JPH09234055A - ボツリオコッカス属に属する新規な微細藻類及びその培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 炭素数３３の炭化水素を産生する能力を有す
るボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースに属する新
規な微細藻類の株及びその効率的な培養方法を提供す
る。 【解決手段】 本発明のボツリオコッカス・ブラウニー
Ａレース株は、ボツリオコッカス属に属する微細藻類
の新規株であり、本株の藻体により産生される炭化水素
は炭素数３３の炭化水素を含有する。また、前記ボツリ
オコッカス・ブラウニー Ａレースに属する新規な微細
藻類の株を、人工光を間欠的に、好ましくは１日１回、
１回あたり５〜１５時間の割合で、照射しながら培養す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なボツリオコ
ッカス属に属する微細藻類及びその培養方法に関し、詳
しくは炭素数３３の炭化水素を産生する能力を有する新
規なボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株及びそ
の効率的な培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ＣＯ₂による地球温暖化が問題と
なっている中で、光エネルギーによりＣＯ₂を固定化し
炭化水素に変換する能力を有する微細藻類の利用に対す
る期待が高まっている。この様に光エネルギーを用いて
ＣＯ₂を固定化し炭化水素を産生する微細藻類のうちで
も、ボツリオコッカス属に属する微細藻類は特に、炭化
水素を産生する能力に優れ、藻体全量に対する炭化水素
の含有量も乾燥重量の２０〜４０％と際だって高く、ボ
ツリオコッカス属に属する微細藻類の培養藻体から炭化
水素を取り出してこれを有効利用する様々な研究が既に
行われている。

【０００３】ここで、上記ボツリオコッカス属に属する
微細藻類のうちでもボツリオコッカス・ブラウニー Ａ
レースに属する微細藻類は、藻体が産生する炭化水素中
に直鎖のアルカジエン、アルカトリエンを多く含有する
という特徴を有するが、ボツリオコッカス・ブラウニー
Ａレースに属する微細藻類においても、株の違いによ
り、産生される炭化水素の種類や、産生される総炭化水
素中の個々の炭化水素の含有量は様々である。現在知ら
れているボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースに属
する微細藻類では何れの株であっても、藻体が産生する
炭化水素は全て炭素数が３２以下の炭化水素であること
が知られている。

【０００４】一方、炭素数３３の炭化水素、特に炭素数
３３の直鎖アルカジエン、アルカトリエンは、燃料とし
ての利用の他に、農薬、医薬、食品添加物、生理活性物
質などの原料として有効に利用できる炭化水素として注
目されており、直鎖のアルカジエン、アルカトリエンを
多く産生するボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース
に属する微細藻類を用いての炭素数３３の炭化水素の生
産が期待されているが、上述の通り、これまでに炭素数
３３の炭化水素を産生するボツリオコッカス・ブラウニ
ー Ａレースに属する微細藻類の株は知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、炭素数３３の炭化水素を産生す
る能力を有するボツリオコッカス・ブラウニー Ａレー
スに属する新規な微細藻類の株及びその効率的な培養方
法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、藻体が産生する
炭化水素が炭素数３３の炭化水素を含有するボツリオコ
ッカス・ブラウニーＡレースに属する微細藻類の新規株
を見出し、また、この様なボツリオコッカス・ブラウニ
ー Ａレースに属する微細藻類の新規株を人工光を間欠
的に照射しながら培養することで培養効率が上がること
を見出し、本発明を完成させた。

【０００７】すなわち本発明は、藻体が産生する炭化水
素が炭素数３３の炭化水素を含有するボツリオコッカス
・ブラウニー Ａレースに属する微細藻類の新規株を提
供する。

【０００８】また本発明は、本発明のボツリオコッカス
・ブラウニー Ａレースに属する微細藻類の新規株にお
いて、前記炭素数３３の炭化水素が直鎖炭化水素である
ボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株、並びに、
これらの新規株においてさらに、炭素数３３の炭化水素
がアルカジエン及び／又はアルカトリエンを含有するボ
ツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株を提供する。

【０００９】さらに本発明は、この様なボツリオコッカ
ス・ブラウニー Ａレースに属する微細藻類の新規株の
具体的な株として、ボツリオコッカス・ブラウニー Ｓ
Ｉ−３０株を提供する。

【００１０】本発明はまた、人工光を間欠的に照射しな
がら培養することを特徴とする上記ボツリオコッカス・
ブラウニー Ａレースに属する微細藻類の新規株の培養
方法を提供する。

