JPH099953A

JPH099953A - 新規なボツリオコッカス属に属する微細藻類

Info

Publication number: JPH099953A
Application number: JP16354095A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Murakami; 信雄村上
Original assignee: CHIKYU KANKYO SANGYO GIJUTSU KENKYU KIKO; Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: CHIKYU KANKYO SANGYO GIJUTSU KENKYU KIKO; Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 1997-01-14

Abstract

(57)【要約】【目的】炭素数３０〜３３程度の炭化水素からなり、
これら炭化水素の内でも炭素数が小さい炭化水素をより
効率的に産生するボツリオコッカス属に属する微細藻類
の新規な株を提供する。【構成】本発明のボツリオコッカス・ブラウニーＢ
レース株は、ボツリオコッカス属に属する微細藻類の新
規株であり、本株の藻体により産生される炭化水素は主
として炭素数３０、３１、３２及び３３の炭化水素から
なり、全炭化水素中に占める炭素数３０の炭化水素の割
合は５重量％以上である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なボツリオコッカ
ス属に属する微細藻類に関し、詳しくは炭素数３０の炭
化水素を多く含有する炭素数３０〜３３の炭化水素を効
率的に産生する新規なボツリオコッカス・ブラウニー
Ｂレース株に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ＣＯ₂による地球温暖化が問題と
なっている中で、光エネルギーによりＣＯ₂を固定化し
炭化水素に変換する能力を有する微細藻類の利用に対す
る期待が高まっている。この様に光エネルギーを用いて
ＣＯ₂を固定化し炭化水素を産生する微細藻類のうちで
も、ボツリオコッカス属に属する微細藻類は特に、炭化
水素を産生する能力に優れ、藻体全量に対する炭化水素
の含有量も乾燥重量の２０〜４０％と際だって高く、ボ
ツリオコッカス属に属する微細藻類の培養藻体から炭化
水素を取り出してこれを有効利用する様々な研究が既に
行われている。

【０００３】上記ボツリオコッカス属に属する微細藻類
のうちでもボツリオコッカス属Ｂレースに属する微細藻
類の藻体が産生する炭化水素は、総称してボツリオコッ
セン（Botryococcenes）と呼ばれる特徴的な炭化水素で
あり、ボツリオコッカス属Ｂレースに属する微細藻類の
株の違いにより、産生される炭化水素の種類や、産生さ
れる総炭化水素中の個々の炭化水素の含有量も様々であ
る。

【０００４】ここで、現在知られているボツリオコッカ
ス・ブラウニーＢレースに属する微細藻類では、産生
する炭化水素は炭素数が３４以上の炭化水素がその大部
分を占める株が多く、また、炭素数３４以上の炭化水素
を産生炭化水素中に含有しない株や含有しても極少量で
ある株も知られているが、これらの株では炭化水素が３
３あるいは３２の炭化水素が産生炭化水素中の主成分と
なっている。この様なボツリオコッカス・ブラウニー
Ｂレースに属する微細藻類が産生する炭化水素は、精製
された後、これをそのまま燃料として用いたり、あるい
は得られた炭化水素を水素添加等の還元反応により飽和
炭化水素として化粧料基剤等に用いたりすることが可能
であるが、上述の様に産生される炭化水素の炭素数が大
きいために精製に必要な蒸留等に多量なエネルギーが必
要であった。

【０００５】そこで、炭化水素を産生する能力に優れる
ボツリオコッカス・ブラウニーＢレースに属する微細
藻類において、精製等に要するエネルギーを省力化する
こと等を目的として、産生する炭化水素の炭素数が３０
〜３３程度の炭化水素からなり、これら炭化水素の内で
も炭素数の小さい炭化水素をより効率的に産生するボツ
リオコッカス属に属する微細藻類の新規な株が望まれて
いた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、炭素数３０〜３３程度の炭化水
素からなり、これら炭化水素の内でも炭素数が小さい炭
化水素をより効率的に産生するボツリオコッカス属に属
する微細藻類の新規な株を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、藻体が産生する
炭化水素が主として炭素数３０〜３３の炭化水素からな
り、前記炭化水素の総量に対する炭素数３０の炭化水素
の割合が５重量％以上であるボツリオコッカス属に属す
る微細藻類の新規株を見出し、本発明を完成させた。

