬ６０細胞およびヒト白血球の主要グリカンおよ
びガングリオシドである。ミエロローリン機能のブロッ
キングは、Ｅ−セレクチン依存性ローリングおよび接着
を惹起する、ミエロローリンに含まれる最小必要構造に
よって達成される。ミエロローリンの糖鎖に対して、非
常に特異的な抗体は、ただちに調製し、選別し、かつ、
抗炎症性薬品調製に使用することができる。
【００６５】５．１ 材料および方法 ＧＳＬｓおよびモノシアロガングリオシド 第１表は、本明細書中に開示する、ガングリオシドの構
造（Ｆｒ．またはＳｔｒ．で同定される）を示す。該ガ
ングリオシドの構造は、先に記載の通り、 1Ｈ−ＮＭ
Ｒ、 +イオン ＦＡＢＭＳ、およびメチル化体のＣＩＤ
を有するＥＳ−ＭＳによって実証される（Stroud et a
l., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm.209:777-787;
Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:758-769; Str
oud et al., 1996, Biochemistry 35:770-778）。Ｆ
ｒ．９−１、９−２、１０−１、および１０−２の構造
は、エンド−β−ガラクトシダーゼ消化（Fukuda et a
l., 1979, J. Biol. Chem. 254:5458-5465 ）、メチル
化分析、および +イオンＦＡＢＭＳによって更に確認さ
れている。
造（Ｆｒ．またはＳｔｒ．で同定される）を示す。該ガ
ングリオシドの構造は、先に記載の通り、 1Ｈ−ＮＭ
Ｒ、 +イオン ＦＡＢＭＳ、およびメチル化体のＣＩＤ
を有するＥＳ−ＭＳによって実証される（Stroud et a
l., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm.209:777-787;
Stroud et al., 1996, Biochemistry 35:758-769; Str
oud et al., 1996, Biochemistry 35:770-778）。Ｆ
ｒ．９−１、９−２、１０−１、および１０−２の構造
は、エンド−β−ガラクトシダーゼ消化（Fukuda et a
l., 1979, J. Biol. Chem. 254:5458-5465 ）、メチル
化分析、および +イオンＦＡＢＭＳによって更に確認さ
れている。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】細胞および結合実験 Ｅ−セレクチンｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯ
細胞は、先に記載の通り、確立された（Handa, et al.,
1995, Int. J. Oncol. 6:773-781 ）。Ｅ−セレクチン
発現性トランスフェクト体は、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ
Ｅ１Ａを使用してサイトフルオロメトリーによって単
離した。Ｅ−セレクチン依存性細胞接着の抑制は、濃度
１０μｇ／ｍＬで、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ Ｅ１Ｃを
使用して行われた。これらのｍＡｂｓは、Ｅ−またはＰ
−セレクチンを発現するＮＳ１細胞によるＢＡＬＢ／ｃ
マウスの免疫化を通して確立された。
細胞は、先に記載の通り、確立された（Handa, et al.,
1995, Int. J. Oncol. 6:773-781 ）。Ｅ−セレクチン
発現性トランスフェクト体は、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ
Ｅ１Ａを使用してサイトフルオロメトリーによって単
離した。Ｅ−セレクチン依存性細胞接着の抑制は、濃度
１０μｇ／ｍＬで、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ Ｅ１Ｃを
使用して行われた。これらのｍＡｂｓは、Ｅ−またはＰ
−セレクチンを発現するＮＳ１細胞によるＢＡＬＢ／ｃ
マウスの免疫化を通して確立された。
【００６９】プラスチック・プレート上、静的条件下で
のＥ−セレクチン依存性細胞の種々のＧＳＬｓに対する
接着 ９６−ウェル・プレートを用いた静的接着実験：５０％
エタノール中に溶解したポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオ
シド（例えば、ＳＬｅX −ＬｅX およびＦｒ．９、１０
−１、１０−２および１２−２）を、９６−ウェル・プ
レート（最初のウェルは２００ｎｇ含む）に逐次的に希
釈し、かつ、該プレートを３７℃で５時間かけて乾燥し
た。ｍＡｂ Ｅ１Ｃの存在下での、対照細胞接着のため
に、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドを同様に逐次的
希釈したプレートを準備した。Ｅ−セレクチン発現性Ｃ
ＨＯ細胞（Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6:773
-781）は、代謝的に［ 3Ｈ］チミジンで標識し、２日間
培養した。培養細胞を２ｍＭ ＥＤＴＡ処理して細胞懸
濁物（２×１０6 ／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁物
の５０μＬ画分（１×１０5 細胞を含む；約５０００ｃ
ｐｍ）を各ウェルに加え、１時間培養した。対照とし
て、ＥＤＴＡ−採取した細胞をＤＭＥＭで洗浄し、３０
分間氷上で、ｍＡｂ Ｅ１Ｃと共に培養し、引き続きｍ
Ａｂ Ｅ１Ｃ含量１０μｇ／ｍＬとした以外は上記と同
様にして、細胞懸濁物を調製した。画分を各ウェルに添
加し、上記と同様に培養した。細胞は、吸取紙上でプレ
ートを逆さにすることによってＰＢＳで３回洗浄した。
接着細胞の数は、 3Ｈ活性の測定により決定した。
のＥ−セレクチン依存性細胞の種々のＧＳＬｓに対する
接着 ９６−ウェル・プレートを用いた静的接着実験：５０％
エタノール中に溶解したポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオ
シド（例えば、ＳＬｅX −ＬｅX およびＦｒ．９、１０
−１、１０−２および１２−２）を、９６−ウェル・プ
レート（最初のウェルは２００ｎｇ含む）に逐次的に希
釈し、かつ、該プレートを３７℃で５時間かけて乾燥し
た。ｍＡｂ Ｅ１Ｃの存在下での、対照細胞接着のため
に、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドを同様に逐次的
希釈したプレートを準備した。Ｅ−セレクチン発現性Ｃ
ＨＯ細胞（Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6:773
-781）は、代謝的に［ 3Ｈ］チミジンで標識し、２日間
培養した。培養細胞を２ｍＭ ＥＤＴＡ処理して細胞懸
濁物（２×１０6 ／ｍＬ）を調製した。この細胞懸濁物
の５０μＬ画分（１×１０5 細胞を含む；約５０００ｃ
ｐｍ）を各ウェルに加え、１時間培養した。対照とし
て、ＥＤＴＡ−採取した細胞をＤＭＥＭで洗浄し、３０
分間氷上で、ｍＡｂ Ｅ１Ｃと共に培養し、引き続きｍ
Ａｂ Ｅ１Ｃ含量１０μｇ／ｍＬとした以外は上記と同
様にして、細胞懸濁物を調製した。画分を各ウェルに添
加し、上記と同様に培養した。細胞は、吸取紙上でプレ
ートを逆さにすることによってＰＢＳで３回洗浄した。
接着細胞の数は、 3Ｈ活性の測定により決定した。
【００７０】静的条件下でポリスチレン・ビーズに固定
したガングリオシドへのＥ−セレクチン依存性細胞接着 動的接着実験で使用したものと同じマトリックスで静的
接着を観察するために、以下の手順を用いた。対物顕微
鏡スライドに固定した１μｍまたは４μｍ直径のポリス
チレン・ラテックス・ビーズ（ＩＤＣ Ｓｐｈｅｒｅｓ
TM；ＩＤＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を、ポリ−Ｌａ
ｃＮＡｃ ＧＳＬｓの担体として使用した。直径４μｍ
のビーズ懸濁物３０μＬ（２×１０9 ビーズ／ｍＬを含
む）または１μｍビーズ懸濁物６０μＬ（１×１０11ビ
ーズ／ｍＬを含む）をエッペンドルフ管内に置き、無水
エタノールで３回洗浄した。沈殿させた４μｍビーズは
５００ｍＬのエタノール中に、また沈殿させた１μｍビ
ーズは２ｍＬのエタノール中に、それぞれ懸濁した。こ
れら懸濁物の１μＬ画分は、新たに開いた顕微鏡スライ
ド（Labcraft Superfrost Plus, Curtin Matheson Scie
ntific, Houston, TX ）上に載置した。ビーズは、ガラ
ス表面上直径約１ｃｍの円形スポット内に均質に分布さ
せた。該スライドを、１５０℃で５０秒間加熱した。そ
れによって、ビーズは、種々の速度の水流によって洗い
流されない程度に、強力に表面に接着した。同じモル濃
度で、イソプロパノール−ヘキサン−水に溶解したガン
グリオシドを、該スライドに固定したビーズに接触させ
た。すなわち、５０〜１００ｎｇのガングリオシドを含
む１μＬの画分を、該円形スポットの中心に設置した。
これにより、ガングリオシドはビーズ表面に固定され
た。室温で１時間、スライドをＰＢＳ中の３％ＢＳＡに
浸漬し、かつＣａ2+／Ｍｇ2+を含むＰＢＳで３回洗浄し
た。
したガングリオシドへのＥ−セレクチン依存性細胞接着 動的接着実験で使用したものと同じマトリックスで静的
接着を観察するために、以下の手順を用いた。対物顕微
鏡スライドに固定した１μｍまたは４μｍ直径のポリス
チレン・ラテックス・ビーズ（ＩＤＣ Ｓｐｈｅｒｅｓ
TM；ＩＤＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）を、ポリ−Ｌａ
ｃＮＡｃ ＧＳＬｓの担体として使用した。直径４μｍ
のビーズ懸濁物３０μＬ（２×１０9 ビーズ／ｍＬを含
む）または１μｍビーズ懸濁物６０μＬ（１×１０11ビ
ーズ／ｍＬを含む）をエッペンドルフ管内に置き、無水
エタノールで３回洗浄した。沈殿させた４μｍビーズは
５００ｍＬのエタノール中に、また沈殿させた１μｍビ
ーズは２ｍＬのエタノール中に、それぞれ懸濁した。こ
れら懸濁物の１μＬ画分は、新たに開いた顕微鏡スライ
ド（Labcraft Superfrost Plus, Curtin Matheson Scie
ntific, Houston, TX ）上に載置した。ビーズは、ガラ
ス表面上直径約１ｃｍの円形スポット内に均質に分布さ
せた。該スライドを、１５０℃で５０秒間加熱した。そ
れによって、ビーズは、種々の速度の水流によって洗い
流されない程度に、強力に表面に接着した。同じモル濃
度で、イソプロパノール−ヘキサン−水に溶解したガン
グリオシドを、該スライドに固定したビーズに接触させ
た。すなわち、５０〜１００ｎｇのガングリオシドを含
む１μＬの画分を、該円形スポットの中心に設置した。
これにより、ガングリオシドはビーズ表面に固定され
た。室温で１時間、スライドをＰＢＳ中の３％ＢＳＡに
浸漬し、かつＣａ2+／Ｍｇ2+を含むＰＢＳで３回洗浄し
た。
【００７１】新しく採取し、動かさずに１５分間、ＲＰ
ＭＩ培養液中に懸濁した５×１０5のＣＨＯ細胞でスラ
イドは重層された。通常、ＲＰＭＩによる３回の洗浄
で、非接着細胞をビーズから除去するに充分であった。
しかし、対象ビーズ上の細胞が洗い流されるまでには、
入念な顕微鏡試験を繰り返し行わねばならなかった。そ
の後、スライドは、ＰＢＳに溶かした１％グルタルアル
デヒドで固定し、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドを
コートしたビーズの層に接着した細胞数をカウントし
た。
ＭＩ培養液中に懸濁した５×１０5のＣＨＯ細胞でスラ
イドは重層された。通常、ＲＰＭＩによる３回の洗浄
で、非接着細胞をビーズから除去するに充分であった。
しかし、対象ビーズ上の細胞が洗い流されるまでには、
入念な顕微鏡試験を繰り返し行わねばならなかった。そ
の後、スライドは、ＰＢＳに溶かした１％グルタルアル
デヒドで固定し、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドを
コートしたビーズの層に接着した細胞数をカウントし
た。
【００７２】動的流動条件下の種々のＧＳＬｓによるＥ
−セレクチン依存性細胞のローリングおよび接着 上記の手順を用いて、ポリスチレン・ビーズ（４．２±
３．７％μｍまたは１μｍ）を調製し、顕微鏡スライド
に固定した。同じモル濃度で、ＩＨＷに溶解したガング
リオシドを該スライドに固定したビーズに接触させた。
すなわち、５０〜１００または０．０５〜０．１ｎｇガ
ングリオシドを含む１μＬの画分を、円形スポットの中
心に設置した。
−セレクチン依存性細胞のローリングおよび接着 上記の手順を用いて、ポリスチレン・ビーズ（４．２±
３．７％μｍまたは１μｍ）を調製し、顕微鏡スライド
に固定した。同じモル濃度で、ＩＨＷに溶解したガング
リオシドを該スライドに固定したビーズに接触させた。
すなわち、５０〜１００または０．０５〜０．１ｎｇガ
ングリオシドを含む１μＬの画分を、円形スポットの中
心に設置した。
【００７３】スライドを、室温で１時間、３％ＢＳＡ含
有ＰＢＳ中に浸漬し、かつ、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含むＰＢ
Ｓで３回洗浄した。スライドを、注入ポンプ（モデル９
３５、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に連結している平行プレート層流チ
ャンバー内に設置した。該装置は、論文（Lawrence et
al., 1990, Blood 75:227-237; Lawrence & Springer,
1991, Cell 65:859-873）によって記載されているよう
に、生理的微小血管環境の中にある流動せん断応力をシ
ミュレートする。規定速度および壁面せん断応力の層流
は、流動チャンバーの入口に連結している、注入ポンプ
の手操作によって実現する。ＥＤＴＡにより培養物から
新たに採取し、洗浄し、１％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中
に再懸濁した、Ｅ−またはＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ
細胞（第２Ａ−２Ｅ図では１×１０5 細胞／ｍＬ；第５
Ａ図では２×１０5 細胞／ｍＬ；第５Ｂ図、第４Ａ図お
よび第４Ｂ図では５×１０5 細胞／ｍＬ）を、種々の層
流速度で、装置内に注入した。細胞の動きは、倒立位相
差顕微鏡（ Diaphot-TMD、ニコン）下で観察し、継時露
出撮影ビデオカセット・レコーダにより記録した。細胞
のローリングおよび接着が観察され、０．６〜１２．０
ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力下、２分間のローリン
グおよび接着細胞の数を、ビデオテープの少なくとも１
０視域（フィールド）でカウントした。壁面せん断応力
（Ｔ）は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood 75:22
7-237 & Lawrence et al., 1987, Blood 70:1284-1290
）記載の下記式によって計算した：
有ＰＢＳ中に浸漬し、かつ、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含むＰＢ
Ｓで３回洗浄した。スライドを、注入ポンプ（モデル９
３５、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に連結している平行プレート層流チ
ャンバー内に設置した。該装置は、論文（Lawrence et
al., 1990, Blood 75:227-237; Lawrence & Springer,
1991, Cell 65:859-873）によって記載されているよう
に、生理的微小血管環境の中にある流動せん断応力をシ
ミュレートする。規定速度および壁面せん断応力の層流
は、流動チャンバーの入口に連結している、注入ポンプ
の手操作によって実現する。ＥＤＴＡにより培養物から
新たに採取し、洗浄し、１％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地中
に再懸濁した、Ｅ−またはＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ
細胞（第２Ａ−２Ｅ図では１×１０5 細胞／ｍＬ；第５
Ａ図では２×１０5 細胞／ｍＬ；第５Ｂ図、第４Ａ図お
よび第４Ｂ図では５×１０5 細胞／ｍＬ）を、種々の層
流速度で、装置内に注入した。細胞の動きは、倒立位相
差顕微鏡（ Diaphot-TMD、ニコン）下で観察し、継時露
出撮影ビデオカセット・レコーダにより記録した。細胞
のローリングおよび接着が観察され、０．６〜１２．０
ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力下、２分間のローリン
グおよび接着細胞の数を、ビデオテープの少なくとも１
０視域（フィールド）でカウントした。壁面せん断応力
（Ｔ）は、論文（Lawrence et al., 1990, Blood 75:22
7-237 & Lawrence et al., 1987, Blood 70:1284-1290
）記載の下記式によって計算した：
【００７４】
【数１】Ｔ＝３μＱ／２ｂａ2 式中、μ＝粘性係数（１．０ｃＰ）、Ｑ＝容積流速（ｃ
ｍ3 ／秒）、ａ＝半チャンネル高（この場合、５．７×
１０-3ｃｍ）、およびｂ＝チャンネル幅（１．３ｃｍ）
である。
ｍ3 ／秒）、ａ＝半チャンネル高（この場合、５．７×
１０-3ｃｍ）、およびｂ＝チャンネル幅（１．３ｃｍ）
である。
【００７５】蛍光分析によるＥ−またはＰ−セレクチン
とミエロローリンガングリオシドとの直接結合デモンス
トレーション ５×１０6 ポリスチレン・ビーズ（直径４．２±３．７
％μｍ）（IDC SpheresTTM;IDC，Portland, OR）を、遠
心分離によりエタノールで洗浄した。洗浄したビーズ
に、５０μＬのエタノール中の１μｇのＧＳＬを加え、
該混合物を窒素流下で蒸発させた。該ビーズは１％ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳ（＋）中に再懸濁し、遠心分離により２回
洗浄した。洗浄したビーズは、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
（＋）により室温で２時間ブロックした。遠心分離後、
ビーズを、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化物を含むＰ