【００１１】本発明の培養方法において、人工光を間欠
的に照射する具体的な方法として、１日１回の光照射
を、１回あたりの照射時間が好ましくは５〜１５時間程
度、より好ましくは７〜１３時間程度となるように行う
方法を挙げることができる。照射する人工光に関するそ
の他の条件、あるいは、光照射以外の培養条件、例え
ば、培地、通気、温度等については、概ね従来のボツリ
オコッカス・ブラウニーＡレースに属する微細藻類と同
様にすればよい。なお、培養をＣＯ₂添加空気を通気し
ながら行う場合には、これまでに知られるボツリオコッ
カス・ブラウニーＡレースに属する微細藻類の増殖がＣ
Ｏ₂濃度に影響され易いのに比べ、本発明の新規なボツ
リオコッカス属に属する微細藻類の培養では、ＣＯ₂濃
度にあまり影響を受けないことから、培養の通気の管理
は比較的容易である。

【００１２】この様な本発明の培養方法によれば、本発
明の新規なボツリオコッカス属に属する微細藻類の培養
を効率よく行うことが可能である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。 （１）ボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースに属す
る微細藻類の新規株 本発明の、藻体が産生する炭化水素が炭素数３３の炭化
水素を含有するボツリオコッカス・ブラウニー（Botryo
coccus braunii） Ａレースに属する微細藻類の新規株
は、湖水等から採取されたボツリオコッカス属に属する
微細藻類（以下、「ボツリオコッカス属藻類」という）
を含有するサンプルから以下の方法を用いて分離するこ
とが可能である。

【００１４】上記ボツリオコッカス属藻類を含有するサ
ンプルは、例えば、淡水湖（池、沼等を含む）、汽水湖
等の湖水表面から、プランクトンネット（網目：１μｍ
〜１０００μｍ程度、好ましくは１０μｍ〜２００μｍ
程度）等を用いてプランクトンネットが沈まない様に引
くことで採取できるが、ボツリオコッカス属藻類を含有
するサンプルであれば特に制限されるものではない。

【００１５】この様にして採取されたサンプルから本発
明のボツリオコッカス・ブラウニーＡレースの新規株を
分離するためにはまず、上記サンプルに有効塩素を作用
させ、ボツリオコッカス属藻類以外の微生物を殺菌す
る。この時、処理されるサンプルは、有効塩素処理及び
その後の処理をしやすくするために、予め適当な培地で
培養して藻体量を増やしておいてもよい。培地として
は、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地など無機培地が
挙げられるが、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した
ものであれば、特に制限されない。また、有効塩素で処
理するのはサンプルまたは培養液そのものでもよく、更
に、サンプルまたは培養液から遠心分離、濾過等により
得た藻体又は濃縮液でもよい。

【００１６】上記ボツリオコッカス属藻類を含むサンプ
ルに有効塩素を作用させるには、例えば、次亜塩素酸水
溶液、または次亜塩素酸ナトリウムもしくは次亜塩素酸
カルシウム等の次亜塩素酸塩の水溶液（以下、単に「次
亜塩素酸」という）に前記試料を懸濁させる方法が挙げ
られる。サンプルの処理に用いる次亜塩素酸の濃度は、
通常、有効塩素の濃度として０．０１〜１０００ｐｐ
ｍ、好ましくは０．１〜１００ｐｐｍであり、また、処
理時間は０．１〜１０００分、好ましくは１〜１００分
である。この濃度が０．０１ｐｐｍよりも低いとあるい
は処理時間が０．１分より短いと雑菌が十分に殺菌され
ないことがある。また、濃度が１０００ｐｐｍを越える
とあるいは処理時間が１０００分より長いとボツリオコ
ッカス属藻類自体が死滅することがある。

【００１７】また、上記サンプルの培養液を次亜塩素酸
で処理する場合には、次亜塩素酸を上記濃度となるよう
に加えればよく、また、藻体を次亜塩素酸で処理する場
合には、上記濃度となるように希釈した次亜塩素酸水溶
液あるいは培養液で希釈した次亜塩素酸に藻体を懸濁さ
せればよい。

【００１８】上記のようにしてサンプルを次亜塩素酸で
処理した後に、これをそのまま用いてもよいが、藻体を
濾過又は遠心分離等により分離し、培養液又は緩衝液に
懸濁する操作を繰り返すことなどによって洗浄し、ある
いはチオ硫酸ナトリウム等を加えること等により有効塩
素を除去することが好ましい。加えるチオ硫酸ナトリウ
ムの量は、加えた次亜塩素酸から生じる有効塩素の全量
を除去するのに必要な量であることが好ましい。

【００１９】続いて、上記次亜塩素酸処理を行ったサン
プルを、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した平板培
地、例えば、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ改変培地な
どの無機培地、またはこれら無機培地に有機炭素源とし
てグルコース、マンノース、フルクトース等の糖類やク
エン酸、酢酸等の有機酸などを加えた培地に、塗布して
培養を行う。ここで用いる培地には、ボツリオコッカス
属藻類の生育に影響を与えない抗生物質等を添加しても
よい。また、平板培地に塗布する際に、塗布量が多すぎ
ると、平板培地に生じるコロニーが近接し、コロニーを
分離しにくくなるので、数段階で希釈したものを塗布す
るとよい。

【００２０】培養は、蛍光灯等を用いて光照射下で行う
ことが好ましいが、照射照度が高すぎるとかえって増殖
が阻害される場合があるので、通常０〜３００μＥ／ｍ
²・ｓ、好ましくは５〜１００μＥ／ｍ²・ｓで照射する
のがよい。また、培養温度としては、通常０〜８０℃、
好ましくは１５〜３５℃がよい。

【００２１】培養は、通常１〜６０日、好ましくは１〜
３０日行う。培養中に生じるコロニーが、残存する雑菌
のコロニーであるか、あるいは単一のボツリオコッカス
属藻類のコロニーであるかを判明するにはある程度の培
養期間が必要であり、培養期間が長すぎると雑菌が繁茂
するので、上記期間内で培養するのが好ましいが、培地
や培養条件、雑菌の残存の程度等によっても異なるの
で、培養中にコロニーを観察し、適宜培養を打ち切れば
よい。

【００２２】上記のようにして平板培地上に生じたボツ
リオコッカス属藻類の単一コロニーを採取することによ
り、ボツリオコッカス属藻類の種々の純化株が得られ
る。平板培地からコロニーを分離する際には、顕微鏡、
好ましくは実体顕微鏡観察下で行うと、ボツリオコッカ
ス属藻類のコロニーであることを確認しながら採取でき
る点で好ましい。なお、ボツリオコッカス属藻類は、葉
緑体を細胞中に含む西洋梨型をした細胞が集合したコロ
ニーを形成する。また、コロニーを顕微鏡下観察を続け
ると油滴を生じる場合がある。

【００２３】コロニーの採取の方法は特に問わず、例え
ば滅菌した白金線でかき取り、あるいはパスツールピペ
ットで吸い上げればよい。この際、空中の雑菌による汚
染を防止するために、無菌室またはクリーベンチ内で操
作を行うとよい。

【００２４】上記のようにして分離した株を再び培養
し、雑菌が生育しないことを確認することによって、こ
れらが純化株であることを確認することができる。さら
に、得られた純化株が、ボツリオコッカス属藻類である
ことを顕微鏡観察等により確認しておくとよい。

【００２５】この様にして得られるボツリオコッカス属
藻類の純化株を分離して、それぞれの純化株について、
これらの純化株の藻体が産生する炭化水素の分析を以下
の方法で行い、藻体が産生する炭化水素中に炭素数３３
の炭化水素を含み、かつ産生炭化水素がボツリオコッカ
ス・ブラウニー Ａレースに属する株の分類学的な特徴
（産生炭化水素が主に炭素数２７、２９、３１の直鎖オ
レフィンである）を有する株をスクリーニングすること
により、本発明のボツリオコッカス属藻類の新規株が得
られる。

【００２６】ボツリオコッカス属藻類の藻体が産生する
炭化水素を分析する方法としては、従来から行われてい
る方法を用いればよく、例えば、ボツリオコッカス属藻
類を培養して藻体を増殖させ、得られる培養液から濾過
等で取り出した湿藻体を凍結乾燥または加温して乾燥し
た後、この藻体乾燥物をｎ−ヘキサン、メタノール−ク
ロロホルム（１：１）等の抽出溶媒に浸漬して炭化水素
を抽出させ（Phytochemistry,vol.19,1081-1085,198
0）、その後、藻体、溶出溶媒を除去し、抽出された炭
化水素についてＮＭＲ、ＩＲ、ガスクロマトグラフィー
やＧＣ−ＭＳ等で分析を行う方法をとればよい。

【００２７】この様にして藻体が産生する炭化水素中に
炭素数３３の炭化水素を含み、かつ産生炭化水素がボツ
リオコッカス・ブラウニー Ａレースに属する株の分類
学的な特徴を有する株をスクリーニングすることで、本
発明のボツリオコッカス属藻類の株が得られる。