【０００８】すなわち本発明は、藻体が産生する炭化水
素が主として炭素数３０、３１、３２及び３３の炭化水
素からなり、前記炭化水素の総量に対する炭素数３０の
炭化水素の割合が５重量％以上であるボツリオコッカス
・ブラウニーＢレースの新規株を提供する。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
の、藻体が産生する炭化水素が主として炭素数３０、３
１、３２及び３３の炭化水素からなり、前記炭化水素の
総量に対する炭素数３０の炭化水素の割合が５重量％以
上であるＢレースに属するボツリオコッカス・ブラウニ
ー（Botryococcus braunii）の新規株は、湖水等から採
取されたボツリオコッカス属に属する微細藻類（以下、
「ボツリオコッカス属藻類」という）を含有するサンプ
ルから以下の方法を用いて分離することが可能である。

【００１０】上記ボツリオコッカス属藻類を含有するサ
ンプルは、例えば、淡水湖（池、沼等を含む）、汽水湖
等の湖水表面から、プランクトンネット（網目：１０μ
ｍ〜２００μｍ程度）等を用いて採取することができる
が、ボツリオコッカス属藻類を含有するサンプルであれ
ば特に制限されるものではない。

【００１１】この様にして採取されたサンプルから本発
明のボツリオコッカス・ブラウニーＢレースの新規株を
分離するためにはまず、上記サンプルに有効塩素を作用
させ、ボツリオコッカス属藻類以外の微生物を殺菌す
る。この時、処理されるサンプルは、有効塩素処理及び
その後の処理をしやすくするために、予め適当な培地で
培養して藻体量を増やしておいてもよい。培地として
は、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地など無機培地が
挙げられるが、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した
ものであれば、特に制限されない。また、有効塩素で処
理するのはサンプルまたは培養液そのものでもよく、更
に、サンプルまたは培養液から遠心分離、濾過等により
得た藻体又は濃縮液でもよい。

【００１２】上記ボツリオコッカス属藻類を含むサンプ
ルに有効塩素を作用させるには、例えば、次亜塩素酸水
溶液、または次亜塩素酸ナトリウムもしくは次亜塩素酸
カルシウム等の次亜塩素酸塩の水溶液（以下、単に「次
亜塩素酸」という）に前記試料を懸濁させる方法が挙げ
られる。サンプルの処理に用いる次亜塩素酸の濃度は、
通常、有効塩素の濃度として０．０１〜１０００ｐｐ
ｍ、好ましくは０．１〜１００ｐｐｍであり、また、処
理時間は０．１〜１０００分、好ましくは１〜１００分
である。この濃度が０．０１ｐｐｍよりも低いとあるい
は処理時間が０．１分より短いと雑菌が十分に殺菌され
ないことがある。また、濃度が１０００ｐｐｍを越える
とあるいは処理時間が１０００分より長いとボツリオコ
ッカス属藻類自体が死滅することがある。

【００１３】また、上記サンプルの培養液を次亜塩素酸
で処理する場合には、次亜塩素酸を上記濃度となるよう
に加えればよく、また、藻体を次亜塩素酸で処理する場
合には、上記濃度となるように希釈した次亜塩素酸水溶
液あるいは培養液で希釈した次亜塩素酸に藻体を懸濁さ
せればよい。

【００１４】上記のようにしてサンプルを次亜塩素酸で
処理した後に、これをそのまま用いてもよいが、藻体を
濾過又は遠心分離等により分離し、培養液又は緩衝液に
懸濁する操作を繰り返すことなどによって洗浄し、ある
いはチオ硫酸ナトリウム等を加えること等により有効塩
素を除去することが好ましい。加えるチオ硫酸ナトリウ
ムの量は、加えた次亜塩素酸から生じる有効塩素の全量
を除去するのに必要な量であることが好ましい。