ＢＳ（＋）中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。黄緑蛍光硫
酸化ラテックス・ビーズ（直径１μｍ）（Molecular Po
rbes, Inc., Portland, OR）を、ヤギの抗ヒトＩｇＧ
（Ｆｃ−フラグメント特異的）抗体（Jackson Immunore
search Lab, West Grove, PA）で、製造業者のプロトコ
ルに従って、コートした。ＰＢＳによる３回の洗浄の
後、該ビーズは、４℃で２時間、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
でブロックした。ブロックされたビーズ（約５×１
０8 ）は、ＣＨＯトランスフェクト体（Handa et al.,
1995, Int. J. Oncol. 6:773-781）からのＥ−またはＰ
−セレクチン−Ｉｇ融合タンパク質含有培養上清（約１
μｇ／ｍＬ融合タンパク質）１．５ｍＬと、血液ミキサ
ーを使用して４℃で、６〜１８時間混合した。この混合
手順を、該融合タンパク質を含む、新しい培養上清を用
いて３回繰り返した。ＰＢＳで洗浄後、ビーズを、５０
μｇのヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）を含む１
ｍＬのＰＢＳ中で培養した。対照ビーズ調製のため、融
合タンパク質の代わりに、１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを
使用した。ガングリオシドでコートしたビーズは、室温
で、かつ様々な期間、蛍光性ビーズと混合した。その結
果生じた懸濁物は、フローサイトメトリー分析にかけ
た。各実験条件は、以下に詳述する。
とミエロローリンガングリオシドとの直接結合デモンス
トレーション ５×１０6 ポリスチレン・ビーズ（直径４．２±３．７
％μｍ）（IDC SpheresTTM;IDC，Portland, OR）を、遠
心分離によりエタノールで洗浄した。洗浄したビーズ
に、５０μＬのエタノール中の１μｇのＧＳＬを加え、
該混合物を窒素流下で蒸発させた。該ビーズは１％ＢＳ
Ａ含有ＰＢＳ（＋）中に再懸濁し、遠心分離により２回
洗浄した。洗浄したビーズは、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
（＋）により室温で２時間ブロックした。遠心分離後、
ビーズを、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化物を含むＰ
ＢＳ（＋）中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。黄緑蛍光硫
酸化ラテックス・ビーズ（直径１μｍ）（Molecular Po
rbes, Inc., Portland, OR）を、ヤギの抗ヒトＩｇＧ
（Ｆｃ−フラグメント特異的）抗体（Jackson Immunore
search Lab, West Grove, PA）で、製造業者のプロトコ
ルに従って、コートした。ＰＢＳによる３回の洗浄の
後、該ビーズは、４℃で２時間、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
でブロックした。ブロックされたビーズ（約５×１
０8 ）は、ＣＨＯトランスフェクト体（Handa et al.,
1995, Int. J. Oncol. 6:773-781）からのＥ−またはＰ
−セレクチン−Ｉｇ融合タンパク質含有培養上清（約１
μｇ／ｍＬ融合タンパク質）１．５ｍＬと、血液ミキサ
ーを使用して４℃で、６〜１８時間混合した。この混合
手順を、該融合タンパク質を含む、新しい培養上清を用
いて３回繰り返した。ＰＢＳで洗浄後、ビーズを、５０
μｇのヒトＩｇＧ（Jackson Immunoresearch）を含む１
ｍＬのＰＢＳ中で培養した。対照ビーズ調製のため、融
合タンパク質の代わりに、１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧを
使用した。ガングリオシドでコートしたビーズは、室温
で、かつ様々な期間、蛍光性ビーズと混合した。その結
果生じた懸濁物は、フローサイトメトリー分析にかけ
た。各実験条件は、以下に詳述する。
【００７６】５．２ 結果 静的条件下でのＥ−セレクチン依存性接着 静的条件下における、Ｅ−セレクチン発現性細胞のミエ
ロローリン・ガングリオシドおよびＳＬｅX 含有ガング
リオシドとの接着を、「材料および方法」に記載の、２
つの異なった方法によって検討した。一つの方法では、
９６−ウェル・プレート表面に、ガングリオシドを直接
コートし、引き続きＢＳＡでブロッキングし、しかも［
3Ｈ］チミジン標識したＥ−セレクチン発現性細胞を添
加し、抗Ｅ−セレクチン抗体存在下および不存在下で、
培養した。その結果、静的条件下においては、Ｅ−セレ
クチン発現性細胞は、ＳＬｅX −ＬｅX をコートした表
面には結合したが、ミエロローリン（Ｆｒ．１０−１、
１０−２、９および１２−２）をコートした表面には結
合しないことが判明した（第１Ａ図）。結合反応におけ
るｍＡｂ Ｅ１Ｃの存在は、Ｅ−セレクチン発現性細胞
のＳＬｅX −ＬｅXでコートした表面への結合を阻害し
た。
ロローリン・ガングリオシドおよびＳＬｅX 含有ガング
リオシドとの接着を、「材料および方法」に記載の、２
つの異なった方法によって検討した。一つの方法では、
９６−ウェル・プレート表面に、ガングリオシドを直接
コートし、引き続きＢＳＡでブロッキングし、しかも［
3Ｈ］チミジン標識したＥ−セレクチン発現性細胞を添
加し、抗Ｅ−セレクチン抗体存在下および不存在下で、
培養した。その結果、静的条件下においては、Ｅ−セレ
クチン発現性細胞は、ＳＬｅX −ＬｅX をコートした表
面には結合したが、ミエロローリン（Ｆｒ．１０−１、
１０−２、９および１２−２）をコートした表面には結
合しないことが判明した（第１Ａ図）。結合反応におけ
るｍＡｂ Ｅ１Ｃの存在は、Ｅ−セレクチン発現性細胞
のＳＬｅX −ＬｅXでコートした表面への結合を阻害し
た。
【００７７】データを第１Ａ図に示す、本実験の追加的
詳細は、以下の通りである：５０％エタノールに溶解し
た、ＳＬｅX −ＬｅX およびポリ−ＬａｃＮＡｃガング
リオシド（Ｆｒ．９、１０−１、１０−２および１２−
２）を、適正に希釈し、９６−ウェル・プレートのウェ
ル上にコートした（横座標に示したとおり２５〜２００
ｎｇ量）。ウェルは３７℃にて５時間乾燥した。２つの
全く同じプレート（１および２）を以下のように調製し
た。プレート１においては、１×１０5 の、［3Ｈ］チ
ミジンで代謝的に標識したＥ−セレクチン発現性ＣＨＯ
細胞を含む、ＲＰＭＩ５０μＬ画分をウェルに添加し
た。プレート２においては、１×１０5 のＥ−セレクチ
ン発現性ＣＨＯ細胞および抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ Ｅ
１Ｃ（１０μｇＩｇ／ｍＬ）によりプレインキュベート
したｍＡｂ Ｅ１Ｃ細胞を含む、ＲＰＭＩ５０μＬ画分
をウェルに添加した。プレート１および２を、２５分間
培養し、以下のように、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルに
は、２００μＬのＰＢＳを入れ、注意深く振盪し、プレ
ートは、１０分間吸い取り紙の上で逆さにした。全ての
非接着細胞は、沈殿し、該吸い取り紙の上に吸収され
た。ウェル上に残った接着細胞をカウントした。細胞数
は、測定された放射能に基づいて計算した。
詳細は、以下の通りである：５０％エタノールに溶解し
た、ＳＬｅX −ＬｅX およびポリ−ＬａｃＮＡｃガング
リオシド（Ｆｒ．９、１０−１、１０−２および１２−
２）を、適正に希釈し、９６−ウェル・プレートのウェ
ル上にコートした（横座標に示したとおり２５〜２００
ｎｇ量）。ウェルは３７℃にて５時間乾燥した。２つの
全く同じプレート（１および２）を以下のように調製し
た。プレート１においては、１×１０5 の、［3Ｈ］チ
ミジンで代謝的に標識したＥ−セレクチン発現性ＣＨＯ
細胞を含む、ＲＰＭＩ５０μＬ画分をウェルに添加し
た。プレート２においては、１×１０5 のＥ−セレクチ
ン発現性ＣＨＯ細胞および抗Ｅ−セレクチンｍＡｂ Ｅ
１Ｃ（１０μｇＩｇ／ｍＬ）によりプレインキュベート
したｍＡｂ Ｅ１Ｃ細胞を含む、ＲＰＭＩ５０μＬ画分
をウェルに添加した。プレート１および２を、２５分間
培養し、以下のように、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルに
は、２００μＬのＰＢＳを入れ、注意深く振盪し、プレ
ートは、１０分間吸い取り紙の上で逆さにした。全ての
非接着細胞は、沈殿し、該吸い取り紙の上に吸収され
た。ウェル上に残った接着細胞をカウントした。細胞数
は、測定された放射能に基づいて計算した。
【００７８】もう一つの方法では、ガラス顕微鏡スライ
ド上に固定したポリスチレン・ビーズ（直径１μｍ）を
使用した。ガングリオシドは、定量的にビーズ上に吸着
された。このマトリックスに、放射能標識してないＥ−
セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を加え、培養し、洗浄し、
「材料と方法」に記載した方法で、接着細胞の数をカウ
ントした。結果は、以下の通りである。ＳＬｅX −Ｌｅ
X （VI3NeuAcV3FucIII3FucnLc6Cer ）は、Ｆｒ．１３−
１（X3NeuAcVII3FucV3FucnLc10Cer; Str.7）よりわずか
に高い細胞接着を示した。Ｆｒ．１４（Ｓｔｒ．９、１
０、１１および１２の混合物）は、中程度の接着（ＳＬ
ｅX −ＬｅX よりわずかに低い）を示した。同じ条件下
で、Ｆｒ．１０−１（VIII3NeuAcV3FucnLc8Cer; Str.
4）、Ｆｒ．１０−２（VIII3NeuAcIII3FucnLc8Cer; St
r. 5) ）、およびＦｒ．１２−２（X3NeuAcVII3FucnLc
10Cer）は、Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４よりはる
かによわい細胞接着を示した（第１Ｂ図）。内部フコシ
ル化を持たないシアロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃ（例え
ば、VI3NeuAcnLc6Cer; Fr. 7）は、細胞接着を示さなか
った。
ド上に固定したポリスチレン・ビーズ（直径１μｍ）を
使用した。ガングリオシドは、定量的にビーズ上に吸着
された。このマトリックスに、放射能標識してないＥ−
セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を加え、培養し、洗浄し、
「材料と方法」に記載した方法で、接着細胞の数をカウ
ントした。結果は、以下の通りである。ＳＬｅX −Ｌｅ
X （VI3NeuAcV3FucIII3FucnLc6Cer ）は、Ｆｒ．１３−
１（X3NeuAcVII3FucV3FucnLc10Cer; Str.7）よりわずか
に高い細胞接着を示した。Ｆｒ．１４（Ｓｔｒ．９、１
０、１１および１２の混合物）は、中程度の接着（ＳＬ
ｅX −ＬｅX よりわずかに低い）を示した。同じ条件下
で、Ｆｒ．１０−１（VIII3NeuAcV3FucnLc8Cer; Str.
4）、Ｆｒ．１０−２（VIII3NeuAcIII3FucnLc8Cer; St
r. 5) ）、およびＦｒ．１２−２（X3NeuAcVII3FucnLc
10Cer）は、Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４よりはる
かによわい細胞接着を示した（第１Ｂ図）。内部フコシ
ル化を持たないシアロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃ（例え
ば、VI3NeuAcnLc6Cer; Fr. 7）は、細胞接着を示さなか
った。
【００７９】第１Ａ図および第１Ｂ図に示した、重要な
知見は次の通り。静的条件下においては、１）ＳＬｅX
−ＬｅX はミエロローリン（Ｆｒ．１３−１および１
４）よりはるかに強い接着活性を示す；２）内部α１→
３フコシル化を１つ有するシアロシル・ポリ−ＬａｃＮ
Ａｃ（Ｆｒ．９、１０−１、１０−２および１２−２）
およびフコシル化を持たないシアロシル・ポリ−Ｌａｃ
ＮＡｃ（Ｆｒ．７）は、ほとんどまたは全く接着活性を
示さない；および３）ｍＡｂ Ｅ１Ｃは、Ｅ−セレクチ
ン発現性細胞のＳＬｅX −ＬｅX をコートした表面への
接着をブロックする。
知見は次の通り。静的条件下においては、１）ＳＬｅX
−ＬｅX はミエロローリン（Ｆｒ．１３−１および１
４）よりはるかに強い接着活性を示す；２）内部α１→
３フコシル化を１つ有するシアロシル・ポリ−ＬａｃＮ
Ａｃ（Ｆｒ．９、１０−１、１０−２および１２−２）
およびフコシル化を持たないシアロシル・ポリ−Ｌａｃ
ＮＡｃ（Ｆｒ．７）は、ほとんどまたは全く接着活性を
示さない；および３）ｍＡｂ Ｅ１Ｃは、Ｅ−セレクチ
ン発現性細胞のＳＬｅX −ＬｅX をコートした表面への
接着をブロックする。
【００８０】動的流動条件下でのＥ−セレクチン依存性
細胞のポリスチレン・ビーズに固定されたガングリオシ
ドへの結合 上記結果とは対照的に、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞のローリングおよび接着は、動的流動条件下では、Ｆ
ｒ．１０、１３−１および１４（それぞれ、Ｓｔｒ．４
−５、Ｓｔｒ．７−８およびＳｔｒ．９−１２を含有す
る）をコートしたビーズ上で生じた。ポリスチレン・ビ
ーズは、ガラス顕微鏡スライドに固定した。種々のガン
グリオシドを「材料と方法」に記載のとおり、コートし
た。スライドは、１％または２％のウシ血清アルブミン
含有ＰＢＳ中に１時間置いてブロックし、次いで、「材
料と方法」に記載のとおり、平行層流チャンバー内に組
み立てた。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を、新たに
採取し、ＲＰＭＩ培地内に懸濁した（１×１０5 細
胞）。細胞懸濁物は、流動チャンバーに連結した注入ポ
ンプに設置し、種々の層流速で、装置内に注入した。細
胞の動きを位相差顕微鏡の下で観察し、かつ、ビデオカ
セット・レコーダーで記録した。少なくとも、１０顕微
鏡視域で、ローリング細胞数をカウントし、その平均数
を記録した。その結果を、第４Ｃ図に示す。
細胞のポリスチレン・ビーズに固定されたガングリオシ
ドへの結合 上記結果とは対照的に、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞のローリングおよび接着は、動的流動条件下では、Ｆ
ｒ．１０、１３−１および１４（それぞれ、Ｓｔｒ．４
−５、Ｓｔｒ．７−８およびＳｔｒ．９−１２を含有す
る）をコートしたビーズ上で生じた。ポリスチレン・ビ
ーズは、ガラス顕微鏡スライドに固定した。種々のガン
グリオシドを「材料と方法」に記載のとおり、コートし
た。スライドは、１％または２％のウシ血清アルブミン
含有ＰＢＳ中に１時間置いてブロックし、次いで、「材
料と方法」に記載のとおり、平行層流チャンバー内に組
み立てた。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞を、新たに
採取し、ＲＰＭＩ培地内に懸濁した（１×１０5 細
胞）。細胞懸濁物は、流動チャンバーに連結した注入ポ
ンプに設置し、種々の層流速で、装置内に注入した。細
胞の動きを位相差顕微鏡の下で観察し、かつ、ビデオカ
セット・レコーダーで記録した。少なくとも、１０顕微
鏡視域で、ローリング細胞数をカウントし、その平均数
を記録した。その結果を、第４Ｃ図に示す。
【００８１】細胞ローリングは、ミエロローリン構造を
有するがＳＬｅX エピトープを欠く、Ｆｒ．１０または
Ｆｒ．１４をコートしたビーズ上で最も強かった（第４
Ｃ図）。ローリングは、特に、２．４および４．８ｄｙ
ｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力で明らかであった。ＳＬｅ
X −ＬｅX をコートしたビーズ上では、せん断応力に関
係なく、ローリングは観察されなかった。このことは、
ミエロローリンＦｒ．１３−１またはＦｒ．１４をコー
トしたビーズ上では、かなりのローリング後接着が観察
されたことと際立った対照をなすものであった。動的流
動条件下において、ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビー
ズは、細胞結合をしたが、ミエロローリン・フラクショ
ンをコートしたビーズよりもより少程度であった。Ｓｔ
ｒ．１または２をコートしたビーズでは、細胞接着は見
られなかった。
有するがＳＬｅX エピトープを欠く、Ｆｒ．１０または
Ｆｒ．１４をコートしたビーズ上で最も強かった（第４
Ｃ図）。ローリングは、特に、２．４および４．８ｄｙ
ｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力で明らかであった。ＳＬｅ
X −ＬｅX をコートしたビーズ上では、せん断応力に関
係なく、ローリングは観察されなかった。このことは、
ミエロローリンＦｒ．１３−１またはＦｒ．１４をコー
トしたビーズ上では、かなりのローリング後接着が観察
されたことと際立った対照をなすものであった。動的流
動条件下において、ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビー
ズは、細胞結合をしたが、ミエロローリン・フラクショ
ンをコートしたビーズよりもより少程度であった。Ｓｔ
ｒ．１または２をコートしたビーズでは、細胞接着は見
られなかった。
【００８２】種々のせん断応力下、動的流動系中でのＥ
−セレクチン依存性の単純ローリング、ローリング後接
着、および接着については、第６Ａ図および第６Ｂ図で
対比させた。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズで
は、せん断応力（１２〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）に
関係なく、殆どまたは全くローリングは観察されなかっ
た。少数の細胞（５以下／視域）は接着したが、ローリ
ングは示さなかった。それと対照的に、ミエロローリン
をコートしたビーズ上では、せん断応力条件下（４．８
および１２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）で、かなりの数の単純
ローリング細胞が見られた。単純ローリングおよびロー
リング後接着を示した細胞数は、試験した全てのミエロ
ローリン（Ｆｒ．１３−１、Ｆｒ．１４およびＦｒ．１
０）において、２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 が、最も多か