【００２８】本発明のボツリオコッカス属藻類は、上述
の様に炭化水素産生能に関してボツリオコッカス・ブラ
ウニー Ａレースに属する株の分類学的な特徴を有し、
すなわち、本発明のボツリオコッカス属藻類はボツリオ
コッカス・ブラウニー Ａレースに属する株であって、
かつ藻体が産生する炭化水素中に炭素数３３の炭化水素
を含むという特徴を有する。本発明のボツリオコッカス
・ブラウニー Ａレース株の炭化水素産生能についての
上記特徴（藻体が産生する炭化水素中に炭素数３３の炭
化水素を含む）は、後述のように、これまでに見出され
た他のボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースの株に
は見られないものであり、本発明のボツリオコッカス・
ブラウニー Ａレース株は新規であると言える。

【００２９】なお、この様な藻体が産生する炭化水素が
炭素数３３の炭化水素を含有するボツリオコッカス・ブ
ラウニー Ａレース株のうちでも、炭素数３３の炭化水
素が直鎖炭化水素である株や、これらの株のうちでもさ
らに、炭素数３３の炭化水素がアルカジエン及び／又は
アルカトリエンを含有する株が、産生される炭化水素の
有用性の点から本発明においてはより好ましい。

【００３０】この様な本発明のボツリオコッカス・ブラ
ウニー Ａレース株の１例として後述の実施の形態で分
離されたボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株
が挙げられる。このボツリオコッカス・ブラウニー Ｓ
Ｉ−３０株は、本発明により初めて得られた新規株であ
り、この株の藻体が産生する炭化水素は、炭素数３３の
炭化水素を概ね２〜４５％含有し、これら炭素数３３の
炭化水素は全て直鎖アルカジエン又は直鎖アルカトリエ
ンであり、本発明において好ましい株と言える。

【００３１】また、本株の工業技術院生命工学工業技術
研究所への寄託は拒否されたが、本発明の成立の確認の
ために本株を分譲することは、ここに保証されるもので
ある。

【００３２】（２）本発明のボツリオコッカス・ブラウ
ニー Ａレースに属する微細藻類新規株の培養方法 本発明のボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースに属
する微細藻類の新規株の培養方法は、藻体の増殖を効率
よく行うために、人工光を間欠的に照射しながら培養す
ることを特徴とする。

【００３３】本発明の培養方法においては、培養中、人
工光が間欠的、具体的には、１日１回、１回あたり好ま
しくは５〜１５時間程度、より好ましくは７〜１３時間
程度の割合で照射される。人工光の光源としては、通
常、ボツリオコッカス属藻類を培養する際に用いる光
源、例えば、白熱灯、蛍光灯等を用いればよい。照射照
度についても、一般にボツリオコッカス属藻類を培養す
る際と同様でよく、具体的には、２０〜８００μＥ／ｍ
²・ｓ程度、好ましくは４０〜５００μＥ／ｍ²・ｓ程度
の照射照度とするのがよい。

【００３４】本発明の培養方法は、上記の様にして人工
光を間欠的に照射しながら培養すること以外は、通常、
ボツリオコッカス属藻類を培養するのと概ね同様な方法
とすることができる。例えば、本発明の培養方法におい
ては、培地として、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ改変
培地などの無機培地、またはこれら無機培地に有機炭素
源としてグルコース、マンノース、フルクトース等の糖
類やクエン酸、酢酸等の有機酸などを加えた培地等、通
常、ボツリオコッカス属藻類を培養する際と同様の培地
を用いることができる。また、培養温度についても同様
に、通常０〜８０℃、好ましくは１５〜３５℃程度であ
る。培養の方法としては、静置培養、振盪培養等の通常
の方法が挙げられる。

【００３５】本発明の培養方法において、培地に通気を
行う場合には、ＣＯ₂濃度が０．５〜２０％程度のＣＯ₂
添加空気を通気量０．０１〜１ｖｖｍ程度に流し込むこ
とが好ましい。さらに、本発明の培養方法において上記
人工光照射を行わない時間には、通気をしてもよいが、
通気を行わないことが好ましい。

【００３６】なお、これまでに知られるボツリオコッカ
ス・ブラウニー Ａレースに属する微細藻類の培養にお
いては、通気の際のＣＯ₂濃度を上記の範囲０．５〜２
０％とすると、高濃度域では藻体の増殖量が減少する傾
向にあるのに比べ、本発明の新規なボツリオコッカス属
に属する微細藻類の培養では、藻体の増殖量はＣＯ₂濃
度にあまり影響を受けないことが後述の実施例で確認さ
れた。これは、本発明のボツリオコッカス・ブラウニー
Ａレース株が新規であることを裏付けるものであり、
この特徴により本発明の新規なボツリオコッカス属に属
する微細藻類の培養の際の通気の管理は、従来の株に比
べて容易であるといえる。

【００３７】

【実施例】以下に、本発明の実施例をボツリオコッカス
・ブラウニー ＳＩ−３０株を例にして説明する。

【００３８】

【実施例１】 ボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−
３０株の取得 （１）湖水のサンプリング 網目が２５μｍの北原式プランクトンネット用いて、満
濃池（香川県）の湖水表面のプランクトン類を採集し
た。得られた試料を顕微鏡で観察したところ、ボツリオ
コッカス属藻類に特徴的な形態をしたコロニー（顕微鏡
下、１０〜３０分経過するとコロニーから油滴が分泌）
が認められた。

【００３９】（２）ボツリオコッカス・ブラウニー Ｓ
Ｉ−３０株の分離 上記湖水サンプルを４本の試験管に分け、それぞれに有
効塩素濃度が１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、２０ｐ
ｐｍになるように次亜塩素酸ナトリウムを加え、１０分
間、室温で静置した。静置後、有効塩素を除去するため
にチオ硫酸ナトリウムを有効塩素１ｍｇあたり７．１６
ｍｇとなるように加えた。

【００４０】上記処理液を、グルコース０．１％、寒天
１．５％を含むＪＭ培地の平板培地に塗布し、蛍光灯を
光源として約１５μＥ／ｍ²・ｓになるように照射し、
２５℃にて１週間培養した。尚、ＪＭ培地の組成は以下
のとおりである。

【００４１】〔ＪＭ培地の組成〕下記表１中１〜９のス
トック溶液１ｍＬずつを混合し、蒸留水又は脱イオン水
を用いて１Ｌとし、ｐＨを７付近に調整する。

【００４２】

【表１】

【００４３】培養後、クリーンベンチ内で実体顕微鏡
（倍率２０倍）を用いてコロニー形状等のボツリオコッ
カス属藻類特有の性質を観察しながらボツリオコッカス
属藻類の単一コロニーを白金線でかき取り、グルコース
０．１％、寒天１．５％を含むＪＭ平板培地に移植し
た。これを、蛍光灯による約１５μＥ／ｍ²・ｓの光照
射下で、２５℃で４週間培養した。

【００４４】上記で得られたボツリオコッカス属藻類の
藻体を白金線を用いてかき取り、ＪＭ培地の液体培地に
移し、光照射下でさらに２週間培養した。白金耳で培養
液の一部をとり、普通寒天培地（１Ｌ中に、肉エキス：
５ｇ、ペプトン：１０ｇ、塩化ナトリウム：５ｇ、寒
天：１５ｇを含む；ｐＨ７．０）の平板培地に塗布し、
２５℃で７日間培養し、雑菌が生育しないことを確認し
た。また、こうして得られた純化株を顕微鏡観察し、ボ
ツリオコッカス・ブラウニーのみであることを、コロニ
ー形状等の本藻類特有の性質（葉緑体を細胞中に含む西
洋梨型をした細胞が集合してコロニーを形成している。
更に、コロニーを顕微鏡下観察を続けると油滴を生じ
る。）により確認した。

【００４５】ここで、この様にして得られた純化株をボ
ツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株とした。な
お、湖水サンプルをそのまま平板（ＪＭ培地及びグルコ
ースを含むＪＭ培地）に塗布し培養したが、ボツリオコ
ッカスのみのコロニーは得られなかった。

【００４６】（３）ボツリオコッカス・ブラウニー Ｓ
Ｉ−３０株の同定 次に、上記で得られたボツリオコッカス・ブラウニー
ＳＩ−３０株をグルコースを含むＪＭ培地に接種し、植
え継ぎを繰り返しながら５日間培養した。この平板培養
で得られた藻体を、表２に組成を示すＣＨＵ−１３×２
培地（ｐＨ７）を０．３Ｌ入れた偏平フラスコに接種
し、８日間の液体培養（培養条件；照度：３５０μＥ／
ｓ・ｍ²、通気量：０．５ｖｖｍ（５％ＣＯ₂）、温度２
５℃）を行った。

【００４７】

【表２】

【００４８】

【表３】

【００４９】上記液体培養により得られた培養液から濾
紙を用いて藻体を回収し、この藻体を１０５℃で乾燥し
た。この乾燥藻体について、５０倍量のｎ−ヘキサンを
用いて炭化水素の抽出を３回行った。ｎ−ヘキサン相を
濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで炭化水
素を精製した。ｎ−ヘキサン溶出された炭化水素画分を
濃縮し、これをＮＭＲ、ＩＲ、ＧＣ−ＭＳを用いて分析
した。

【００５０】ＮＭＲ分析では、不飽和プロトン由来のピ
ークが４．８〜６．２ｐｐｍに、飽和プロトン由来のピ
ークが０．７〜２．４ｐｐｍに観察された。飽和プロト
ンと不飽和プロトンの比はほぼ１０：１であった。ＩＲ
では、３０８０ｃｍ^-1、１６５０ｃｍ^-1に二重結合由来
の吸収が、２９５０ｃｍ^-1、２８５０ｃｍ^-1にＣＨ結合
由来の吸収がそれぞれ認められた。その他、ＣＨ結合、
ＣＣ結合以外の吸収が認められないことから炭化水素と
確認された。

【００５１】また、ＧＣ−ＭＳ分析より、４０４、４３
２、４５８、４６０の親ピークが観察され、これらのピ
ークはそれぞれ炭素数２９のアルカジエン（Ｃ2
₉Ｈ₅₆）、３１のアルカジエン（Ｃ₃₁Ｈ₆₀）、３３のア
ルカトリエン（Ｃ₃₃Ｈ₆₂）、３３のアルカジエン（Ｃ₃₃
Ｈ₆₄）を表すピークと判定された。

【００５２】さらにＮＭＲ分析では、メチル基由来のピ
ークが０．７８〜１ｐｐｍに、メチレン基由来のピーク
が１．０５〜１．６ｐｐｍに、二重結合に隣接する炭素
のプロトン由来のピークが１．８２〜２．２ｐｐｍに、
不飽和炭素に結合するプロトンに由来するピークが４．
７〜６．１ｐｐｍにそれぞれ観察され、メチル基由来の
ピーク、メチレン基由来のピーク、二重結合に隣接する
炭素のプロトン由来のピーク及び不飽和炭素に結合する
プロトン由来のピークの４種のピーク面積の比は、３：
５：４４：６であった。また、ＧＣ−ＭＳ分析によって
得られた分子量測定結果から計算するとメチル基の存在
は１種であることが確認された。よって、これらの炭化
水素を、末端に二重結合を有する直鎖の炭化水素である
と同定した。

【００５３】この様な分析の結果、ボツリオコッカス・
ブラウニー ＳＩ−３０株の産生する上記炭化水素につ
いて、ボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースに属す
る微細藻類の産生する炭化水素の有する特徴的な性質が
確認され、これよりボツリオコッカス・ブラウニー Ｓ
Ｉ−３０株をボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース
と同定した。

【００５４】

【実施例２】上記実施例１で得られたボツリオコッカス
・ブラウニー ＳＩ−３０株をグルコースを含むＪＭ培
地に接種し、植え継ぎを繰り返しながら５日間培養し
た。この平板培養で得られた藻体を、偏平フラスコに入
れた０．３ＬのＣＨＵ−１３×２培地（ｐＨ７）に接種
し、８日間の液体培養（培養条件；照度：３５０μＥ／
ｓ・ｍ²、通気量：０．５ｖｖｍ（５％ＣＯ₂）、温度２
５℃）を行った。得られた培養液からその５ｍｌを取出
し濾紙を用いて藻体を回収し、これを１０５℃で乾燥し
た。次いで、この乾燥藻体に内部標準として、ｎ−ペン
タコサンをヘキサンに１ｇ／Ｌの割合で溶解した溶液１
ｍｌを加えた後、ｎ−ヘキサンで３回抽出した。得られ
たｎ−ヘキサン相を濃縮後、ガスクロマトグラフィーで
分析した。ガスクロマトグラフィーのカラムにはフェニ
ルメチルシリコン系キャピラリーカラム（２５ｍ）を用
いた。ガスクロマトグラフィー分析により、上述の液体
培養でボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株が
産生した炭化水素の組成を確認した。

【００５５】また、比較のために上記実施例２において
用いたボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株の
平板培養で得られた藻体の替わりに、ボツリオコッカス
・ブラウニー ＣＣＡＰ８０７／２純化株（比較例１）
を用いた以外は上記実施例１と全く同様にして、また
は、ボツリオコッカス・ブラウニー Ａｕｓｔｉｎ純化
株（比較例２）を用いた以外は上記実施例１と全く同様
にして、それぞれ液体培養を行い、得られた藻体からそ
れぞれの株が産生した炭化水素を抽出し、この炭化水素
の組成を上記実施例２と同様の方法（ガスクロマトグラ
フィー分析）で確認した。

【００５６】結果を、他の実施例の結果、及び従来より
知られているボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース
株の産生する炭化水素の組成と共に、後記表４に示す。

【００５７】

【実施例３】上記実施例２と同様にして植え継ぎ培養さ
れたボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−３０株の藻体
を、偏平フラスコに入れた０．３ＬのＣＨＵ−１３×２
培地（ｐＨ７）に接種し、５日間の液体培養（培養条
件；照度：３５０μＥ／ｓ・ｍ²、通気量：０．５ｖｖ
ｍ（５％ＣＯ₂）、温度２５℃）を行った。この培養に
より得られた藻体を上記実施例２と同様に処理して、こ
の液体培養でボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３
０が産生した炭化水素を抽出し、得られた炭化水素の組
成を上記実施例２と同様の方法（ガスクロマトグラフィ
ー分析）で確認した。結果を表４に示す。

【００５８】

【実施例４】上記実施例２と同様にして植え継ぎ培養さ
れたボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−３０株の藻体
を、アクリル製の培養装置に入れた１０ＬのＣＨＵ−１
３×２培地（ｐＨ７）に接種し、１０日間の液体培養
（培養条件；照度：３５０μＥ／ｓ・ｍ²、通気量：
０．５ｖｖｍ（５％ＣＯ₂）、温度２５℃）を行った。
この培養により得られた藻体を上記実施例２と同様に処
理して、この液体培養でボツリオコッカス・ブラウニー
ＳＩ−３０が産生した炭化水素を抽出し、得られた炭
化水素の組成を上記実施例２と同様の方法（ガスクロマ
トグラフィー分析）で確認した。結果を表４に示す。

【００５９】

【実施例５】上記実施例２と同様にして植え継ぎ培養さ
れたボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−３０株の藻体
を、グルコースを含むＪＭ培地に接種し、４９日間の静
置培養（培養条件；照度：３０μＥ／ｓ・ｍ²、温度２
５℃）を行った。この培養により得られた藻体を白金耳
で掻き取り５ｍｌの無菌水に希釈後、これを上記実施例
２で培養液から取り出されたその５ｍｌと同様に処理し
て、この静置培養でボツリオコッカス・ブラウニー Ｓ
Ｉ−３０が産生した炭化水素を抽出し、得られた炭化水
素の組成を上記実施例２と同様の方法（ガスクロマトグ
ラフィー分析）で確認した。結果を表４に示す。

【００６０】なお、表４は上記実施例２〜５の培養で本
発明のボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株に
より産生された炭化水素の組成についての分析結果及び
上記比較例１、２の培養で従来より知られているボツリ
オコッカス・ブラウニー Ａレース株により産生された
炭化水素の組成についての分析結果並びに従来より知ら
れているボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株の
産生する炭化水素分析値（文献値）を示す表である。

【００６１】

【表４】

【００６２】この結果から、これまでに見出された他の
ボツリオコッカス・ブラウニー Ａレースの株が表に示
す様に炭素数３３の炭化水素を全く産生しないのとは異
なり、本発明により得られた上記ボツリオコッカス・ブ
ラウニー ＳＩ−３０株の藻体により産生された炭化水
素は、炭素数３３の炭化水素を４．７〜３３．８重量％
含有することがわかる。また、上記各分析結果からボツ
リオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株の藻体により
産生されたこの炭素数３３の炭化水素は何れも直鎖アル
カジエン又は直鎖アルカトリエンであることがわかって
いる。

【００６３】この様なボツリオコッカス・ブラウニー
ＳＩ−３０株の産生する炭化水素についての特徴は、従
来より知られているボツリオコッカス・ブラウニー Ａ
レースの株には見られないものであり、ボツリオコッカ
ス・ブラウニー ＳＩ−３０株は、本発明により初めて
得られた新規株であると言える。

【００６４】

【実施例６】外部・内部反射型の撹拌型培養槽に３．０
ＬのＣＨＵ−１３×２培地（ｐＨ７）を加えて殺菌し
た。この培地に上記実施例２と同様にして植え継ぎ培養
されたボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株の
藻体を接種し、７日間の液体培養（培養条件；照度：外
部照度が１４０μＥ／ｓ・ｍ²、内部照度が３６０μＥ
／ｓ・ｍ²、通気量：０．５ｖｖｍ（５％ＣＯ₂）、温度
２５℃、撹拌速度：１００ｒｐｍ）を行った。この培養
によって得られた藻体の培養液中の藻体濃度を乾燥重量
法（培養液を３ｍｌ取り、濾過で藻体を集め、１０５℃
で１時間乾燥後、藻体の重量を測定し藻体の濃度を求め
る方法）により、培養期間中毎日測定して、得られた藻
体濃度からボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０
株藻体の１日あたりの増殖量を算出した。さらに、上記
培養において、ＣＯ₂濃度を１０％または１５％に替え
た以外は全く同様の培養を行い、上記と同様にして各培
養における１日あたりのボツリオコッカス・ブラウニー
ＳＩ−３０株藻体の増殖量を算出した。また、比較の
ために、ボツリオコッカス・ブラウニー ＣＣＡＰ８０
７／２純化株を用いて同様の培養試験を行った。結果を
表５に示す。

【００６５】

【表５】

【００６６】この結果から、これまでに知られるボツリ
オコッカス・ブラウニー Ａレースに属する微細藻類の
培養においては、通気の際のＣＯ₂濃度を１０％、１５
％と高濃度とすると藻体の増殖量が減少するが、本発明
の新規なボツリオコッカス属に属する微細藻類の培養で
は、藻体の増殖量はＣＯ₂濃度が５〜１５％の範囲で
は、ＣＯ₂濃度にあまり影響を受けないことがわかっ
た。これは、本発明のボツリオコッカス・ブラウニー
Ａレース株が新規であることによるものであり、この特
徴により本発明の新規なボツリオコッカス属に属する微
細藻類の培養の際の通気の管理は、従来の株に比べて容
易であるといえる。

【００６７】

【実施例７】次に、上記本発明の新規なボツリオコッカ
ス属に属する微細藻類に関する本発明の培養方法につい
ての実施例を説明する。

【００６８】扁平フラスコ（Ａ／Ｖ＝４１）に０．３Ｌ
のＣＨＵ−１３×２培地（ｐＨ７）を加えて殺菌した。
この培地に上記実施例２と同様にして植え継ぎ培養され
たボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株の藻体
を接種し、８日間の液体培養（培養条件；通気量：０．
５ｖｖｍ（５％ＣＯ₂）、温度２５℃）を行った。培養
中の光照射は、照度が３５０μＥ／ｓ・ｍ²の蛍光灯の
光を、１日に１回、１０時間照射して、残りの１４時間
は非照射という間欠照射を行った。なお、非照射の間の
み通気は停止した。また、比較のために上記培養におい
て光照射を、上記と同様の人工光、すなわち照度が３５
０μＥ／ｓ・ｍ²の蛍光灯の光を２４時間／日で連続照
射にした以外は全く上記と同様にしてボツリオコッカス
・ブラウニー ＳＩ−３０株の藻体を培養した。

【００６９】上記それぞれの培養条件下で培養して得ら
れた藻体の培養液中の藻体濃度を上記実施例６と同様の
乾燥重量法により培養期間中毎日測定して、得られた藻
体濃度から、それぞれの培養条件下におけるボツリオコ
ッカス・ブラウニー ＳＩ−３０株の１日あたりの増殖
量を算出した。

【００７０】さらに参考のために、ボツリオコッカス・
ブラウニー ＣＣＡＰ８０７／２純化株を用いて上記と
全く同様の培養試験を行った。結果を表６に示す。

【００７１】

【表６】

【００７２】この結果から明らかなように、本発明の培
養方法で本発明の新規ボツリオコッカス・ブラウニー
Ａレース株の藻体を培養すれば、前記藻体を効率よく増
殖させることが可能である。

【００７３】

【発明の効果】本発明の新規ボツリオコッカス・ブラウ
ニー Ａレース株は、本株の藻体により産生される炭化
水素が炭素数３３の炭化水素を含有するという、これま
でに知られるボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース
株には見られない特徴を持つ。従って、本発明のボツリ
オコッカス・ブラウニー Ａレース株を用いることで、
燃料としての利用の他に、農薬、医薬、食品添加物、生
理活性物質などの原料として有効に利用できる炭素数３
３の炭化水素や、さらに有用性の高い炭素数３３の直鎖
アルカジエン、アルカトリエンを生産することが可能と
なる。

【００７４】また、本発明の培養方法によれば、上記本
発明の新規ボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株
の藻体を効率よく増殖させることが可能である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 5/02 Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 藻体が産生する炭化水素が炭素数３３の
   炭化水素を含有するボツリオコッカス・ブラウニー Ａ
   レース株。
2. 【請求項２】 炭素数３３の炭化水素が直鎖炭化水素で
   ある請求項１記載のボツリオコッカス・ブラウニー Ａ
   レース株。
3. 【請求項３】 炭素数３３の炭化水素がアルカジエン及
   び／又はアルカトリエンを含有する請求項１又は２記載
   のボツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株。
4. 【請求項４】 ボツリオコッカス・ブラウニー ＳＩ−
   ３０株である請求項１〜３の何れか１項に記載のボツリ
   オコッカス・ブラウニー Ａレース株。
5. 【請求項５】 人工光を間欠的に照射しながら培養する
   ことを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のボ
   ツリオコッカス・ブラウニー Ａレース株の培養方法。
6. 【請求項６】 人工光の照射が１回あたり５〜１５時間
   である請求項５に記載の培養方法。