JP3330604B2 - 固相免疫学的検定法 - Google Patents

固相免疫学的検定法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固相免疫学的検定法、特に血液試料のスク
リーニングに用いられる固相血清学的検定法に関する。
免疫検定法、特に血清学的検定法は、臨床科学で日常
的に用いられる重要な方法である。血液型に特異な抗体
を、輸血前に患者の血清から検出できるようにすること
が特に重要である。輸血前に、供血者および患者の血液
試料は主要な血液型抗原であるＡ、Ｂ、Ｏ、およびRh
（Ｄ）の表現型で分類された後、Duffy、Kidd、Kell、M
NSおよび他のRh特異性などの患者の血清中に含まれる非
定型抗体に関しスクリーニングされる。このような不規
則抗体を検出した後、同定を行うことにより、輸血に適
する血液、すなわちこれらの不規則抗体が向けられる抗
原を発現しない血液を容易に選択することができる。適
切に選択された血液を輸血することによって、軽度の発
熱から死亡にまで及ぶ患者の輸血反応が避けられる。
既知の血清学的検定法は、赤血球の抗原−抗体の相互
作用検出用懸濁液中での赤血球の凝集作用を利用したも
のである。このような患者の血清中の抗体検出試験は、
本質的に手作業による試験であって、極めて主観的であ
り、オペレーター自身が凝集作用の有無を視覚的に識別
することが要求される。抗原に対して陽性を示す血液を
in vivoで輸血する場合に臨床上重篤な輸血反応を起こ
すことがある抗体の多くは、低濃度で存在し、in vitro
では血清／血漿を希釈せずに試験を行っても、弱い凝集
反応しか引き起こさない。余り熟練していないオペレー
ターは弱い凝集反応を見逃しがちなことから、このよう
な試験操作は、実際上、感受性および精確性に欠ける。
他の分野では、固相免疫検定法が用いられており、抗
原調製物を固体支持体上に固定し、抗体を含む試験試料
に暴露した後、結合した抗体を例えば酵素または放射能
標識した二次抗体を用いて検出する。この方法は、容易
に自動化できる他、標識物質を適当に選択することによ
って結果を定量できるという利点を有する。このような
方法の感受性は非常に高い。
固相法は、標的抗体と反応する固定した赤血球を用い
ることによって、不規則血液細胞抗体の抗体スクリーニ
ングに応用されている。この手法では、赤血球に結合し
た抗グロブリンを、抗体−抗原相互作用の検出手段とし
て用いており、これは抗グロブリンと固定した標的抗体
との間の結合反応によるものである。このような赤血球
を、「インディケーター」という。赤血球は、例えば塩
化クロムなどを用いた直接的な抗グロブリンへの化学的
カップリングによって、あるいは赤血球および抗グロブ
リン試薬の両方に結合する抗Rh（Ｄ）のような赤血球抗
原に対する抗体を用いて調製し、インディケーターとし
て用いる。これらの系では、陽性反応はインディケータ
ー赤血球の固体表面への付着によって示される。この反
応をマイクロプレート上でまたは凹面のある他の表面で
行う場合には、インディケーター細胞を適当な重力およ
び時間条件下にてその表面上に遠心して、陽性反応の場
合には、赤血球の単層がウェル／凹面の周囲に形成さ
れ、陰性反応では赤血球がボタン状となってウェル底部
に形成される。反応はインディケーター赤血球の視覚検
査によって検出されるが、その際、赤血球パターンの主
観的解釈が要求される。インディケーター赤血球パター
ンの自動客観読み取りではイメージ分析器が必要とな
り、得られるパターンは用いた遠心条件によって変わ
る。
しかしながら、水性物質で標識した、例えば酵素標識
した、二次抗体をインディケーター赤血球で標識した二
次抗体の代わりに赤血球抗原に対する抗体の検出系に用
いると、バックグラウンドシグナルが許容不可能なほど
高くなる。従って、客観的であるという利点があるにせ
よ、このような系が提供する自動読み取りには、非特異
的に結合した免疫グロブリンが検出されることによりバ
ックグラウンドが許容不可能なほど高くなるという問題
が残る。
固相法の利点にもかかわらず、非特異的結合による許
容不可能なほどバックグラウンドが高くなるという問題