【００１５】続いて、上記次亜塩素酸処理を行ったサン
プルを、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した平板培
地、例えば、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ改変培地な
どの無機培地、またはこれら無機培地にグルコース、ク
エン酸、酢酸などの有機炭素源を加えた培地に塗布して
培養を行う。ここで用いる培地には、ボツリオコッカス
属藻類の生育に影響を与えない抗生物質等を添加しても
よい。また、平板培地に塗布する際に、塗布量が多すぎ
ると、平板培地に生じるコロニーが近接し、コロニーを
分離しにくくなるので、数段階で希釈したものを塗布す
るとよい。

【００１６】培養は、蛍光灯等を用いて光照射下で行う
ことが好ましいが、照射照度が高すぎるとかえって増殖
が阻害される場合があるので、通常０〜３００μＥ／ｍ
²・ｓ、好ましくは５〜１００μＥ／ｍ²・ｓで照射する
のがよい。また、培養温度としては、通常０〜８０℃、
好ましくは１５〜３５℃がよい。

【００１７】培養は、通常１〜６０日、好ましくは１〜
３０日行う。培養中に生じるコロニーが、残存する雑菌
のコロニーであるか、あるいは単一のボツリオコッカス
属藻類のコロニーであるかを判明するにはある程度の培
養期間が必要であり、培養期間が長すぎると雑菌が繁茂
するので、上記期間内で培養するのが好ましいが、培地
や培養条件、雑菌の残存の程度等によっても異なるの
で、培養中にコロニーを観察し、適宜培養を打ち切れば
よい。

【００１８】上記のようにして平板培地上に生じたボツ
リオコッカス属藻類の単一コロニーを採取することによ
り、ボツリオコッカス属藻類の種々の純化株が得られ
る。平板培地からコロニーを分離する際には、顕微鏡、
好ましくは実体顕微鏡観察下で行うと、ボツリオコッカ
ス属藻類のコロニーであることを確認しながら採取でき
る点で好ましい。コロニーの採取の方法は特に問わず、
例えば滅菌した白金線でかき取り、あるいはパスツール
ピペットで吸い上げればよい。この際、空中の雑菌によ
る汚染を防止するために、無菌室またはクリーベンチ内
で操作を行うとよい。

【００１９】上記のようにして分離した株を再び培養
し、雑菌が生育しないことを確認することによって、こ
れらが純化株であることを確認することができる。さら
に、得られた純化株が、ボツリオコッカス属藻類である
ことを顕微鏡観察等により確認しておくとよい。

【００２０】この様にして得られたボツリオコッカス属
藻類の純化株を分離して、それぞれの純化株について、
これらの純化株の藻体が産生する炭化水素の分析を以下
の方法で行い、藻体が産生する炭化水素が主として炭素
数３０、３１、３２及び３３の炭化水素からなり、全炭
化水素量に対する炭素数３０の炭化水素の割合が５重量
％以上である株をスクリーニングすることにより、本発
明のボツリオコッカス属藻類の新規株が得られる。ここ
で、本発明において「炭化水素が主として炭素数３０、
３１、３２及び３３の炭化水素からなり」とは、炭素数
３０、３１、３２及び３３の炭化水素の合計量の、藻体
が産生する全炭化水素量に占める割合が概ね９０重量％
以上であることを示す。

【００２１】ボツリオコッカス属藻類の藻体が産生する
炭化水素を分析する方法としては、従来から行われてい
る方法を用いればよく、例えば、ボツリオコッカス属藻
類を培養して藻体を増殖させ、得られた培養液から濾過
等で取り出した湿藻体を凍結乾燥または加温して乾燥し
た後、この藻体乾燥物に内部標準として一定量のｎ−ペ
ンタコサン等を加え、ｎ−ヘキサン、メタノール−クロ
ロホルム（１：１）等の抽出溶媒に浸漬して炭化水素を
抽出させ（Phytochemistry,vol.19,1081-1085,1980）、
その後、藻体、溶出溶媒を除去し、抽出された炭化水素
についてＮＭＲ、ＩＲ、ガスクロマトグラフィーやＧＣ
−ＭＳ等で分析を行う方法をとればよい。

【００２２】この様にして藻体が産生する炭化水素が主
として炭素数３０、３１、３２及び３３の炭化水素から
なり、全炭化水素量に対する炭素数３０の炭化水素の割
合が５重量％以上である株をスクリーニングすること
で、本発明のボツリオコッカス属藻類の株が得られる
が、これらの株についてそれぞれ分類学的性質を調べる
ことにより、これらの株の同定が行われる。炭化水素産
生能に関して上記特徴（藻体が産生する炭化水素が主と
して炭素数３０、３１、３２及び３３の炭化水素からな
り、全炭化水素量に対する炭素数３０の炭化水素の割合
が５重量％以上である）を有する本発明のボツリオコッ
カス属藻類は、この様な分類学的性質の調査によりボツ
リオコッカス・ブラウニーＢレースに属する株である
ことが確認された。また、藻体が産生する炭化水素につ
いての上記特徴は、後述のように、これまでに見出され
た他のボツリオコッカス・ブラウニーＢレースの株に
は見られないものであり、本発明のボツリオコッカス・
ブラウニーＢレース株は新規であると言える。

【００２３】尚、この様な藻体が産生する炭化水素が主
として炭素数３０、３１、３２及び３３の炭化水素から
なり、全炭化水素量に対する炭素数３０の炭化水素の割
合が５重量％以上である本発明のボツリオコッカス・ブ
ラウニーＢレース株のうちでも、更に藻体が産生する
全炭化水素量に対する炭素数３０の炭化水素の割合が１
０重量％以上であるボツリオコッカス・ブラウニーＢ
レース株が本発明においてはより好ましい。

【００２４】この様な本発明のボツリオコッカス・ブラ
ウニーＢレース株の１例として後述実施例で分離され
たボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−１株が挙げら
れるが、このボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−１
株は、本発明により初めて得られた新規株であり、この
株の藻体が産生する炭化水素においては、炭素数３０、
３１、３２及び３３の炭化水素の合計量の、全炭化水素
量に占める割合は概ね９５重量％以上であり、全炭化水
素量に対する炭素数３０の炭化水素の割合は概ね１０〜
３０重量％であり、本発明においてより好ましいと言え
る。また、本株の工業技術院生命工学工業技術研究所へ
の寄託は拒否されたが、本発明の成立の確認のために菌
株を分譲することは、ここに保証されるものである。

【００２５】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００２６】

【実施例１】網目が２５μｍの北原式プランクトンネッ
ト用いて、一碧湖（静岡県）の湖水表面のプランクトン
類を採集した。得られた試料を顕微鏡で観察したとこ
ろ、ボツリオコッカス属藻類に特徴的な形態をしたコロ
ニー（顕微鏡下、１０〜３０分経過するとコロニーから
油滴が分泌）が認められた。

【００２７】上記湖水サンプルを４本の試験管に分け、
それぞれに有効塩素濃度が１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐ
ｐｍ、２０ｐｐｍになるように次亜塩素酸ナトリウムを
加え、１０分間、室温で静置した。静置後、活性塩素を
除去するためにチオ硫酸ナトリウムを活性塩素１ｍｇあ
たり７．１６ｍｇとなるように加えた。

【００２８】上記処理液を、グルコース０．１％、寒天
１．５％を含むＪＭ培地の平板培地に塗布し、蛍光灯を
光源として約１５μＥ／ｍ²・ｓになるように照射し、
２５℃にて１週間培養した。尚、ＪＭ培地の組成は以下
のとおりである。〔ＪＭ培地の組成〕下記表１中１〜９のストック溶液１
ｍＬずつを混合し、蒸留水又は脱イオン水を用いて１Ｌ
とし、ｐＨを７付近に調整する。