った。せん断応力条件（０．６および１．２ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ2 ）下で、ローリング後接着細胞数は、大きく増
加した。
−セレクチン依存性の単純ローリング、ローリング後接
着、および接着については、第６Ａ図および第６Ｂ図で
対比させた。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズで
は、せん断応力（１２〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）に
関係なく、殆どまたは全くローリングは観察されなかっ
た。少数の細胞（５以下／視域）は接着したが、ローリ
ングは示さなかった。それと対照的に、ミエロローリン
をコートしたビーズ上では、せん断応力条件下（４．８
および１２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）で、かなりの数の単純
ローリング細胞が見られた。単純ローリングおよびロー
リング後接着を示した細胞数は、試験した全てのミエロ
ローリン（Ｆｒ．１３−１、Ｆｒ．１４およびＦｒ．１
０）において、２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 が、最も多か
った。せん断応力条件（０．６および１．２ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ2 ）下で、ローリング後接着細胞数は、大きく増
加した。
【００８３】第６Ａ図および第６Ｂ図を参照し、さらに
詳細にみると、規定された壁面せん断応力条件（１２、
４．８、２．４、１．２および０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ
2 ）下における、単純ローリング細胞およびローリング
後接着細胞数は、らせん矢印つきのブロックで示した。
第６Ａ図：パネルＩ、ＳＬｅX −ＬｅX （Ｓｄｉｙ2）
に対する細胞接着。試験した全てのせん断応力条件下
で、ローリングは見られなかった。低レベルだがローリ
ングのない接着が、４．８〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2
せん断応力で、観察された。壁面せん断応力は異なって
も、接着細胞数に変化は見られなかった。ａ，ローリン
グ細胞数；ｂ、非ローリング性接着細胞数；パネルＩ
Ｉ、ガングリオシドＦｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７）をコ
ートしたビーズに対する単純ローリング細胞およびロー
リング後接着細胞。ローリングは２．４ｄｙｎｅｓ／ｃ
ｍ2 で最高で、より小さいせん断応力では減少した。
ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。
第６Ｂ図：パネルＩＩＩ、Ｆｒ．１４（Ｓｔｒ．９、１
０、１１および１２の混合物）でコートしたビーズに対
する単純ローリングおよびローリング後接着細胞。高い
ローリング後接着が、２．４〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ
2 で観察された。ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリン
グ後接着細胞数。パネルＩＶ、Ｓｔｒ．４および５の混
合物である、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物を
コートしたビーズに対する単純ローリング細胞およびロ
ーリング後接着細胞。ローリング後接着の最大値は、
２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で観察された。ａ、ローリン
グ細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。
詳細にみると、規定された壁面せん断応力条件（１２、
４．８、２．４、１．２および０．６ｄｙｎｅｓ／ｃｍ
2 ）下における、単純ローリング細胞およびローリング
後接着細胞数は、らせん矢印つきのブロックで示した。
第６Ａ図：パネルＩ、ＳＬｅX −ＬｅX （Ｓｄｉｙ2）
に対する細胞接着。試験した全てのせん断応力条件下
で、ローリングは見られなかった。低レベルだがローリ
ングのない接着が、４．８〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2
せん断応力で、観察された。壁面せん断応力は異なって
も、接着細胞数に変化は見られなかった。ａ，ローリン
グ細胞数；ｂ、非ローリング性接着細胞数；パネルＩ
Ｉ、ガングリオシドＦｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７）をコ
ートしたビーズに対する単純ローリング細胞およびロー
リング後接着細胞。ローリングは２．４ｄｙｎｅｓ／ｃ
ｍ2 で最高で、より小さいせん断応力では減少した。
ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。
第６Ｂ図：パネルＩＩＩ、Ｆｒ．１４（Ｓｔｒ．９、１
０、１１および１２の混合物）でコートしたビーズに対
する単純ローリングおよびローリング後接着細胞。高い
ローリング後接着が、２．４〜１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ
2 で観察された。ａ、ローリング細胞数；ｂ、ローリン
グ後接着細胞数。パネルＩＶ、Ｓｔｒ．４および５の混
合物である、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物を
コートしたビーズに対する単純ローリング細胞およびロ
ーリング後接着細胞。ローリング後接着の最大値は、
２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で観察された。ａ、ローリン
グ細胞数；ｂ、ローリング後接着細胞数。
【００８４】動的流動条件下におけるＥ−セレクチン発
現性細胞のローリングおよび接着 第２Ａ〜２Ｅ図は、上記実験で得られたと同様の、せん
断応力条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞のローリングおよび接着結果を示す。第２Ａ図は、Ｓ
ＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上では、全てのせん
断応力で、接着は見られたが、ローリング細胞は見られ
なかったことを示す。
現性細胞のローリングおよび接着 第２Ａ〜２Ｅ図は、上記実験で得られたと同様の、せん
断応力条件下における、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞のローリングおよび接着結果を示す。第２Ａ図は、Ｓ
ＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上では、全てのせん
断応力で、接着は見られたが、ローリング細胞は見られ
なかったことを示す。
【００８５】第２Ｂ図は、Ｆｒ．１２−２をコートした
ビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示
す。ローリングは、４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で最も高
かった。ローリングおよび接着は、何れも、Ｆｒ．１３
−１または１４をコートしたビーズ上より、低かった
（それぞれ、第２Ｃ図および第２Ｅ図）。しかし、ＳＬ
ｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上でのそれに匹敵し
た。
ビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示
す。ローリングは、４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で最も高
かった。ローリングおよび接着は、何れも、Ｆｒ．１３
−１または１４をコートしたビーズ上より、低かった
（それぞれ、第２Ｃ図および第２Ｅ図）。しかし、ＳＬ
ｅX −ＬｅX をコートしたビーズ上でのそれに匹敵し
た。
【００８６】第２Ｃ図は、Ｆｒ．１３−１（Ｓｔｒ．
７）をコートしたビーズ上での細胞のローリングおよび
接着結果を示す。ローリング細胞数は、４．８および
２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ
2 より高かった。
７）をコートしたビーズ上での細胞のローリングおよび
接着結果を示す。ローリング細胞数は、４．８および
２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ
2 より高かった。
【００８７】第２Ｄ図は、Ｆｒ．１３−１をコートした
ビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示
す。ローリング細胞数は、４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で
最も高かった。１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 では、接着は
より高かったが、ローリングはより低かった。
ビーズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示
す。ローリング細胞数は、４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で
最も高かった。１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 では、接着は
より高かったが、ローリングはより低かった。
【００８８】第２Ｅ図は、Ｆｒ．１４をコートしたビー
ズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示す。ロ
ーリングおよび接着は、２．４および４．８ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ2 で最も高かった。ローリングは、１．２ｄｙｎ
ｅｓ／ｃｍ2 で、より低かった。
ズ上での、細胞のローリングおよび接着結果を示す。ロ
ーリングおよび接着は、２．４および４．８ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ2 で最も高かった。ローリングは、１．２ｄｙｎ
ｅｓ／ｃｍ2 で、より低かった。
【００８９】ミエロローリン同族体は、生理的せん断応
力の動的流動条件下、ＳＬｅX −ＬｅX より高いＥ−セ
レクチン依存性ローリングおよび接着を示した １００ｎｇのポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆ
ｒ．１３−１、Ｆｒ．１４またはＳＬｅX −ＬｅX ）
を、顕微鏡スライドに固定したビーズに接着し、その
後、「材料および方法」で記載した動的流動系に置い
た。この系で、種々のせん断応力下において、Ｅ−セレ
クチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着を、測
定した。ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドをコートし
たビーズへの、細胞接着の傾向は、４μｍビーズでも１
μｍビーズでも、本質的に同様であった（それぞれ、第
２Ｃ図および第２Ｄ図）。Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．
１４は、４．８または２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、強
いローリングおよび接着を引き起こした。ローリング細
胞数は、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 では、より低かった
（第２Ｃ図、第２Ｄ図および第２Ｅ図）。ＳＬｅX −Ｌ
ｅX をコートしたビーズ上での接着細胞数は、Ｆｒ．１
３−１または１４をコートしたそれよりも、かなり低か
った。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズでは、いか
なるローリング細胞も観察されなかった（第２Ａ図）。
力の動的流動条件下、ＳＬｅX −ＬｅX より高いＥ−セ
レクチン依存性ローリングおよび接着を示した １００ｎｇのポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆ
ｒ．１３−１、Ｆｒ．１４またはＳＬｅX −ＬｅX ）
を、顕微鏡スライドに固定したビーズに接着し、その
後、「材料および方法」で記載した動的流動系に置い
た。この系で、種々のせん断応力下において、Ｅ−セレ
クチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着を、測
定した。ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシドをコートし
たビーズへの、細胞接着の傾向は、４μｍビーズでも１
μｍビーズでも、本質的に同様であった（それぞれ、第
２Ｃ図および第２Ｄ図）。Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．
１４は、４．８または２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、強
いローリングおよび接着を引き起こした。ローリング細
胞数は、１．２ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 では、より低かった
（第２Ｃ図、第２Ｄ図および第２Ｅ図）。ＳＬｅX −Ｌ
ｅX をコートしたビーズ上での接着細胞数は、Ｆｒ．１
３−１または１４をコートしたそれよりも、かなり低か
った。ＳＬｅX −ＬｅX をコートしたビーズでは、いか
なるローリング細胞も観察されなかった（第２Ａ図）。
【００９０】動的流動条件下、種々のガングリオシドに
対するＥ−セレクチン発現性細胞のローリング／接着に
関する一連の実験で、ＳＬｅX を有する構造がローリン
グを惹起しないことが明らかとなった。Ｆｒ．１０およ
び１４に見られるような、異なったＧｌｃＮＡｃで、α
１→３結合した、一つのＦｕｃ（フコース）を有するシ
アロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃが、強いローリングを引
き起こした。二つのα１→３Ｆｕｃ残基を有する本質的
に純粋な成分である、Ｆｒ．１３−１も、また、強いロ
ーリングを惹起した。接着細胞を除いて、ローリング細
胞をカウントし、第４Ｃ図にその結果を示した。
対するＥ−セレクチン発現性細胞のローリング／接着に
関する一連の実験で、ＳＬｅX を有する構造がローリン
グを惹起しないことが明らかとなった。Ｆｒ．１０およ
び１４に見られるような、異なったＧｌｃＮＡｃで、α
１→３結合した、一つのＦｕｃ（フコース）を有するシ
アロシル・ポリ−ＬａｃＮＡｃが、強いローリングを引
き起こした。二つのα１→３Ｆｕｃ残基を有する本質的
に純粋な成分である、Ｆｒ．１３−１も、また、強いロ
ーリングを惹起した。接着細胞を除いて、ローリング細
胞をカウントし、第４Ｃ図にその結果を示した。
【００９１】ミエロローリン混合物は、精製ミエロロー
リンより、より強いローリングおよび接着を惹起した 第３Ａ図、第４Ｂ図、第４Ｃ図、第５Ａ図、第５Ｂ図、
第６Ａ図および第６Ｂ図に示した、動的条件下におけ
る、細胞ローリングおよび接着に関するデータ（ＳＬｅ
X −ＬｅX に関するデータを除く）は、ミエロローリン
混合物に関するものである。更なる実験の結果、「ミエ
ロローリン混合物」は、精製ミエロローリンより高い、
Ｅ−セレクチン依存性ローリング後接着を惹起する能力
を示すことが、明らかになった（第２表参照）。
リンより、より強いローリングおよび接着を惹起した 第３Ａ図、第４Ｂ図、第４Ｃ図、第５Ａ図、第５Ｂ図、
第６Ａ図および第６Ｂ図に示した、動的条件下におけ
る、細胞ローリングおよび接着に関するデータ（ＳＬｅ
X −ＬｅX に関するデータを除く）は、ミエロローリン
混合物に関するものである。更なる実験の結果、「ミエ
ロローリン混合物」は、精製ミエロローリンより高い、
Ｅ−セレクチン依存性ローリング後接着を惹起する能力
を示すことが、明らかになった（第２表参照）。
【００９２】ミエロローリン混合物は、また、静的条件
下においても、精製ミエロローリンより強い接着活性を
有する。例えば、Ｓｔｒ．６の純粋化合物である、Ｆ
ｒ．１１は、Ｅ−セレクチン発現性細胞との弱い接着を
示した；一方、Ｓｔｒ．４および５の混合物である、Ｆ
ｒ．１０は、Ｅ−セレクチン発現性細胞との際立った強
い接着を示した（第３Ａ図）。
下においても、精製ミエロローリンより強い接着活性を
有する。例えば、Ｓｔｒ．６の純粋化合物である、Ｆ
ｒ．１１は、Ｅ−セレクチン発現性細胞との弱い接着を
示した；一方、Ｓｔｒ．４および５の混合物である、Ｆ
ｒ．１０は、Ｅ−セレクチン発現性細胞との際立った強
い接着を示した（第３Ａ図）。
【００９３】フローサイトメトリーにより測定された、
ミエロローリンのＥ−およびＰ−セレクチンへの直接結
合 我々の先の研究において、二つのα１→３Ｆｕｃ残基を
有する、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（例えば、
Ｆｒ．１２−３、１３−１および１４）は、静的条件下
においては、Ｅ−セレクチン発現性細胞との結合のみが
可能であった。内部ＧｌｃＮＡｃに、１つのα１→３Ｆ
ｕｃ残基を有するポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド
（Ｆｒ．９、１０および１２−１）への、静的条件下に
おける細胞接着は、観察しなかった（Stroud et al., 1
995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-778; S
troud et al., Biochemistry 35:758-769; Stroud et a
l.,1996, Biochemistry 35:770-778 ）。これらの知見
は、その後の実験データによって、確認された（第１Ａ
図および第１Ｂ図に示す）。
ミエロローリンのＥ−およびＰ−セレクチンへの直接結
合 我々の先の研究において、二つのα１→３Ｆｕｃ残基を
有する、ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（例えば、
Ｆｒ．１２−３、１３−１および１４）は、静的条件下
においては、Ｅ−セレクチン発現性細胞との結合のみが
可能であった。内部ＧｌｃＮＡｃに、１つのα１→３Ｆ
ｕｃ残基を有するポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド
（Ｆｒ．９、１０および１２−１）への、静的条件下に
おける細胞接着は、観察しなかった（Stroud et al., 1
995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:777-778; S
troud et al., Biochemistry 35:758-769; Stroud et a
l.,1996, Biochemistry 35:770-778 ）。これらの知見
は、その後の実験データによって、確認された（第１Ａ
図および第１Ｂ図に示す）。
【００９４】対照的に、動的流動条件下においては、内
部ＧｌｃＮＡｃに、１つのα１→３Ｆｕｃ残基を有する
ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆｒ．９、１０お
よび１２−１）は、Ｅ−セレクチン発現性細胞と結合
し、強いローリングを惹起した。これらのミエロローリ
ン・フラクションは、好中球およびＨＬ６０細胞の主要
細胞表面成分であるので、他の方法によって、それらの
Ｅ−セレクチン結合能力を確認することは、重要であ
る。
部ＧｌｃＮＡｃに、１つのα１→３Ｆｕｃ残基を有する
ポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド（Ｆｒ．９、１０お
よび１２−１）は、Ｅ−セレクチン発現性細胞と結合
し、強いローリングを惹起した。これらのミエロローリ
ン・フラクションは、好中球およびＨＬ６０細胞の主要
細胞表面成分であるので、他の方法によって、それらの
Ｅ−セレクチン結合能力を確認することは、重要であ
る。
【００９５】Ｅ−またはＰ−セレクチン結合の種々のガ
ングリオシドへの接着は、Ｅ−またはＰ−セレクチンを
コートした蛍光性ビーズを使用する、新規かつ鋭敏な方
法で評価した。接着は、ミエロローリンをコートしたポ
リスチレン・ビーズ、およびセレクチンをコートした蛍
光性ビーズの凝集により測定した。ガングリオシドを、
非蛍光性ポリスチレン・ビーズにコートし、次いで、Ｅ
ＤＴＡの存在または不存在下、Ｅ−またはＰ−セレクチ
ンをコートした蛍光性ビーズと混合した。凝集は、短く
強い攪拌下で起こるので、該過程は、「静的」でも「動
的」接着でもなく、その中で、ミエロローリンは、不動
の固相として存在した。結合は、サイトフルオロメトリ
ーによって測定した。結合指数は、ガングリオシド・フ
ラクションの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、シアリルパラ
グロボシド（IV3NeuAcnLc4Cer ）のＭＦＩで割ったもの
として定義した。
ングリオシドへの接着は、Ｅ−またはＰ−セレクチンを
コートした蛍光性ビーズを使用する、新規かつ鋭敏な方
法で評価した。接着は、ミエロローリンをコートしたポ
リスチレン・ビーズ、およびセレクチンをコートした蛍
光性ビーズの凝集により測定した。ガングリオシドを、
非蛍光性ポリスチレン・ビーズにコートし、次いで、Ｅ
ＤＴＡの存在または不存在下、Ｅ−またはＰ−セレクチ
ンをコートした蛍光性ビーズと混合した。凝集は、短く
強い攪拌下で起こるので、該過程は、「静的」でも「動
的」接着でもなく、その中で、ミエロローリンは、不動
の固相として存在した。結合は、サイトフルオロメトリ
ーによって測定した。結合指数は、ガングリオシド・フ
ラクションの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、シアリルパラ
グロボシド（IV3NeuAcnLc4Cer ）のＭＦＩで割ったもの
として定義した。
【００９６】結果は、第３Ａ図に示すとおり。ミエロロ
ーリンをコートしたビーズのＥ−セレクチンをコートし
たビーズへの結合は、ＥＤＴＡの存在下において、完全
に阻害された；ミエロローリンをコートしたビーズは、
Ｐ−セレクチンをコートしたビーズと結合できなかっ
た。ＳＬｅX 末端をもたず、ＧｌｃＮＡｃ−ＩＩＩおよ
びＧｌｃＮＡｃ−Ｖにおいて、内部α１→３フコシル化
された、Ｓｔｒ．４および５の混合物をコートしたビー
ズは、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズと強く結合し
た。Ｆｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７および８を１０：１の
割合で含む）およびミエロローリンＳｔｒ．９−１２を
含むＦｒ．１４をコートしたビーズは、同様に、Ｅ−セ
レクチンをコートしたビーズと明白な結合を示した。こ
れと対照的に、内部フコシル化を持たない、Ｆｒ．７
（Ｓｔｒ．１を含む）またはＦｒ．８（Ｓｔｒ．２を含
む）をコートしたビーズは、Ｅ−セレクチンをコートし
たビーズとの結合を示さなかった。ＳＬｅX 末端を有
し、内部α１→３フコシル化を有するＳｔｒ．３をコー
トしたビーズは、予期したとおり、Ｅ−セレクチンをコ
ートしたビーズとの結合を示した。
ーリンをコートしたビーズのＥ−セレクチンをコートし
たビーズへの結合は、ＥＤＴＡの存在下において、完全
に阻害された；ミエロローリンをコートしたビーズは、
Ｐ−セレクチンをコートしたビーズと結合できなかっ
た。ＳＬｅX 末端をもたず、ＧｌｃＮＡｃ−ＩＩＩおよ
びＧｌｃＮＡｃ−Ｖにおいて、内部α１→３フコシル化
された、Ｓｔｒ．４および５の混合物をコートしたビー
ズは、Ｅ−セレクチンをコートしたビーズと強く結合し
た。Ｆｒ．１３−１（Ｓｔｒ．７および８を１０：１の
割合で含む）およびミエロローリンＳｔｒ．９−１２を
含むＦｒ．１４をコートしたビーズは、同様に、Ｅ−セ
レクチンをコートしたビーズと明白な結合を示した。こ
れと対照的に、内部フコシル化を持たない、Ｆｒ．７
（Ｓｔｒ．１を含む）またはＦｒ．８（Ｓｔｒ．２を含
む）をコートしたビーズは、Ｅ−セレクチンをコートし
たビーズとの結合を示さなかった。ＳＬｅX 末端を有
し、内部α１→３フコシル化を有するＳｔｒ．３をコー
トしたビーズは、予期したとおり、Ｅ−セレクチンをコ
ートしたビーズとの結合を示した。
【００９７】第３Ｂ図は、抗Ｅ−セレクチン抗体の、Ｅ
−セレクチンをコートしたビーズと種々のミエロローリ
ン・フラクションをコートしたビーズとの結合に対す
る、抑制効果を示す。Ｅ１Ｃは、ＨＬ６０細胞へのＥ−
セレクチン結合に対する抑制効果に基づいて選択され
た、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂｓの一つである。結合反応
における、ｍＡＢ Ｅ１Ｃの含有は、Ｅ−セレクチンを
コートしたビーズと被験ガングリオシドの何れかをコー
トしたビーズとの結合を、本質的に阻害する（第３Ｂ
図）。
−セレクチンをコートしたビーズと種々のミエロローリ
ン・フラクションをコートしたビーズとの結合に対す
る、抑制効果を示す。Ｅ１Ｃは、ＨＬ６０細胞へのＥ−
セレクチン結合に対する抑制効果に基づいて選択され
た、抗Ｅ−セレクチンｍＡｂｓの一つである。結合反応
における、ｍＡＢ Ｅ１Ｃの含有は、Ｅ−セレクチンを
コートしたビーズと被験ガングリオシドの何れかをコー
トしたビーズとの結合を、本質的に阻害する（第３Ｂ
図）。
【００９８】異なったＧｌｃＮＡｃ残基においてα１→
３結合したフコシルを有する２つのポリ−ＬａｃＮＡｃ
ガングリオシドによる、強化された細胞接着およびロー
リング 第５Ａ図および第５Ｂ図は、Ｅ−セレクチン発現性細胞
の接着およびローリングに対するミエロローリンの併用
による相乗効果を示す。Ｆｒ．１０−１および１０−２
は、それぞれ、ＧｌｃＮＡｃ−ＶおよびＧｌｃＮＡｃ−
ＩＩＩにα１→３フコシル化を有するポリ−ＬａｃＮＡ
ｃガングリオシドである。１００ｎｇのどちらか一方の
フラクションをコートしたビーズは、４．８および２．
４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、同等の細胞ローリングおよび
接着を惹起した（第５Ａ図、プロット１および２）。Ｆ
ｒ．１０−１および１０−２の各５０ｎｇの混合物でコ
ートしたビーズは、これらと同じせん断応力下におい
て、より高い細胞ローリングおよび接着を惹起した（プ
ロット３）。三つのプロット間の相違の統計学的有意性
（対応のないスチューデントのｔ−検定からのＰ値）
は、第５Ａ図の挿入表に示した。
３結合したフコシルを有する２つのポリ−ＬａｃＮＡｃ
ガングリオシドによる、強化された細胞接着およびロー
リング 第５Ａ図および第５Ｂ図は、Ｅ−セレクチン発現性細胞
の接着およびローリングに対するミエロローリンの併用
による相乗効果を示す。Ｆｒ．１０−１および１０−２
は、それぞれ、ＧｌｃＮＡｃ−ＶおよびＧｌｃＮＡｃ−
ＩＩＩにα１→３フコシル化を有するポリ−ＬａｃＮＡ
ｃガングリオシドである。１００ｎｇのどちらか一方の
フラクションをコートしたビーズは、４．８および２．
４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 で、同等の細胞ローリングおよび
接着を惹起した（第５Ａ図、プロット１および２）。Ｆ
ｒ．１０−１および１０−２の各５０ｎｇの混合物でコ
ートしたビーズは、これらと同じせん断応力下におい
て、より高い細胞ローリングおよび接着を惹起した（プ
ロット３）。三つのプロット間の相違の統計学的有意性
（対応のないスチューデントのｔ−検定からのＰ値）
は、第５Ａ図の挿入表に示した。
【００９９】細胞ローリングおよび接着に対する、Ｆ
ｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２の混合物の、何れか
一方のフラクションだけと比較した相乗効果は、Ｆｒ．
１０−１およびＦｒ．１０−２を１０００倍低い濃度で
使用した時、より明らかであった（第５Ｂ図）。Ｆｒ．
１０−２は、この低レベル（０．１ｎｇ／スポット）に
おいて、なお、いくらかの細胞ローリングおよび接着を
引き起こしたが（第５Ｂ図、プロット２）、Ｆｒ．１０
−１は、起こさなかった（プロット１）。これとは対照
的に、Ｆｒ．１０−１および１０−２の各０．０５ｎｇ
の混合物は、生理的せん断応力下（２．４〜４．８ｄｙ
ｎｅｓ／ｃｍ2 ）、かなりの細胞ローリングおよび接着
を惹起した（プロット３）。プロット間の統計学的有意
性（対応のないスチューデントのｔ−検定からのＰ値）
は、第５Ｂ図の挿入表に示した。
ｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２の混合物の、何れか
一方のフラクションだけと比較した相乗効果は、Ｆｒ．
１０−１およびＦｒ．１０−２を１０００倍低い濃度で
使用した時、より明らかであった（第５Ｂ図）。Ｆｒ．
１０−２は、この低レベル（０．１ｎｇ／スポット）に
おいて、なお、いくらかの細胞ローリングおよび接着を
引き起こしたが（第５Ｂ図、プロット２）、Ｆｒ．１０
−１は、起こさなかった（プロット１）。これとは対照
的に、Ｆｒ．１０−１および１０−２の各０．０５ｎｇ
の混合物は、生理的せん断応力下（２．４〜４．８ｄｙ
ｎｅｓ／ｃｍ2 ）、かなりの細胞ローリングおよび接着
を惹起した（プロット３）。プロット間の統計学的有意
性（対応のないスチューデントのｔ−検定からのＰ値）
は、第５Ｂ図の挿入表に示した。
【０１００】ＳＬｅX −ＬｅX 並びにＦｒ．１０−１お
よびＦｒ．１０−２の混合物の、低濃度での細胞ローリ
ングおよび接着の比較 第４Ａ図は、０．０５ｎｇのＳＬｅx −Ｌｅx （静的条
件下においては、最も強い接着を引き起こした化合物）
は、二つの反復実験（プロット１および２）で、動的条
件下において、ローリングも接着も惹起しなかったこと
を示している。対照的に、第４Ｂ図は、Ｆｒ．１０−１
およびＦｒ．１０−２の各０．０５ｎｇは、同じせん断
応力下で、高い細胞ローリングおよび接着を惹起したこ
とを示している（プロット１および２）。更に実験を重
ねた結果、０．１ｎｇのＳＬｅX−ＬｅX は、細胞ロー
リングおよび接着を惹起しないことを示した。
よびＦｒ．１０−２の混合物の、低濃度での細胞ローリ
ングおよび接着の比較 第４Ａ図は、０．０５ｎｇのＳＬｅx −Ｌｅx （静的条
件下においては、最も強い接着を引き起こした化合物）
は、二つの反復実験（プロット１および２）で、動的条
件下において、ローリングも接着も惹起しなかったこと
を示している。対照的に、第４Ｂ図は、Ｆｒ．１０−１
およびＦｒ．１０−２の各０．０５ｎｇは、同じせん断
応力下で、高い細胞ローリングおよび接着を惹起したこ
とを示している（プロット１および２）。更に実験を重
ねた結果、０．１ｎｇのＳＬｅX−ＬｅX は、細胞ロー
リングおよび接着を惹起しないことを示した。
【０１０１】５．３ 討議 炎症性刺激に対する反応における、ＥＣｓ上のＥ−およ
びＰ−セレクチンの発現は、ＥＣｓと好中球および他の
白血球との相互作用を引き起こし、ローリング後接着お
よび白血球の経内皮遊走をもたらす。Ｅ−セレクチン依
存性ローリング後接着およびＥ−セレクチン依存性接着
は、Ｅ−セレクチンにより、白血球上に発現されるＳＬ
ｅX エピトープの認識が、仲介すると考えられていた。
この概念は、種々の観察に基づいていたが、しかし、好
中球上に存在する、真の糖質エピトープについての絶対
的化学的同定を含んではいなかった。ヒト好中球、他の
白血球および白血病性白血球株細胞（ＨＬ６０およびＵ
９３７）は、以前にはＳＬｅX に結合すると主張され
た、種々のｍＡｂｓと強い反応性を示した。しかしなが
ら、これら細胞に、化学的に検出できるＳＬｅX の量
は、極端に小さい。白血病性白血球の、Ｎ−結合構造の
メチル化側鎖に対するプラスイオンＦＡＢＭＳは、わず
かに検出できるＳＬｅX をあらわす構造、ｍ／ｚ９９９
シグナルを与えた（Fukuda et al., 1984, J. Biol. Ch
em. 259:10925-10935 ）。好中球または骨髄性白血病細
胞のＮ−またはＯ−結合構造の側鎖中のＳＬｅx の存在
は、推定されていたが（Asada et al., 1991, Biochemi
stry 30:1561-1571; Patel et al.,1994, Biochemistry
33:14815-14824）、しかし、絶対的化学的分析によっ
ては裏付けられていなかった。
びＰ−セレクチンの発現は、ＥＣｓと好中球および他の
白血球との相互作用を引き起こし、ローリング後接着お
よび白血球の経内皮遊走をもたらす。Ｅ−セレクチン依
存性ローリング後接着およびＥ−セレクチン依存性接着
は、Ｅ−セレクチンにより、白血球上に発現されるＳＬ
ｅX エピトープの認識が、仲介すると考えられていた。
この概念は、種々の観察に基づいていたが、しかし、好
中球上に存在する、真の糖質エピトープについての絶対
的化学的同定を含んではいなかった。ヒト好中球、他の
白血球および白血病性白血球株細胞（ＨＬ６０およびＵ
９３７）は、以前にはＳＬｅX に結合すると主張され
た、種々のｍＡｂｓと強い反応性を示した。しかしなが
ら、これら細胞に、化学的に検出できるＳＬｅX の量
は、極端に小さい。白血病性白血球の、Ｎ−結合構造の
メチル化側鎖に対するプラスイオンＦＡＢＭＳは、わず
かに検出できるＳＬｅX をあらわす構造、ｍ／ｚ９９９
シグナルを与えた（Fukuda et al., 1984, J. Biol. Ch
em. 259:10925-10935 ）。好中球または骨髄性白血病細
胞のＮ−またはＯ−結合構造の側鎖中のＳＬｅx の存在
は、推定されていたが（Asada et al., 1991, Biochemi
stry 30:1561-1571; Patel et al.,1994, Biochemistry
33:14815-14824）、しかし、絶対的化学的分析によっ
ては裏付けられていなかった。
【０１０２】正常ヒト白血球および前骨髄球性白血病Ｈ
Ｌ６０細胞のガングリオシドに関する、我々の最近の系
統的な研究は、１０糖以上のコアを有する非分枝モノシ
アロガングリオシドのみが、Ｅ−セレクチン結合の原因
となることを示唆した（Stroud et al., 1995, Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 209:777-787 ）。種々のタ
イプのヒト固形癌中に豊富に存在しているＳＬｅX 構造
を有するガングリオシド（例えば、IV3NeuAcIII3FucnLc
4Cer、VI3NeuAcV3FucnLc6Cer、VI3NeuAcV3FunIII3FucnL
c6Cer ）（Yang and Hakomori, 1971 J. Biol. Chem. 2
46:1192-1200; Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem.
259:10511-10517）は、白血球およびＨＬ６０細胞には
全く存在しなかった。８−、１０−、または１２−糖コ
アを有する、長鎖のＰＬＡ脂質の中には、内部フコシル
化を持たず、ＳＬｅX エピトープを有する構造（例え
ば、VIII3NeuAcVII3FucnLc8Cer、 X3NeuAcIX3FucnLc10C
er、 XII3NeuAcXI3FucnLc12Cer）は、全く存在しなかっ
た。その代わり、内部フコシル化を有しＳＬｅX を持
つ、微量成分が存在した（例えば、X3NeuAcIX3FucVII3F
ucnLC10Cer）（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 209:777-787 ）。白血球およびＨＬ６
０細胞に存在する、主要構造は、末端α２→３シアリル
化および内部α１→３フコシル化を有する、一連の非分
枝長鎖ＰＬＡｓであった。代表的構造Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
ＸおよびＹを以下に示す：
Ｌ６０細胞のガングリオシドに関する、我々の最近の系
統的な研究は、１０糖以上のコアを有する非分枝モノシ
アロガングリオシドのみが、Ｅ−セレクチン結合の原因
となることを示唆した（Stroud et al., 1995, Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 209:777-787 ）。種々のタ
イプのヒト固形癌中に豊富に存在しているＳＬｅX 構造
を有するガングリオシド（例えば、IV3NeuAcIII3FucnLc
4Cer、VI3NeuAcV3FucnLc6Cer、VI3NeuAcV3FunIII3FucnL
c6Cer ）（Yang and Hakomori, 1971 J. Biol. Chem. 2
46:1192-1200; Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem.