点が残る。更に、検定で一定の結果を保証できるような
均一の特性を備えた赤血球の提供も難しい。
本出願人は、意外にも、標的抗体の結合対（a bindin
g partner for the target antibody）を担持する標識
ラテックスを検出系として用いることによって、バック
グラウンドシグナルを有意に減少させることができるこ
とを見出した。
従って、本発明は一つの態様では、血清または血漿試
料中における細胞表面抗原に特異的な標的抗体の存在ま
たは量を検出または検定する固相法であって、前記試料
を前記抗原を担持する固定化細胞調製体と接触させ、そ
れに結合した抗体をインディケーターを用いて検出また
は検定する方法であり、前記インディケーターが、標識
されたラテックス粒子に結合された、前記抗体に対する
結合対からなるものである、方法を提供する。
この方法は、血液、特にヒト血液の固相抗体のスクリ
ーニングに好適であって、本発明の好ましい態様を形成
している。この場合、多数の標的抗体に対応する抗原を
有する赤血球を固定したパネルを、抗体のスクリーニン
グに最も好都合に固定して用いることができる。
本明細書で用いる用語「細胞」は、特に断らない限
り、完全な細胞の表面抗原を有するが、乾燥した形態で
保存できる利点のある細胞膜かまたは「ゴースト（ghos
ts）」を含む意味で用いられるものとする。
固定する表面は、プレート、チューブ、スティック、
ビーズ、粒子膜、フィルターまたはゲルなどの任意の通
常の形態をとることができる。しかしながら、自動化し
た系に適用できる表面が好ましく、特にマイクロプレー
トが好ましい。
支持体の構成材料は、プラスティック材料またはニト
ロセルロースなどの通常のものであることができるが、
ポリスチレンおよびポリ塩化ビニルが好ましい。
抗原調製物は、細胞、好ましくは血液細胞、更に好ま
しくは赤血球を含んでなるものであり、またはそのよう
な細胞から誘導される膜調製物、例えば赤血球ゴースト
（すなわち、溶解した赤血球の膜）を含むことができ
る。
この方法を、特に患者の血清中に標的抗体が含まれて
いるかどうかを輸血前にスクリーニングするのに適用す
る場合には、２種類の固定した試験細胞であって、通常
のABO血液型分類法で両方共Ｏ型であることが確認され
た細胞を用いる系で、平行して試験を行うことが望まし
い。また、低頻度抗原、すなわち通常の母集団で頻度が
１％未満の抗原を発現する細胞を除外することが望まし
い。下記の抗原が、試験細胞の少なくとも１つで発現さ
れることが望ましい： Ｃ ｃ Ｄ Ｅ ｅ Ｋ ｋ Fya Fyb Jka Jkb Ｓ
ｓ Ｍ Ｎ Ｐ LeaおよびLeb。
試験細胞を適宜選択すれば、本発明の方法を用いて、
不規則抗体のスクリーニングだけでなく、既知の表現型
の他の試験細胞のより幅広いパネルを用いてこれらの抗
体の特異性を分類することもできる。
好適なスクリーニング細胞は、例えばBPL、Elstree、
Hertsなどから市販されている。
この赤血球細胞は、様々な方法で表面に固定すること
ができ、例えば細胞表面に表現した非血液型抗原に対す
る抗体により、またはポリ−Ｌ−リジン、有機染料また
はレクチンを用いて付着させることにより固定すること
ができる。しかしながら、用いる試薬が細胞表面に適合
するものであって、細胞または膜を検定中ずっと安定し
て表面に結合させることができるものであるのが望まし
い。
レクチン、特にAgaricus bisporus、Agaricus campes
trisまたはBauhinia purpureaレクチンのようなガラク
トシル残基に特異性を有するものが好ましく、これも本
発明の一つの態様を構成している。
赤血球をこのようなレクチンを介してプラスティック
に付着させると、化学物質（ポリ−Ｌ−リジンまたは有
機染料）または抗体を用いる方法よりも赤血球を一層均
一で強固にコーティングできることが示された。これ
は、様々な条件下で赤血球をコーティングしたマイクロ
プレートの顕微鏡による視覚検査、および完全法（enti
re method）で試験を行った場合には、限界希釈した抗
体から得られる反応強度により評価した。抗体を限界希
釈した場合、得られるシグナルの程度は利用可能な抗原
