JPH09235295A

JPH09235295A - 新規基質ペプチド

Info

Publication number: JPH09235295A
Application number: JP9003145A
Authority: JP
Inventors: Steven P Adams; ポールアダムススチーブン; Luis Glaser; グレイサールイス; Dwight Arnold Towler; アーノルドトウラードウワイト
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1986-08-07
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 1997-09-09
Also published as: US4740588A; DE3751398D1; ES2076933T3; GR3017297T3; EP0258203A2; EP0258203A3; CA1308217C; AU585167B2; AU7662387A; JPS6344597A; DE3751398T2; JP2674753B2; ATE124955T1; EP0258203B1

Abstract

(57)【要約】【課題】新規基質ペプチド及びその製造法が提供され
る。【解決手段】以下に示すアミノ酸配列からなるペプチ
ドはミリストイル化酵素の基質ペプチドであり、天然基
質の極めて特異的な競争的抑制因子として有用である。Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ；及びＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ．

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規ペプチドに関す
る。更に詳細には、本発明は、５−８個のアミノ酸残基
を有し、ミリストイル化酵素の基質として有用なユニー
クなペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシ
ル化はよく知られた工程であり、かかる工程は２つに大
別することができる。即ち、１つは、遺伝子の翻訳後に
恐らくゴルジ体においてパルミテート（Ｃ₁₆）が、エス
テル又はチオエステル結合を介して膜蛋白質に結合する
工程である。他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階に
おいて、ミリステート（Ｃ₁₄）がアミド結合を介して溶
解性の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリス
トイル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基が
アシル化部位であることが知られている〔Ａｉｔｋｉｎ
ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１５０、３１４−３１８（１
９８２）；Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２
７、４２７−４２９（１９８５）；Ｃａｒｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９、６１
２８−６１３１（１９８２）；Ｏｚｏｌｓら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９、１３３４９−１３３５４（１
９８４）；及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０、３３９−３４
３（１９８３）〕。

【０００３】蛋白質のＮ−ミリストイル化については、
その機能がようやく理解され始めたところである。公知
の４つのＮ−ミリストイル化蛋白質として、ｐ６
０^src，サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ
触媒サブユニット、カルシノイリンＢ−サブユニット及
びマウス白血病ウイルス発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂｌ融合
蛋白質があり、これらは、プロテインキナーゼあるいは
細胞の生合成経路を調節するホスホプロテインホスファ
ターゼ（カルシノイリン）の調節因子のいずれかであ
る。ｐ６０^v-srcについては、膜に結合してその細胞形
質転換能を発現するためには、ミリストイル化が必要で
あることが示されている〔Ｃｒｏｓｓら、Ｍｏｌｅｃ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１８３４−１８４２（１９８
４）；Ｋａｍｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２、４６２５−４６２８（１９８
５）〕。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ペプチド合成法により
慣用的に合成することのできる比較的短い合成ペプチド
の開発は、同定する上で非常に好ましく、また脂肪酸ア
シル化における酵素活性の調節を研究する上でも非常に
望ましい。このようなペプチドは、酵母及び哺乳動物細
胞のミリストイル化酵素の基質として提供される。また
これら合成ペプチドは、天然基質の極めて特異的な競争
的抑制因子として提供されることもできる。ミリストイ
ル化反応は以下の如くに表わすことができる。

【０００５】

【化１】

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、以下に
示すアミノ酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列
を有する、ミリストイル化酵素の基質ペプチド又はその
生理学的に許容し得るアミド誘導体もしくは塩誘導体が
提供される。

【０００７】Ｇｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｗ，Ｇｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｗ−Ｘ，Ｇｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ又はＧｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ，（ここでＲはＡｌａ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ又はＳｅｒ；Ｓは
Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｐｈｅ又はＳｅｒ；
ＴはＡｌａ又はＬｙｓ；ＷはＡｌａ又はＳｅｒ；ＸはＡ
ｌａ，Ｔｙｒ，又はＬｙｓ；ＹはＡｒｇ又はＰｒｏ；Ｚ
はＡｒｇ，Ｌｅｕ又はＬｙｓを表わし、但しＳ−Ｔ−Ｗ
−Ｘ−Ｙ−ＺがＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ−ＡｒｇであるときＲはＡｓｎでない。）。