259:10511-10517）は、白血球およびＨＬ６０細胞には
全く存在しなかった。８−、１０−、または１２−糖コ
アを有する、長鎖のＰＬＡ脂質の中には、内部フコシル
化を持たず、ＳＬｅX エピトープを有する構造（例え
ば、VIII3NeuAcVII3FucnLc8Cer、 X3NeuAcIX3FucnLc10C
er、 XII3NeuAcXI3FucnLc12Cer）は、全く存在しなかっ
た。その代わり、内部フコシル化を有しＳＬｅX を持
つ、微量成分が存在した（例えば、X3NeuAcIX3FucVII3F
ucnLC10Cer）（Stroud et al., 1995, Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 209:777-787 ）。白血球およびＨＬ６
０細胞に存在する、主要構造は、末端α２→３シアリル
化および内部α１→３フコシル化を有する、一連の非分
枝長鎖ＰＬＡｓであった。代表的構造Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
ＸおよびＹを以下に示す：
【０１０３】
【化２１】式中、→は、共有結合を示し、Ｒは、セラミ
ド残基である。
ド残基である。
【０１０４】構造Ａは、Ｓｔｒ．４および６に共通であ
る。構造Ｂは、Ｓｔｒ．５および１０に共通である。構
造Ｃは、Ｓｔｒ．７および１１に共通である。構造Ｄ
は、Ｓｔｒ．１２の中に見出せる。これら４つの構造
は、何れもＳＬｅX エピトープを含有しない。
る。構造Ｂは、Ｓｔｒ．５および１０に共通である。構
造Ｃは、Ｓｔｒ．７および１１に共通である。構造Ｄ
は、Ｓｔｒ．１２の中に見出せる。これら４つの構造
は、何れもＳＬｅX エピトープを含有しない。
【０１０５】構造Ａは、先に、慢性骨髄性白血病細胞
（Fukuda et al.,1984, J. Biol. Chem. 259:10925-109
35）およびヒト結腸ガンから単離したガングリオシド中
に発見され、ＡＣＦＨ−１８抗原として同定された（Nu
delman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13942-1395
1）。構造Ａは、また、ｍＡｂ「ＶＩＭ−２」により決
められるものとして同定され（Macher et al., 1988,
J. Biol. Chem. 263:10186-10191 ）、しかも、一時
は、Ｅ−セレクチン結合性エピトープであると主張され
た（Tiemeyer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:1138-1142）。しかしながら、ＶＩＭ−２−陽
性、ＳＬｅX −陰性ＣＨＯ細胞は、Ｅ−セレクチン依存
性接着を示さなかったので（Lowe et al, 1991, J. Bio
l. Chem. 266:17467-17477; Walz et al., 1990, Scien
ce 250:1132-1135）、ＶＩＭ−２エピトープは、かかる
接着とは、関係がないように思われる。ＶＩＭ−２抗原
が有力なＥ−セレクチン・リガンドである可能性は、Ｖ
ＩＭ−２抗体が、接着をブロックできなかったという事
実、およびＳＬｅX 構造を含まず、ＶＩＭ−２抗原を含
む細胞が、組み換え型のＥ−セレクチンとも活性化内皮
細胞とも結合できなかったという事実によって、否定さ
れた（Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-
17477; Walz et al., 1990, Science 250:1132-1135
）。事実、ＶＩＭ−２エピトープを有するガングリオ
シドＳｔｒ．４および６は、静的条件下で、識別できる
接着は示さなかった。
（Fukuda et al.,1984, J. Biol. Chem. 259:10925-109
35）およびヒト結腸ガンから単離したガングリオシド中
に発見され、ＡＣＦＨ−１８抗原として同定された（Nu
delman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13942-1395
1）。構造Ａは、また、ｍＡｂ「ＶＩＭ−２」により決
められるものとして同定され（Macher et al., 1988,
J. Biol. Chem. 263:10186-10191 ）、しかも、一時
は、Ｅ−セレクチン結合性エピトープであると主張され
た（Tiemeyer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:1138-1142）。しかしながら、ＶＩＭ−２−陽
性、ＳＬｅX −陰性ＣＨＯ細胞は、Ｅ−セレクチン依存
性接着を示さなかったので（Lowe et al, 1991, J. Bio
l. Chem. 266:17467-17477; Walz et al., 1990, Scien
ce 250:1132-1135）、ＶＩＭ−２エピトープは、かかる
接着とは、関係がないように思われる。ＶＩＭ−２抗原
が有力なＥ−セレクチン・リガンドである可能性は、Ｖ
ＩＭ−２抗体が、接着をブロックできなかったという事
実、およびＳＬｅX 構造を含まず、ＶＩＭ−２抗原を含
む細胞が、組み換え型のＥ−セレクチンとも活性化内皮
細胞とも結合できなかったという事実によって、否定さ
れた（Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17467-
17477; Walz et al., 1990, Science 250:1132-1135
）。事実、ＶＩＭ−２エピトープを有するガングリオ
シドＳｔｒ．４および６は、静的条件下で、識別できる
接着は示さなかった。
【０１０６】我々は、ここに、ガングリオシドをコート
したラテックス・ビーズとＥ−またはＰ−セレクチン−
Ｉｇ融合タンパク質をコートした蛍光性ビーズとの間の
相互作用に基づく、新規実験を導入する。該相互作用
は、適正なゲート操作によるフローサイトメトリーによ
って容易にモニターできる。本実験を用いて、Ｆｒ．１
０−１および１０−２の混合物（Ｓｔｒ．４および５を
含む）、Ｆｒ．１３−１（主として、Ｓｔｒ．７を含
む）、およびＦｒ．１４（主要成分として、Ｓｔｒ．９
および１１を含む）は、Ｅ−セレクチンと強力に結合す
ることを発見した。特に重要なことは、異なったタイプ
のミエロローリン混合物が、ローリング後接着を非常に
増進することを観察したことである。これは、フローサ
イトメトリー法のみでなく、動的流動チャンバー内での
細胞接着によっても、明白に実証された（第２表参
照）。
したラテックス・ビーズとＥ−またはＰ−セレクチン−
Ｉｇ融合タンパク質をコートした蛍光性ビーズとの間の
相互作用に基づく、新規実験を導入する。該相互作用
は、適正なゲート操作によるフローサイトメトリーによ
って容易にモニターできる。本実験を用いて、Ｆｒ．１
０−１および１０−２の混合物（Ｓｔｒ．４および５を
含む）、Ｆｒ．１３−１（主として、Ｓｔｒ．７を含
む）、およびＦｒ．１４（主要成分として、Ｓｔｒ．９
および１１を含む）は、Ｅ−セレクチンと強力に結合す
ることを発見した。特に重要なことは、異なったタイプ
のミエロローリン混合物が、ローリング後接着を非常に
増進することを観察したことである。これは、フローサ
イトメトリー法のみでなく、動的流動チャンバー内での
細胞接着によっても、明白に実証された（第２表参
照）。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】要約すると、Ｓｔｒ．１および２（内部フ
コシル化を持たない）は、Ｅ−セレクチンをコートした
表面が何であれ、結合しなかった。これらフラクション
の中で、唯一Ｆｒ．１３−１は、微量のＳｔｒ．８（末
端にＳＬｅX 決定基を有するが、更に、内部フコシル化
も有する）を含有していた。その他のＥ−セレクチン結
合性フラクションは、いずれもＳＬｅX エピトープを含
まなかった。Ｓｔｒ．３（結腸ガン、胃ガン、および肺
ガンなどのヒト固形ガン中に豊富に存在する）は、ＳＬ
ｅX および内部フコシル化を有し、Ｅ−セレクチンをコ
ートした表面と結合した。
コシル化を持たない）は、Ｅ−セレクチンをコートした
表面が何であれ、結合しなかった。これらフラクション
の中で、唯一Ｆｒ．１３−１は、微量のＳｔｒ．８（末
端にＳＬｅX 決定基を有するが、更に、内部フコシル化
も有する）を含有していた。その他のＥ−セレクチン結
合性フラクションは、いずれもＳＬｅX エピトープを含
まなかった。Ｓｔｒ．３（結腸ガン、胃ガン、および肺
ガンなどのヒト固形ガン中に豊富に存在する）は、ＳＬ
ｅX および内部フコシル化を有し、Ｅ−セレクチンをコ
ートした表面と結合した。
【０１０９】末端がα２→３シアリル化され、かつ内部
がα１→３フコシル化されたＰＬＡｓを有する、モノシ
アロガングリオシドは、好中球および骨髄性白血病細胞
の主要成分であり、「ミエロローリン」と総称される。
以前に、ＳＬｅX 決定基に結合すると同定された、ｍＡ
ｂｓ ＦＨ６（Fukushi et al., 1984, J Biol. Chem.
259:10511-10517）、ＣＳＬＥＸ（Fukushima et al., 1
984, Cancer Res. 44:5279-5285）、並びにＳＮＨ３お
よびＳＮＨ４（Muroi et al., 1992, Blood 79:713-71
9）は、全てのミエロローリンと反応することが判明し
た。ＳＬｅX に特異的な、すなわち、ミエロローリンと
交差反応しないｍＡｂｓはなかった。これらｍＡｂｓの
特異性は、なお、究明中である。
がα１→３フコシル化されたＰＬＡｓを有する、モノシ
アロガングリオシドは、好中球および骨髄性白血病細胞
の主要成分であり、「ミエロローリン」と総称される。
以前に、ＳＬｅX 決定基に結合すると同定された、ｍＡ
ｂｓ ＦＨ６（Fukushi et al., 1984, J Biol. Chem.
259:10511-10517）、ＣＳＬＥＸ（Fukushima et al., 1
984, Cancer Res. 44:5279-5285）、並びにＳＮＨ３お
よびＳＮＨ４（Muroi et al., 1992, Blood 79:713-71
9）は、全てのミエロローリンと反応することが判明し
た。ＳＬｅX に特異的な、すなわち、ミエロローリンと
交差反応しないｍＡｂｓはなかった。これらｍＡｂｓの
特異性は、なお、究明中である。
【０１１０】我々は、動的流動および静的条件下におい
て、顕微鏡スライドに固定した、ガングリオシドをコー
トしたラテックス・ビーズに対する、Ｅ−およびＰ−セ
レクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着を比
較した。ミエロローリン（Ｆｒ．１０−１とＦｒ．１０
−２の混合物、Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４）だけ
が、動的流動条件下で、細胞のローリング後接着を引き
起こした。Ｆｒ．１０および１４（微量のＳＬｅX も含
まず、ミエロローリンだけからなる）は、特に０．６〜
２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力下で、最も強い
ローリングおよび接着効果を示した。Ｓｔｒ．３（内部
フコシル化されたＳＬｅX エピトープを有する）は、低
レベルの接着は引き起こしたが、細胞のローリングは引
き起こさなかった。静的条件下においては、対照的に、
Ｓｔｒ．３は、ミエロローリンよりはるかに高い接着を
惹起した。
て、顕微鏡スライドに固定した、ガングリオシドをコー
トしたラテックス・ビーズに対する、Ｅ−およびＰ−セ
レクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着を比
較した。ミエロローリン（Ｆｒ．１０−１とＦｒ．１０
−２の混合物、Ｆｒ．１３−１またはＦｒ．１４）だけ
が、動的流動条件下で、細胞のローリング後接着を引き
起こした。Ｆｒ．１０および１４（微量のＳＬｅX も含
まず、ミエロローリンだけからなる）は、特に０．６〜
２．４ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力下で、最も強い
ローリングおよび接着効果を示した。Ｓｔｒ．３（内部
フコシル化されたＳＬｅX エピトープを有する）は、低
レベルの接着は引き起こしたが、細胞のローリングは引
き起こさなかった。静的条件下においては、対照的に、
Ｓｔｒ．３は、ミエロローリンよりはるかに高い接着を
惹起した。
【０１１１】細胞ローリング後接着（ローリングに続く
接着）は、セレクチン依存性ローリングおよび接着の特
徴的特質と考えられるので、我々は、Ｓｔｒ．４、５、
７、１０、１１等により例証したように、ミエロローリ
ンは、ＥＣｓ上でのセレクチン発現によって仲介され
る、白血球の接着において主要な役割を演ずると推定し
た。この結論は、次の事実に基づいてなされた：すなわ
ち、（ｉ）ミエロローリンは、好中球およびＨＬ６０細
胞に存在する主要構造である。（ｉｉ）ミエロローリン
だけが（内部フコシル化の有無に関係なく、ＳＬｅX で
はなく）細胞ローリング後接着を引き起こした。（ｉｉ
ｉ）内部フコシル化のないＳＬｅX は、好中球およびＨ
Ｌ６０細胞には全く存在しない。
接着）は、セレクチン依存性ローリングおよび接着の特
徴的特質と考えられるので、我々は、Ｓｔｒ．４、５、
７、１０、１１等により例証したように、ミエロローリ
ンは、ＥＣｓ上でのセレクチン発現によって仲介され
る、白血球の接着において主要な役割を演ずると推定し
た。この結論は、次の事実に基づいてなされた：すなわ
ち、（ｉ）ミエロローリンは、好中球およびＨＬ６０細
胞に存在する主要構造である。（ｉｉ）ミエロローリン
だけが（内部フコシル化の有無に関係なく、ＳＬｅX で
はなく）細胞ローリング後接着を引き起こした。（ｉｉ
ｉ）内部フコシル化のないＳＬｅX は、好中球およびＨ
Ｌ６０細胞には全く存在しない。
【０１１２】我々の研究において、静的条件下、末端α
２→３シアリル化および多数の内部α１→３ポリフコシ
ル化を有するフラクション（例えば、上記構造Ｃおよび
Ｄ、またはこれら構造の混合物）だけが、32Ｐ−標識さ
れた、永続的Ｅ−またはＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞を用いた、ＴＬＣ重層技術応用下において、明らかな
Ｅ−セレクチン結合を示した。末端α２→３シアリル化
および内部α１→３モノフコシル化を有するポリ−Ｌａ
ｃＮＡｃ（例えば、構造ＡおよびＢ）は、これら条件下
では、Ｅ−セレクチン結合を示さなかった。これらの結
合特性は、ガラス・プレートに固定した、糖脂質をコー
トしたポリスチレン・ビーズ上に重層した、Ｅ−セレク
チン発現性ＣＨＯ細胞を使用する、静的接着実験システ
ムにおいて確認された。典型的なＳＬｅX 構造を有する
糖脂質（ＳＬｅX −ＬｅX ；VI3NeuAcV3FucIII3FucnLc6
Cer ）は、静的系において、最も高い接着を示した。対
照的に、ガラス・プレートに固定した、同じ糖脂質をコ
ートしたビーズを使用した、動的流動系において、ＳＬ
ｅX −ＬｅX は、全くローリングは起こさず、Ｆｒ．１
０−１、１０−２、１３−１および１４に比べて、弱い
接着しか引き起こさなかった。強い細胞ローリングおよ
び接着は、構造ＸおよびＹを使用した時に観察された。
典型的な例は、Ｆｒ．１０−１、１０−２、Ｆｒ．１３
−１およびＦｒ．１４（構造Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの混合
物）であり、また、生理的せん断応力条件下で、強いロ
ーリングおよび接着を引き起こした。
２→３シアリル化および多数の内部α１→３ポリフコシ
ル化を有するフラクション（例えば、上記構造Ｃおよび
Ｄ、またはこれら構造の混合物）だけが、32Ｐ−標識さ
れた、永続的Ｅ−またはＰ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞を用いた、ＴＬＣ重層技術応用下において、明らかな
Ｅ−セレクチン結合を示した。末端α２→３シアリル化
および内部α１→３モノフコシル化を有するポリ−Ｌａ
ｃＮＡｃ（例えば、構造ＡおよびＢ）は、これら条件下
では、Ｅ−セレクチン結合を示さなかった。これらの結
合特性は、ガラス・プレートに固定した、糖脂質をコー
トしたポリスチレン・ビーズ上に重層した、Ｅ−セレク
チン発現性ＣＨＯ細胞を使用する、静的接着実験システ
ムにおいて確認された。典型的なＳＬｅX 構造を有する
糖脂質（ＳＬｅX −ＬｅX ；VI3NeuAcV3FucIII3FucnLc6
Cer ）は、静的系において、最も高い接着を示した。対
照的に、ガラス・プレートに固定した、同じ糖脂質をコ
ートしたビーズを使用した、動的流動系において、ＳＬ
ｅX −ＬｅX は、全くローリングは起こさず、Ｆｒ．１
０−１、１０−２、１３−１および１４に比べて、弱い
接着しか引き起こさなかった。強い細胞ローリングおよ
び接着は、構造ＸおよびＹを使用した時に観察された。
典型的な例は、Ｆｒ．１０−１、１０−２、Ｆｒ．１３
−１およびＦｒ．１４（構造Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの混合
物）であり、また、生理的せん断応力条件下で、強いロ
ーリングおよび接着を引き起こした。
【０１１３】ミエロローリン構造の混合物（例えば、Ｆ
ｒ．１４）が、生理的せん断応力下において、最も強い
ローリングおよび接着を惹起するという発見を得て、我
々は、Ｆｒ．１０−１、Ｆｒ．１０−２およびＦｒ．１
０−１と１０−２の等量の混合物を、更に念入りに究明
した。生理的せん断応力下において、１００ｎｇの純粋
Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２が惹起したローリ
ングおよび接着は、相互に同等であった。興味深いこと
に、これら二つの成分、各５０ｎｇの混合物は、特に、
生理的せん断応力下において、はるかに高いローリング
および接着を引き起こした。この傾向は、より少ない量
の糖脂質を使用した時、さらに明白であった。最も劇的
な強化は、０．１ｎｇの何れかの成分だけを使用した時
に比較して、それぞれ０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１お
よび１０−２を使用した時に見られた。これらの知見
は、非常に少量のＦｒ．１０−１および１０−２でも、
互いに影響し合って、動的流動条件下において、Ｅ−セ
レクチンがローリングおよび接着を惹起するのに、好適
な構造を形成することを示唆している。この相乗的効果
のメカニズムは、未知のままである。
ｒ．１４）が、生理的せん断応力下において、最も強い
ローリングおよび接着を惹起するという発見を得て、我
々は、Ｆｒ．１０−１、Ｆｒ．１０−２およびＦｒ．１
０−１と１０−２の等量の混合物を、更に念入りに究明
した。生理的せん断応力下において、１００ｎｇの純粋
Ｆｒ．１０−１およびＦｒ．１０−２が惹起したローリ
ングおよび接着は、相互に同等であった。興味深いこと
に、これら二つの成分、各５０ｎｇの混合物は、特に、
生理的せん断応力下において、はるかに高いローリング
および接着を引き起こした。この傾向は、より少ない量
の糖脂質を使用した時、さらに明白であった。最も劇的
な強化は、０．１ｎｇの何れかの成分だけを使用した時
に比較して、それぞれ０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１お
よび１０−２を使用した時に見られた。これらの知見
は、非常に少量のＦｒ．１０−１および１０−２でも、
互いに影響し合って、動的流動条件下において、Ｅ−セ
レクチンがローリングおよび接着を惹起するのに、好適
な構造を形成することを示唆している。この相乗的効果
のメカニズムは、未知のままである。
【０１１４】静的条件下で、最も強いＥ−セレクチン依
存性接着を引き起こす、ＳＬｅX −ＬｅX 構造は、動的
流動条件下においては、ミエロローリン構造より、弱か
った（第２Ａ図と第２Ｃ図、第２Ｄ図および第２Ｅ図を
比較のこと）。この相違は、非常に低い濃度において、
更に、際立っていた。ＳＬｅX −ＬｅX は、０．０５ｎ
ｇの濃度において、本質的に細胞ローリングおよび接着
を惹起しなかった（第４Ａ図）、ところが、Ｆｒ．１０
−１および１０−２の混合物（それぞれ０．０５ｎｇ、
０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX と同じモル濃度を与え
る）は、強いローリングおよび接着を惹起した（第４Ｂ
図）。Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物による強
化は、いずれか一方のフラクションだけの場合と比較し
て、高濃度（５０〜１００ｎｇ）時よりむしろ、低濃度
（例えば、０．０５〜０．１ｎｇ）時により明白であっ
た。Ｆｒ．１０−１および１０−２の効果と対照的に、
ＳＬｅX −ＬｅX は、低濃度（例えば、０．０５〜０．
１ｎｇ）でのＥ−セレクチン発現性細胞のいかなるロー
リングまたは接着も惹起しなかった。
存性接着を引き起こす、ＳＬｅX −ＬｅX 構造は、動的
流動条件下においては、ミエロローリン構造より、弱か
った（第２Ａ図と第２Ｃ図、第２Ｄ図および第２Ｅ図を
比較のこと）。この相違は、非常に低い濃度において、
更に、際立っていた。ＳＬｅX −ＬｅX は、０．０５ｎ
ｇの濃度において、本質的に細胞ローリングおよび接着
を惹起しなかった（第４Ａ図）、ところが、Ｆｒ．１０
−１および１０−２の混合物（それぞれ０．０５ｎｇ、
０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX と同じモル濃度を与え
る）は、強いローリングおよび接着を惹起した（第４Ｂ
図）。Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物による強
化は、いずれか一方のフラクションだけの場合と比較し
て、高濃度（５０〜１００ｎｇ）時よりむしろ、低濃度
（例えば、０．０５〜０．１ｎｇ）時により明白であっ
た。Ｆｒ．１０−１および１０−２の効果と対照的に、
ＳＬｅX −ＬｅX は、低濃度（例えば、０．０５〜０．
１ｎｇ）でのＥ−セレクチン発現性細胞のいかなるロー
リングまたは接着も惹起しなかった。
【０１１５】これらの結果は、ＳＬｅX −ＬｅX よりむ
しろ、ミエロローリンが、生理的動的流動条件下におけ
る、血管内皮細胞上の骨髄細胞のＥ−セレクチン依存性
ローリングおよび接着に対する、主要リガンドであるこ
とを示している。
しろ、ミエロローリンが、生理的動的流動条件下におけ
る、血管内皮細胞上の骨髄細胞のＥ−セレクチン依存性