部位の数に依存する。
細胞またはゴーストは、例えば重力下での沈降による
などの単なる接触により固体支持体表面をコーティング
することができ、または細胞を表面に遠心することなど
によりコーティングを補助し且つコーティングの速度を
増加させることができる。全細胞よりもゴーストを用い
ることが好ましいのは、本出願人が保存上、ゴーストの
方が固相上で安定であることを見出したことによる。ゴ
ーストは、固体表面上に固定された赤血球を溶解させる
ことによって固相上のin situで調製することも、また
は懸濁液中に調製した後に表面上に沈降させるかまたは
遠心することで調整することができる。
細胞調製物としてゴーストを用いるもう一つの利点
は、ゴーストをプレート上で乾燥させて保存できること
である。このようにして、試験プレートを多量に調製
し、将来の使用に備えて保存することができる。ゴース
トは、既知の技術を用いてプレート上で乾燥させること
ができ、例えば糖の存在下で、場合によってはタンパク
質と共に周囲温度で乾燥することができる。当然なが
ら、乾燥技術は抗原を変質させないことが望ましい。こ
れらの技術は、EP−Ａ−140489号明細書およびEP−Ａ−
367468号明細書に記載されている。
更に、本出願人は、線状構造の糖アルコールであるキ
シリトールを用いて有利に赤血球膜を乾燥および保存で
きることを見い出した。これは本発明の新規な態様を構
成しており、赤血球膜の乾燥貯蔵の間の好ましい保存法
である。
調製したプレートは、４℃にて袋入りの乾燥剤を入れ
た遮光性気密容器に密閉保存ができる。
試験抗体、例えば血清を含んだ溶液は、固定した細胞
膜と接触させてから、適切なインキュベーション時間を
経た後に未結合抗体を洗浄により除去することができ
る。
次に、陽性反応をインディケーター試薬を用いて検出
する。この試薬は、標的抗体の結合対が結合しているラ
テックス粒子の懸濁物からなり、このインディケーター
は検出できるよう標識されている。
このラテックス粒子の直径は0.8〜6.4ミクロンである
ことができ、好ましくは２〜2.4ミクロンである。ラテ
ックス粒子は任意の好適な材料を含んでいることができ
るが、ポリビニルトルエンが好ましい。非磁化性または
磁化性のラテックスを用いることができる。結合対は、
任意の好都合な手段、例えば溶液からの受動的吸収、に
よって粒子に結合させることができ、次いで洗浄し、残
っている反応性部位を通常の手段、例えばアルブミンな
どの不活性タンパク質でブロックする。この検出系は、
好ましくは結合対への予備結合によって粒子に結合され
る。
標的抗体の結合対は、様々な形態をとることができ、
例えば、抗グロブリン抗体またはそのフラグメント、プ
ロテインＡまたはプロテインＧを含んでなることができ
る。検出される抗体がヒトの抗体である場合、二次抗−
ヒト抗体は、ウサギ、ヤギまたはヒツジなどの種におい
てポリクローナル的に産生させることができ、または好
適なモノクローナル抗体は齧歯類から誘導することもで
きる。
インディケーター粒子は、好ましくは、酵素、例えば
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはグル
コースオキシダーゼ；蛍光標識、例えばフルオレセイン
またはフィコエリスリン；放射能標識、例えば125I、ま
たは発光分子、例えばルミノールのような例えば任意の
客観検出が可能な手段で標識されることが好ましい。用
いる標識、特に酵素標識は、使用する抗原調製物の種類
に合わせて適切に選択し、抗原調製物中の内因性酵素に
よって生じる擬似的な結果を避ける必要がある。従っ
て、赤血球はペルオキシダーゼを含んでいるため、全赤
血球を固定して用いる場合は、検出用標識にペルオキシ
ダーゼを用いるべきではなく、アルカリホスファターゼ
が好適な代替酵素になる。いずれも、固定したゴースト
を用いたスクリーニングに好ましく用いることができ
る。更に、全赤血球をスクリーニングする場合には、選
択された酵素は、便宜的に細胞の赤色と区別できる検出
用着色生成物を生成するものであることができる。しか
し、ゴーストを用いる場合には適用されない。