【０００８】これら基質ペプチドの例としては、例え
ば、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒなどのペ
ンタペプチド；Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｌａなどのヘキサペプチド；Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇなどのヘプタペ
プチド；Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲはＧｌｎ又はＳｅｒを示す），Ｇ
ｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ（ＲはＡｌａ又はＡｓｎ、ＳはＡｒｇ，Ｇｌｎ又はＰ
ｈｅを示す），Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ，Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓなどのオクタペプチドが挙げられる。これらペプチ
ドのアミド誘導体としては、カルボキシアミドが挙げら
れ、塩誘導体としてはＨＣｌ塩が挙げられる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の新規ペプチドは、慣用的
なペプチド合成法を適当に採用することにより合成する
ことができる。しかして、ペプチド鎖に構成アミノ酸
を、目的とする配列で付加して行く一連の縮合反応によ
って、最終的に目的とするペプチド鎖を調製することが
できる。各種の試薬、即ち、カルボベンジルオキシ基、
ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基などのＮ−保護
基；ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイ
ミダゾールなどの縮合剤；Ｎ−ヒドロキシフタルイミド
のエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル
などの活性エステル；トリフルオロ酢酸、ＨＣｌジオキ
サン溶液、ボロントリス（トリフルオロアセテート）、
シアノゲンブロマイドなどの開裂剤等の各種試薬を使用
することはペプチド合成法ではよく知られたことであ
り、また単離体と溶液中で反応させること、あるいは中
間体の精製法もよく知られた事項である。

【００１０】本発明のペプチドは、好ましくはよく知ら
れたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相支持法〔Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２
１４９−５４（１９６３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ１５０、
１７８−８５（１９６５）〕により調製することができ
る。この方法は、同様の化学反応及び典型的なペプチド
合成に用いる保護基を何回も使用する方法ではあるが、
この方法によれば、通常架橋ポリスチレン、スチレンジ
ビニルベンゼンコポリマーなどの固相支持体にそのカル
ボキシ末端が固定されたペプチド鎖が得られる。この方
法では、各工程における過剰な試薬を、単にポリマーを
洗浄するだけで除去しているため、多くの操作が簡略化
されている。

【００１１】慣用的なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド
合成法の反応工程を以下に説明する。Ｉ．クロロメチル化工程（ペプチドを結合させるための
活性基を付与する工程）

【００１２】

【化２】（ここで、ＰＳはポリスチレン残基を示す）

【００１３】ＩＩ．エステル化工程（ｔ−ＢＯＣで保護
された第１のアミノ酸（Ｒ¹）トリエチルアンモニウム
塩との反応

【００１４】

【化３】

【００１５】ＩＩＩ．ペプチド形成工程（ジシクロカル
ボジイミド使用）

【００１６】

【化４】

【００１７】この工程ＩＩＩに続いて、例えば２５％ト
リフルオロ酢酸メチレンクロライド溶液などの処理によ
るｔ−ＢＯＣの脱保護が行なわれ、次いで過剰のトリエ
チルアミン処理によりＮ−末端アミノ基が遊離化され、
これにより、次の保護されたアミノ酸（Ｒ²）の活性化
カルボキシル基との反応が可能となる。最終工程におい
ては、例えば無水ＨＦアニソール溶液による処理によ
り、完成されたペプチドをＰＳ樹脂から脱離せしめる。
確立された固相合成法についての更に詳細な技術事項に
ついては、ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇの論文“固相ペ
プチド合成法”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，
ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９；Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄの総説ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ３２，ｐｐ．２２１−２９６，Ｆ．Ｆ．Ｎｏ
ｌｄ，Ｅｄ．，ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９６９；及び文献Ｅ
ｒｉｃｋｓｏｎとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．２，ｐ．２５５ｅｔｓｅ
ｑ．（ｅｄ．ＮｅｕｒａｔｈとＨｉｌｌ），Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７６など
を参照することができる。

【００１８】本発明の好ましい基質ペプチドとしては、
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ，Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓなどが挙げ
られる。これらのすべてのオクタペプチドは、０．０４
ｍＭ−０．０７ｍＭのＫｍ値を有している。

【００１９】これらペプチドのカルボキシ末端がカルボ
キサミドの形態にあるもの、例えば、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｇ−ＮＨ
₂は、カルボキシレートの形態にあるものよりも好まし
い。

