JPH09224528A - トランスジェニック動物の作製方法及びトランスジェニック動物 - Google Patents
トランスジェニック動物の作製方法及びトランスジェニック動物Info
- Publication number
- JPH09224528A JPH09224528A JP8065319A JP6531996A JPH09224528A JP H09224528 A JPH09224528 A JP H09224528A JP 8065319 A JP8065319 A JP 8065319A JP 6531996 A JP6531996 A JP 6531996A JP H09224528 A JPH09224528 A JP H09224528A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fertilized egg
- foreign gene
- complex
- transgenic animal
- lumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 36
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 abstract description 51
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 9
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 14
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000011824 transgenic rat model Methods 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】作製しようとするトランスジェニック動物の種
類や系にかかわらず、受精卵に外来遺伝子を注入するこ
とにより、簡易にトランスジェニック動物を得る方法を
提供する。 【解決手段】外来遺伝子を含んだトランスフェクション
用複合体を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入することに
より、生殖細胞及び／又は体細胞に前記外来遺伝子を導
入する。
類や系にかかわらず、受精卵に外来遺伝子を注入するこ
とにより、簡易にトランスジェニック動物を得る方法を
提供する。 【解決手段】外来遺伝子を含んだトランスフェクション
用複合体を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入することに
より、生殖細胞及び／又は体細胞に前記外来遺伝子を導
入する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、受精卵への外来
遺伝子の導入を介してトランスジェニック動物を作製す
る技術に関し、詳しくは、胚盤胞期の受精卵の内腔に外
来遺伝子を含んだトランスフェクション用複合体を注入
することにより、トランスジェニック動物を作製する方
法及びこの方法によって作製されたトランスジェニック
動物に関する。
遺伝子の導入を介してトランスジェニック動物を作製す
る技術に関し、詳しくは、胚盤胞期の受精卵の内腔に外
来遺伝子を含んだトランスフェクション用複合体を注入
することにより、トランスジェニック動物を作製する方
法及びこの方法によって作製されたトランスジェニック
動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】トランスジェニック動物を作製するため
に行われる、受精卵等への外来遺伝子の導入には、マイ
クロインジェクション法が多く用いられている。マイク
ロインジェクション法は、マイクロマニピュレーターを
用いて、顕微鏡下で、減数分裂後の受精卵をホールディ
ングピペットで保持し、先端が直径１μｍ程度の注入用
のガラスピペットを受精卵に突き刺して、雌性前核ある
いは雄性前核に到達させ、前核内部に外来遺伝子を含ん
だ溶液を注入する方法である。この方法によると、雄性
前核内等での遺伝子の組換えにより、注入された外来遺
伝子が受精卵の染色体に組込まれる。そして、この受精
卵を仮親に移植し、仔を発生、出産させて目的とする遺
伝子を持つトランスジェニック動物を得ることができ
る。
に行われる、受精卵等への外来遺伝子の導入には、マイ
クロインジェクション法が多く用いられている。マイク
ロインジェクション法は、マイクロマニピュレーターを
用いて、顕微鏡下で、減数分裂後の受精卵をホールディ
ングピペットで保持し、先端が直径１μｍ程度の注入用
のガラスピペットを受精卵に突き刺して、雌性前核ある
いは雄性前核に到達させ、前核内部に外来遺伝子を含ん
だ溶液を注入する方法である。この方法によると、雄性
前核内等での遺伝子の組換えにより、注入された外来遺
伝子が受精卵の染色体に組込まれる。そして、この受精
卵を仮親に移植し、仔を発生、出産させて目的とする遺