ローリングおよび接着に対する、主要リガンドであるこ
とを示している。
【０１１６】我々の結果は、また、何故、異なった位置
のα１→３フコシル化および末端シアリル化を有する、
一連のポリ−ＬａｃＮＡｃ構造が、好中球表面に存在
し、かつ配列を形成するのか、という疑問に対する説明
を暗示している。特異的構造の組み合わせは、高−、中
−または低−せん断応力動的流動条件下において、最適
条件でＥ−セレクチンと結合するために、高−、中−ま
たは低−親和性結合部位を形成するのかもしれない。ポ
リ−ＬａｃＮＡｃが、らせん構造を形成することは、知
られている。ミエロローリンおよびミエログリカンは、
多数または一個のフコシル残基が結合し、かつ異なった
方向に配向している、らせん骨格構造を有しているかも
しれない。かかるらせん構造は、フコシル残基の位置に
基づいて、互いに影響し合うことができた。
のα１→３フコシル化および末端シアリル化を有する、
一連のポリ−ＬａｃＮＡｃ構造が、好中球表面に存在
し、かつ配列を形成するのか、という疑問に対する説明
を暗示している。特異的構造の組み合わせは、高−、中
−または低−せん断応力動的流動条件下において、最適
条件でＥ−セレクチンと結合するために、高−、中−ま
たは低−親和性結合部位を形成するのかもしれない。ポ
リ−ＬａｃＮＡｃが、らせん構造を形成することは、知
られている。ミエロローリンおよびミエログリカンは、
多数または一個のフコシル残基が結合し、かつ異なった
方向に配向している、らせん骨格構造を有しているかも
しれない。かかるらせん構造は、フコシル残基の位置に
基づいて、互いに影響し合うことができた。
【０１１７】本研究を通して、試験したガングリオシド
が何であれ、Ｐ−セレクチン依存性結合は、上記のフロ
ーサイトメトリー法によっても、また、Ｐ−セレクチン
発現性ＣＨＯ細胞のガングリオシドをコートしたプレー
トへの接着によっても、静的または動的流動条件下何れ
においても、観察されなかった。Ｐ−セレクチン依存性
接着は、特異的糖質構造に加えて、明らかに「ＰＳＧＬ
−１類似の」集合分子を要求する（Handa et al., 199
5, Int. J. Oncol. 6:773-781; Sako et al., 1993, Ce
ll 75:1179-1186）。Ｐ−セレクチン結合のために、要
求される糖質エピトープに関する、より進んだ研究は進
行中である。
が何であれ、Ｐ−セレクチン依存性結合は、上記のフロ
ーサイトメトリー法によっても、また、Ｐ−セレクチン
発現性ＣＨＯ細胞のガングリオシドをコートしたプレー
トへの接着によっても、静的または動的流動条件下何れ
においても、観察されなかった。Ｐ−セレクチン依存性
接着は、特異的糖質構造に加えて、明らかに「ＰＳＧＬ
−１類似の」集合分子を要求する（Handa et al., 199
5, Int. J. Oncol. 6:773-781; Sako et al., 1993, Ce
ll 75:1179-1186）。Ｐ−セレクチン結合のために、要
求される糖質エピトープに関する、より進んだ研究は進
行中である。
【０１１８】ミエロローリンのポリラクトサミン鎖上の
シアル酸（ＳＡ）およびフコシル残基（Ｆｕｃ）の組立
に関する、三つのあり得るスキームを第７図に示した。
反復的なＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ
１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌは、らせん構造を形
成する（Atkins et al., Polymer 15:263-271, 1974;Re
es DA, MTP Intl Review of Science 5:1-42, 1975; Ni
emann et al., Biochem Biophys Res Commun 81:1286-1
293, 1978）。二重または三重のらせん構造が、水素結
合を通して形成される可能性は高い(Rees DA, MTP Intl
Review of Science 5:1-42, 1975; Frey-Wyssling A.,
Submicroscopic morphology of protoplasm, Elsevier
Publ. Co., Amsterdam, 1953)。スキームＡは、一個の
Ｆｕｃを異なった内部ＧｌｃＮＡｃ残基に有する二つの
ミエロローリン分子が取りうる二重らせん会合である
（位置は、１および２で示した；Ｆｕｃ残基は、「Ｆｕ
ｃ１」および「Ｆｕｃ２」で示した）（第７図、パネル
Ａ）。スキームＢ：それぞれ二個のＦｕｃ残基を有す
る、二個の同一ミエロローリン分子が取りうる二重らせ
ん会合；位置１および２に一つづつ；残基は、上記のよ
うに、「Ｆｕｃ１」および「Ｆｕｃ２」で示した（第７
図、パネルＢ）。スキームＣは、末端から二番目のＧｌ
ｃＮＡｃにＦｕｃ「Ｘ」を有するＳＬｅX の配置である
（第７図、パネルＣ）。
シアル酸（ＳＡ）およびフコシル残基（Ｆｕｃ）の組立
に関する、三つのあり得るスキームを第７図に示した。
反復的なＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ
１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌは、らせん構造を形
成する（Atkins et al., Polymer 15:263-271, 1974;Re
es DA, MTP Intl Review of Science 5:1-42, 1975; Ni
emann et al., Biochem Biophys Res Commun 81:1286-1
293, 1978）。二重または三重のらせん構造が、水素結
合を通して形成される可能性は高い(Rees DA, MTP Intl
Review of Science 5:1-42, 1975; Frey-Wyssling A.,
Submicroscopic morphology of protoplasm, Elsevier
Publ. Co., Amsterdam, 1953)。スキームＡは、一個の
Ｆｕｃを異なった内部ＧｌｃＮＡｃ残基に有する二つの
ミエロローリン分子が取りうる二重らせん会合である
（位置は、１および２で示した；Ｆｕｃ残基は、「Ｆｕ
ｃ１」および「Ｆｕｃ２」で示した）（第７図、パネル
Ａ）。スキームＢ：それぞれ二個のＦｕｃ残基を有す
る、二個の同一ミエロローリン分子が取りうる二重らせ
ん会合；位置１および２に一つづつ；残基は、上記のよ
うに、「Ｆｕｃ１」および「Ｆｕｃ２」で示した（第７
図、パネルＢ）。スキームＣは、末端から二番目のＧｌ
ｃＮＡｃにＦｕｃ「Ｘ」を有するＳＬｅX の配置である
（第７図、パネルＣ）。
【０１１９】動的流動条件下でのＥ−セレクチン発現性
細胞のローリング／接着は、恐らく、ＳＡおよびＦｕｃ
の立体的配置および相互関係によって、すなわち；らせ
んポリラクトサミン骨格に沿った、これらの角度差およ
び配向性によって支配される。
細胞のローリング／接着は、恐らく、ＳＡおよびＦｕｃ
の立体的配置および相互関係によって、すなわち；らせ
んポリラクトサミン骨格に沿った、これらの角度差およ
び配向性によって支配される。
【０１２０】らせん骨格の軸に沿って見た、ＳＡおよび
Ｆｕｃ間のあり得る配置および相互関係は、第７図のパ
ネルＤに示した（ＩはスキームＡと；ＩＩはスキームＢ
と；ＩＩＩはスキームＣと対応する）。異なったＦｕｃ
位置を有する二個のミエロローリン分子間に形成されて
いる（Ｆｕｃ１［黒］およびＦｕｃ２［白］）配置Ｉ
は、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物によって例
証されたように、ローリングおよび接着能力を大いに高
めるであろう。恐らく、Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２は、図
示されたように、らせんポリラクトサミン骨格に沿って
対称の位置にある。
Ｆｕｃ間のあり得る配置および相互関係は、第７図のパ
ネルＤに示した（ＩはスキームＡと；ＩＩはスキームＢ
と；ＩＩＩはスキームＣと対応する）。異なったＦｕｃ
位置を有する二個のミエロローリン分子間に形成されて
いる（Ｆｕｃ１［黒］およびＦｕｃ２［白］）配置Ｉ
は、Ｆｒ．１０−１および１０−２の混合物によって例
証されたように、ローリングおよび接着能力を大いに高
めるであろう。恐らく、Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２は、図
示されたように、らせんポリラクトサミン骨格に沿って
対称の位置にある。
【０１２１】スキームＢの様に会合し、かつ軸に沿って
見たときＩＩの様にみえる、ミエロローリン分子間のロ
ーリングおよび接着能力は、スキームＡのように会合し
た二個の分子の場合と殆ど同じである。恐らく、二個の
分子上の、Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２は、ＩＩに示したと
おり、対称の位置にある。
見たときＩＩの様にみえる、ミエロローリン分子間のロ
ーリングおよび接着能力は、スキームＡのように会合し
た二個の分子の場合と殆ど同じである。恐らく、二個の
分子上の、Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２は、ＩＩに示したと
おり、対称の位置にある。
【０１２２】ＳＬｅX は、非常に異なった配置を有し
（スキームＣ；図ＩＩＩ）、ローリングを惹起できない
のであろう。
（スキームＣ；図ＩＩＩ）、ローリングを惹起できない
のであろう。
【０１２３】本発明の好ましい実施態様については、図
解し、かつ詳述したが、本発明の意図するところおよび
範囲から離脱せず、種々の変更が可能であることが理解
されるだろう。
解し、かつ詳述したが、本発明の意図するところおよび
範囲から離脱せず、種々の変更が可能であることが理解
されるだろう。
【０１２４】種々の出版物を、本明細書で引用してお
り、その開示事項は、そっくりそのまま参考文献として
組み入れられる。
り、その開示事項は、そっくりそのまま参考文献として
組み入れられる。
【図１】第１Ａ図。 静的条件下における、Ｅ−セレク
チン発現性ＣＨＯ細胞の、種々の量のポリ−ＬａｃＮＡ
ｃガングリオシドでコートした９６−ウエル・プレート
のウエルへの接着。各点は、３重実験の平均実験値マイ
ナス対照値を表す。記号「●」は、ＳＬｅX −ＬｅX を
表す。他の記号は、Ｆｒ．９、１０−１、１０−２、１
２−２を表す。
チン発現性ＣＨＯ細胞の、種々の量のポリ−ＬａｃＮＡ
ｃガングリオシドでコートした９６−ウエル・プレート
のウエルへの接着。各点は、３重実験の平均実験値マイ
ナス対照値を表す。記号「●」は、ＳＬｅX −ＬｅX を
表す。他の記号は、Ｆｒ．９、１０−１、１０−２、１
２−２を表す。
【図２】第１Ｂ図。 静的条件下における、Ｅ−セレク
チン発現性ＣＨＯ細胞の、種々のポリ−ＬａｃＮＡｃガ
ングリオシドでコートしたポリスチレン・ビーズ（直径
１μｍ）への接着。各点は、１実験の結果を表す。水平
線は、算術平均を示す。
チン発現性ＣＨＯ細胞の、種々のポリ−ＬａｃＮＡｃガ
ングリオシドでコートしたポリスチレン・ビーズ（直径
１μｍ）への接着。各点は、１実験の結果を表す。水平
線は、算術平均を示す。
【図３】〜
【図７】第２Ａ〜２Ｅ図。 動的流動条件下における、
Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の、種々のガングリオ
シド（ＧＳＬ）でコートしたポリスチレン・ビーズへの
ローリングおよび接着。ガングリオシドは、材料と方法
の章に記載した、ガラス顕微鏡スライドに固定したビー
ズに定量的に吸着させた。ガラス・プレートに固定した
ポリスチレン・ビーズは、動的流動に耐性がある。スラ
イドは、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、室温で１時間培養
することによってブロックして、平行板層流チャンバー
中に組み立てた。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞は、
新規に採取し、ＲＰＭＩ培地（１×１０5 細胞／ｍＬ）
に懸濁した。細胞懸濁物は、層流チャンバーと連結した
注入ポンプ中におき、種々の層流速度で該装置に注入し
た。細胞の動きは、位相差顕微鏡で観察し、ビデオカセ
ットレコーダーに記録した。４または５の異なるせん断
応力（ｄｙｎｅ／ｃｍ2 ；横軸参照）で、少なくとも１
０の顕微鏡視野で見られた、ローリング細胞の数（○）
並びにローリングおよび接着細胞の合計数（●）をプロ
ットした。各図で、円の数は４を超えても単に４で表し
た。
Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の、種々のガングリオ
シド（ＧＳＬ）でコートしたポリスチレン・ビーズへの
ローリングおよび接着。ガングリオシドは、材料と方法
の章に記載した、ガラス顕微鏡スライドに固定したビー
ズに定量的に吸着させた。ガラス・プレートに固定した
ポリスチレン・ビーズは、動的流動に耐性がある。スラ
イドは、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、室温で１時間培養
することによってブロックして、平行板層流チャンバー
中に組み立てた。Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞は、
新規に採取し、ＲＰＭＩ培地（１×１０5 細胞／ｍＬ）
に懸濁した。細胞懸濁物は、層流チャンバーと連結した
注入ポンプ中におき、種々の層流速度で該装置に注入し
た。細胞の動きは、位相差顕微鏡で観察し、ビデオカセ
ットレコーダーに記録した。４または５の異なるせん断
応力（ｄｙｎｅ／ｃｍ2 ；横軸参照）で、少なくとも１
０の顕微鏡視野で見られた、ローリング細胞の数（○）
並びにローリングおよび接着細胞の合計数（●）をプロ
ットした。各図で、円の数は４を超えても単に４で表し
た。
【図３】第２Ａ図。 ＳＬｅX −ＬｅX でコートした４
μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
μｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
【図４】第２Ｂ図。 Ｆｒ．１２−２でコートした４μ
ｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
ｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
【図５】第２Ｃ図。 Ｆｒ．１３−１でコートした４μ
ｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
ｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
【図６】第２Ｄ図。 Ｆｒ．１３−１でコートした１μ
ｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
ｍビーズ上での細胞のローリング・接着。
【図７】第２Ｅ図。 Ｆｒ．１４でコートした１μｍビ
ーズ上での細胞のローリング・接着。
ーズ上での細胞のローリング・接着。
【図８】第３Ａ図。 静的条件下における、Ｅ−セレク
チンでコートしたビーズの、種々のガングリオシドでコ
ートしたビーズへの接着。白い柱は、Ｅ−セレクチンで
コートしたビーズ；薄い影付の柱は、５ｍＭのＥＤＴＡ
存在下Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；濃い影付の
柱は、Ｐ−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、
ヒトＩｇＧでコートしたビーズ。
チンでコートしたビーズの、種々のガングリオシドでコ
ートしたビーズへの接着。白い柱は、Ｅ−セレクチンで
コートしたビーズ；薄い影付の柱は、５ｍＭのＥＤＴＡ
存在下Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；濃い影付の
柱は、Ｐ−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、
ヒトＩｇＧでコートしたビーズ。
【図９】第３Ｂ図。 種々のミエロローリン・フラクシ
ョンでコートしたビーズと結合するＥ−セレクチンでコ
ートしたビーズに対する、抗−Ｅ−セレクチン抗体の抑
制効果。白い柱は、対照マウスＩｇＧでプレインキュベ
ートした、Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱
は、ｍＡｂ Ｅ１Ｃでプレインキュベートした、Ｅ−セ
レクチンでコートしたビーズ。
ョンでコートしたビーズと結合するＥ−セレクチンでコ
ートしたビーズに対する、抗−Ｅ−セレクチン抗体の抑
制効果。白い柱は、対照マウスＩｇＧでプレインキュベ
ートした、Ｅ−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱
は、ｍＡｂ Ｅ１Ｃでプレインキュベートした、Ｅ−セ
レクチンでコートしたビーズ。
【図１０】〜
【図１２】第４Ａ〜４Ｃ図。 動的流動条件下におけ
る、非常に少量のＳＬｅX −ＬｅXまたはフラクション
１０−１およびフラクション１０−２でコートしたビー
ズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリン
グおよび接着。
る、非常に少量のＳＬｅX −ＬｅXまたはフラクション
１０−１およびフラクション１０−２でコートしたビー
ズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリン
グおよび接着。
【図１０】第４Ａ図。 プロット１。 ７．７、３．１
および１．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2のせん断応力におけ
る、０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX でコートしたビー
ズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリン
グおよび接着の合計（●）並びにローリング（○）。
プロット２。 プロット１と同一条件下での反復実験。
および１．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2のせん断応力におけ
る、０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX でコートしたビー
ズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリン
グおよび接着の合計（●）並びにローリング（○）。
プロット２。 プロット１と同一条件下での反復実験。
【図１１】第４Ｂ図。 プロット１。 各０．０５ｎｇ
のＦｒ．１０−１および１０−２の混合物（注：これ
で、分子数は０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX と同じに
なる。ＳＬｅX −ＬｅX の分子量が、Ｆｒ．１０−１お
よび１０−２の２倍だから。）でコートしたビーズ上で
の、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよ
び接着の合計（●）並びにローリング（○）。第４Ａ図
と同一のせん断応力。プロット２。 プロット１と同一
条件下での反復実験。
のＦｒ．１０−１および１０−２の混合物（注：これ
で、分子数は０．０５ｎｇのＳＬｅX −ＬｅX と同じに
なる。ＳＬｅX −ＬｅX の分子量が、Ｆｒ．１０−１お
よび１０−２の２倍だから。）でコートしたビーズ上で
の、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよ
び接着の合計（●）並びにローリング（○）。第４Ａ図
と同一のせん断応力。プロット２。 プロット１と同一
条件下での反復実験。
【図１２】第４Ｃ図。 動的流動条件下における、Ｅ−
セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリング。異なるせん
断応力の動的流動系における、種々のガングリオシド
（各１００ｎｇ）でコートしたビーズ（直径４μｍ）上
でのローリング細胞数の平均値。縦軸： ローリング細
胞の数（注：接着細胞数を含む）。横軸： 壁面せん断
応力（ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）。各せん断応力のグループ
において、柱は、ビーズをコートするのに使用した材料
と関係し、左から右に、ＳＬｅX −ＬｅX ；Ｆｒ．１０
（Ｆｒ．１０−１と１０−２の混合物）；Ｆｒ．１３−
１；およびＦｒ．１４。
セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリング。異なるせん
断応力の動的流動系における、種々のガングリオシド
（各１００ｎｇ）でコートしたビーズ（直径４μｍ）上
でのローリング細胞数の平均値。縦軸： ローリング細
胞の数（注：接着細胞数を含む）。横軸： 壁面せん断
応力（ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2 ）。各せん断応力のグループ
において、柱は、ビーズをコートするのに使用した材料
と関係し、左から右に、ＳＬｅX −ＬｅX ；Ｆｒ．１０
（Ｆｒ．１０−１と１０−２の混合物）；Ｆｒ．１３−
１；およびＦｒ．１４。
【図１３】〜
【図１４】第５Ａ図および第５Ｂ図。 動的流動条件下
における、Ｆｒ．１０−１、Ｆｒ．１０−２並びに１０
−１および１０−２の混合物でコートしたビーズ上で
の、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよ
び接着。
における、Ｆｒ．１０−１、Ｆｒ．１０−２並びに１０
−１および１０−２の混合物でコートしたビーズ上で
の、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよ
び接着。
【図１３】第５Ａ図。 （プロット１）１００ｎｇのＦ
ｒ．１０−１；（プロット２）１００ｎｇのＦｒ．１０
−２；（プロット３）各５０ｎｇのＦｒ．１０−１およ
び１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セ
レクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合
計（●）並びにローリング（○）。ガングリオシドは、
１μｍのビーズに吸着した。２．４および４．８ｄｙｎ
ｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力に対する値を図示した。種々
のデータ群間の差異に統計学的有意性があるかどうか
は、対応のないスチューデントのｔ−検定によって評価
し、Ｐ値は、挿入表に要約した。
ｒ．１０−１；（プロット２）１００ｎｇのＦｒ．１０
−２；（プロット３）各５０ｎｇのＦｒ．１０−１およ
び１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セ
レクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合
計（●）並びにローリング（○）。ガングリオシドは、
１μｍのビーズに吸着した。２．４および４．８ｄｙｎ
ｅｓ／ｃｍ2 のせん断応力に対する値を図示した。種々
のデータ群間の差異に統計学的有意性があるかどうか
は、対応のないスチューデントのｔ−検定によって評価
し、Ｐ値は、挿入表に要約した。
【図１４】第５Ｂ図。 （プロット１）０．１ｎｇのＦ
ｒ．１０−１；（プロット２）０．１ｎｇのＦｒ．１０
−２；（プロット３）各０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１
および１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ
−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着
の合計（●）並びにローリング（○）。ガングリオシド
は、１μｍのビーズに吸着した。３つの異なるせん断応
力値を図示した。ローリング／接着は、このように低い
ガングリオシド濃度でも惹起された。ローリングおよび
接着細胞の数は、ガングリオシド混合物（プロット３）
で最大となった。Ｐ値は、第５Ａ図と同様、挿入表に要
約した。
ｒ．１０−１；（プロット２）０．１ｎｇのＦｒ．１０
−２；（プロット３）各０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１
および１０−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ
−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着
の合計（●）並びにローリング（○）。ガングリオシド
は、１μｍのビーズに吸着した。３つの異なるせん断応
力値を図示した。ローリング／接着は、このように低い
ガングリオシド濃度でも惹起された。ローリングおよび
接着細胞の数は、ガングリオシド混合物（プロット３）
で最大となった。Ｐ値は、第５Ａ図と同様、挿入表に要
約した。
【図１５】〜
【図１６】第６Ａ図および第６Ｂ図。 動的流動条件下
における、種々のガングリオシドでコートしたビーズに
対する、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の接着および
ローリング後接着。
における、種々のガングリオシドでコートしたビーズに
対する、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞の接着および
ローリング後接着。
【図１７】第７図。 シアロシル残基（ＳＡ）およびポ
リラクトサミン鎖上異なる位置の内部ＧｌｃＮＡｃにつ
くフコシル残基（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の、可能性
のある立体的配置。 パネルＡ： 異なる位置にＦｕｃ１またはＦｕｃ２を有
するモノフコシルガングリオシド（例えば、Ｓｔｒ．４
および５またはＳｔｒ．９および１０）の２重螺旋構造
の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在する末
端側から見ると、ＳＡおよびＦｕｃ１、Ｆｕｃ２の立体
的配置は、パネルＤのＩのように見えるだろう。 パネルＢ： 位置は異なるが同じポリラクトサミン鎖に
Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２を有するジフコシルガングリオ
シド（例えば、Ｓｔｒ．７，Ｓｔｒ．１１）の２重螺旋
構造の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在す
る末端側から見ると、ＳＡ並びにＦｕｃ１および２の立
体的配置は、パネルＤのＩＩのように見えるだろう。 パネルＣ： Ｆｕｃが末端から２番目のＧｌｃＮＡｃに
ある（Ｆｕｃ ｘ）、ＳＬｅX 構造。ＳＡとＦｕｃ ｘ
の間の位置関係は、パネルＤのＩＩＩのように見える。 パネルＤ： パネルＡ〜Ｃに図示したガングリオシドを
末端側から見た図。
リラクトサミン鎖上異なる位置の内部ＧｌｃＮＡｃにつ
くフコシル残基（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の、可能性
のある立体的配置。 パネルＡ： 異なる位置にＦｕｃ１またはＦｕｃ２を有
するモノフコシルガングリオシド（例えば、Ｓｔｒ．４
および５またはＳｔｒ．９および１０）の２重螺旋構造
の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在する末
端側から見ると、ＳＡおよびＦｕｃ１、Ｆｕｃ２の立体
的配置は、パネルＤのＩのように見えるだろう。 パネルＢ： 位置は異なるが同じポリラクトサミン鎖に
Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２を有するジフコシルガングリオ
シド（例えば、Ｓｔｒ．７，Ｓｔｒ．１１）の２重螺旋
構造の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在す
る末端側から見ると、ＳＡ並びにＦｕｃ１および２の立
体的配置は、パネルＤのＩＩのように見えるだろう。 パネルＣ： Ｆｕｃが末端から２番目のＧｌｃＮＡｃに
ある（Ｆｕｃ ｘ）、ＳＬｅX 構造。ＳＡとＦｕｃ ｘ
の間の位置関係は、パネルＤのＩＩＩのように見える。 パネルＤ： パネルＡ〜Ｃに図示したガングリオシドを
末端側から見た図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年２月６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】静的条件下における、Ｅ−セレクチン発現性Ｃ
ＨＯ細胞の、種々の量のポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオ
シドでコートした９６−ウエル・プレートのウエルへの
接着。各点は、３重実験の平均実験値マイナス対照値を
表す。記号「●」は、ＳＬｅｘ−Ｌｅｘを表す。他の記
号は、Ｆｒ．９、１０−１、１０−２、１２−２を表
す。（図１を、発明の詳細な説明の項では、第１Ａ図と
表記した。）
ＨＯ細胞の、種々の量のポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオ
シドでコートした９６−ウエル・プレートのウエルへの
接着。各点は、３重実験の平均実験値マイナス対照値を
表す。記号「●」は、ＳＬｅｘ−Ｌｅｘを表す。他の記
号は、Ｆｒ．９、１０−１、１０−２、１２−２を表
す。（図１を、発明の詳細な説明の項では、第１Ａ図と
表記した。）
【図２】静的条件下における、Ｅ−セレクチン発現性Ｃ
ＨＯ細胞の、種々のポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド
でコートしたポリスチレン・ビーズ（直径１μｍ）への
接着。各点は、１実験の結果を表す。水平線は、算術平
均を示す。（図２を、発明の詳細な説明の項では、第１
Ｂ図と表記した。）
ＨＯ細胞の、種々のポリ−ＬａｃＮＡｃガングリオシド
でコートしたポリスチレン・ビーズ（直径１μｍ）への
接着。各点は、１実験の結果を表す。水平線は、算術平
均を示す。（図２を、発明の詳細な説明の項では、第１
Ｂ図と表記した。）
【図３】動的流動条件下における、Ｅ−セレクチン発現
性ＣＨＯ細胞の、種々のガングリオシド（ＧＳＬ）でコ
ートしたポリスチレン・ビーズへのローリングおよび接
着。ガングリオシドは、材料と方法の章に記載した、ガ
ラス顕微鏡スライドに固定したビーズに定量的に吸着さ
せた。ガラス・プレートに固定したポリスチレン・ビー
ズは、動的流動に耐性がある。スライドは、２％ＢＳＡ
を含むＰＢＳ中、室温で１時間培養することによってブ
ロックして、平行板層流チャンバー中に組み立てた。Ｅ
−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞は、新規に採取し、ＲＰ
ＭＩ培地（１×１０５細胞／ｍＬ）に懸濁した。細胞懸
濁物は、層流チャンバーと連結した注入ポンプ中にお
き、種々の層流速度で該装置に注入した。細胞の動き
は、位相差顕微鏡で観察し、ビデオカセットレコーダー
に記録した。４または５の異なるせん断応力（ｄｙｎｅ
／ｃｍ２ ；横軸参照）で、少なくとも１０の顕微鏡視
野で見られた、ローリング細胞の数（〇）並びにローリ
ングおよび接着細胞の合計数（●）をプロットした。各
図で、円の数は４を超えても単に４で表した。（以上、
図４〜７についても、同じ） ＳＬｅｘ−Ｌｅｘでコートした４μｍビーズ上での細胞
のローリング・接着。（図３を、発明の詳細な説明の項
では、第２Ａ図と表記した。）
性ＣＨＯ細胞の、種々のガングリオシド（ＧＳＬ）でコ
ートしたポリスチレン・ビーズへのローリングおよび接
着。ガングリオシドは、材料と方法の章に記載した、ガ
ラス顕微鏡スライドに固定したビーズに定量的に吸着さ
せた。ガラス・プレートに固定したポリスチレン・ビー
ズは、動的流動に耐性がある。スライドは、２％ＢＳＡ
を含むＰＢＳ中、室温で１時間培養することによってブ
ロックして、平行板層流チャンバー中に組み立てた。Ｅ
−セレクチン発現性ＣＨＯ細胞は、新規に採取し、ＲＰ
ＭＩ培地（１×１０５細胞／ｍＬ）に懸濁した。細胞懸
濁物は、層流チャンバーと連結した注入ポンプ中にお
き、種々の層流速度で該装置に注入した。細胞の動き
は、位相差顕微鏡で観察し、ビデオカセットレコーダー
に記録した。４または５の異なるせん断応力（ｄｙｎｅ
／ｃｍ２ ；横軸参照）で、少なくとも１０の顕微鏡視
野で見られた、ローリング細胞の数（〇）並びにローリ
ングおよび接着細胞の合計数（●）をプロットした。各
図で、円の数は４を超えても単に４で表した。（以上、
図４〜７についても、同じ） ＳＬｅｘ−Ｌｅｘでコートした４μｍビーズ上での細胞
のローリング・接着。（図３を、発明の詳細な説明の項
では、第２Ａ図と表記した。）
【図４】Ｆｒ．１２−２でコートした４μｍビーズ上で
の細胞のローリング・接着。（図４を、発明の詳細な説
明の項では、第２Ｂ図と表記した。）
の細胞のローリング・接着。（図４を、発明の詳細な説
明の項では、第２Ｂ図と表記した。）
【図５】Ｆｒ．１３−１でコートした４μｍビーズ上で
の細胞のローリング・接着。（図５を、発明の詳細な説
明の項では、第２Ｃ図と表記した。）
の細胞のローリング・接着。（図５を、発明の詳細な説
明の項では、第２Ｃ図と表記した。）
【図６】Ｆｒ．１３−１でコートした１μｍビーズ上で
の細胞のローリング・接着。（図６を、発明の詳細な説
明の項では、第２Ｄ図と表記した。）
の細胞のローリング・接着。（図６を、発明の詳細な説
明の項では、第２Ｄ図と表記した。）
【図７】Ｆｒ．１４でコートした１μｍビーズ上での細
胞のローリング・接着。（図７を、発明の詳細な説明の
項では、第２Ｅ図と表記した。）
胞のローリング・接着。（図７を、発明の詳細な説明の
項では、第２Ｅ図と表記した。）
【図８】静的条件下における、Ｅ−セレクチンでコート
したビーズの、種々のガングリオシドでコートしたビー
ズへの接着。白い柱は、Ｅ−セレクチンでコートしたビ
ーズ；薄い影付の柱は、５ｍＭのＥＤＴＡ存在下Ｅ−セ
レクチンでコートしたビーズ；濃い影付の柱は、Ｐ−セ
レクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、ヒトＩｇＧで
コートしたビーズ。（図８を、発明の詳細な説明の項で
は、第３Ａ図と表記した。）
したビーズの、種々のガングリオシドでコートしたビー
ズへの接着。白い柱は、Ｅ−セレクチンでコートしたビ
ーズ；薄い影付の柱は、５ｍＭのＥＤＴＡ存在下Ｅ−セ
レクチンでコートしたビーズ；濃い影付の柱は、Ｐ−セ
レクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、ヒトＩｇＧで
コートしたビーズ。（図８を、発明の詳細な説明の項で
は、第３Ａ図と表記した。）
【図９】種々のミエロローリン・フラクションでコート
したビーズと結合するＥ−セレクチンでコートしたビー
ズに対する、抗−Ｅ−セレクチン抗体の抑制効果。白い
柱は、対照マウスＩｇＧでプレインキュベートした、Ｅ
−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、ｍＡｂ
Ｅ１Ｃでプレインキュベートした、Ｅ−セレクチンでコ
ートしたビーズ。（図９を、発明の詳細な説明の項で
は、第３Ｂ図と表記した。）
したビーズと結合するＥ−セレクチンでコートしたビー
ズに対する、抗−Ｅ−セレクチン抗体の抑制効果。白い
柱は、対照マウスＩｇＧでプレインキュベートした、Ｅ
−セレクチンでコートしたビーズ；黒い柱は、ｍＡｂ
Ｅ１Ｃでプレインキュベートした、Ｅ−セレクチンでコ
ートしたビーズ。（図９を、発明の詳細な説明の項で
は、第３Ｂ図と表記した。）
【図１０】動的流動条件下における、非常に少量のＳＬ
ｅｘ−Ｌｅｘまたはフラクション１０−１およびフラク
ション１０−２でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレク
チン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着。（以
上、図１１〜１２についても、同じ） プロット１。 ７．７、３．１および１．５ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ２のせん断応力における、０．０５ｎｇのＳＬｅ
ｘ−Ｌｅｘでコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン
発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計（●）
並びにローリング（○）。 プロット２。 プロット１
と同一条件下での反復実験。（図１０を、発明の詳細な
説明の項では、第４Ａ図と表記した。）
ｅｘ−Ｌｅｘまたはフラクション１０−１およびフラク
ション１０−２でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレク
チン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着。（以
上、図１１〜１２についても、同じ） プロット１。 ７．７、３．１および１．５ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ２のせん断応力における、０．０５ｎｇのＳＬｅ
ｘ−Ｌｅｘでコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン
発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計（●）
並びにローリング（○）。 プロット２。 プロット１
と同一条件下での反復実験。（図１０を、発明の詳細な
説明の項では、第４Ａ図と表記した。）
【図１１】プロット１。 各０．０５ｎｇのＦｒ．１０
−１および１０−２の混合物（注：これで、分子数は
０．０５ｎｇのＳＬｅｘ−Ｌｅｘと同じになる。ＳＬｅ
ｘ−Ｌｅｘの分子量が、Ｆｒ．１０−１および１０−２
の２倍だから。）でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレ
クチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計
（●）並びにローリング（○）。図１０と同一のせん断
応力。 プロット２。プロット１と同一条件下での反復
実験。（図１１を、発明の詳細な説明の項では、第４Ｂ
図と表記した。）
−１および１０−２の混合物（注：これで、分子数は
０．０５ｎｇのＳＬｅｘ−Ｌｅｘと同じになる。ＳＬｅ
ｘ−Ｌｅｘの分子量が、Ｆｒ．１０−１および１０−２
の２倍だから。）でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレ
クチン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計
（●）並びにローリング（○）。図１０と同一のせん断
応力。 プロット２。プロット１と同一条件下での反復
実験。（図１１を、発明の詳細な説明の項では、第４Ｂ
図と表記した。）
【図１２】動的流動条件下における、Ｅ−セレクチン発
現性ＣＨＯ細胞のローリング。異なるせん断応力の動的
流動系における、種々のガングリオシド（各１００ｎ
ｇ）でコートしたビーズ（直径４μｍ）上でのローリン
グ細胞数の平均値。縦軸：ローリング細胞の数（注：接
着細胞数を含む）。横軸： 壁面せん断応力（ｄｙｎｅ
ｓ／ｃｍ２）。各せん断応力のグループにおいて、柱
は、ビーズをコートするのに使用した材料と関係し、左
から右に、ＳＬｅｘ−Ｌｅｘ；Ｆｒ．１０（Ｆｒ．１０
−１と１０−２の混合物）；Ｆｒ．１３−１；およびＦ
ｒ．１４。（図１２を、発明の詳細な説明の項では、第
４Ｃ図と表記した。）
現性ＣＨＯ細胞のローリング。異なるせん断応力の動的
流動系における、種々のガングリオシド（各１００ｎ
ｇ）でコートしたビーズ（直径４μｍ）上でのローリン
グ細胞数の平均値。縦軸：ローリング細胞の数（注：接
着細胞数を含む）。横軸： 壁面せん断応力（ｄｙｎｅ
ｓ／ｃｍ２）。各せん断応力のグループにおいて、柱
は、ビーズをコートするのに使用した材料と関係し、左
から右に、ＳＬｅｘ−Ｌｅｘ；Ｆｒ．１０（Ｆｒ．１０
−１と１０−２の混合物）；Ｆｒ．１３−１；およびＦ
ｒ．１４。（図１２を、発明の詳細な説明の項では、第
４Ｃ図と表記した。）
【図１３】動的流動条件下における、Ｆｒ．１０−１、
Ｆｒ．１０−２並びに１０−１および１０−２の混合物
でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨ
Ｏ細胞のローリングおよび接着。（以上、図１４につい
ても、同じ） （プロット１）１００ｎｇのＦｒ．１０−１；（プロッ
ト２）１００ｎｇのＦｒ．１０−２；（プロット３）各
５０ｎｇのＦｒ．１０−１および１０−２の混合物でコ
ートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞のローリングおよび接着の合計（●）並びにローリン
グ（○）。ガングリオシドは、１μｍのビーズに吸着し
た。２．４および４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２のせん断応
力に対する値を図示した。種々のデータ群間の差異に統
計学的有意性があるかどうかは、対応のないスチューデ
ントのｔ−検定によって評価し、Ｐ値は、挿入表に要約
した。（図１３を、発明の詳細な説明の項では、第５Ａ
図と表記した。）
Ｆｒ．１０−２並びに１０−１および１０−２の混合物
でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨ
Ｏ細胞のローリングおよび接着。（以上、図１４につい
ても、同じ） （プロット１）１００ｎｇのＦｒ．１０−１；（プロッ
ト２）１００ｎｇのＦｒ．１０−２；（プロット３）各
５０ｎｇのＦｒ．１０−１および１０−２の混合物でコ
ートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチン発現性ＣＨＯ細
胞のローリングおよび接着の合計（●）並びにローリン
グ（○）。ガングリオシドは、１μｍのビーズに吸着し
た。２．４および４．８ｄｙｎｅｓ／ｃｍ２のせん断応
力に対する値を図示した。種々のデータ群間の差異に統
計学的有意性があるかどうかは、対応のないスチューデ
ントのｔ−検定によって評価し、Ｐ値は、挿入表に要約
した。（図１３を、発明の詳細な説明の項では、第５Ａ
図と表記した。）
【図１４】（プロット１）０．１ｎｇのＦｒ．１０−
１；（プロット２）０．１ｎｇのＦｒ．１０−２；（プ
ロット３）各０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１および１０
−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチ
ン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計
（●）並びにローリング（○）。ガングリオシドは、１
μｍのビーズに吸着した。３つの異なるせん断応力値を
図示した。ローリング／接着は、このように低いガング
リオシド濃度でも惹起された。ローリングおよび接着細
胞の数は、ガングリオシド混合物（プロット３）で最大
となった。Ｐ値は、図１３と同様、挿入表に要約した。
（図１４を、発明の詳細な説明の項では、第５Ｂ図と表
記した。）
１；（プロット２）０．１ｎｇのＦｒ．１０−２；（プ
ロット３）各０．０５ｎｇのＦｒ．１０−１および１０
−２の混合物でコートしたビーズ上での、Ｅ−セレクチ
ン発現性ＣＨＯ細胞のローリングおよび接着の合計
（●）並びにローリング（○）。ガングリオシドは、１
μｍのビーズに吸着した。３つの異なるせん断応力値を
図示した。ローリング／接着は、このように低いガング
リオシド濃度でも惹起された。ローリングおよび接着細
胞の数は、ガングリオシド混合物（プロット３）で最大
となった。Ｐ値は、図１３と同様、挿入表に要約した。
（図１４を、発明の詳細な説明の項では、第５Ｂ図と表
記した。）
【図１５】動的流動条件下における、種々のガングリオ
シドでコートしたビーズに対する、Ｅ−セレクチン発現
性ＣＨＯ細胞の接着およびローリング後接着。（図１５
を、発明の詳細な説明の項では、第６Ａ図と表記し
た。）
シドでコートしたビーズに対する、Ｅ−セレクチン発現
性ＣＨＯ細胞の接着およびローリング後接着。（図１５
を、発明の詳細な説明の項では、第６Ａ図と表記し
た。）
【図１６】動的流動条件下における、種々のガングリオ
シドでコートしたビーズに対する、Ｅ−セレクチン発現
性ＣＨＯ細胞の接着およびローリング後接着。（図１６
を、発明の詳細な説明の項では、第６Ｂ図と表記し
た。）
シドでコートしたビーズに対する、Ｅ−セレクチン発現
性ＣＨＯ細胞の接着およびローリング後接着。（図１６