臨床試験に関する限りでは酵素を検出用標識に用いる
利点があるが、これは抗体のスクリーニングを臨床検査
室で日常的に行っている他の標準的なELISA法に組み込
むことができるからである。更に、マイクロプレートを
用いて行う完全なスクリーニング技術は、利用可能な方
法および装置を用い、更に特別な道具および熟練者の技
術に負うことなく、容易に自動化に適用できる。酵素標
識を用いることにより、反応を簡単な分光光度測定で客
観的に評価できるようになる。
通常の試験では、本発明の方法に用いる反応物をキッ
トの形態で供給することができる。
従って、本発明のもう一つの態様では、血清または血
漿試料中における細胞表面抗原に特異的な標的抗体の存
在または量を検出または検定する固相での検出または検
定用のキットであって、 ａ）固体支持体に固定した前記抗体に対する抗原を与え
る少なくとも一種類の細胞膜調製物、 ｂ）ラテックス粒子に結合した前記標的抗体の結合対を
含んでなる検出可能に標識したインディケーター試薬を
含んでなるキットが提供される。
また、このようなキットには、適切な緩衝液および酵
素基質、更に陽性および陰性両方のコントロール血清を
含むことができる。
本発明を、次に実施例によって説明するが、これらの
実施例は発明を制限するものではない。
実施例１ ヒト赤血球に対する未知の血液型特異抗体の検出用免疫
検定法 ａ）固定した赤血球の調製 Agaricus bisporusレクチン（Sigma L−5640）の溶液
を、1mM NaClを含む20mMリン酸緩衝液pH7.0で10μg/ml
の濃度で調製した。75μｌずつをポリスチレン製のＵ型
ウェルマイクロプレート（Sterilin 611U96）のウェル
に加えた。プレートを室温（18〜25℃）で１時間インキ
ュベーションした。次にプレートを、0.055％w/v Twee
n 20を含む10mMリン酸で緩衝した0.15M食塩水（pH7.
2）（PBS/Tween）で３回洗浄した。
赤血球（検出しようとする抗体に対する抗原を網羅す
るように選択したもの）を、PBSで３回洗浄し、最後にP
BS中に0.5％の濃度に懸濁し、プレートに加えた。マイ
クロプレートを230gで１分間遠心するか、または赤血球
を１時間沈降させた。次に、マイクロプレートをPBS/Tw
eenで３回洗浄し、ウェル周辺の赤血球単層を残して、
過剰な赤血球を除去した。細胞単層の集結度は、この時
点で顕微鏡によって観察することができる。穴や裂け目
のない、均一な細胞の単層が見える。
検定にゴースト単層が必要ならば、次にpH7.6の5mMリ
ン酸緩衝液を加えて赤血球を溶解させることができる。
ウェルにこの緩衝液を入れてマイクロプレートを室温で
１分間インキュベーションした後、ウェルを同じ緩衝液
で２回洗浄した。
保存には、1Mキシリトール75μｌを0.15NaClに溶解し
たものをウェルに加え、マイクロプレートを室温で３分
間インキュベーションした。ウェルから液体を除去し、
プレートを室温で３時間かけて乾燥した。次に、このマ
イクロプレートを好適な気密、防湿、遮光性の袋にシリ
カゲル乾燥剤の袋と一緒に密閉し、４℃で保存した。
（ｂ）インディケーターの調製 ラテックス検出試薬は、アルカリホスファターゼ結合
抗ヒトIgGを直径２μｍのポリビニルトルエンラテック
ス粒子に受動的に付着させて調製した。このラテックス
は、10％懸濁液として供給された。ラテックス粒子を遠
心分離によってペレット状にした後、最初の５倍容量の
1mM NaClを含む20mMリン酸緩衝液（pH8.0）に再懸濁し
た。ラテックス粒子を再度ペレット状にした。最初の6/
10倍容量の、適当に希釈したアルカリホスファターゼ標
識した抗ヒトIgGを同じリン酸緩衝液に溶解したものを
ラテックスに加え、ラテックスをこの溶液に懸濁した。
混合物を室温（18〜25℃）で２時間インキュベーション
し、次にラテックスをペレット状にしてからPBSに４回
再懸濁した。最後に、ラテックスを10mMトリス緩衝化1m
M MgCl2、１％ウシ血清アルブミンおよび0.1％アジ化
ナトリウムを含む0.15M NaClに適当な濃度（通常1/15
0）に再懸濁した。この検出試薬を４℃で保存した。
ｃ）スクリーニング検定法 抗体についての血清／血漿試料のスクリーニングに系
を用いるため、保存したマイクロプレートを保存袋から
取り出した。50μl/ウェルのLISS（低イオン強度溶液、
0.24M グリシン、0.03M NaCl、0.003Mリン酸緩衝液pH
6.7）を、用いるウェルに加えた。次に、25μｌの試験
血清／血漿試料を加えた。マイクロプレートを37℃で15
分間インキュベーションした後、PBS/Tweenで３回洗浄
した。75μl/ウェルのラテックス検出試薬を加え、マイ
クロプレートを230gで１分間遠心し、続いて930gで２分
間遠心した。あるいはこのラテックスは、遠心せずに室
温（18〜25℃）で１時間インキュベーションすることも
できる。次にマイクロプレートをPBS/Tweenで４回洗浄
した。次に、75μl/ウェルの発色性の酵素基質を加え
た。アルカリホスファターゼに用いる基質溶液は、ｐ−
ニトロフェニルホスフェートの錠剤を0.1Mジエタノール
アミン緩衝液pH9.8に溶解して調製した。マイクロプレ
ートを室温に15分間（18〜25℃）に保持した後、ウェル
の吸光度を405nmでプレート透過分光光度計で読み取っ
た。プレートの読み取りを直ちに行えない場合には、50
μl/ウェルの3M NaOHを加えて反応を中止させた。プレ
ートを暗所に４℃で保存すれば、２日以内ならば結果は
随時読み取れる。試料について記録した吸収値を、平行
して陽性および陰性のコントロール血清から得られた結
果と比較した。記録された吸収値が陰性コントロールの
それを有意に上回る場合は、試料中に抗体が存在するこ
とを示している。
調製したマイクロプレート、インディケーター試薬、
LISS溶液およびアルカリホスファターゼ基質の錠剤およ
び緩衝溶液は、キットの成分を形成することができる。
実施例２ ラテックス結合抗グロブリン試薬および水性酵素結合抗
グロブリン試薬を検出系としての使用した場合の比較 第１図は、前記の方法を用い、R1r（Rh（Ｄ）抗原陽
性）およびrr（Rh（Ｄ）抗原陰性）赤血球に対し、弱い
抗Rh（Ｄ）血清を一連の希釈率で得た結果を示す。抗原
陽性赤血球と抗原陰性赤血球では、記録されたシグナル
に明らかな差が見られる。抗Rh（Ｄ）は、1IU/mlの抗−
Ｄを含んでいた。第２図は、同じアルカリホスファター
ゼを結合したがラテックスへのカップリングを行わない
抗ヒトIgG試薬を用いた場合に得られた結果を示す。抗
原陽性赤血球と抗原陰性赤血球で記録されたシグナルに
差はない。これらの結果は、本検出系でラテックスを使
用する必要性を示したものである。
実施例３ レクチン、ポリ−Ｌ−リジンおよびアルシアンイエロー
の、赤血球のプラスティックマイクロプレートへの結合
に関する比較 ポリスチレンおよびポリ塩化ビニルの異なる部分を、
最適な濃度のAgaricus bisporusレクチン、ポリ−Ｌ−
リジンまたはアルシアンイエローでコーティングした。
（事前に実験を行い、これらの物質の各々の最適なコー
ティング濃度を定めた）。表現型R1R1（Rh（Ｄ）抗原陽
性）およびrr（Rh（Ｄ）抗原陰性）を、前記のようにウ
ェル上にコーティングした。ウェルを顕微鏡を用いて赤
血球の単層の集結について調べた。前記と同様に一連の
希釈率の弱い抗−Ｄを、検出系としてラテックス結合さ
せたペルオキシダーゼ結合抗グロブリンを使って前記の
方法に従って用いた。
結果は、両方の型のマイクロプレート上で、レクチン
およびポリ−Ｌ−リジンが穴のない完全な赤血球単層を
生じたことを示した。アルシアンイエローでコーティン
グしたしたウェルには、数個の穴が見られた。記録され
た吸光度を、抗−Ｄの1/64（限界希釈）で下記に示す。
この結果は、レクチンが全体として最良の性能を与え
ることを示している。ポリ−Ｌ−リジンは、PVCプレー
ト上で生ずるバックグラウンドが高く、２回測定を行っ
ても通常その性能は一定していない。アルシアンイエロ
ーは、レクチンよりも低い結果を示しており、これは検
定中にゴースト単層が幾らか失われたためと推察され
る。
実施例４ キシリトール、グルコースおよび食塩水の、固定赤血球
膜乾燥用保存溶液としての比較 1Mキシリトールおよびグルコースを0.15M NaClに溶
解したものおよびNaClのみを前記における乾燥保存溶液
として比較した。（これらのモル濃度は、予め最適であ
ることが示されていた）。抗原陽性細胞および抗原陰性
細胞を、抗−Rh（Ｄ）、抗−Fya、抗−Ｋ、抗−Ｓ、抗
−Jkaを含む血清の評価用に選択した。各血清をそのま
までおよび限界希釈で、２週間後乾燥した様々な溶液中
に入れた細胞に対して、および乾燥しなかったが全血を
保存しておき新たに固定した同種の細胞に対して試験し
た。結果（下記）は、グルコースおよびキシリトールの
両方とも、試験した赤血球抗原の好適な乾燥保存料であ
ることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/548 G01N 33/53

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血清または血漿試料中の、細胞表面抗原に
    特異的な標的抗体の存在または量を検出または検定する
    固相法であって、 ここで該方法は、前記試料を、前記抗原を担持する固定
    化細胞調製体と接触させ、それに結合した抗体をインデ
    ィケーターにより検出または検定する方法であり、前記
    インディケーターが、標識されたラテックス粒子に結合
    された、前記抗体に対する結合対からなるものである、
    方法。
  2. 【請求項２】ラテックス粒子がポリビニルトルエンを含
    んでなるものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】粒子の直径が0.8〜6.4ミクロンである、請
    求の範囲第１項または２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記ラテックス粒子の標識が酵素である、
    請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】細胞が血液細胞である、請求の範囲第１〜
    ４項のいずれか一項に記載の方法。
  6. 【請求項６】細胞が赤血球または赤血球ゴーストであ
    る、請求の範囲第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】細胞が赤血球ゴーストである、請求の範囲
    第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞がレクチンによって表面上に固定され
    ている、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】レクチンがガラクトシル残基に特異性を有
    するものである、請求の範囲第８項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】レクチンが、Agaricus bisporus、Agari
    cus campestris、またはBauhinia purpureaレクチンを
    含んでなるものである、請求の範囲第９項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】固定されたゴーストが糖アルコールの存
    在下にて乾燥されたものである、請求の範囲第７項に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】糖アルコールがキシリトールである、請
    求の範囲第11項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】血清または血漿試料中における細胞表面
    抗原に特異的な標的抗体の存在または量を検出または検
    定する固相法用のキットであって、 ａ）固体支持体に固定した前記抗体に対する抗原を与え
    る少なくとも一種類の細胞膜調製物、 ｂ）ラテックス粒子に結合した前記標的抗体の結合対を
    含んでなる検出可能に標識したインディケーター試薬を
    含んでなるキット。
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