伝子を持つトランスジェニック動物を得ることができ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、かかる
マイクロインジェクション法にあっては、核への注入操
作に習熟して初めて、受精卵に傷害を与えないで核内に
外来遺伝子を注入することができる。さらに、実際に、
外来遺伝子が染色体に組込ませた仔を得るには、多くの
受精卵を処理する必要がある。特に、ウシやブタなどの
家畜として有用な大型哺乳類については、細胞質が脂肪
滴の存在によって不透明であるために、前核が良く見え
ず、前核への注入操作が困難であるという問題がある。
このため、効率良く受精卵に外来遺伝子を導入すること
のできる方法が要望されていた。
マイクロインジェクション法にあっては、核への注入操
作に習熟して初めて、受精卵に傷害を与えないで核内に
外来遺伝子を注入することができる。さらに、実際に、
外来遺伝子が染色体に組込ませた仔を得るには、多くの
受精卵を処理する必要がある。特に、ウシやブタなどの
家畜として有用な大型哺乳類については、細胞質が脂肪
滴の存在によって不透明であるために、前核が良く見え
ず、前核への注入操作が困難であるという問題がある。
このため、効率良く受精卵に外来遺伝子を導入すること
のできる方法が要望されていた。
【０００４】また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）系列が確立
されている系においては、トランスジェニック動物を作
製する方法の一つとして、ＥＳ細胞に外来遺伝子をトラ
ンスフェクションし、外来遺伝子が導入されたＥＳ細胞
を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入し、かかる受精卵
を、仮親の子宮内に移植することによって、トランスジ
ェニック動物（キメラ動物）を得る方法がある。この方
法では、まず、ＥＳ細胞系列が確立されていなければな
らない。しかしながら、未だＥＳ細胞系列が確立されて
いるのは、マウスのある系だけである。ブタ、ウシ、ウ
マ等畜産において重要な種においてもかかるＥＳ細胞系
列の確立が永年努力されているが、未だ確立されたとの
報告は得られておらず、ましてや、ＥＳ細胞系列を利用
したトランスジェニック動物の産出には至っていない。
このように、ＥＳ細胞系列の確立は非常に困難であるの
が現状である。
されている系においては、トランスジェニック動物を作
製する方法の一つとして、ＥＳ細胞に外来遺伝子をトラ
ンスフェクションし、外来遺伝子が導入されたＥＳ細胞
を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入し、かかる受精卵
を、仮親の子宮内に移植することによって、トランスジ
ェニック動物（キメラ動物）を得る方法がある。この方
法では、まず、ＥＳ細胞系列が確立されていなければな
らない。しかしながら、未だＥＳ細胞系列が確立されて
いるのは、マウスのある系だけである。ブタ、ウシ、ウ
マ等畜産において重要な種においてもかかるＥＳ細胞系
列の確立が永年努力されているが、未だ確立されたとの
報告は得られておらず、ましてや、ＥＳ細胞系列を利用
したトランスジェニック動物の産出には至っていない。
このように、ＥＳ細胞系列の確立は非常に困難であるの
が現状である。
【０００５】ここに、受精卵の胚盤胞期にあっては、受
精卵にすでに極性が生じ、受精卵の一方には内部細胞塊
が、他方には内腔が形成される。この時期においては、
内腔は、脂肪滴の存在しないクリアな領域となり、ま
た、受精卵外部からの注入物を受け入れることのできる
キャビティにもなる。また、細胞に外来遺伝子をトラン
スフェクションするにあたっては、例えば、外来遺伝子
とリポソームとの複合体と細胞とを培養することにより
行うことができる。
精卵にすでに極性が生じ、受精卵の一方には内部細胞塊
が、他方には内腔が形成される。この時期においては、
内腔は、脂肪滴の存在しないクリアな領域となり、ま
た、受精卵外部からの注入物を受け入れることのできる
キャビティにもなる。また、細胞に外来遺伝子をトラン
スフェクションするにあたっては、例えば、外来遺伝子
とリポソームとの複合体と細胞とを培養することにより
行うことができる。
【０００６】そこで、本発明者は、胚盤胞期の受精卵の
内腔に外来遺伝子を注入することにより、内腔に接した
細胞群に外来遺伝子をトランスフェクションし、トラン
スジェニック動物を作製できることに着目した。かかる
観点からのトランスジェニック動物の作製方法は、従来
にない新規な方法である。そこで、本発明では、作製し
ようとするトランスジェニック動物の種類や系にかかわ
らず、受精卵に外来遺伝子を注入することにより、簡易
にトランスジェニック動物を得ることができる方法及び
この方法によって作製されたトランスジェニック動物を
提供することを課題とする。
内腔に外来遺伝子を注入することにより、内腔に接した
細胞群に外来遺伝子をトランスフェクションし、トラン
スジェニック動物を作製できることに着目した。かかる
観点からのトランスジェニック動物の作製方法は、従来
にない新規な方法である。そこで、本発明では、作製し
ようとするトランスジェニック動物の種類や系にかかわ
らず、受精卵に外来遺伝子を注入することにより、簡易
にトランスジェニック動物を得ることができる方法及び
この方法によって作製されたトランスジェニック動物を
提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記した課題を解決する
ための発明は、外来遺伝子を含むトランスフェクション
用複合体を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入することに
より、生殖細胞及び／又は体細胞に前記外来遺伝子を導
入することを特徴とするトランスジェニック動物の作製
方法である。この発明によれば、外来遺伝子のトランス
フェクション用複合体が、内腔に注入されると、外来遺
伝子が受精卵の内部の細胞にトランスフェクションされ
る。外来遺伝子が生殖細胞及び／又は体細胞の染色体に
組込まれると、トランスジェニック動物が得られる。
ための発明は、外来遺伝子を含むトランスフェクション
用複合体を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入することに
より、生殖細胞及び／又は体細胞に前記外来遺伝子を導
入することを特徴とするトランスジェニック動物の作製
方法である。この発明によれば、外来遺伝子のトランス
フェクション用複合体が、内腔に注入されると、外来遺
伝子が受精卵の内部の細胞にトランスフェクションされ
る。外来遺伝子が生殖細胞及び／又は体細胞の染色体に
組込まれると、トランスジェニック動物が得られる。
【０００８】また、胚盤胞期の受精卵の内腔には、複合
体を注入するのに際して障害となる脂肪滴を含む細胞群
が存在しない。したがって、脂肪滴を多く含む動物の受
精卵であっても、簡易に、胚盤胞期の受精卵の内腔に外
来遺伝子を含む複合体が注入される。また、ＥＳ細胞へ
のトランスフェクションを経ることなく、直接、受精卵
の胚盤胞期の細胞群に外来遺伝子がトランスフェクショ
ンされる。したがって、ＥＳ細胞が確立されていない動
物の系においても、簡易にトランスジェニック動物が得
られる。
体を注入するのに際して障害となる脂肪滴を含む細胞群
が存在しない。したがって、脂肪滴を多く含む動物の受
精卵であっても、簡易に、胚盤胞期の受精卵の内腔に外
来遺伝子を含む複合体が注入される。また、ＥＳ細胞へ
のトランスフェクションを経ることなく、直接、受精卵
の胚盤胞期の細胞群に外来遺伝子がトランスフェクショ
ンされる。したがって、ＥＳ細胞が確立されていない動
物の系においても、簡易にトランスジェニック動物が得
られる。
【０００９】この発明において、特に、前記トランスフ
ェクション用複合体は、外来遺伝子と、リポソームとか
ら形成されていることが好ましい。外来遺伝子−リポソ
ーム複合体によれば、胚盤胞期の受精卵の内腔への注入
操作が容易であり、細胞群へのトランスフェクションの
効率が良いからである。
ェクション用複合体は、外来遺伝子と、リポソームとか
ら形成されていることが好ましい。外来遺伝子−リポソ
ーム複合体によれば、胚盤胞期の受精卵の内腔への注入
操作が容易であり、細胞群へのトランスフェクションの
効率が良いからである。
【００１０】また、この発明において、トランスジェニ
ック動物は、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の大型家畜動
物であることが好ましい。かかる大型家畜動物では、未
だＥＳ細胞系列が確立されていないからである。より好
ましくは、ブタ、ウシである。とりわけ、ウシ、ブタに
おいては、受精卵の細胞質内に脂肪を多く含むために、
マイクロインジェクション法による外来遺伝子の導入が
困難な動物だからである。
ック動物は、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の大型家畜動
物であることが好ましい。かかる大型家畜動物では、未
だＥＳ細胞系列が確立されていないからである。より好
ましくは、ブタ、ウシである。とりわけ、ウシ、ブタに
おいては、受精卵の細胞質内に脂肪を多く含むために、
マイクロインジェクション法による外来遺伝子の導入が
困難な動物だからである。
【００１１】また、この発明は、外来遺伝子を含むトラ
ンスフェクション用複合体が、胚盤胞期の受精卵の内腔
に注入されたことにより、生殖細胞及び／又は体細胞に
前記外来遺伝子が導入されたことを特徴とするトランス
ジェニック動物の構成を採ることができる。この場合に
おいても、前記トランスジェニック動物は，ブタ、ウ
シ、ウマ、ヒツジ等の大型家畜動物であることが好まし
い。大型家畜動物では、ＥＳ細胞系列が確立されていな
いからである。より好ましくは、ブタ、ウシである。ブ
タ、ウシの受精卵の前核が、脂肪滴により視認しにく
く、マイクロインジェクションによる外来遺伝子の導入
が困難な動物だからである。
ンスフェクション用複合体が、胚盤胞期の受精卵の内腔
に注入されたことにより、生殖細胞及び／又は体細胞に
前記外来遺伝子が導入されたことを特徴とするトランス
ジェニック動物の構成を採ることができる。この場合に
おいても、前記トランスジェニック動物は，ブタ、ウ
シ、ウマ、ヒツジ等の大型家畜動物であることが好まし
い。大型家畜動物では、ＥＳ細胞系列が確立されていな
いからである。より好ましくは、ブタ、ウシである。ブ
タ、ウシの受精卵の前核が、脂肪滴により視認しにく
く、マイクロインジェクションによる外来遺伝子の導入
が困難な動物だからである。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につ
き、詳細に説明する。本発明においては、受精卵に注入
するのに用いる外来遺伝子は、哺乳動物に対して導入し
ようとする遺伝子の塩基配列を含んでいるものを用い
る。外来遺伝子は、直鎖状であることが、染色体へ組込
まれる率が高い点で好ましい。本発明において、外来遺
伝子と複合体を形成させる物質としては、リポソーム、
リン酸カルシウム、レトロウイルス等を挙げることがで
きる。さらに、外来遺伝子の動物細胞へのトランスフェ
クションに用いることのできる公知の各種物質を用いる
こともできる。
き、詳細に説明する。本発明においては、受精卵に注入
するのに用いる外来遺伝子は、哺乳動物に対して導入し
ようとする遺伝子の塩基配列を含んでいるものを用い
る。外来遺伝子は、直鎖状であることが、染色体へ組込
まれる率が高い点で好ましい。本発明において、外来遺
伝子と複合体を形成させる物質としては、リポソーム、
リン酸カルシウム、レトロウイルス等を挙げることがで
きる。さらに、外来遺伝子の動物細胞へのトランスフェ
クションに用いることのできる公知の各種物質を用いる
こともできる。
【００１３】リポソームとしては、各種リポソームを任
意に用いることができる。本発明に好適に用いられるリ
ポソームとしては、リポフェクチン試薬（ギブコ（Ｇｉ
ｂｃｏ）社製）を挙げることができる。リポソームと外
来遺伝子との複合体の形成は、リポソームと核酸とを混
合することにより行うことができる。
意に用いることができる。本発明に好適に用いられるリ
ポソームとしては、リポフェクチン試薬（ギブコ（Ｇｉ
ｂｃｏ）社製）を挙げることができる。リポソームと外
来遺伝子との複合体の形成は、リポソームと核酸とを混
合することにより行うことができる。
【００１４】トランスフェクション用複合体を、胚盤胞
期の受精卵の内腔に注入するには、マイクロマニピュレ
ーター装置を用いる。すなわち、図１に示すように、イ
ンジェクションチャンバー内の受精卵を支持ピペットで
保持し、複合体を入れたインジェクション針で受精卵を
突き刺して、インジェクション針から複合体を内腔に吐
出して注入する。複合体を注入した受精卵を、仮親の子
宮に移植し、妊娠させて産仔を得る。
期の受精卵の内腔に注入するには、マイクロマニピュレ
ーター装置を用いる。すなわち、図１に示すように、イ
ンジェクションチャンバー内の受精卵を支持ピペットで
保持し、複合体を入れたインジェクション針で受精卵を
突き刺して、インジェクション針から複合体を内腔に吐
出して注入する。複合体を注入した受精卵を、仮親の子
宮に移植し、妊娠させて産仔を得る。
【００１５】得られた仔において、外来遺伝子が導入さ
れているかどうかは、仔の体組織の一部、例えば尾の一
部を切り取り、ＤＮＡを抽出してサザーンブロッテンィ
ングにより、外来遺伝子に由来する断片の有無を確認す
ることにより行う。また、この確認には、他の方法、例
えばＰＣＲ法等各種方法を用いることができる。
れているかどうかは、仔の体組織の一部、例えば尾の一
部を切り取り、ＤＮＡを抽出してサザーンブロッテンィ
ングにより、外来遺伝子に由来する断片の有無を確認す
ることにより行う。また、この確認には、他の方法、例
えばＰＣＲ法等各種方法を用いることができる。
【００１６】なお、本発明が適用される哺乳動物は、種
を問わないものである。
を問わないものである。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて、具体的に説
明する。本実施例は、ラットの受精卵に外来遺伝子を注
入して、トランスジェニックラットを得るものである。
なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものでは決
してない。
明する。本実施例は、ラットの受精卵に外来遺伝子を注
入して、トランスジェニックラットを得るものである。
なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものでは決
してない。
【００１８】（外来遺伝子断片の調製）本実施例で用い
た外来遺伝子断片は、ｐＭＡＭｎｅｏプラスミド（クロ
ーンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製）を制限酵素Ｐｖ
ｕＩで切断して、ＲＳＶエンハンサー部分からアンピシ
リン耐性遺伝子内の切断部分までの約６．４ｋｂを用い
た。 （リポソーム）リポソームとしては、リポフェクチン試
薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）を用いた。
た外来遺伝子断片は、ｐＭＡＭｎｅｏプラスミド（クロ
ーンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製）を制限酵素Ｐｖ
ｕＩで切断して、ＲＳＶエンハンサー部分からアンピシ
リン耐性遺伝子内の切断部分までの約６．４ｋｂを用い
た。 （リポソーム）リポソームとしては、リポフェクチン試
薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）を用いた。
【００１９】（外来遺伝子−リポソーム複合体の調製）
前記外来遺伝子は、ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社
製）中に、約０．１μｇ／μｌとなるように調製した外
来遺伝子溶液とし、リポフェクチン試薬１０μｌに対し
て、１０μｌの無血清培地を混合して、リポソーム溶液
とした。これらの溶液各２０μｌ（計４０μｌ）を、緩
やかに混合し、室温にて１０〜１５分放置した後、さら
に、６０μｌの無血清培地を加えて、緩やかに混合し
た。撹拌されている状態で外来遺伝子のトランスフェク
ション用複合体（１００μｌ）として利用した。
前記外来遺伝子は、ＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社
製）中に、約０．１μｇ／μｌとなるように調製した外
来遺伝子溶液とし、リポフェクチン試薬１０μｌに対し
て、１０μｌの無血清培地を混合して、リポソーム溶液
とした。これらの溶液各２０μｌ（計４０μｌ）を、緩
やかに混合し、室温にて１０〜１５分放置した後、さら
に、６０μｌの無血清培地を加えて、緩やかに混合し
た。撹拌されている状態で外来遺伝子のトランスフェク
ション用複合体（１００μｌ）として利用した。
【００２０】（ラット受精卵の採取）成熟したＦ３４４
系と、同系の発情した雌ラットと交配させた。交配を確
認した雌ラットから、交配後７２〜９６時間経過後に、
計３０個の胚盤胞期の受精卵を採取した。
系と、同系の発情した雌ラットと交配させた。交配を確
認した雌ラットから、交配後７２〜９６時間経過後に、
計３０個の胚盤胞期の受精卵を採取した。
【００２１】（ラット受精卵への複合体の注入）マイク
ロマニピュレーター装置のインジェクションチャンバー
内に、支持ピペットで保持した採取した胚盤胞期の受精
卵の内腔に、前記複合体溶液を入れたインジェクション
ピペットを栄養外胚葉を貫いて到達させ、内腔内に複合
体を注入した。注入量は、５０〜１００ｐｌとした。
ロマニピュレーター装置のインジェクションチャンバー
内に、支持ピペットで保持した採取した胚盤胞期の受精
卵の内腔に、前記複合体溶液を入れたインジェクション
ピペットを栄養外胚葉を貫いて到達させ、内腔内に複合
体を注入した。注入量は、５０〜１００ｐｌとした。
【００２２】（複合体を注入した受精卵の仮親への移
植）このように外来遺伝子のトランスフェクション用複
合体を注入した受精卵を、移植用ピペットに拾い上げて
おき、予め、受精卵を移植できるように準備された同系
の偽妊娠状態の雌ラットの子宮内に注入して移植した。
このようにして、外来遺伝子が注入された受精卵計２０
個を、２匹の雌ラットに移植した。
植）このように外来遺伝子のトランスフェクション用複
合体を注入した受精卵を、移植用ピペットに拾い上げて
おき、予め、受精卵を移植できるように準備された同系
の偽妊娠状態の雌ラットの子宮内に注入して移植した。
このようにして、外来遺伝子が注入された受精卵計２０
個を、２匹の雌ラットに移植した。
【００２３】（外来遺伝子が導入されたトランスジェニ
ックラットの選別）受精卵を移植した雌ラットから、約
３週間後に、仔を得た。生まれた仔から、その尾の一部
を切り取ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡ中に、導入し
たＤＮＡに由来する断片が存在するか否かをサザーンブ
ロッティング法により調べた。ＤＮＡは、制限酵素Ｂｇ
ｌIIと制限酵素ＳｍａＩとで切断した。プローブは、外
来遺伝子断片を同様の制限酵素で切断して得た、約１０
００ｂｐのＤＮＡ断片とした。
ックラットの選別）受精卵を移植した雌ラットから、約
３週間後に、仔を得た。生まれた仔から、その尾の一部
を切り取ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡ中に、導入し
たＤＮＡに由来する断片が存在するか否かをサザーンブ
ロッティング法により調べた。ＤＮＡは、制限酵素Ｂｇ
ｌIIと制限酵素ＳｍａＩとで切断した。プローブは、外
来遺伝子断片を同様の制限酵素で切断して得た、約１０
００ｂｐのＤＮＡ断片とした。
【００２４】この実施例における産仔数、トランスジェ
ニック（Ｔｇ）ラット数を表１に示す。
ニック（Ｔｇ）ラット数を表１に示す。
【表１】 外来遺伝子断片を有するＴｇラットの作製 ──────────────────────────── 産仔数 分析数 Ｔｇラット数（導入率％） ──────────────────────────── １４ １４ １（ ７．１％） ────────────────────────────
【００２５】このように、本実施例においては、簡易
に、Ｔｇラットを得ることができた。すなわち、胚盤胞
期の受精卵の内腔へ、外来遺伝子とリポソームとの複合
体を注入することにより、注入された外来遺伝子が産仔
にも導入されたことが示された。
に、Ｔｇラットを得ることができた。すなわち、胚盤胞
期の受精卵の内腔へ、外来遺伝子とリポソームとの複合
体を注入することにより、注入された外来遺伝子が産仔
にも導入されたことが示された。
【００２６】Ｔｇラットにおける、外来遺伝子の導入を
サザーンブロッティング法にて検定した一例を図３に示
す。この図において、レーン１は、ネガティブコントロ
ールであり、レーン２は、コントロールのＤＮＡ断片を
泳動した結果であり、レーン２から９が、産仔のＤＮＡ
を制限酵素処理して得たＤＮＡ試料を泳動した結果であ
る。この結果では、レーン６がＴｇラットであった。
サザーンブロッティング法にて検定した一例を図３に示
す。この図において、レーン１は、ネガティブコントロ
ールであり、レーン２は、コントロールのＤＮＡ断片を
泳動した結果であり、レーン２から９が、産仔のＤＮＡ
を制限酵素処理して得たＤＮＡ試料を泳動した結果であ
る。この結果では、レーン６がＴｇラットであった。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、胚盤胞期の受精卵の内腔
へ、外来遺伝子を含んだトランスフェクション用複合体
を注入するという、全く新規な方法により、外来遺伝子
が生殖細胞及び／又は体細胞に導入されたトランスジェ
ニック動物を簡易に作製することが可能となる。
へ、外来遺伝子を含んだトランスフェクション用複合体
を注入するという、全く新規な方法により、外来遺伝子
が生殖細胞及び／又は体細胞に導入されたトランスジェ
ニック動物を簡易に作製することが可能となる。
【図１】マイクロマニピュレーター装置を用いて、胚盤
胞期の受精卵の内腔にトランスフェクション用複合体を
注入する操作を示す図である。
胞期の受精卵の内腔にトランスフェクション用複合体を
注入する操作を示す図である。
【図２】実施例で用いｐＭＡＭｎｅｏプラスミドの制限
酵素切断部位を示す図である。
酵素切断部位を示す図である。
【図３】産仔への外来遺伝子の導入をサザーンブロッテ
ィング法で検定した結果を示す図である。
ィング法で検定した結果を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】外来遺伝子を含んだトランスフェクション
用複合体を、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入することに
より、生殖細胞及び／又は体細胞に前記外来遺伝子を導
入することを特徴とするトランスジェニック動物の作製
方法。 - 【請求項２】外来遺伝子を含んだトランスフェクション
用複合体が、胚盤胞期の受精卵の内腔に注入されたこと
により、生殖細胞及び／又は体細胞に前記外来遺伝子が
導入されたことを特徴とするトランスジェニック動物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8065319A JPH09224528A (ja) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | トランスジェニック動物の作製方法及びトランスジェニック動物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8065319A JPH09224528A (ja) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | トランスジェニック動物の作製方法及びトランスジェニック動物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09224528A true JPH09224528A (ja) | 1997-09-02 |
Family
ID=13283481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8065319A Pending JPH09224528A (ja) | 1996-02-26 | 1996-02-26 | トランスジェニック動物の作製方法及びトランスジェニック動物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09224528A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103109775A (zh) * | 2012-12-29 | 2013-05-22 | 贵阳台农种养殖有限公司 | 开阳瘦肉型猪的选育方法 |
| WO2024219431A1 (ja) * | 2023-04-18 | 2024-10-24 | 国立大学法人大阪大学 | 核酸及び／又はタンパク質を細胞内へ導入する方法 |
-
1996
- 1996-02-26 JP JP8065319A patent/JPH09224528A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103109775A (zh) * | 2012-12-29 | 2013-05-22 | 贵阳台农种养殖有限公司 | 开阳瘦肉型猪的选育方法 |
| WO2024219431A1 (ja) * | 2023-04-18 | 2024-10-24 | 国立大学法人大阪大学 | 核酸及び／又はタンパク質を細胞内へ導入する方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cho et al. | Generation of transgenic mice | |
| US5523222A (en) | Polyelectrolyte DNA conjugation and genetic transformation of an animal | |
| JP3739652B2 (ja) | 成体の体細胞核を再構成した被核除去卵母細胞からの動物の満期の成長 | |
| US20060191025A1 (en) | Method for the rapid selection of homozygous primary cell lines for the production of transgenic animals by somatic cell nuclear transfer | |
| JP4095898B2 (ja) | 人工染色体を含むトランスジェニック動物のクローニング | |
| JP2003508018A (ja) | 異核共存体の作成を介した細胞のリプログラミング法 | |
| US20170099813A1 (en) | Method of generating sterile terminal sires in livestock and animals produced thereby | |
| US7199281B2 (en) | Method of generating a transgenic livestock animal | |
| Bevacqua et al. | Assessing Tn5 and Sleeping Beauty for transpositional transgenesis by cytoplasmic injection into bovine and ovine zygotes | |
| JPH10304790A (ja) | トランスジェニック動物の作成方法 | |
| JP2002524054A (ja) | 遺伝子転移を行う方法 | |
| CN1735338A (zh) | 利用体细胞核转移胚胎作为细胞供体进行附加核转移的方法和系统 | |
| US6498285B1 (en) | Methods for producing transgenic pigs by microinjecting a blastomere | |
| AU783715B2 (en) | Method for producing livestock individuals from cells of established cell line | |
| Wilmut et al. | Methods of gene transfer and their potential use to modify milk composition | |
| JPH09224528A (ja) | トランスジェニック動物の作製方法及びトランスジェニック動物 | |
| JP4845073B2 (ja) | 再構築受精卵の作製方法及びそれを用いたトランスジェニック胚の作製方法 | |
| Niemann et al. | Production of biopharmaceuticals in transgenic animals | |
| JPH09220039A (ja) | 精子又は卵子への外来遺伝子の導入方法及びトランスジェニック動物の作製方法 | |
| Matsuda et al. | Production of transgenic chimera rabbit fetuses using somatic cell nuclear transfer | |
| JP2019097499A (ja) | 哺乳動物の受精卵に物質を導入する方法 | |
| CN104450673B (zh) | 一种y染色体修饰方法及其应用 | |
| CN104388560A (zh) | 一种y染色体标记方法及其应用 | |
| Do et al. | Effects of duration of electric pulse on in vitro development of cloned cat embryos with human artificial chromosome vector | |
| JPH0614945A (ja) | 豚の繁殖方法 |