を、発明の詳細な説明の項では、第６Ｂ図と表記し
た。）
【図１７】シアロシル残基（ＳＡ）およびポリラクトサ
ミン鎖上異なる位置の内部ＧｌｃＮＡｃにつくフコシル
残基（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の、可能性のある立体
的配置。 パネルＡ： 異なる位置にＦｕｃ１またはＦｕｃ２を有
するモノフコシルガングリオシド（例えば、Ｓｔｒ．４
および５またはＳｔｒ．９および１０）の２重螺旋構造
の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在する末
端側から見ると、ＳＡおよびＦｕｃ１、Ｆｕｃ２の立体
的配置は、パネルＤのＩのように見えるだろう。 パネルＢ： 位置は異なるが同じポリラクトサミン鎖に
Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２を有するジフコシルガングリオ
シド（例えば、Ｓｔｒ．７，Ｓｔｒ．１１）の２重螺旋
構造の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在す
る末端側から見ると、ＳＡ並びにＦｕｃ１および２の立
体的配置は、パネルＤのＩＩのように見えるだろう。 パネルＣ： Ｆｕｃが末端から２番目のＧｌｃＮＡｃに
ある（Ｆｕｃ ｘ）、ＳＬｅｘ構造。ＳＡとＦｕｃ ｘ
の間の位置関係は、パネルＤのＩＩＩのように見える。 パネルＤ： パネルＡ〜Ｃに図示したガングリオシドを
末端側から見た図。（図１７を、発明の詳細な説明の項
では、第７図と表記した。）
ミン鎖上異なる位置の内部ＧｌｃＮＡｃにつくフコシル
残基（Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２）の、可能性のある立体
的配置。 パネルＡ： 異なる位置にＦｕｃ１またはＦｕｃ２を有
するモノフコシルガングリオシド（例えば、Ｓｔｒ．４
および５またはＳｔｒ．９および１０）の２重螺旋構造
の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在する末
端側から見ると、ＳＡおよびＦｕｃ１、Ｆｕｃ２の立体
的配置は、パネルＤのＩのように見えるだろう。 パネルＢ： 位置は異なるが同じポリラクトサミン鎖に
Ｆｕｃ１およびＦｕｃ２を有するジフコシルガングリオ
シド（例えば、Ｓｔｒ．７，Ｓｔｒ．１１）の２重螺旋
構造の、可能性のある配置。この構造を、ＳＡの存在す
る末端側から見ると、ＳＡ並びにＦｕｃ１および２の立
体的配置は、パネルＤのＩＩのように見えるだろう。 パネルＣ： Ｆｕｃが末端から２番目のＧｌｃＮＡｃに
ある（Ｆｕｃ ｘ）、ＳＬｅｘ構造。ＳＡとＦｕｃ ｘ
の間の位置関係は、パネルＤのＩＩＩのように見える。 パネルＤ： パネルＡ〜Ｃに図示したガングリオシドを
末端側から見た図。（図１７を、発明の詳細な説明の項
では、第７図と表記した。）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マーク・アール・ストラウド アメリカ合衆国98107ワシントン州、シア トル、エヌ・ダブリュウ56 800 (72)発明者 センイチロウ・ハコモリ アメリカ合衆国98040ワシントン州、マー サー・アイランド、80エス・イー 2024
Claims (16)
- 【請求項１】少なくとも６個の単糖類を含み、かつ末端
がα２→３シアリル化され、内部が種々のＮ−アセチル
グルコサミン残基においてα１→３フコシル化されてい
るが、該フコシル化は末端から２番目のＮ−アセチルグ
ルコサミン残基単独ではないことを特徴とする非分枝ポ
リラクトサミン。 - 【請求項２】 【化１】 （式中、Ｒ1 はα１→３でフコシル化されていること
を、Ｒ2 は−ＯＨまたはα１→３でフコシル化されてい
ることを、ａは２〜６の整数を、ｂは１〜６の整数を、
またＲはＨ原子、置換または非置換のアリール基、炭素
原子数１〜１０のアルキル、アルケニルもしくはヒドロ
キシアルキル基、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖、セラ
ミド残基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそれら
の共有結合した化合物を示す。）で表される請求項１記
載のポリラクトサミン。 - 【請求項３】Ｒ2 が−ＯＨである請求項２記載のポリラ
クトサミン。 - 【請求項４】 【化２】 （式中、Ｒ’はＨ原子、置換または非置換のアリール
基、炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニルもしく
はヒドロキシアルキル基、複合脂質、単純脂質、ラクト
サミン残基を有しないオリゴ糖、セラミド残基、薬学的
に活性な成分、固体担体またはそれらの共有結合した化
合物を示す。）で表される請求項３記載のポリラクトサ
ミン。 - 【請求項５】 【化３】 （式中、Ｒ’はＨ原子、置換または非置換のアリール
基、炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニルもしく
はヒドロキシアルキル基、複合脂質、単純脂質、オリゴ
糖、セラミド残基、薬学的に活性な成分、固体担体また
はそれらの共有結合した化合物を示す。）で表されるポ
リラクトサミン。 - 【請求項６】 【化４】 【化５】 または 【化６】 （式中、ＲはＨ原子、置換または非置換のアリール基、
炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニルもしくはヒ
ドロキシアルキル基、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖、
セラミド残基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそ
れらの共有結合した化合物を示す。）で表される請求項
３記載のポリラクトサミン。 - 【請求項７】 【化７】 （式中、ＲはＨ原子、置換または非置換のアリール基、
炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニルもしくはヒ
ドロキシアルキル基、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖、
セラミド残基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそ
れらの共有結合した化合物を示す。）で表されるポリラ
クトサミン。 - 【請求項８】人体内と同じ生理的せん断応力の存在する
条件下で、糖鎖が固定された固相上でＥ−セレクチン発
現細胞のローリングが観察されるような、該糖鎖を含む
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の
ポリラクトサミン。 - 【請求項９】請求項４記載のポリラクトサミンと、 【化８】 （式中、ＲはＨ原子、置換または非置換のアリール基、
炭素原子数１〜１０のアルキル、アルケニルもしくはヒ
ドロキシアルキル基、複合脂質、単純脂質、オリゴ糖、
セラミド残基、薬学的に活性な成分、固体担体またはそ
れらの共有結合した化合物を示す。）で表されるポリラ
クトサミンとからなる組成物。 - 【請求項１０】第２の細胞上に発現されたＥ−セレクチ
ンに依存するローリングおよび接着を惹起するリガンド
を発現する第１の細胞を、少なくとも６個の単糖類を含
み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシ
ル化されているが、該フコシル化は末端から２番目のＮ
−アセチルグルコサミン残基単独ではない、少なくとも
１種の非分枝ポリラクトサミンの、Ｅ−セレクチン依存
性ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露すること
を特徴とする細胞相互作用の抑制方法。 - 【請求項１１】第２の細胞上に発現されたＥ−セレクチ
ンに依存するローリングおよび接着を惹起するリガンド
を発現する第１の細胞を、少なくとも６個の単糖類を含
み、かつ末端がα２→３シアリル化され、内部が種々の
Ｎ−アセチルグルコサミン残基においてα１→３フコシ
ル化されているが、該フコシル化は末端から２番目のＮ
−アセチルグルコサミン残基単独ではない、非分枝ポリ
ラクトサミンと結合する抗体の、Ｅ−セレクチン依存性
ローリングおよび接着を抑制する量に、暴露し、しかも
該抗体は、生体外での動的流動条件下における上記第１
の細胞と第２の細胞との接着を抑制するものであること
を特徴とする細胞相互作用の抑制方法。 - 【請求項１２】活性成分として、請求項１〜７記載のい
ずれかのポリラクトサミンを含むことを特徴とする抗炎
症性組成物。 - 【請求項１３】活性成分として、請求項８記載のポリラ
クトサミンを含むことを特徴とする抗炎症性組成物。 - 【請求項１４】活性成分として、請求項９の組成物に記
載のポリラクトサミンを含むことを特徴とする抗炎症性
組成物。 - 【請求項１５】薬学的に許容される担体および請求項１
〜７のいずれかに記載のポリラクトサミンを含む薬学的
組成物の、治療上有効使用量を患者に投与することを特
徴とする患者の炎症を抑制する方法。 - 【請求項１６】薬学的に許容される担体および請求項８
記載のポリラクトサミンを含む薬学的組成物の、治療上
有効使用量を患者に投与することを特徴とする患者の炎
症を抑制する方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51617495A | 1995-08-17 | 1995-08-17 | |
| US08/516,174 | 1995-08-17 | ||
| US08/635,849 US5876715A (en) | 1995-08-17 | 1996-04-22 | Antibodies that bind novel carbohydrate ligands (myelorollins) that cause E-selectin dependent cell rolling, and uses thereof |
| US08/635,849 | 1996-04-22 | ||
| US08/688,124 | 1996-07-29 | ||
| US08/688,124 US6133239A (en) | 1995-08-17 | 1996-07-29 | Carbohydrate ligands (myelorollin) that cause E-selectin dependent cell rolling and adhesion under dynamic flow system |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09216902A true JPH09216902A (ja) | 1997-08-19 |
| JP3795588B2 JP3795588B2 (ja) | 2006-07-12 |
Family
ID=27414629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25077696A Expired - Fee Related JP3795588B2 (ja) | 1995-08-17 | 1996-08-19 | 動的流動系においてｅ−セレクチンに依存する細胞回転および付着を惹起する新規な炭水化物リガンド類（ミエロローリン） |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0765884B1 (ja) |
| JP (1) | JP3795588B2 (ja) |
| DE (1) | DE69632176T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004058824A1 (ja) * | 2002-12-26 | 2006-04-27 | 康宏 梶原 | ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法 |
| WO2008131301A1 (en) * | 2007-04-18 | 2008-10-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Surfaces, methods and devices employing cell rolling |
| US8986988B2 (en) | 2007-09-27 | 2015-03-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell rolling separation |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0926154B1 (en) * | 1996-07-23 | 2010-01-27 | Seikagaku Corporation | Novel lactosamine oligosaccharides and process for the preparation thereof |
| FI20021989A0 (fi) * | 2002-11-06 | 2002-11-06 | Halina Miller-Podraza | Korkean affiniteetin Helicobacter pylori-reseptorit ja niiden käyttö |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5030723A (en) * | 1988-05-31 | 1991-07-09 | The Biomembrane Institute | Long-chain glycolipid structure |
| WO1991019501A1 (en) * | 1990-06-15 | 1991-12-26 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
-
1996
- 1996-08-14 EP EP96113074A patent/EP0765884B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-14 DE DE69632176T patent/DE69632176T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-19 JP JP25077696A patent/JP3795588B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004058824A1 (ja) * | 2002-12-26 | 2006-04-27 | 康宏 梶原 | ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法 |
| JP2011038112A (ja) * | 2002-12-26 | 2011-02-24 | Yasuhiro Kajiwara | ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法 |
| JP4790271B2 (ja) * | 2002-12-26 | 2011-10-12 | 康宏 梶原 | ３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、該糖鎖アスパラギン、該糖鎖およびそれらの製造方法 |
| WO2008131301A1 (en) * | 2007-04-18 | 2008-10-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Surfaces, methods and devices employing cell rolling |
| US8986988B2 (en) | 2007-09-27 | 2015-03-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell rolling separation |
| US9555413B2 (en) | 2007-09-27 | 2017-01-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell rolling separation |
| US10011817B2 (en) | 2007-09-27 | 2018-07-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell rolling separation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69632176D1 (de) | 2004-05-19 |
| DE69632176T2 (de) | 2005-04-14 |
| JP3795588B2 (ja) | 2006-07-12 |
| EP0765884A1 (en) | 1997-04-02 |
| EP0765884B1 (en) | 2004-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5876715A (en) | Antibodies that bind novel carbohydrate ligands (myelorollins) that cause E-selectin dependent cell rolling, and uses thereof | |
| US5470842A (en) | Carbohydrate-based anti-inflammatory agents | |
| US5648344A (en) | Methods of treating inflammation using selection binding compounds | |
| AU681010B2 (en) | Substituted lactose derivatives as cell adhesion inhibitors | |
| US5143712A (en) | Method of determining a site of inflammation utilizing elam-1 ligands | |
| US5658880A (en) | Sialic acid/fucose based medicaments | |
| US5753631A (en) | Intercellular adhesion mediators | |
| AU660931B2 (en) | Intercellular adhesion mediators | |
| US6503885B1 (en) | Carboxymethylgalactose derivatives | |
| JPH09500683A (ja) | 二価のシアリルルイスｘサッカリド | |
| WO1996005209A9 (en) | Sialic acid/fucose based medicaments | |
| JP3795588B2 (ja) | 動的流動系においてｅ−セレクチンに依存する細胞回転および付着を惹起する新規な炭水化物リガンド類（ミエロローリン） | |
| EP0642523B1 (en) | Ganglioside analogs | |
| Unger | The chemistry of oligosaccharide ligands of selectins: significance for the development of new immunomodulatory medicines | |
| WO1993017033A1 (en) | Inhibition of cell adhesion by chemically-defined oligosaccharides, their derivatives, mimetics, and antibodies directed thereto | |
| Yan et al. | Synthesis of a lipid conjugate of SO3Lea and its enhancement on liposomal binding to activated platelets | |
| JPH10508580A (ja) | Ｅおよびｐセレクチンに対するリガンドのオリゴ糖構造 | |
| US20030186935A1 (en) | Myeloglycan | |
| US20030064956A1 (en) | Myeloglycan | |
| US20050245479A1 (en) | Myeloglycan | |
| JPH10500948A (ja) | シアル酸／フコース含有薬剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060313 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20060313 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060411 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060413 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090421 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100421 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110421 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110421 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120421 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120421 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130421 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130421 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140421 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |