JPH09229938A - 抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析方法及び免疫分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定を簡
便な操作で短時間に行うための分析方法とその分析装置
の提供。 【解決手段】 毛細管作用により輸液可能なマトリック
ス１に展開液ゾーン２と、標識された遺伝子組換え梅毒
トレポネーマ抗原からなる標識試薬ゾーン４と、梅毒ト
レポネーマ抗原をマトリックスに固定した検出ゾーン５
と、検体点着ゾーン３と、展開液吸収ゾーン６とを設け
た免疫分析装置を用いて測定を行い検出ゾーン５に結合
した標識物から検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を分析
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、毛細管作用により
輸液可能なマトリックスに標識された遺伝子組換え梅毒
トレポネーマ（トレポネーマパリダム；以下ＴＰとい
う）抗原からなる標識試薬ゾーンと、ＴＰ抗原をマトリ
ックスに固定した検出ゾーンとを設けた免疫分析装置
に、検体を添加し、検出ゾーンに結合した検体中の抗梅
毒トレポネーマ抗体（以下抗ＴＰ抗体という）の検出を
行う免疫分析方法及びその分析を行うための分析装置に
関する。

【０００２】

【従来の技術】血液や尿等に含まれる生体成分や薬物の
分析は、病態の診断や治療経過の判定に重要である。そ
こでこの生体成分、薬物等を抗原抗体反応を利用し、検
体中から簡便に分析する方法として、反応試薬を含浸さ
せたストリップ状のろ紙からなるストリップ分析装置を
用いる方法が見出された。この分析法は装置のろ紙上に
設けた検体点着ゾーンに検体を加え、溶液を展開させ、
ろ紙上に設けた検出ゾーンに表示される発色の度合いか
ら診断する方法である。これらのストリップ分析装置で
は反応形式に応じた必要試薬（酵素標識抗体、基質、発
色試薬等）が含まれるろ紙を用い、その発色から分析を
行うため、特別な判定装置を用いない簡便な方法を実施
するとができる。また、カラーラテックス、金属コロイ
ド等の粒子を標識物として用いる分析方法も知られてい
る。この分析方法では、検出すべき抗原又は抗体と反応
する抗体又は抗原を粒子に結合した試薬を用い、検出ゾ
ーンに結合された粒子像を検出することにより行われて
いた。

【０００３】また、従来抗ＴＰ抗体の検出には血球にＴ
Ｐ菌体成分を結合させたＴＰＨＡ試薬を用いる方法、人
工粒子にＴＰ抗原を結合させて製造した間接凝集免疫測
定試薬を用いる方法、ＴＰ抗原結合固相と標識抗グロブ
リン抗体からなる酵素免疫測定試薬を用いる方法等が知
られていた。これらの方法ではいずれも測定を開始して
結果を得るまでに２時間以上を要し、判定には測定機器
を用いるため、緊急な検査やベッドサイドでの短時間で
の測定には対応することができなかった。

【０００４】従来のストリップ分析装置を用いた抗ＴＰ
抗体の測定法では、検体中に存在する多量のグロブリン
と標識抗体との間で反応が起こり、測定を行うことがで
きなかった。そこで、分析装置に洗浄槽を付加した装置
（特開平５−１２６８３２号）、展開液に標識物により
起こるシグナルを防止するゾーンを設けた装置（特表平
１−５０３４３９号）等を用いる方法が見出された。

【０００５】これらの方法では操作が煩雑であり、測定
操作を常に一定の条件で実施することが難しかった。ま
た、検体中に含まれるグロブリン等の影響により感度よ
く測定を行うには満足することのできる方法ではなかっ
た。この問題を解決するため検体中の抗ＴＰ抗体の測定
を行うにあたり、固相に結合したＴＰ抗原と標識ＴＰ抗
原とによりサンドイッチ法で検出することが試みられた
が、従来の生体中で培養され得られたＴＰ抗原の混合物
に標識物を導入することは容易ではなく、また常に一定
の標識物が置換された標識抗原試薬を継続的に得ること
ができなかった。このようにこれまで標識ＴＰ抗原を用
いる方法は知られていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来の抗ＴＰ抗体の測
定法は、操作が複雑であり精度の高い分析を短時間に行
うとができないという問題がある。本発明の目的は、従
来の方法に比べ簡便な操作で短時間で結果が得られる分
析法とその分析を実施するための装置を提供することで
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意研究を
行った結果、毛細管作用により輸液可能なマトリックス
に標識された遺伝子組換えＴＰ抗原からなる標識試薬ゾ
ーンと、ＴＰ抗原をマトリックスに固定した検出ゾーン
とを設けてなる抗梅毒トレポネマ抗体分析装置に、検体
を添加し、検出ゾーンに結合した検体中の抗梅毒トレポ
ネーマ抗体の検出を行う免疫分析方法、及び毛細管作用
により輸液可能なマトリックスに標識された遺伝子組換
えＴＰ抗原からなる標識試薬ゾーンを設けた新たな抗Ｔ
Ｐ抗体の免疫分析装置を見い出し本発明を完成した。さ
らに詳しくは、毛細管作用により輸液可能なマトリック
スに基質を含む展開液ゾーンと、酵素標識された遺伝子
組換えＴＰ抗原からなる標識試薬ゾーンと、ＴＰ抗原を
マトリックスに固定した検出ゾーンと、検体点着ゾーン
と、展開液吸収ゾーンとを設けてなる抗ＴＰ抗体の免疫
分析装置を用いて、前記検体点着ゾーンに検体液を点着
した後、前記展開液ゾーンに展開液を供給し、検体液中
の抗ＴＰ抗体に依存する量の前記検出ゾーンに固定化さ
れた酵素の活性を基質で検出して行うことを特徴とする
免疫分析方法、及び毛細管作用により輸液可能なマトリ
ックスに放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒
子、蛍光粒子又は着色粒子で標識された遺伝子組換えＴ
Ｐ抗原と検体とをを含む展開溶液を添加するための展開
液ゾーンと、ＴＰ抗原をマトリックスに固定した検出ゾ
ーンと、展開液吸収ゾーンとを設けてなる抗ＴＰ抗体の
免疫分析装置を用いて、前記検体点着ゾーンに検体液を
点着した後、前記展開液ゾーンに展開液を供給し、検体
液中の抗ＴＰ抗体に依存する量の前記検出ゾーンに固定
化された標識物を検出して行うことを特徴とする免疫分
析方法である。

【０００８】以下本発明の免疫分析方法を装置により更
に詳細に説明する。この免疫分析装置において、マトリ
ックスは毛細管作用により輸液可能な吸水性材料で構成
される。この好ましい材料としては、例えばセルロー
ス、ニトロセルロース等のセルロース又はその誘導体、
ガラス繊維等により形成されたろ紙、多孔質膜等であ
る。このマトリックスの大きさには制限はないが、例え
ば幅３ｍｍ〜１０ｍｍ、長さ３０ｍｍ〜１００ｍｍ程度
のストリップ状のものが取扱が容易で好ましい。マトリ
ックスの厚さは１００μｍ〜１ｍｍのものを用いること
が好ましい。またマトリックスは、その一部を蛋白質の
非特異反応による吸着を防止するために、例えば牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、シュークロース等で
ブロッキングして用いることもできる。

【０００９】（標識試薬ゾーン）標識試薬ゾーンは、マ
トリックス上に設けられた標識された遺伝子組換えＴＰ
抗原を含むゾーンである。このゾーンは展開液ゾーンか
らの展開液の輸液方向で検出ゾーンの上流側に設けるこ
とができる。このゾーンを設けるには、マトリックスに
標識された遺伝子組換えＴＰ抗原を点着する方法、標識
された遺伝子組換えＴＰ抗原を含む吸水性のパッドをマ
トリックス上に付設する方法により行うことができる。

【００１０】ＴＰ抗原はＴＰの細胞表面に各種分子量の
表面抗原が存在し、主なものとして分子量４７ｋＤａ
（ＴＰ４７）、４２ｋＤａ（ＴＰ４２）、１７ｋＤａ
（ＴＰ１７）、１５ｋＤａ（ＴＰ１５）、５０ＫＤａ
（ＴＰＮ５０）、ＴｍｐＡ等の抗原が知られている。こ
れらの抗原をコードする遺伝子は既にクローニングされ
ており、遺伝子工学的に抗原が生産されている（特表平
２−５００４０３号、INFECTION AND IMMUNITY, Vol.5
7, No.17, PP.3708-3714, 1989; Molecular Microbiolo
gy, 4(8), 1371-1379, 1990等参照）。本発明の遺伝子
組換えＴＰ抗原は前記各分子量の抗原を例えばノルガー
ド（Ｎｏｒｇａｒｄ）らの方法（INFECTION ANDIMMUNIT
Y, Vol.61,PP.1202-1210, 1993 ）に記載の方法に従い
ベクターに組み込み形質転換した大腸菌を培養し、培養
液から周知の方法を組み合わせて精製することにより製
造することができる。また本発明の遺伝子組換えＴＰ抗
原には、前記各分子量の抗原蛋白質の誘導体が存在し、
例えば蛋白質のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したＴＰ抗原を遺伝子工学的
に製造したものを用いることもできる（特開平７−２８
７０１７号参照）。更に組換えＴＰ抗原は、前記各抗原
から選ばれる２以上の抗原を融合させて製造した例えば
ＴＰ１５−１７抗原、ＴＰ１５−４２抗原、ＴＰ１５−
４７抗原、ＴＰ１７−４７抗原、ＴＰ４２−４７抗原、
ＴＰ１５−１７−４２抗原、ＴＰ１５−４２−４７抗
原、ＴＰ１５−１７−４７抗原、ＴＰ１５−４２−４７
抗原、ＴＰ１５−１７−４２−４７抗原又はこれらの順
序を入れ換えた融合ＴＰ抗原であってもよい。

【００１１】この遺伝子組換えＴＰ抗原には標識物を結
合させて試薬とするが、その標識物としては、例えば酵
素、放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、
蛍光粒子、着色粒子等を挙げることができる。酵素とし
ては酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に用いられる各種酵素を
挙げることができ、その酵素として例えばアルカリホス
ファターゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ等を挙げることができる。また放射性同位元素とし
ては、例えばヨウ素、トリチウム、炭素等の同位元素を
挙げることができる。ラテッススとしては、例えばポリ
スチレンラテックス等の高分子化合物の粒子を挙げるこ
とができる。金属コロイド粒子は、例えば各種金属コロ
イドからなる粒子であり、セレニウム、白金、金等の金
属コロイドを挙げることがきる。粒径は直径１０ｎｍ〜
１μｍのものを用いることが好ましい。

【００１２】蛍光粒子としては、例えばフルオレセイ
ン、ローダミン、シアン化白金等の蛍光物質を含むポリ
スチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−
アクリル酸共重合体、ガラス等の粒子を挙げることがで
きる。着色粒子は各種染料又は顔料により着色した有機
高分子化合物又は無機化合物で構成される粒子であり、
例えばポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリア
キリルアミド、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガ
ラス等を単独又は混合した材料で構成される。これらの
蛍光粒子及び着色粒子の粒径は１０ｎｍ〜１μｍのもの
を用いることが好ましい。

【００１３】また標識物と遺伝子組換えＴＰ抗原との結
合方法は、公知の共有結合又は非共有結合を作る方法を
利用して製造することができる。結合の方法には、例え
ばグタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、
ピリジル・ジスルフィド法、各種架橋剤を用いる方法等
を挙げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊
３１号、３７〜４５頁（１９８５）参照）。架橋剤を用
いる結合方法では、架橋剤としては例えばＮ−スクシン
イミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スク
シンイミジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ−スクシ
ンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボン酸等を用いることができる。共有結
合による方法では、遺伝子組換えＴＰ抗原に存在する官
能基を用いることができる他、組換えＴＰ抗原に例えば
チオール基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官
能基を常法により導入したのち前記結合法により標識遺
伝子組換えＴＰ抗原を製造することができる。また非共
有結合による方法としては物理吸着法等を挙げることが
できる。

【００１４】遺伝子組換えＴＰ抗原に放射性同位元素を
用いて標識する方法としては、例えばボルトンハンター
試薬等を用いて行うことができる。

【００１５】標識試薬ゾーンに含有される標識遺伝子組
換えＴＰ抗原の量は、マトリックスに点着又は吸水性パ
ッドに含有させる方法、検査対象物、測定に用いる検体
量により適宜変更することができるが、通常乾燥重量で
０．０１μｇ〜５μｇ程度である。標識遺伝子組換えＴ
Ｐ抗原は、例えばＴＰ４７、ＴＰ４２、ＴＰ１７、ＴＰ
１５、ＴＰＮ５０、ＴｍｐＡ、前記融合ＴＰ抗原等の遺
伝子組換えＴＰ抗原を標識したものから少なくとも１種
類の抗原を標識試薬ゾーンに添加して用いることができ
る。

【００１６】（検体点着ゾーン）検体点着ゾーンは、展
開液ゾーンの展開液の輸液方向の下流側で検出ゾーンの
上流側のマトリックスに特に試薬等を含まずに設けるこ
とができる。さらに検体点着ゾーンは、展開液ゾーンの
展開液輸液方向の下流側で標識試薬ゾーンの上流側、標
識試薬ゾーンの下流側で検出ゾーンの上流側又は標識試
薬ゾーンの上に設けることができる。また、前記標識試
薬ゾーンに検体点着ゾーンを設けた装置では、標識ゾー
ンとして標識された遺伝子組換えＴＰ抗原を含有する吸
水性パッドを付設することが効率よく分析を行う上で好
ましい。このパッドを付加する装置では、多量の検体液
を点着することができるため、検体中の微量成分を検出
感度を高めて分析を行うことができる。この吸水性のパ
ッドとしては、例えばポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）、不織布、セルロース等の多孔質の合成又は天然の
高分子化合物からなる材料を単独又は組み合わせて構成
することができる。このパッドの大きさ及び厚さは限定
されないが、通常縦と横が３ｍｍ〜１０ｍｍ程度で厚さ
が０．５ｍｍ〜４ｍｍ程度のパッドを用いることが効率
よく測定を行うためには好ましい。