【００２０】後者のオクタペプチドは、牛心筋のｃＡＭ
Ｐ依存プロテインキナーゼの６個のアミノ末端残基のう
ち５個（３番目の位置のＡｌａの代わりにＰｈｅがあ
る）を含んでおり、これに続いて２つのアルギニン残基
を有している。かかるアルギニン残基は、Ｃａｒｒらに
よって報告された〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ７９，６１２８−６１３１（１９８
２）〕Ｎ−末端ヘプタペプチド配列のリシン残基に代わ
るものに相当する。Ｃａｒｒのヘプタペプチドは、天然
の蛋白質のシアノゲンブロマイド開裂断片を分解して生
じる、ブロックされたトリプシン断片として得られたも
のである。内因性の蛋白質は、すでにミリストイル化さ
れているため、かかるペプチドをｉｎｖｉｔｒｏでア
シルアクセプターとして使用することはできない。

【００２１】ＴｏｗｌｅｒとＧｌａｓｅｒによって報告
された、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇの合成オクタペプチド〔Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３，２８１２−２
８１６（１９８６）〕を、本発明では標準コントロール
ペプチドとして使用して、ミリスチン酸を、このあるい
は他のペプチドのアミノ末端グリシンに移動せしめるユ
ニークな酵素活性の同定を行なった。ミリストイル化酵
素に対する新規ペプチドの基質活性は、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮ−ミリストイ
ルグリシルペプチドシンセターゼ（Ｎ−ミリストイルト
ランスフェラーゼ）によって証明することができる。〔
³Ｈ〕−ミリスチン酸のアクセプターペプチドへの移動
を測定するｉｎｖｉｔｒｏアッセイ法により、酵素活
性を測定した。移動反応は、アデノシントリホスフェー
ト（ＡＴＰ）とコエンザイムＡ（ＣｏＡ）に依存してい
る。高速液体クロマトグラフィーで、化学的に合成した
ミリストイルペプチド標準物質と共に溶出せしめること
によって、酵素生成物を同定した。酵素反応生成物と化
学的に合成した標準物質とは同一であり、グリシンに共
有結合したミリステートを含んでいることを証明するた
めに、ＨＰＬＣで精製した標準物質と酵素生成物とをと
もにプロナーゼで消化し、逆相ＨＰＬＣで分析した。

【００２２】両者とも、Ｍ−ミリストイル化グリシンを
含んでいた。本発明のペプチドへのアシルドナーとして
のミリストイルＣｏＡに対して、ミリストイルグリシル
ペプチドシンセターゼ酵素は極めて高い特異性を有して
いる。ペプチドのＮ−末端アミノ酸の１番目の位置のグ
リシンは、この目的のための基質活性に対して臨界的で
あり、１番目の位置にアラニンを有するペプチドは、こ
の酵素に対する基質として機能しない。また２番目の位
置のＬ−アスパラギンをアスパラギン酸、チロシン、フ
ェニルアラニンあるいはＤ−アスパラギンステレオアイ
ソマーに置換した場合には、不活性な基質となることも
判った。同様に、Ｎ−末端グリシンを有する短いペプチ
ドあるいは長いペプチドもテストした所、不活性であっ
た。即ち、以下に示す如きペプチドも不活性な基質であ
った。

【００２３】Ｇｌｙ−Ａｓｎ，Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
−Ｐｒｏ，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ。この最後の
ペプチドは、基質として使用することができなかった。
またこれらすべては、活性ペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇのミリ
ストイル化を起こすことが出来なかった。

【００２４】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅのプロテアーゼ欠損株ＪＲ１５３〔Ｈｅｍｍ
ｉｎｇｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ７８，４３５−４３９（１９８１）〕を、Ｎ−
ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼの原料とし
て用いて、オクタペプチドのアシル化を証明した。この
酵母を〔³Ｈ〕ミリスチン酸でラベル化し、細胞を溶解
し次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で細胞蛋白質を分析し
た所、この株は内因性のＮ−ミリストイル化蛋白質を有
していることが判った。プロナーゼで消化し、分離し次
いで逆相ＨＰＬＣで分析することにより、Ｎ−〔³Ｈ〕
ミリストイル化グリシンを、ラベル化した内因性のアシ
ル化蛋白質から単離することができた。

【００２５】ＢＣ₃Ｈｌ細胞〔Ｓｃｈｕｂｅｒｔらの報
告したマウス筋肉セルライン（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．６１，３９８−４１３（１９７４）〕を用いて、同
様にして、より高度な真核生物の細胞内に存在するＮ−
ミリストイル化酵素によるオクタペプチドのアシル化を
証明した。

【００２６】

【実施例】以下に、本発明を実施例を用いて更に詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定される
ものではない。

【００２７】実施例１本明細書に示す全てのペプチドは、比較基質である標準
コントロールペプチドの以下に記載した製造方法に、本
質的に従って調製した。Ａ．Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ₂の合成Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法〔Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２
１４９−２１５４（１９６３）〕に従い、樹脂１ｇ当り
０．３５ｍｌのアミノ基を置換基として有するｐ−メチ
ルベンズヒドリルアミン上にペプチドを合成した。ＢＯ
Ｃで保護したアミノ酸を用い、このアミノ酸とジシクロ
ヘキシルカルボジイミドとを２：１の割合でジクロロメ
タン中で１５分間混合して対称性の無水物を形成した。
溶媒を減圧下に留去し、無水物をジメチルホルムアミド
に再溶解して、樹脂と混合し、次いで１時間激しく攪拌
した。アスパラギンとの反応では（グルタミン、アルギ
ニンの場合も同様）、等モル（アミノ酸に基づく）のヒ
ドロキシベンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。

【００２８】ＢＯＣ保護基を、５０％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）のジクロロメタン溶液を用いて脱離せしめ、
アミノ酸との縮合反応を行なう前に、１０％ジイソプロ
ピルエチルアミンのジメチルホルムアミド溶液で中和し
た。ペプチドを樹脂から脱離せしめ、液体ＨＦ／アニソ
ール（９：１，ｖ／ｖ）を用いて０℃で１時間で脱保護
せしめた。粗ペプチドを、５０％酢酸水溶液で樹脂から
抽出し、凍結乾燥した。

【００２９】Ｂ．精製粗ペプチドを水に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ μ−Ｂｏｎｄ
ａｐａｋＣ₁₈カラム（１９ｍｍ×１５０ｍｍ）に付
し、０−１５％アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）の
水溶液（０．０５％ＴＦＡ）の勾配で、流速９ｍｌ／ｍ
ｉｎで１５分間溶出せしめた。生成物を含む画分を集め
て凍結乾燥し、ペプチドの同定及び純度測定を、アミノ
酸分析、ＨＰＬＣにより行なった。

【００３０】実施例２電気泳動分析用の酵母蛋白質のラベル化及び抽出酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３，交配型
ａｌｐｈａ，ｔｒｐｌ，ｐｒｄｌ，ｐｒｃｌ，ｐｅｐ
４−３）を、ロータリーシェーカーのＹＰＯ培地（１％
酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％デキストロース
蒸留水溶液）中で３０℃で生育せしめて、光学密度が６
６０ｎｍで１−３となるようにした。酵母培養液の１５
ｍｌアリコートを、〔³Ｈ〕脂肪酸１ｍＣｉのエタノー
ル溶液１０μｌを加えて同様の条件下で３０分間ラベル
化した。ラベル化反応の終りに、培養液を氷で５分間冷
却し、４℃で７６００ｘｇで１０分間遠心して細胞をペ
レット化した。

【００３１】次いで細胞を、１０ｍＭＮａＮ₃の１４
０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭホスフェート溶液（ｐＨ
７．２）１ｍｌに再懸濁せしめ、ポリプロピレン製の円
椎状の１．５ｍｌ遠心チューブに移し、４℃で上記した
と同様にして遠心して細胞を集めた。上清液を捨て、細
胞を、５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、３ｍＭジスレ
イトール、１％ＳＤＳ及び１ｍＭフェニルメチルスル
ホニルフルオライドを含む溶液１００μｌに懸濁し、氷
で冷却しながら、３０秒間の渦動を６回行ない、細胞１
個と等容量の０．５ｍｍガラスビーズで細胞を崩壊し
た。テーブルトップ（ｔａｂｌｅｔｏｐ）Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ遠心機で８０００ｘｇで３０秒間遠心して細胞
の破片を除いた。次いで、上清液を、８ｍＭＴｒｉｓ
（ｐＨ８．０）１２５μｌ中で、室温下１時間、２０ｍ
Ｍヨードアセトアミドによりアルキル化した。２０μｌ
アリコートを取り、慣用的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＯｌｓ
ｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，５３６４−
５３６７（１９８４）に記載されたと本質的に同様のフ
ルオログラフィー法により分析した。

【００３２】〔³Ｈ〕脂肪酸の蛋白質への結合分析還元され且つアルキル化された、〔³Ｈ〕脂肪酸ラベル
化蛋白質２０μｌを、新たに調製した４Ｍヒドロキシル
アミン／２０ｍＭグリシン（ｐＨ１０）７μｌで処理し
た。２３℃で４時間処理後、電気泳動用及び上記したフ
ルオログラフィー用にサンプルを調製した。

【００３３】ＪＲ１５３の２０，０００ダルトンのアシ
ル蛋白質への、〔³Ｈ〕ミリスチン酸のヒドロキシルア
ミン安定化結合を測定するため、脂肪酸を加える前にセ
ルレニン２μｇ／ｍｌで１５分間細胞を処理する以外は
前記したと同様にして培養液をラベル化した。セルレニ
ンは、酵母の脂肪酸合成の抑制因子として知られたもの
であり、ＪＲ１５３の特定のアシル蛋白質のラベル化を
数倍に促進するものである。次いで細胞蛋白質を調製
し、前記したと同様にしてＳＤＳ１２％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離した。この時、サンプルレ
ーンに隣接して、あらかじめ発色した分子量標準蛋白質
を同時に電気泳動に付した。電気泳動後、２０，０００
ダルトンの分子量領域における、未乾燥ゲルサンプルレ
ーンから、２ｍｍのゲルスライスを切り出した。

【００３４】ゲルスライスを、１０％メタノール水溶液
０．５ｍｌで素早くリンスし、次いで、Ｌａｂｑｕａｋ
ｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｒｋｌ
ｅｙ，ＣＡ）で混合しながら５０ｍＭ重炭酸アンモニウ
ム１ｍｌ中で、３７℃で７２時間、プロナーゼＥ（Ｓｉ
ｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１ｍｇを用いてそれ
ぞれ消化した。微生物の生育を抑えるために、消化１検
体当り、１μｌのトルエンを加えた。２４時間後に、新
たなプロナーゼＥ１ｍｇを加えた。消化後、それぞれの
消化体のアリコートについて放射活性を測定した。放射
活性を有するスライスから消化体を除き、ゲルスライス
を０．１％ＳＤＳ５００μｌで１回リンスし、消化体と
リンス液とを合わせ、４ＮＨＣｌ４０μｌでｐＨ１
−２とした。酸性化された溶液を、クロロホルム−メタ
ノール（２：１，ｖ／ｖ）１．５ｍｌで２回抽出した。
有機層を集めて、クロロホルム−メタノール−０．０１
ＮＨＣｌ（１：１０：１０，ｖ／ｖ／ｖ）で１回洗浄
し、有機層を窒素気流で乾燥した。

【００３５】得られる残渣を、５０％メタノール−５０
％ＨＰＬＣバッファーＡ（後記参照）に再溶解した。抽
出操作後に、もとの蛋白質消化体の放射活性の９７％が
回収された。サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ μ−Ｂｏｎｄ
ａｐａｋＣ₁₈カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに付し、バ
ッファーＡとして０．１％トリフルオロ酢酸／０．０５
％トリエチルアミン水溶液、バッファーＢとして０．１
％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液を用い１分間
当り１％のアセトニトリル量が上昇する勾配で流速１ｍ
ｌ／ｍｉｎで溶出せしめた。１分間のフラクションを集
め、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定
した。ミリストイル−〔³Ｈ〕グリシン標準物質は、Ｔ
ｏｗｌｅｒとＧｌａｓｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５，８７８−８８４（１９８６）に記載されたと本
質的に同様の方法により合成し前記した如くにしてＨＰ
ＬＣで分析した。

【００３６】脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成放射活性を有する対称性のミリスチン酸あるいはパルミ
チン酸の無水物と、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇとをピリジン中で反応
せしめてアシル化ペプチド標準物質の合成を行った。〔
³Ｈ〕脂肪酸１００ｍＣｉを、それぞれの脂肪酸クロラ
イド４μｌで処理し、次いでそれぞれの非放射活性脂肪
酸４．８ｍｇを含むピリジン１５０μｌ中に懸濁せしめ
た。２３℃で６０分間反応を進行せしめた。次いで、こ
の溶液の６５μｌを、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ４００−５００μ
ｇに加えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサーで混合しなが
ら、反応を１晩進行せしめた。次いで、ピリジンを減圧
下に留去し、得られる残渣を石油エーテル０．３ｍｌで
２回抽出し、５０％メタノール水溶液４００μｌに再溶
解した。反応生成物を精製し、前記したと同様にして逆
相ＨＰＬＣで分析した。化学合成標準物質と酵素生成物
とは、いずれもプロナーゼＥで消化された。またこれら
を、前記したと同様にして２０，０００ダルトンのアシ
ル化蛋白質について逆相ＨＰＬＣで分析した。但しこの
場合消化を完全に行なうためにはプロナーゼ２００μｇ
で十分であった。

【００３７】Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセ
ターゼ活性分析用の酵母抽出物の調製酵母培養物を、前記したと同様にして生育せしめて、６
６０ｎｍでのＯ．Ｄ．を１−３とした。培養液４０ｍｌ
を、４℃で７６００ｘｇで１０分間遠心して細胞を集め
た。上清液をデカンテーションし次いで、冷却した１０
ｍＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）１ｍｌに細胞ペレットをピ
ペットで移し、次いでポリプロピレン製の円椎状の１．
５ｍｌ遠心チューブに移して４℃で７６００ｘｇで１０
分間遠心して、細胞を再びペレット化した。次いで細胞
を、コールドアッセイ溶解バッファー〔１０ｍＭＴｒ
ｉｓ（ｐＨ７．４），１ｍＭジチオスレイトール、０．
１ｍＭエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエ
ーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）
及び１０μｇ／ｍｌアプロチニン〕４００μｌにピペッ
トで移して再懸濁せしめた。０．５ｍｍガラスビーズ約
４００μｌを、再懸濁した細胞に加え、前記した放射活
性ラベル化細胞の崩壊の時と同様にして渦動せしめて細
胞を溶解した。ビーズが静置後、溶解物を集め、細胞の
破片を、４℃で１０００ｘｇで１０分間遠心して除い
た。

【００３８】次いで上清液を、Ｂｅｃｋｍａｎ７５Ｔ
ｉロイター中で、４℃で４５，０００ｒｐｍで３０分間
遠心した。上清液を除き、粗膜ペレットを、コールドア
ッセイ溶解バッファー４００μｌにピペットで移して再
懸濁した。３つの細胞フラクションのアリコートについ
て、すぐに分析するかあるいは−６０°で保存した。粗
膜ペレットの活性は、−６０°で少なくとも３ヶ月間安
定であった。蛋白質はＰｅｔｅｒｓｏｎの方法〔Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３，３４６−３５６（１９７
７）〕により測定した。

【００３９】Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセ
ターゼ活性の分析以下の如くにして、〔³Ｈ〕脂肪酸アシル化ＣｏＡを酵
素的に合成し、インキュベーション体に加えた。アシル
ＣｏＡシンセターゼ反応は以下のものから構成される
（アッセイチューブ１個当り）。即ち、〔³Ｈ〕ミリス
チン酸０．５μＣｉ；２Ｘアッセイバッファー〔２０ｍ
ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４），２ｍＭジチオスレイトー
ル，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，０．２ｍＭＥＧＴＡ〕２
５μｌ；５ｍＭＡＴＰ蒸留水溶液５μｌ（ＮａＯＨで
ｐＨ７．０に調整）；２０ｍＭリチウムＣｏＡの蒸留水
溶液２．５μｌ；ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアシルＣｏ
Ａシンセターゼ１ｍＵ／μｌの５０ｍＭＮ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
溶液（ｐＨ７．３）１５μｌ；及び蒸留水２．５μｌか
ら構成される。反応を３０℃で２０分間進行せしめた。
Ｈｏｓａｋａらの方法〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７
１，３２５−３３３（１９８１）〕の変法により測定し
た所、典型的には〔³Ｈ〕脂肪酸の４０％−５０％が、
この方法によりそのＣｏＡエステルに変換された。