【００２９】

【表１】

【００３０】培養後、クリーンベンチ内で実体顕微鏡
（倍率２０倍）を用いてコロニー形状等のボツリオコッ
カス属藻類特有の性質を観察しながらボツリオコッカス
属藻類の単一コロニーを白金線でかき取り、グルコース
０．１％、寒天１．５％を含むＪＭ平板培地に移植し
た。これを、蛍光灯による約１５μＥ／ｍ²・ｓの光照
射下で、２５℃で４週間培養した。

【００３１】上記で得られたボツリオコッカス属藻類の
藻体を白金線を用いてかき取り、ＪＭ液体培地に移し、
光照射下でさらに２週間培養した。白金耳で培養液の一
部をとり、普通寒天培地（１Ｌ中に、肉エキス：５ｇ、
ペプトン：１０ｇ、塩化ナトリウム：５ｇ、寒天：１５
ｇを含む；ｐＨ７．０）の平板培地に塗布し、２５℃で
７日間培養し、雑菌が生育しないことを確認した。ま
た、こうして得られた純化株を顕微鏡観察し、ボツリオ
コッカス・ブラウニーのみであることを、コロニー形状
等の本藻類特有の性質（葉緑体を細胞中に含む西洋梨型
をした細胞が集合し、ほぼ球状のコロニーを形成してい
る。更に、コロニーを顕微鏡下観察を続けると油滴を生
じる。）により確認した。

【００３２】ここで、この様にして得られた純化株をボ
ツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−１株とした。な
お、湖水サンプルをそのまま平板（ＪＭ培地及びグルコ
ースを含むＪＭ培地）に塗布し培養したが、ボツリオコ
ッカスのみのコロニーは得られなかった。

【００３３】次に、上記で得られたボツリオコッカス・
ブラウニーＳＩ−１株をグルコースを含むＪＭ培地に
接種し、植え継ぎを繰り返しながら５カ月間培養した。
この固体培養で得られた藻体を、表２に組成を示すＣＨ
Ｕ−１３×２培地（ｐＨ７）を０．３Ｌ入れた偏平フラ
スコに接種し、８日間の液体培養（培養条件；照度：２
８０μＥ／ｓ・ｍ²、通気量：０．５ｖｖｍ（５％Ｃ
Ｏ₂）、温度２５℃）を行った。

【００３４】

【表２】

【００３５】

【表３】

【００３６】得られた藻体を１０５℃で乾燥し、５０倍
量のｎ−ヘキサンを用いて炭化水素の抽出を３回行っ
た。ｎ−ヘキサン相を濃縮後、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで炭化水素を精製した。ｎ−ヘキサン溶出
された炭化水素画分を濃縮し、これをＮＭＲ、ＩＲ、Ｇ
Ｃ−ＭＳを用いて分析した。ＮＭＲ分析では、不飽和プ
ロトン由来のピークが４．４〜６ｐｐｍに、飽和プロト
ン由来のピークが０．６〜２．７ｐｐｍに観察された。
飽和プロトンと不飽和プロトンの比はほぼ４：１であっ
た。ＩＲでは、３０８０ｃｍ^-1、１６４０ｃｍ^-1に二重
結合由来の吸収が認められた。その他、ＣＨ結合、ＣＣ
結合以外の結合が認められないことから炭化水素と確認
された。

【００３７】次にＧＣ−ＭＳより、ＧＣで観察されたピ
ークの親イオンは４１０、４２４、４３４、４４６であ
ることからそれぞれ炭素数３０、３１、３２、３３のボ
ツリオコッカス・ブラウニーＢレースに特徴的な炭化
水素であることが確認され、これよりボツリオコッカス
・ブラウニーＳＩ−１株をボツリオコッカス・ブラウ
ニーＢレースと同定した。また、上記液体培養により
ボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−１株が産生した
炭化水素の組成は、上記ＧＣ−ＭＳ分析により、炭素数
３０、３１、３２、３３の炭化水素がそれぞれ２６重量
％、１２重量％、４４重量％、１５重量％であり、この
他に炭素数３４の炭化水素が微量ではあるが含まれてい
ることがわかった。

【００３８】

【実施例２】上記実施例１と同様にして得られたボツリ
オコッカス・ブラウニーＳＩ−１株をグルコースを含
むＪＭ培地に接種し４週間培養した。この固体培養で得
られた藻体を掻き取り、これを１０５℃で乾燥した後、
この乾燥藻体をｎ−ヘキサンで３回抽出した。抽出溶液
よりｎ−ヘキサンを濃縮除去後、これをガスクロマトグ
ラフィーで分析した。ガスクロマトグラフィーのカラム
には、フェニルメチルシリコン系キャピラリーカラム
（２５ｍ）を用いた。この結果、この培養で産生された
炭化水素の組成は、炭素数３０、３１、３２、３３の炭
化水素がそれぞれ１１重量％、６重量％、６１重量％、
２２重量％であることがわかった。

【００３９】

【実施例３】上記実施例１と同様にして、ボツリオコッ
カス・ブラウニーＳＩ−１株をグルコースを含むＪＭ
培地で固体培養した後、得られた藻体を上記表２に組成
を示すＣＨＵ−１３×２培地（ｐＨ７）で液体培養し
た。得られた藻体をＣＨＵ−１３×２培地（ｐＨ７）３
Ｌの入った撹拌型培養槽に接種し、更に８日間の液体培
養（培養条件；照度：１８０μＥ／ｓ・ｍ²、通気量：
０．５ｖｖｍ（５％ＣＯ₂）、温度２５℃）を行った。
この培養液の１０ｍＬを取り出し、濾紙を用いて藻体を
回収後、１０５℃で乾燥した。得られた乾燥藻体にｎ−
ヘキサンを加え３回の抽出処理を行った。抽出液を濃縮
後、ガスクロマトグラフィーで分析した。この結果、こ
の培養で産生された炭化水素の組成は、炭素数３０、３
１、３２、３３の炭化水素がそれぞれ１６重量％、１５
重量％、５２重量％、１７重量％であることがわかっ
た。

【００４０】上記実施例１〜３の培養で本発明のボツリ
オコッカス・ブラウニーＳＩ−１株により産生された
炭化水素の組成についての分析結果を、他のボツリオコ
ッカス・ブラウニーＢレース株の産生炭化水素分析値
（文献値）と共に表４に示す。

【００４１】

【表４】

【００４２】これから、本発明により得られた上記ボツ
リオコッカス・ブラウニーＳＩ−１株の藻体により産
生された炭化水素においては、炭素数３０、３１、３２
及び３３の炭化水素の合計量の、全炭化水素量に占める
割合は９７重量％以上であり、且つ全炭化水素中の炭素
数３０の炭化水素の占める割合は１１〜２６重量％であ
ることがわかった。本発明のボツリオコッカス・ブラウ
ニーＳＩ−１株の産生炭化水素におけるこの様な特徴
は、表からわかるように、これまでに見出された他のボ
ツリオコッカス・ブラウニーＢレースの株には見られ
ないものであり、ボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ
−１株は、本発明により初めて得られた新規株であると
言える。

【００４３】

【発明の効果】本発明の新規ボツリオコッカス・ブラウ
ニーＢレース株は、本株の藻体により産生される炭化
水素が主として炭素数３０、３１、３２及び３３の炭化
水素からなり、全炭化水素中に占める炭素数３０の炭化
水素の割合が５重量％以上という、これまでに知られる
ボツリオコッカス・ブラウニーＢレース株には見られ
ない特徴を持つ。従って、本発明のボツリオコッカス・
ブラウニーＢレース株を用いることで、炭素数３０の
炭化水素を多く含有する炭素数３０〜３３の炭化水素を
効率的に生産することが可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:89）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】藻体が産生する炭化水素が主として炭素
数３０、３１、３２及び３３の炭化水素からなり、前記
炭化水素の総量に対する炭素数３０の炭化水素の割合が
５重量％以上であるボツリオコッカス・ブラウニーＢ
レース株。
【請求項２】ボツリオコッカス・ブラウニーＳＩ−
１株である請求項１記載のボツリオコッカス・ブラウニ
ーＢレース株。