【００１７】（検出ゾーン）検出ゾーンは、展開液の輸
液方向で展開液吸収ゾーンの上流側で且つ検体点着ゾー
ンの下流側であり、ＴＰ抗原を固定して設けることがで
きる。このゾーンは、マトリックスに共有結合等の化学
結合、物理吸着等の方法により固定化することにより設
けることができる。またＴＰ抗原を不溶性の担体に結合
させ、これをマトリックス内に含有させてもよい。この
不溶性担体としてはゼラチン、アラビアゴム及びヘキサ
メタリン酸ナトリウムからなる混合物を不溶化して得ら
れる粒子（特公昭６３−２９２２３）、ポリスチレンラ
テックス、各種動物赤血球、ガラス繊維等がある。不溶
性の担体とＴＰ抗原との結合には、前記化学結合又は物
理吸着により結合させることができる。検出ゾーンは、
どのような形状でもよいが、展開液の輸液方向と直交す
るように線状に形成し、ＴＰ抗原を固定することが検出
感度を向上させるためには好ましい。

【００１８】検出ゾーンには前記したＴＰ４７、ＴＰ４
２、ＴＰ１７、ＴＰ１５、前記融合ＴＰ抗原等の遺伝子
組換えＴＰ抗原をそれぞれ単独にマトリックス上に固定
し、検出ゾーンを形成することができる。さらにこれら
の抗原をマトリックス上の異なる位置にそれぞれ固定し
２以上の検出ゾーンを設けることもできる。２以上の検
出ゾーンを設けた装置ではそれぞれの抗原に対する抗体
を分別して検出することが可能である。さらにこれらの
２以上の遺伝子組換えＴＰ抗原を混合して１つの検出ゾ
ーンとすることもできる。またさらにこの検出ゾーンに
は、遺伝子組換えＴＰ抗原以外に当業者には周知の方法
に従い、例えばウサギ睾丸等の生体内で培養したＴＰ
（ニコルス株）の菌体を分解し、抽出、遠心分離等の方
法を組み合わせて精製し取得した所謂培養ＴＰ抗原（特
開昭５８−７１４５７号公報参照）を用いることができ
る。

【００１９】（展開液ゾーン）展開液ゾーンは、マトリ
ックスの一端に設けられ展開液が供給されるゾーンであ
る。測定を開始するには、このゾーンを少なくとも展開
液吸収ゾーンに達する量の展開液の入った容器に浸し行
うとができる。さらに展開液の供給には展開液ゾーンに
展開液の入った液槽を付加し、この液槽を破り展開液と
マトリックスを接触させることにより測定を開始するこ
ともできる。展開液には、界面活性剤、緩衝剤等を適宜
含有することができる。緩衝剤を含む緩衝液としては、
例えば酢酸緩衝液、ほう酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、ジエタノールアミン緩衝液等を挙げることができ
る。また展開液ゾーンには展開液の供給形態によりさら
に吸水性のろ紙等を付設することもできる。

【００２０】（展開液吸収ゾーン）展開液吸収ゾーン
は、マトリックスの一端に設けられた前記展開液ゾーン
に対して他端に設置される。このゾーンはマトリックス
に供給される展開液を吸収し分析を円滑に行うために設
けられる。展開液吸収ゾーンはマトリックスを長く形成
してこのゾーンを確保するともできる。また、マトリッ
クスに吸水性材料を付設し展開を促進することもでき
る。この吸水性材料を付加する場合には、天然高分子化
合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、
スポンジ等を用いることができる。吸収性材料はマトリ
ックスに積層することにより、小型化した免疫分析装置
を製造することができる。

【００２１】本発明の装置としては、標識物の種類によ
り各種装置形態をとることができるが、標識物として酵
素を用いる場合には、毛細管作用により輸液可能なマト
リックスに基質を含む展開液ゾーンと、酵素標識された
遺伝子組換えＴＰ抗原からなる標識試薬ゾーンと、ＴＰ
抗原をマトリックスに固定した検出ゾーンと、検体点着
ゾーンと、展開液吸収ゾーンとを設けた抗ＴＰ抗体の免
疫分析装置である。

【００２２】標識物として前記酵素を用いる装置では酵
素活性を測定するために各種基質を用いることができ
る。この基質としては酵素に対応して以下に示す各種発
色基質、蛍光基質、発光基質等を用いることができる。

【００２３】（ａ）発色基質 パーオキシダーゼ用：過酸化水素と組合せた２，２’−
アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡ
Ｂ） アルカリホスファターゼ用：５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）

【００２４】（ｂ）蛍光基質 アルカリホスファターゼ用：４−メチルウムベリフェニ
ル−ホスフェート（４ＭＵＰ） β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用：４−メチルウムベリフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）

【００２５】（ｃ）発光基質 アルカリホスファターゼ用：３−（２’−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−ホスフォリル
オキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウ
ム塩（ＡＭＰＰＤ） β−Ｄ−ガラクトシダーゼ用：３−（２’−スピロアダ
マンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン
（ＡＭＧＰＤ） パーオキシダーゼ用：過酸化水素と組み合わせたルミノ
ール、イソルミノール

【００２６】これら基質は、通常展開液中に添加して用
いられるが、基質をマトリックス上に基質ゾーンとして
設けることもできる。このマトリックスに基質ゾーンを
設けるには、通常基質を溶液に溶解してマトリックスに
添加した後、乾燥させることにより形成することができ
る。

【００２７】さらに本発明の装置の態様として、毛細管
作用により輸液可能なマトリックスに放射性同位元素、
ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子
で標識された標識遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原と
検体とを含む展開溶液を添加するための展開液ゾーン
と、ＴＰ抗原をマトリックスに固定した検出ゾーンと、
展開液吸収ゾーンとを設けた抗ＴＰ抗体の免疫分析装置
を挙げるとができる。

【００２８】この分析装置は、展開液ゾーンに放射性同
位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は
着色粒子で標識された標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体
とをそれぞれ添加するゾーンであることが前記装置とは
相違する。この展開液ゾーンには前記標識遺伝子組換え
ＴＰ抗原と検体とを含む溶液をそれぞれ添加する方法、
標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体との混合液を添加する
方法により行うことができる。この展開溶液には、所望
により前記界面活性剤、緩衝剤等を含む展開液を添加す
ることができる。この展開液ゾーンに添加する標識遺伝
子組換えＴＰ抗原は、放射性同位元素、ラテックス、コ
ロイド粒子又は着色粒子で標識された標識遺伝子組換え
ＴＰ抗原であり、前記分析装置で用いた標識遺伝子組換
えＴＰ抗原の中から選択して用いることができる。さら
にこの分析装置の検出ゾーン及び展開液吸収ゾーンは前
記分析装置と同じゾーンとすることができる。

【００２９】（使用方法）本発明の分析装置を用いて各
種検体中の抗ＴＰ抗体の分析を行うことができる。この
装置で分析を行うには、まず検体を装置のマトリックス
に供給した後、展開液により展開を行う。展開液は毛細
管作用により展開液吸収ゾーンに達し、検出ゾーンに結
合されなかった検体中の成分、標識遺伝子組換えＴＰ抗
原が吸収され展開が完了する。展開終了後、検体液中の
抗梅毒トレポネーマ抗体に依存する量の前記検出ゾーン
に固定化された標識物を直接的又は間接的に検出するこ
とにより抗ＴＰ抗体の分析を行うことできる。この検出
は標識物によりそれぞれ対応する目視又はシンチレーシ
ョンカウンター、比色計、蛍光光度計、フォトンカウン
ター、感光フィルム等の測定装置を用いて実施すること
ができる。分析では、例えば酵素を標識物として用い発
色基質により生成する色素の有無を定性的に目視で測定
する方法が簡便である。またこの方法では抗ＴＰ抗体の
濃度に対応した色票（カラーチャート）を用いることに
より半定量的な分析が可能となる。

【００３０】また、前記マトリックスは標識物の種類に
よりプラスチック、金属、紙等の支持部材上に積層し固
定して用いることもできる。さらにマトリックスはプラ
スチック等のケースに固定し、展開液を含む液槽を展開
液ゾーンに付設し前記各ゾーン部分に穴の開いたカバー
をすることにより取扱の容易な装置を構成することがで
きる。本発明の免疫分析装置では、検体として特に制限
はなく例えば血清、血漿、全血、尿等の各種体液中の抗
ＴＰ抗体の検出に適用することができる。

【００３１】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。

【００３２】実施例１ アルカリホスファターゼ標識さ
れた遺伝子組換えＴＰ１７抗原の作成 特開平７−２８７０１７号に記載の方法に従い製造し、
ＧＳＴの結合した遺伝子組換えＴＰ１７抗原０．１２ｍ
ｇに２−イミノチオラン２００ｎｍｏｌを加え、３０℃
で６０分間放置し、チオール化ＴＰ抗原を得た。次にア
ルカリホスファターゼ３ｍｇに３００ｎｍｏｌのＮ−ス
クシンイミジル−４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）を加
え３０℃で６０分間放置し、マレイミド化アルカリホス
ファターゼを得た。その後前記チオール化ＴＰ抗原１０
０μｇとマレイミド化アルカリホスファターゼ２．５ｍ
ｇとを混合し、４℃一夜反応を行った後、ゲルろ過カラ
ムにより未反応の抗原及び酵素を除いて、アルカリホス
ファターゼ標識した遺伝子組換えＴＰ１７抗原を得た。

【００３３】実施例２ 抗ＴＰ１７抗体分析用装置 図２に示すように幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍのセルロース
膜（ミリポア社製）のマトリックス１に上端から１５ｍ
ｍの位置に実施例１で用いた同じ遺伝子組換えＴＰ１７
抗原を塗布装置でライン状に点着後乾燥して検出ゾーン
５を作成した。実施例１で製造したアルカリホスファタ
ーゼ標識された遺伝子組換えＴＰ１７抗原溶液２０μｌ
を幅５ｍｍ、長さ５ｍｍに切ったポリビニルアルコール
（ＰＶＡ）シートに点着し乾燥したパッドをマトリック
スの上端から２５ｍｍの位置に置き標識試薬ゾーン４と
検体点着ゾーン３とした。またマトリックスの下端１０
ｍｍの位置に幅５ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア
社製）を付設し、展開液ゾーン２とした。更に展開液吸
収ゾーン６としてマトリックスの上端１０ｍｍの位置に
幅１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ約１ｍｍのろ紙を付設
して抗ＴＰ１７抗体分析用の装置を得た。

【００３４】実施例３ 抗ＴＰ１７抗体の測定 実施例２で作成した分析装置を用いて抗ＴＰ抗体の分析
を行った。まず検体１５μｌを点着ゾーン３に添加後、
０．３％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸（ＢＣＩＰ）を含有する溶液２００μｌを展開液ゾ
ーンに滴下し吸収展開した。１５分後に検出ゾーン５の
呈色を目視判定した。ヒト血清検体８９例について測定
を行いその結果を表１に示す。着色が見られたものを陽
性、着色が見られなかったものを陰性と判定した。ま
た、同一の検体について、希釈列を作り従来の抗ＴＰ抗
体の間接凝集免疫測定試薬（セロディア−ＴＰ・ＰＡ
（登録商標）；富士レビオ社製）で測定した結果を表１
に示す。

【００３５】実施例４ 抗ＴＰ４７抗体の測定 ノルガード（Ｎｏｒｇａｒｄ）らの方法（INFECTION AN
D IMMUNITY, Vol.61,PP.1202-1210, 1993 ）に従い製造
し精製した組換えＴＰ４７抗原を用いて、実施例１及び
２の方法に従いアルカリホスファターゼ標識した組換え
ＴＰ４７抗原を作成し、さらに抗ＴＰ４７抗体分析用の
装置を得た。この装置を用いて表１に記載の検体につい
て測定を行った。実施例３及び４の結果を表１に示す。
実施例３及び４とを組み合わせて少なくとも一方の装置
で陽性を示す検体を陽性判定とすると、すべての検体で
間接凝集法と同じ結果を得た。

【００３６】

【表１】

【００３７】実施例５ 抗１７ＴＰ抗体及び抗４７ＴＰ
抗体分析用装置 図４に示すように幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍのセルロース
膜（ミリポア社製）のマトリックス１の上端から１２ｍ
ｍの位置に組換えＴＰ１７抗原、１７ｍｍの位置に遺伝
子組換えＴＰ４７抗原を塗布装置でライン状に点着後乾
燥して検出ゾーン５及び８を作成した。実施例１で作成
したアルカリホスファターゼ標識した組換えＴＰ１７抗
原及び実施例３で作成したアルカリホスファターゼ標識
した組換えＴＰ４７抗原の混合溶液２０μｌを幅５ｍ
ｍ、長さ５ｍｍに切ったＰＶＡシートに点着し乾燥した
コンジュゲートパッドをマトリックスの上端から２５ｍ
ｍの位置に置き標識試薬ゾーン４とした。また実施例２
と同様に展開液ゾーン２と展開液吸収ゾーン６のろ紙を
付設して抗ＴＰ１７抗体及び抗４７ＴＰ抗体分析用の装
置を作成した。

【００３８】実施例６ 抗１７ＴＰ抗体及び抗４７ＴＰ
抗体の測定 実施例５で作成した装置を用いて間接凝集免疫測定法で
陽性を示した検体について抗ＴＰ抗体の測定をを行っ
た。まず検体１５μｌを標識試薬ゾーン４に設けた点着
ゾーン３に添加後、０．３％のＢＣＩＰを含有する溶液
２００μｌを展開液ゾーンに滴下し吸収展開させた。１
５分後に検出ゾーン５及び８の呈色を目視判定した。着
色が見られたものを陽性、着色が見られなかったものを
陰性と判定した。

【００３９】前記間接凝集免疫測定試薬で陽性又は陰性
と判定された検体について、実施例５の分析装置で測定
を行った。その結果を表２に示す。また、既知の梅毒感
染初期検体、感染二期検体及び感染晩期検体についてそ
れぞれ間接凝集免疫測定及び実施例４の分析装置で測定
を行った。その結果を表３に示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】実施例７ アルカリホスファターゼ標識Ｔ
Ｐ１５−１７抗原の作成 ＴＰ１５抗原とＴＰ１７抗原とが融合した遺伝子組換え
ＴＰ１５−１７抗原を製造し、更に実施例１と同じ方法
に従いアルカリホスファターゼ標識ＴＰ１５−１７抗原
を得た。

【００４３】実施例８ 抗ＴＰ１５−１７抗体分析用装
置 実施例２と同じ方法に従い、マトリックス１上に実施例
７で製造したアルカリホスファターゼ標識ＴＰ１５−１
７抗原及び遺伝子組換えＴＰ１５−１７抗原とを点着し
て、抗ＴＰ１５−１７抗体分析用装置を得た。

【００４４】実施例９ 抗ＴＰ１５−１７抗体分析用装
置 実施例８で作成した分析装置を用いて抗ＴＰ抗体の分析
を実施例３の方法に従いヒト血清検体５例について行っ
た。その結果を表４に示す。更に同一の検体について、
前記間接凝集免疫測定試薬及び抗ＴＰ４７抗体分析装置
での結果を併せて表４に示す。

【００４５】

【表４】

【００４６】

【発明の効果】本発明は、簡便かつ高感度に検体中の抗
ＴＰ抗体の分析方法を提供する。この方法では、例えば
血清中の抗ＴＰ抗体を約１５分間で分析を行い結果を得
ることができる。また抗ＴＰ抗体の抗体価が高い検体の
測定時に観察されるプロゾーン現象は、本発明の分析方
法では見られなかった。さらに本発明の方法を用いると
検体中の複数の抗ＴＰ抗体を分別して分析できるため、
感染時期を推定することができ、梅毒の治療にも有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫分析装置の態様の一例を模式的に
示す平面図である。

【図２】本発明の免疫分析装置において、標識遺伝子組
換えＴＰ抗原を含むパッドからなる標識試薬ゾーンを付
加した時の装置断面図である。

【図３】本発明の免疫分析装置において、マトリックス
１に基質ゾーン７設けた時の装置断面図である。

【図４】本発明の免疫分析装置において、マトリックス
に２か所の検出ゾーン５及び８を設けた時の装置断面図
である。

【図５】本発明の免疫分析装置の展開液ゾーン２に放射
性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子
又は着色粒子で標識された遺伝子組換えＴＰ抗原と検体
混合溶液９とを供給し測定する時の平面図である。

【符号の説明】

１ マトリックス ２ 展開液ゾーン ３ 検体点着ゾーン ４ 標識試薬ゾーン ５ 検出ゾーン ６ 展開液吸収ゾーン ７ 基質ゾーン ８ 検出ゾーン ９ 標識遺伝子組換えＴＰ抗原と検体との混合溶液

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 毛細管作用により輸液可能なマトリック
   スに標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原から
   なる標識試薬ゾーンと、梅毒トレポネーマ抗原をマトリ
   ックスに固定した検出ゾーンとを設けてなる抗梅毒トレ
   ポネマ抗体の免疫分析装置に、検体を添加し、検出ゾー
   ンに結合した検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の検出を
   行うことを特徴とする免疫分析方法。
2. 【請求項２】 毛細管作用により輸液可能なマトリック
   スに基質を含む展開液ゾーンと、酵素標識された遺伝子
   組換え梅毒トレポネーマ抗原からなる標識試薬ゾーン
   と、梅毒トレポネーマ抗原をマトリックスに固定した検
   出ゾーンと、検体点着ゾーンと、展開液吸収ゾーンとを
   設けてなる抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置を用
   いて、前記検体点着ゾーンに検体液を点着した後、前記
   展開液ゾーンに展開液を供給し、検体液中の抗梅毒トレ
   ポネーマ抗体に依存する量の前記検出ゾーンに固定化さ
   れた酵素の活性を基質で検出して行うことを特徴とする
   免疫分析方法。
3. 【請求項３】 免疫分析装置がマトリックスに展開液ゾ
   ーンと、基質ゾーンと、検体点着ゾーンと、酵素標識さ
   れた遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原からなる標識試
   薬ゾーンと、梅毒トレポネーマ抗原をマトリックスに固
   定した検出ゾーンと、展開液吸収ゾーンとを設けた分析
   装置である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 標識試薬ゾーン上に検体点着ゾーンを設
   けた分析装置を用いる請求項２又は３記載の方法。
5. 【請求項５】 標識試薬ゾーンがマトリックス上に付設
   した酵素標識された遺伝子組換え梅毒トレポネマ抗原を
   含有した吸水性パッドからなる請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 毛細管作用により輸液可能なマトリック
   スに展開液ゾーンと、放射性同位元素、ラテックス、金
   属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子で標識された遺
   伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原からなる標識試薬ゾー
   ンと、梅毒トレポネーマ抗原をマトリックスに固定した
   検出ゾーンと、検体点着ゾーンと、展開液吸収ゾーンと
   を設けてなる抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置を
   用いて、前記検体点着ゾーンに検体液を点着した後、前
   記展開液ゾーンに展開液を供給し、検体液中の抗梅毒ト
   レポネーマ抗体に依存する量の前記検出ゾーンに固定化
   された標識物を検出して行うことを特徴とする免疫分析
   方法。
7. 【請求項７】 毛細管作用により輸液可能なマトリック
   スに放射性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、
   蛍光粒子又は着色粒子で標識された遺伝子組換え梅毒ト
   レポネーマ抗原と検体とを含む展開溶液を添加するため
   の展開液ゾーンと、梅毒トレポネーマ抗原をマトリック
   スに固定した検出ゾーンと、展開液吸収ゾーンとを設け
   てなる抗梅毒トレポネーマ抗体の免疫分析装置を用い
   て、前記検体展開液ゾーンに前記標識された遺伝子組換
   え梅毒トレポネーマ抗原と検体液とを添加し、検体液中
   の抗梅毒トレポネーマ抗体に依存する量の前記検出ゾー
   ンに固定化された標識物を検出して行うことを特徴とす
   る免疫分析方法。
8. 【請求項８】 検出ゾーンの梅毒トレポネーマ抗原が遺
   伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原である請求項１ないし
   ７のいずれか１項に記載の免疫分析方法。
9. 【請求項９】 遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原が梅
   毒トレポネーマ表面抗原の分子量１５ｋＤａのＴＰ１５
   抗原、分子量１７ｋＤａのＴＰ１７抗原、分子量４２ｋ
   ＤａのＴＰ４２抗原、分子量４７ｋＤａのＴＰ４７抗原
   及びこれらのＴＰ抗原が２以上融合した融合ＴＰ抗原か
   ら選ばれる少なくとも１つの抗原である請求項１ないし
   ８のいずれか１項に記載の免疫分析方法。
10. 【請求項１０】 毛細管作用により輸液可能なマトリッ
    クスに、標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原
    からなる標識試薬ゾーンを設けてなる抗梅毒トレポネー
    マ抗体の免疫分析装置。
11. 【請求項１１】 マトリックスに基質を含む展開液ゾー
    ンと、酵素標識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗
    原からなる標識試薬ゾーンと、梅毒トレポネーマ抗原を
    マトリックスに固定した検出ゾーンと、検体点着ゾーン
    と、展開液吸収ゾーンとを設けてなる請求項１０記載の
    分析装置。
12. 【請求項１２】 マトリックスに展開液ゾーンと、基質
    ゾーンと、検体点着ゾーンと、酵素標識された遺伝子組
    換え梅毒トレポネーマ抗原からなる標識試薬ゾーンと、
    梅毒トレポネーマ抗原をマトリックスに固定した検出ゾ
    ーンと、展開液吸収ゾーンとを設けてなる請求項１０記
    載の分析装置。
13. 【請求項１３】 マトリックスの標識試薬ゾーン上に検
    体点着ゾーンを設けてなる請求項１１又は１２記載の分
    析装置。
14. 【請求項１４】 標識試薬ゾーンがマトリックス上に付
    設した酵素標識された遺伝子組換え梅毒トレポネマ抗原
    を含有した吸水性パッドからなる請求項１３記載の分析
    装置。
15. 【請求項１５】 マトリックスに展開液ゾーンと、放射
    性同位元素、ラテックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子
    又は着色粒子で標識された遺伝子組換え梅毒トレポネー
    マ抗原からなる標識試薬ゾーンと、梅毒トレポネーマ抗
    原をマトリックスに固定した検出ゾーンと、検体点着ゾ
    ーンと、展開液吸収ゾーンとを設けてなる請求項１０記
    載の分析装置。
16. 【請求項１６】 試薬ゾーンが、放射性同位元素、ラテ
    ックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子で標
    識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原を含有し、
    検体が添加される吸水性パッドからなる試薬ゾーンをマ
    トリックス上に付設し、この試薬ゾーン上に検体点着ゾ
    ーンを設けてなる請求項１５記載の分析装置。
17. 【請求項１７】 マトリックスに放射性同位元素、ラテ
    ックス、金属コロイド粒子、蛍光粒子又は着色粒子で標
    識された遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原と検体とを
    含む展開溶液を添加するための展開液ゾーンと、梅毒ト
    レポネーマ抗原をマトリックスに固定した検出ゾーン
    と、展開液吸収ゾーンとを設けてなる請求項１０記載の
    分析装置。
18. 【請求項１８】 検出ゾーンの梅毒トレポネーマ抗原が
    遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原である請求項１０な
    いし１７のいずれか１項に記載の分析装置。
19. 【請求項１９】 遺伝子組換え梅毒トレポネーマ抗原が
    梅毒トレポネーマ表面抗原の分子量１５ｋＤａのＴＰ１
    ５抗原、分子量１７ｋＤａのＴＰ１７抗原、分子量４２
    ｋＤａのＴＰ４２抗原、分子量４７ｋＤａのＴＰ４７抗
    原及びこれらＴＰ抗原が２以上融合した融合ＴＰ抗原か
    ら選ばれる少なくとも１つの抗原である請求項１０ない
    し１８のいずれか１項に記載の分析装置。