【００４０】この変法は、６ＮＨＣｌでｐＨ２．０に
酸性化し、５倍容量のヘプトンで６回抽出後に、反応液
中に残存する放射活性を測定して分析する方法である。
この反応液５０μｌを、アッセイ抽出バッファー（前記
参照）４０μｌ及び１ｍＭＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ１０μｌを含
むチューブに加えた。チューブ１個当り酵母細胞抽出物
１０μｌ（典型的には蛋白質５０μｇ）を加えて３０℃
で１０分間インキュベーションしてアッセイを開始し
た。１チューブ当りメタノール１１０μｌ及び１００％
トリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）１０μｌを加えて氷で１０分
間冷却してアッセイを終止した。沈澱した蛋白質を、テ
ーブルトップＥｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で８０００ｘｇで
３分間遠心して除いた（この条件下では、合成〔³Ｈ〕
ミリストイルペプチドあるいは〔 ³Ｈ〕パルミトイルペ
プチドの９５％は、アッセイ混合物に加えた時溶解した
ままである）。上清液５０μｌを、メタノール７５μｌ
及びＨＰＬＣバッファーＡ７５μｌと混合し、３０ｃｍ
Ｗａｔｅｒｓ μ−ＢｏｎｄａｐａｋＣ₁₈カラムの
３．９ｍｍ及び前記したと同じＨＰＬＣバッファーを用
いて逆相ＨＰＬＣにより分析した。３５％アセトニトリ
ルで溶出をスタートし、次いで１分間当り１％のアセト
ニトリル量が上昇する勾配で溶出せしめた。１分間のフ
ラクションを集め、それぞれのフラクションの放射活性
を、液体シンチレーションカウンターで測定した。〔³
Ｈ〕−ミリストイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは２４分後に溶出
し、〔³Ｈ〕パルミトイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは３０分後に
溶出した。

【００４１】結果前述した如くにして調整した〔³Ｈ〕−ミリストイルグ
リシルペプチド及び〔 ³Ｈ〕パルミトイルグリシルペプ
チドの化学合成標準物質は、サンプルの分析と同様の条
件下で、逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９％アセ
トニトリル、６５％アセトニトリルの時に溶出した。細
胞溶解調製物は、粗膜フラクションと溶解フラクション
に分別され、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセ
ターゼ活性は、粗膜フラクションと溶解フラクションの
両者で検出された。全比活性、溶解フラクションの比活
性及び膜フラクションの比活性は、それぞれ１０分間ア
ッセイでの蛋白質１μｇ当り、１４１０，１３２０，２
２６０ｄｐｎであった。最初の反応速度から判断して、
活性の６５％は粗膜フラクション中に存在しているもの
と考えられる。酵素反応生成物と化学的に合成した標準
物質〔³Ｈ〕−ミリストイルペプチドは、同じであり、
グリシンに共有結合したミリステートを有していること
が、前記した逆相ＨＰＬＣで分析した時に証明された。

【００４２】ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグ
リシルペプチドの特異性を証明するために、他のグリシ
ルペプチドがＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇのアシル化を競争的に抑制す
る能力を調べた。下記する表Ｉのテスト１から明らかな
ように、１ｍＭジペプチド、１ｍＭテトラペプチド、１
ｍＭデカペプチドのいずれも、１８μＭペプチドのミリ
ストイル化に対して何んらの効果も及ぼさなかった（約
１／８のＫｍ値）。しかして、Ｎ−ミリストイルグリシ
ルペプチドシンセターゼは、オクタペプチド基質に対し
て特異性を示すことが判る。

【００４３】

【表１】表−ＩＮ−ミリストイルグリシンペプチドシンセターゼの特徴付けミリストイルペプチドのテスト合成速度ＤＰＭ×１０³／１０ｍｉｎ ────────────────────────────────── １コントロール１１１ −ＡＴＰ９ −ＣｏＡ１２コントロール８３加熱した膜フラクション２（５ｍｉｎ／６５°）３コントロール２６．７＋１ｍＭＧＮ２８．０＋１ｍＭＧＰＲＰ２５．６＋１ｍＭＧＳＳＫＳＰＫＤＰＳ２７．４ ──────────────────────────────────

【００４４】酵母からの粗膜フラクションを用いて上記
表Ｉの如く変化せしめて、前記した如くにしてアッセイ
を行なった。テスト１では、アッセイのＡＴＰ及びＣｏ
Ａに対する依存性を、外因性の脂肪酸ＣｏＡリガーゼの
非存在下にテストした。テスト２では、酵母の酵素は熱
に不安定であることが証明されており、テスト３では、
Ｎ−末端グリシンを含む他のペプチドでは反応は抑制さ
れないことが証明されている。このテストでは、可能な
抑制効果を最大限に発揮せしめるために、通常用いる９
０μＭではなく１８μＭのペプチド基質を用いて測定し
た。

【００４５】実施例３実施例１と本質的に同様にして、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
の固相法により、本発明の他のペプチドを合成し次いで
酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３）のミリ
ストイル化酵素に対する基質としての活性をテストし
た。アッセイチューブ１個当り〔³Ｈ〕−ミリスチン酸
１μ Ｃｉを用いる以外は、実施例２のアッセイ条件と
同様にして、酵素に対するペプチド基質の特異性をテス
トした。本実施例で用いた酵母の酵素は、酵母の培養細
胞の粗ホモジェネートを５１−７０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ
₄で分別し、ＢＥＡＥ−セファロース^TM ＣＬ−６Ｂ
（ファルマシャ）を用いたイオン交換カラムクロマトグ
ラフィー次いでＣｏＡ−アガロースアフィニティーマト
リックス（ファルマシア）を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーで部分精製して得たものである。ペプチ
ドは表ＩＩに示すように、それぞれの動力学的データＫ
_m，Ｖ_maxにより特徴付けを行なった。

【００４６】

【表２】

【００４７】＊：標準コントロールオクタペプチドのＶ
_maxは、部分精製した酵母の酵素１ｍｇ当りの１分間に
形成されるミリストイル化ペプチドの量２８４０ｐｍｏ
ｌであった。

【００４８】実施例４ＢＣ₃Ｈｌマウスの筋肉細胞から得たミリストイル化酵
素に対するオクタペプチド基質特異性を、実施例２と類
似の方法により、いくつかのオクタペプチドについてテ
ストした。このマウス筋肉細胞は、Ｏｌｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，２６４４−２６５２（１
９８３）に記載されたと本質的に同様の方法により培養
した。酵素のアッセイは、マウス筋肉細胞から得た、核
のない上清液のフラクションを用いて実施した。トリク
ロロ酢酸−メタノールアッセイ上清液の５０μｌについ
て、実施例２と本質的に同様にしてＨＰＬＣで分析し
た。表ＩＩＩでは、このテストにおけるオクタペプチド
基質の特異性が示されている。

【００４９】

【表３】

【００５０】表ＩＩＩの標準コントロールペプチド（＊
印を付けた）及び最後のオクタペプチドは、他の３つの
オクタペプチドに比べて極めて高い活性を示した。他の
３つのオクタペプチドは、バックグランドＤＰＭ（１分
間当りの分解量）に比べて本質的に不活性であった。本
明細書に用いたアミノ酸の略号は以下に示す意味を有す
る。

【００５１】

【表４】 ────────────────────────────────── アミノ酸略号 ────────────────────────────────── Ｌ−アラニンＡｌａ又はＡＬ−アルギニンＡｒｇ又はＲＬ−アスパラギンＡｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸Ａｓｐ又はＤＬ−グルタミンＧｌｎ又はＱＬ−グリシンＧｌｙ又はＧＬ−ロイシンＬｅｕ又はＬＬ−リシンＬｙｓ又はＫＬ−フェニルアラニンＰｈｅ又はＦＬ−プロリンＰｒｏ又はＰＬ−セリンＳｅｒ又はＳＬ−チロシンＴｙｒ又はＹＬ−バリンＶａｌ又はＶ ──────────────────────────────────

【００５２】本明細書の記述から、本発明の精神及び範
囲内での他の例は、当業者にとって明らかであろう。そ
してかかる例も、本明細書の特許請求の範囲内のもので
ある。しかして、本明細書に記載した如き、ミリストイ
ル化酵素に対する基質としての生物学的活性に不利な、
あるいは決定的な影響を及ぼさない限り、個々のアミノ
酸及び／又はペプチドの長さを変えることは任意であ
り、これらの変化したものも、本明細書の特許請求の範
囲内のものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ドウワイトアーノルドトウラーアメリカ合衆国ミズーリ州，セントルイス，アパートメント 102，ラクレーデ 4545

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下に示すアミノ酸配列からなる群より
選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の
基質ペプチド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導
体もしくは塩誘導体：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ；及びＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ．
【請求項２】以下に示すアミノ酸配列を有する特許請
求の範囲第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ．
【請求項３】以下に示すアミノ酸配列を有する特許請
求の範囲第１項記載の基質ペプチド：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ．
【請求項４】以下に示すアミノ酸配列からなる群より
選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の
基質ペプチド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導
体もしくは塩誘導体の製造法であって、固相樹脂上で以
下に示したアミノ酸配列中のアミノ酸を順次縮合させ
て、固相樹脂にそのカルボキシ末端が固定された以下に
示したアミノ酸配列のペプチドを合成し、次いで固相樹
脂からそのペプチドを開裂させてペプチドを得る、上記
製造法：Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ；及びＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ．