JPS6344597A - 新規基質ペプチド - Google Patents
新規基質ペプチドInfo
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- JPS6344597A JPS6344597A JP62195443A JP19544387A JPS6344597A JP S6344597 A JPS6344597 A JP S6344597A JP 62195443 A JP62195443 A JP 62195443A JP 19544387 A JP19544387 A JP 19544387A JP S6344597 A JPS6344597 A JP S6344597A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ala
- arg
- ser
- amino acid
- asn
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は新規ペプチドに関する。更に詳細には、本発明
は、５−８個のアミノ酸残基を有し、ミリストイル化酵
素の基質として有用なユニークなペプチドに関する。
は、５−８個のアミノ酸残基を有し、ミリストイル化酵
素の基質として有用なユニークなペプチドに関する。
く背景技術〉
真核生物の特定の蛋白質での脂肪酸アシル化はよく知ら
れた工程であシ、かかる工程は２つに大別することがで
きｂ０即ち、１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴルジ体
においてパルミテート（Ｃｘ６）が、エステル又はチオ
エステル結合を介して膜蛋白質に結合する工程である。
れた工程であシ、かかる工程は２つに大別することがで
きｂ０即ち、１つは、遺伝子の翻訳後に恐らくゴルジ体
においてパルミテート（Ｃｘ６）が、エステル又はチオ
エステル結合を介して膜蛋白質に結合する工程である。
他の１つは、蛋白質生合成の初期の段階において、ミリ
ステー） （Ｃ１４）がアミド結合を介し″′ｃ＠解性
の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリストイ
ル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基がアシ
ル化部位であることが知られている［ Ａｉｔｋｉｎら
、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ−１５０，３１４−３１ｓ （１
９８２）；３ＱｈｕｌｔＺら、３ｃｉｅｎＯθ２２７．
４２７−４２９ＱＺＯ１Ｂら、Ｊ、Ｂｌｏｌ、 ０ｈｅ
ｍ、 ２５９．１３３４９−１３３５４（１９８４）；
及びＨｅｎａｅｒａｏｎら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａａ、３ｃｉ、ＵＳＡ ８０、３６９−３４３（１
９８３）］。
ステー） （Ｃ１４）がアミド結合を介し″′ｃ＠解性
の膜蛋白質に共有結合する工程である。Ｎ−ミリストイ
ル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基がアシ
ル化部位であることが知られている［ Ａｉｔｋｉｎら
、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ−１５０，３１４−３１ｓ （１
９８２）；３ＱｈｕｌｔＺら、３ｃｉｅｎＯθ２２７．
４２７−４２９ＱＺＯ１Ｂら、Ｊ、Ｂｌｏｌ、 ０ｈｅ
ｍ、 ２５９．１３３４９−１３３５４（１９８４）；
及びＨｅｎａｅｒａｏｎら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａａ、３ｃｉ、ＵＳＡ ８０、３６９−３４３（１
９８３）］。
蛋白質のＮ−ミ＋）ストイル化については、その機ｎ２
がようやく理解され始めたところである。公昶の４つの
Ｎ−ミリストイル化蛋白質として、Ｐ２Ｏ”０？ サイ
クリックＡＭＰ依存性プロティンキナーゼ触媒サブユニ
ット、カルシノイリンＢ−サブユニット及びマウス白血
病ウィルス発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂ１融合蛋白質があり
、これらは、プロティンキナーゼあるいは細胞の生合成
経路を調節するホスホプロティンホスファターゼ（カル
シノイリン）の調節因子のいずれかである。ｐ ６０Ｖ
−８ｒ Ｃについては、膜に結合してその細胞形質転換
能を発現するためには、ミリストイル化が必要であるこ
とが示されている［ Ｃｒｏｓｓら、Ｍｏ１ｅｃ、 （
’４３１１゜Ｂｉ、ＯＬ、４．１８３４−１８４２（１
９８４）；［ａｍｐａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａａ、 ３ｃ１． ＵＳＡ ８２．４６２５−４６
２８（１９８５））。
がようやく理解され始めたところである。公昶の４つの
Ｎ−ミリストイル化蛋白質として、Ｐ２Ｏ”０？ サイ
クリックＡＭＰ依存性プロティンキナーゼ触媒サブユニ
ット、カルシノイリンＢ−サブユニット及びマウス白血
病ウィルス発癌遺伝子ｇａｇ−ａｂ１融合蛋白質があり
、これらは、プロティンキナーゼあるいは細胞の生合成
経路を調節するホスホプロティンホスファターゼ（カル
シノイリン）の調節因子のいずれかである。ｐ ６０Ｖ
−８ｒ Ｃについては、膜に結合してその細胞形質転換
能を発現するためには、ミリストイル化が必要であるこ
とが示されている［ Ｃｒｏｓｓら、Ｍｏ１ｅｃ、 （
’４３１１゜Ｂｉ、ＯＬ、４．１８３４−１８４２（１
９８４）；［ａｍｐａら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａａ、 ３ｃ１． ＵＳＡ ８２．４６２５−４６
２８（１９８５））。
ペプチド合成法により慣用的に合成することのできる比
較的短い合成ペプチドの開発は、同定する上で非常に好
ましり、マた脂肪咳アシル化における酵素活性の調節を
研究する上でも非常に望ましい。このようなペプチドは
、酵母及び哺乳動物細胞のミリストイル化酵素の基質と
して提供される。またこれら合成ペプチドは、天然基質
の極めて特異的な競争的抑制因子として提供されること
もできる。
較的短い合成ペプチドの開発は、同定する上で非常に好
ましり、マた脂肪咳アシル化における酵素活性の調節を
研究する上でも非常に望ましい。このようなペプチドは
、酵母及び哺乳動物細胞のミリストイル化酵素の基質と
して提供される。またこれら合成ペプチドは、天然基質
の極めて特異的な競争的抑制因子として提供されること
もできる。
ミリストイル化反応は以下の如くに表わすことがで＠る
。
。
ＣＨ３（ＣＨｚ）ｘｚ”ゝＮ−ｇｌｙ−蛋白質＋ＣｏＡ
〈発明の袂旨〉 本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群よ
り選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素
の基質ペプチド又はその生理学的忙許容し得るアミド誘
導体もしくは塩誘導体が提供されろ。
〈発明の袂旨〉 本発明によれば、以下に示すアミノ酸配列からなる群よ
り選ばれたアミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素
の基質ペプチド又はその生理学的忙許容し得るアミド誘
導体もしくは塩誘導体が提供されろ。
Ｇｌｙ−Ｒ−８−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ 又％＠（こごでＲ
はＡｌａ 、 Ａｓｎ 、 （）Ｉｎ又はｓｅｒ ；
ＳはＡｌａ 、 Ａｒｇ 、 Ｇｌｎ 、 Ｇｌｕ 、
ｐｈｅ又はＳｅｒ ； ＴはＡｌａ又はＬ７８ ； ＷはＡｈａ又はｓｅｒ ； ＸはＡｌａ 、 Ｔｙｒ 、又はＬｙＢ；ＹはＡｒｇ又
＆’：Ｊ、Ｐｒｏ； ＺはＡｒｇ ＊ Ｌｅｕ又はＬ７８を表わし、但し５
−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが ＡＩａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＩＩＬ−Ａｒｇ−Ａｒｇで
あるときＲはＡｓｎでない。）。
はＡｌａ 、 Ａｓｎ 、 （）Ｉｎ又はｓｅｒ ；
ＳはＡｌａ 、 Ａｒｇ 、 Ｇｌｎ 、 Ｇｌｕ 、
ｐｈｅ又はＳｅｒ ； ＴはＡｌａ又はＬ７８ ； ＷはＡｈａ又はｓｅｒ ； ＸはＡｌａ 、 Ｔｙｒ 、又はＬｙＢ；ＹはＡｒｇ又
＆’：Ｊ、Ｐｒｏ； ＺはＡｒｇ ＊ Ｌｅｕ又はＬ７８を表わし、但し５
−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが ＡＩａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＡＩＩＬ−Ａｒｇ−Ａｒｇで
あるときＲはＡｓｎでない。）。
これら基質ペプチドの例としては、例えば、Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒなどのペンタペプチド；
Ｇｌｙ−Ａｆｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ４１１Ｌ−Ａｌａな
どのへキサペプ−ＩＦ−）’； Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ａ１１Ｌ−八ｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇなどのへブタペ
プチド； （）ｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
１．ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲはＧｌｎ又はＢａｒを示す
）。
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒなどのペンタペプチド；
Ｇｌｙ−Ａｆｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ４１１Ｌ−Ａｌａな
どのへキサペプ−ＩＦ−）’； Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌ
ａ−Ａ１１Ｌ−八ｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇなどのへブタペ
プチド； （）ｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
１．ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲはＧｌｎ又はＢａｒを示す
）。
Ｇｌｙ−Ｒ−８−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ （ＲはＡｌ５Ｌ又はＡｓｎ、Ｓはｋ”ｇ 、 Ｇ
ｌｎ又はｐｈｅを示す）。
ｒｇ （ＲはＡｌ５Ｌ又はＡｓｎ、Ｓはｋ”ｇ 、 Ｇ
ｌｎ又はｐｈｅを示す）。
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ。
ｒｇ−Ａｒｇ。
Ｇｌｙ−Ａｅｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−’］’ｈｙ
−Ｐｒｏ−Ｉ、ｅｕ 。
−Ｐｒｏ−Ｉ、ｅｕ 。
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｅ−Ｓｅｒ−Ｉ、ｙｓ−
Ｐｒｏ−４，ｙｓなどのオクタペプチドが挙げられる。
Ｐｒｏ−４，ｙｓなどのオクタペプチドが挙げられる。
これらペプチドのアミド誘導体としては、カルボキシア
ミドが挙げられ、塩誘導体として１工ＨＣＩ塩が挙げら
れる。
ミドが挙げられ、塩誘導体として１工ＨＣＩ塩が挙げら
れる。
〈発明の詳細な記述〉
本発明の新規ペプチドは、慣用的なペプチド合成法を適
当に採用することにより合成することができる。しかし
て、ペプチド鎖に構成アミノ酸を、目的とする配列で付
加して行く一連の縮合反応によって、最終的に目的とす
るペプチド鎖を調製することができる。各種の試薬、即
ち、カルボベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル
（ＢＯＣ）基などのＮ−保獲基；ジシクロへキシルカル
ボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの縮合剤；
ｌＪ−ヒドロキシフタルイミドのエステル、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドのエステルなどの活性エステルニト
リフルオロ酢酸、ＨＣＩジオキサン溶液、ボロントリス
（トリフルオロアセテート）、シテノデンブロマイドな
どの開裂剤等の各種試薬を使用することはペプチド合成
法ではよく知られたことであり、また単離体と溶液中で
反応させろこと、あるいは中間体のｆ−Ｊ製法もよく知
られた事項である。
当に採用することにより合成することができる。しかし
て、ペプチド鎖に構成アミノ酸を、目的とする配列で付
加して行く一連の縮合反応によって、最終的に目的とす
るペプチド鎖を調製することができる。各種の試薬、即
ち、カルボベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル
（ＢＯＣ）基などのＮ−保獲基；ジシクロへキシルカル
ボジイミド、カルボニルジイミダゾールなどの縮合剤；
ｌＪ−ヒドロキシフタルイミドのエステル、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドのエステルなどの活性エステルニト
リフルオロ酢酸、ＨＣＩジオキサン溶液、ボロントリス
（トリフルオロアセテート）、シテノデンブロマイドな
どの開裂剤等の各種試薬を使用することはペプチド合成
法ではよく知られたことであり、また単離体と溶液中で
反応させろこと、あるいは中間体のｆ−Ｊ製法もよく知
られた事項である。
本発明のペプチドは、好ましくはよく知られたＭｅｒｒ
ｉｆｉｅｌａの固相支持法［： ＭＪｒｒｉｆｉｅｌｄ
、 Ｊ。
ｉｆｉｅｌａの固相支持法［： ＭＪｒｒｉｆｉｅｌｄ
、 Ｊ。
Ａｍｅｒ、 Ｃｈｅｍ、 ５Ｏｃ−８５，２１４９−５
４（１９６３）；３ｃｉｅｎｃａ １５０．１７８−
８５（１９６５））忙よジ調製することができろ。この
方法は、同様の化学反応及び典型的なペプチド合成に用
いる保護基を何回も使用する方法ではあるが、この方法
によれば、通常架橋ポリスチレン、スチレンジビニルベ
ンゼンコポリマーなどの固相支持体にそのカルボキシ末
端が固定されたペプチド鎖が得られる。この方法では、
各工程におけろ過剰な試薬を、単にポリマーを洗浄する
だけで除去しているため、多くの操作が簡略化されてい
る。
４（１９６３）；３ｃｉｅｎｃａ １５０．１７８−
８５（１９６５））忙よジ調製することができろ。この
方法は、同様の化学反応及び典型的なペプチド合成に用
いる保護基を何回も使用する方法ではあるが、この方法
によれば、通常架橋ポリスチレン、スチレンジビニルベ
ンゼンコポリマーなどの固相支持体にそのカルボキシ末
端が固定されたペプチド鎖が得られる。この方法では、
各工程におけろ過剰な試薬を、単にポリマーを洗浄する
だけで除去しているため、多くの操作が簡略化されてい
る。
慣用的なＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成法の反応
工程を以下に説明する。
工程を以下に説明する。
（ここで、ＰＳはポリスチレン残基を示す）ム塩との反
応 ＯＲ１ （ＣＨ３ＣＨ２）Ｎ＋ＨＣＩ″″ ド使用） 山 り ＋この工程ｍに
続いて、例えば２５％トリフルオロ酢酸メチレンクロラ
イド溶液などの処理によるｔ −ＢＯＣの脱保護が行な
われ、次いで過剰のトリエチルアミン処理によりＮ−末
端アミノ基が遊離化され、これにより、次の保護さｉ’
したアミノ酸（Ｒ２）の活性化カルボキシル基との反応
が可能となる。最終工程においては、例えば無水ＨＦア
ニンール沼液による処理により、完成されたペプチドを
ＰＳ樹脂′から脱離せしめる。
応 ＯＲ１ （ＣＨ３ＣＨ２）Ｎ＋ＨＣＩ″″ ド使用） 山 り ＋この工程ｍに
続いて、例えば２５％トリフルオロ酢酸メチレンクロラ
イド溶液などの処理によるｔ −ＢＯＣの脱保護が行な
われ、次いで過剰のトリエチルアミン処理によりＮ−末
端アミノ基が遊離化され、これにより、次の保護さｉ’
したアミノ酸（Ｒ２）の活性化カルボキシル基との反応
が可能となる。最終工程においては、例えば無水ＨＦア
ニンール沼液による処理により、完成されたペプチドを
ＰＳ樹脂′から脱離せしめる。
確立された同相合成法についての更に評細な技術事項に
ついては、３ｔｅ’Ｅａｒｔとｙｏｕｎｇの論文１固相
ペプナド合成法”、Ｗ、 Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃ
ｏ、。
ついては、３ｔｅ’Ｅａｒｔとｙｏｕｎｇの論文１固相
ペプナド合成法”、Ｗ、 Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃ
ｏ、。
３ａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ 、 ｉ ９６９ ；
１．Ａｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｏ，’）総説Ａａｖａｎｃ
ｅｓ ｔｎ Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ 、 ｐ
ｐ、 ２２１−２ ９ ６ 、 Ｆ、 Ｆ、
Ｎ０Ｉ（Ｌ 、 Ｅａ、、 Ｉｎｔａｒｓｃ
ｉａｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ 、 Ｎｅｗ ＹＯｒ
ｋ 、 １９６９ 、ｅ及び文献Ｅｒ１ｃｋｓｏＢと
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 、 Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
、 Ｖｏｌ。
１．Ａｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｏ，’）総説Ａａｖａｎｃ
ｅｓ ｔｎ Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３２ 、 ｐ
ｐ、 ２２１−２ ９ ６ 、 Ｆ、 Ｆ、
Ｎ０Ｉ（Ｌ 、 Ｅａ、、 Ｉｎｔａｒｓｃ
ｉａｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ 、 Ｎｅｗ ＹＯｒ
ｋ 、 １９６９ 、ｅ及び文献Ｅｒ１ｃｋｓｏＢと
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 、 Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
、 Ｖｏｌ。
２、 ｐ、 ２５５ ｅｔ、 ｓｅｑ、（ｅｃＬ、 Ｎ
ｅｕｒａｔ、ｈとＨｌｌｌ）。
ｅｕｒａｔ、ｈとＨｌｌｌ）。
Ａｃａａｅｍｉｃ ｐｒｅｓ日、）１θＷＹｏｒｋ、１
９７６などを参照することかで＠る。
９７６などを参照することかで＠る。
本発明の好ましい基質ペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈｅ−ＡＬａ−Ａ１１Ｌ−Ａ１１Ｌ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ 。
ｎ−Ｐｈｅ−ＡＬａ−Ａ１１Ｌ−Ａ１１Ｌ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ 。
（）１７−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−
八ｒｇ−Ａｒｇ ｓＧ’１７−８８ｒ−Ｓｅｒ−Ｌ７Ｂ
−３６ｒ−Ｌ７Ｂ−Ｐｒｏ−Ｌ７Ｂなどが挙げられる。
八ｒｇ−Ａｒｇ ｓＧ’１７−８８ｒ−Ｓｅｒ−Ｌ７Ｂ
−３６ｒ−Ｌ７Ｂ−Ｐｒｏ−Ｌ７Ｂなどが挙げられる。
、これらのすべてのオククペプナドは、０．０４ ｍＭ
−０，０７ｍｕのＫＩＬＬ値を竹している。
−０，０７ｍｕのＫＩＬＬ値を竹している。
これらペプチドのカルボキシ末端がカルボキサミドの形
態にあるもの、例えは、 Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｇ−Ｎｌ２は、カルボキシレートの形態にある
ものよｐも好ユしい。
態にあるもの、例えは、 Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｇ−Ｎｌ２は、カルボキシレートの形態にある
ものよｐも好ユしい。
後者のオクタペプチドは、失心筋のｃＡＭＰ依存プロテ
ィンキナーゼの６個のアミノ末為残基のうち５個（３番
目の位置のＡｌａの代わシにＰｈｅがある）を含んでお
９、これに続いて２つのフルギニン残基を■している。
ィンキナーゼの６個のアミノ末為残基のうち５個（３番
目の位置のＡｌａの代わシにＰｈｅがある）を含んでお
９、これに続いて２つのフルギニン残基を■している。
かかるアルイニン残基は、（’ａｒｒらによって報告さ
れた（ Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＬ、Ａｃａｄ。
れた（ Ｐｒｏｃ、 ＮａｔＬ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７９． ６１ ２８−６１ ３１
（１９８２））Ｎ−末端へブタペプチド配列のりシン
残基に代わるものに相当する。Ｃａｒｒのへブタペプチ
ドは、天然の蛋白質のシアノデンブロマイド開裂断片を
分解して生じろ、ブロックされたトリプシン断片として
得られたものである。内因性の蛋白質は、すでにミリス
トイル化されているため、かかるペプチドをｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでアシルアクセプターとして使用することはでき
ない。
（１９８２））Ｎ−末端へブタペプチド配列のりシン
残基に代わるものに相当する。Ｃａｒｒのへブタペプチ
ドは、天然の蛋白質のシアノデンブロマイド開裂断片を
分解して生じろ、ブロックされたトリプシン断片として
得られたものである。内因性の蛋白質は、すでにミリス
トイル化されているため、かかるペプチドをｉｎ ｖｉ
ｔｒｏでアシルアクセプターとして使用することはでき
ない。
’Ｉ’ＣＩＷｌ１３ｒとＧｌａｓｅｒによって報告され
た、Ｃ）１７−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇの合成オクタペプチド（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、３３ 。
た、Ｃ）１７−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇの合成オクタペプチド（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ、３３ 。
２８１２−２８１６（１９８６）］を、本発明では標準
コントロールペプチドとして使用して、ミリスチン酸な
、このあるいは他のペプチドの７ミノ末端グリシンに移
動せしめるユニークな酵素活性の同定を行なった。ミリ
ストイル化酵素に対する新規ペプチドの基質活性は、３
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃθ８ｃａｒｅｖｉａｉａｅ の
Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ（Ｎ−
ミリストイルトランスフェラーゼ）によって証明するこ
とができる。〔３Ｈ〕−ミリスチン酸のアクセプターペ
プチドへの移動を測定するｉｎ ＶｉｔｒＯアッセイ法
により、酵素活性を測定した。移動反応は、アデノシン
トリホスフェート（ＡＴＰ ）とコエンデイムＡ （Ｃ
ＯＡ ）に依存している。高速液体クロマトグラフィー
テ、化学的に合成したミリストイルペプチド標準物質と
共に溶出せしめろことによって、酵素生成物を同定した
。酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質とは同一
であり、グリシンに共有結合したミリステートを含んで
いることを証明するために、ＨＰＬＣで精製した標率’
４ｍ負と酵素生成物とをともにプロナーゼで消化し、逆
相ＨＰＬＣで分析した。
コントロールペプチドとして使用して、ミリスチン酸な
、このあるいは他のペプチドの７ミノ末端グリシンに移
動せしめるユニークな酵素活性の同定を行なった。ミリ
ストイル化酵素に対する新規ペプチドの基質活性は、３
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃθ８ｃａｒｅｖｉａｉａｅ の
Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターゼ（Ｎ−
ミリストイルトランスフェラーゼ）によって証明するこ
とができる。〔３Ｈ〕−ミリスチン酸のアクセプターペ
プチドへの移動を測定するｉｎ ＶｉｔｒＯアッセイ法
により、酵素活性を測定した。移動反応は、アデノシン
トリホスフェート（ＡＴＰ ）とコエンデイムＡ （Ｃ
ＯＡ ）に依存している。高速液体クロマトグラフィー
テ、化学的に合成したミリストイルペプチド標準物質と
共に溶出せしめろことによって、酵素生成物を同定した
。酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質とは同一
であり、グリシンに共有結合したミリステートを含んで
いることを証明するために、ＨＰＬＣで精製した標率’
４ｍ負と酵素生成物とをともにプロナーゼで消化し、逆
相ＨＰＬＣで分析した。
両者とも、Ｍ−ミリストイル化グリシンを含んでいた。
本発明のペプチドへのアシルドナーとしてのミリストイ
ルＣＯＡに対して、ミリストイルグリシルペプチドシン
セターゼ酵素は極めて高い特異性を有している。ペプチ
ドのＮ−木端アミノ敵の１番目の位置のグリシンは、こ
の目的のための基質活性に対して臨界的であり、１査目
の位置にアラニンな有するペプチドは、この酵素に対す
る基質として機能しない。また２番目の位置のＬ−アス
ハラｊｒ’Ｔンをアスパラギン酸、ナロシン、フェニル
アラニンあるいはＤ−アスパラギンステレオアイソマー
に置換した場合には、不活性な基質となることも判った
。同様に、Ｎ−末端グリシンを有する短いペプチドある
いは長いペプチドもテストした質、不活性であった。即
ち、以下に示す如きペプチドも不活性な基質であった。
ルＣＯＡに対して、ミリストイルグリシルペプチドシン
セターゼ酵素は極めて高い特異性を有している。ペプチ
ドのＮ−木端アミノ敵の１番目の位置のグリシンは、こ
の目的のための基質活性に対して臨界的であり、１査目
の位置にアラニンな有するペプチドは、この酵素に対す
る基質として機能しない。また２番目の位置のＬ−アス
ハラｊｒ’Ｔンをアスパラギン酸、ナロシン、フェニル
アラニンあるいはＤ−アスパラギンステレオアイソマー
に置換した場合には、不活性な基質となることも判った
。同様に、Ｎ−末端グリシンを有する短いペプチドある
いは長いペプチドもテストした質、不活性であった。即
ち、以下に示す如きペプチドも不活性な基質であった。
（）１ｙ−Ａｓｎ 。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ 。
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ ０この最後のペプチド
は、基質として使用することができなかった。またこれ
ら丁ぺては、活性ペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇのミリストイル
化を起こすことが出来なかった。
ｙｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ ０この最後のペプチド
は、基質として使用することができなかった。またこれ
ら丁ぺては、活性ペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇのミリストイル
化を起こすことが出来なかった。
Ｂａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
プロテアーゼ欠損株Ｊ Ｒ１５３（Ｈ６Ｈ６ｌｍｍ１ｎ
ら、Ｐｒｏ、 Ｎａｔｌ、 Ａｅａｄ。
プロテアーゼ欠損株Ｊ Ｒ１５３（Ｈ６Ｈ６ｌｍｍ１ｎ
ら、Ｐｒｏ、 Ｎａｔｌ、 Ａｅａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７８ ＊ ４３５−４３９ （
１９８１） ）を、Ｎ−ミリストイルグリシルペプテド
シンセタ−ゼの原料として用いて、オクタペプチドのア
シル化を証明した。この酵母を（３Ｈ”Ｊ”ｌＪスナン
酸でラベル化し、細胞を溶解し次いでドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドｒル電気泳動（ＳＤＳ −Ｐ
ＡＧＥ ）で細胞蛋白鋼を分析した所、この株は内因性
のＮ −ｚ ’）ストイル化蛋白質な舊していることが
判った。プロナーゼで消化し、分離し次いで逆相ＨＰＬ
Ｃで分析することにより、Ｎ−（３Ｈ）ミリストイル化
グリシンを、ラベル化した内因性のアシル化蛋白質から
単離することができた。
１９８１） ）を、Ｎ−ミリストイルグリシルペプテド
シンセタ−ゼの原料として用いて、オクタペプチドのア
シル化を証明した。この酵母を（３Ｈ”Ｊ”ｌＪスナン
酸でラベル化し、細胞を溶解し次いでドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドｒル電気泳動（ＳＤＳ −Ｐ
ＡＧＥ ）で細胞蛋白鋼を分析した所、この株は内因性
のＮ −ｚ ’）ストイル化蛋白質な舊していることが
判った。プロナーゼで消化し、分離し次いで逆相ＨＰＬ
Ｃで分析することにより、Ｎ−（３Ｈ）ミリストイル化
グリシンを、ラベル化した内因性のアシル化蛋白質から
単離することができた。
ＢＣ３Ｈ１細胞（５ｃｌｌｕｂｅｒｔ らの報告した
マウス筋肉セ、ｖライン（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂ１０１
．６１ ＊ ３９８−４１３（１９７４）］を用いて
、同様にして、より高度な真核生物の細胞内に存在する
Ｎ−ミリストイル化酵素によるオクタペプチドのアシル
化を証明した。
マウス筋肉セ、ｖライン（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂ１０１
．６１ ＊ ３９８−４１３（１９７４）］を用いて
、同様にして、より高度な真核生物の細胞内に存在する
Ｎ−ミリストイル化酵素によるオクタペプチドのアシル
化を証明した。
以下に、本発明を実施例を用いて更に詳細に説明するが
、本発ＩＭはこれら実施例になんら限定されるものでは
ない。
、本発ＩＭはこれら実施例になんら限定されるものでは
ない。
実施例１
本明細書に示す全てのペプチドは、比較基質である標準
コントロールペプチドの以下に記載した製造方法に１本
質的に従って調製した。
コントロールペプチドの以下に記載した製造方法に１本
質的に従って調製した。
Ａ、 Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２の合成 ）Ａｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法［： Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ ｈ Ｊ。
ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ２の合成 ）Ａｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法［： Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ ｈ Ｊ。
Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、 Ｓａｃ、 、 ８５ 、２１４
９−２１５４（１９６３）〕に従い、樹脂１ｇ当り０．
３５ｆｉＪのアミノ基を置換基として有するｐ−メチル
ベンズヒドリルアミン上にペプチドを合成した。ＢＯＣ
で保腹したアミノ酸を用い、このアミノ酸とジクロロへ
キシルカルボジイミドとを２：１の割合でジクロロメタ
ン中で１５分間混合して対称性の無水物を形成した。浴
媒を減圧下に留去し、無水物をジメチルホルムアミドに
再溶解して、樹脂と混合し、次いで１時間激しく攪拌し
た。アスパラギンとの反応では（グルタミン、アルギニ
ノの場合モ同様）、等モル（アミノ酸に基づく）のヒド
ロキシベンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。
９−２１５４（１９６３）〕に従い、樹脂１ｇ当り０．
３５ｆｉＪのアミノ基を置換基として有するｐ−メチル
ベンズヒドリルアミン上にペプチドを合成した。ＢＯＣ
で保腹したアミノ酸を用い、このアミノ酸とジクロロへ
キシルカルボジイミドとを２：１の割合でジクロロメタ
ン中で１５分間混合して対称性の無水物を形成した。浴
媒を減圧下に留去し、無水物をジメチルホルムアミドに
再溶解して、樹脂と混合し、次いで１時間激しく攪拌し
た。アスパラギンとの反応では（グルタミン、アルギニ
ノの場合モ同様）、等モル（アミノ酸に基づく）のヒド
ロキシベンゾトリアゾールを反応混合物中に加えた。
ＢＯＣ保穫基を、５０％トリフルオロ酢酸（ＴＦ’Ａ
）のジクロロメタン溶液を用いて脱離せしめ、アミノ酸
との縮合反応を行なう前に、１０％ジイソプロぎルエチ
ルアミンのジメチルホルムアミドＰＭ ？ａで中和した
。
）のジクロロメタン溶液を用いて脱離せしめ、アミノ酸
との縮合反応を行なう前に、１０％ジイソプロぎルエチ
ルアミンのジメチルホルムアミドＰＭ ？ａで中和した
。
ペプチドを樹脂から脱離せしめ、液体ＨＦ／アニソール
（９： １ 、 Ｖ／Ｖ ）を用いて０ ’Ｃで１時間
で脱保護せしめた。粗ペプチドを、５ｏ％酢酸水浴液で
樹脂から抽出し、凍結乾燥した。
（９： １ 、 Ｖ／Ｖ ）を用いて０ ’Ｃで１時間
で脱保護せしめた。粗ペプチドを、５ｏ％酢酸水浴液で
樹脂から抽出し、凍結乾燥した。
Ｂ、精製
粗ペプチドを水に浴解し、ｗａｔｅｒｓ μｍＢｏｎｄ
ａｐａｋＣ１Ｂカラム（１９朋ｘ １５０ ｍｒｐｔ
） ｋＣ付し、０−１５％アセトニトリルＣ０，０５％
ＴＦＡ ） ｔｖ水ｆｅｒｎ（０，０５％ＴＦ’Ａ ）
の勾配で、流速９ ｍｌ ／ ｍｉｎで１５分間溶出せ
しめた。生成物を含む画分を集めて凍結乾燥し、ペプチ
ドの同定及び純度ｙ１１定全、アミノ酸分析、ＨＰＬＣ
によ）行なった。
ａｐａｋＣ１Ｂカラム（１９朋ｘ １５０ ｍｒｐｔ
） ｋＣ付し、０−１５％アセトニトリルＣ０，０５％
ＴＦＡ ） ｔｖ水ｆｅｒｎ（０，０５％ＴＦ’Ａ ）
の勾配で、流速９ ｍｌ ／ ｍｉｎで１５分間溶出せ
しめた。生成物を含む画分を集めて凍結乾燥し、ペプチ
ドの同定及び純度ｙ１１定全、アミノ酸分析、ＨＰＬＣ
によ）行なった。
実施例２
酵母（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、、ｒＲ１５３，
９配型ａｌｐｈａ、 ｚｒｐｌ、 ｐｒｄｌ、 ｐｒｃ
Ｌ ｐｅｐ ４−３ ）を、ロータリーシェーカーのＹ
ＰＯ培地（１係酵母抽出物、２％バタトペゾトン、２％
デキストロース蒸留水浴液）中で６０°Ｃで生育せしめ
て、光学密度が６６０ ｎｍで１−３となるようにした
。酵母培養液の１５ｍＪアリコートを、〔３Ｈ〕脂肪酸
１ ｍＣｉのエタノール溶液１０μｌを加えて同様の条
件下で３０分間ラベル化した。ラベル化反応の終シに、
培養液を氷で５分間冷却し、４℃で７６００ ｘｇで１
０分間遠心してａ＠をペレット化した。次いで細胞を、
ｉ Ｑ ｍＭ ＮａＮ３の１４０ ｍＭ Ｎａ（Ｊ ／
１０二Ｍホスフェート浴液（ｐＨ７，２）１ｍＪに再
懸濁せしめ、ポリプロピレン製の円椎状の１．５凝遠心
チユーブに移し、４℃で上記したと同様にして遠心して
細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を、５ＩｎＭＴｒｉ
ｓ （ｐＨ７，４）、３ ｍＭジスレイトール、１％Ｓ
ＤＳ及ヒ１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド
を含む溶液１００μｌに懸濁し、氷で冷却しながら、６
０秒間の渦動を６回行ない、細Ｉ＠１個と等容量の０．
５１がラスビーズで細＠を崩壊した。テーブルトップ（
ｚａｂｌｅ ｚｏｐ ） Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で
８００ 口ｘｇで６０秒間遠心して細胞の破片を除いた
。次いで、上清液を、８Ｉ１１ＭＴｒｉｓ （Ｐ）１８
．０ ） １２ Ｓ ｐｉ中で、室温下１時間、２０ｍ
Ｍヨードアセトアミドによジアルキル化した。２０μ！
アリコート１Ｄ１慣用的５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び０１ｓｏ
ｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９．５３６４’−
５３６７（１９８４）に記載されたと本質的に同様のフ
ルオログラフィー法によシ分析した。
９配型ａｌｐｈａ、 ｚｒｐｌ、 ｐｒｄｌ、 ｐｒｃ
Ｌ ｐｅｐ ４−３ ）を、ロータリーシェーカーのＹ
ＰＯ培地（１係酵母抽出物、２％バタトペゾトン、２％
デキストロース蒸留水浴液）中で６０°Ｃで生育せしめ
て、光学密度が６６０ ｎｍで１−３となるようにした
。酵母培養液の１５ｍＪアリコートを、〔３Ｈ〕脂肪酸
１ ｍＣｉのエタノール溶液１０μｌを加えて同様の条
件下で３０分間ラベル化した。ラベル化反応の終シに、
培養液を氷で５分間冷却し、４℃で７６００ ｘｇで１
０分間遠心してａ＠をペレット化した。次いで細胞を、
ｉ Ｑ ｍＭ ＮａＮ３の１４０ ｍＭ Ｎａ（Ｊ ／
１０二Ｍホスフェート浴液（ｐＨ７，２）１ｍＪに再
懸濁せしめ、ポリプロピレン製の円椎状の１．５凝遠心
チユーブに移し、４℃で上記したと同様にして遠心して
細胞を集めた。上清液を捨て、細胞を、５ＩｎＭＴｒｉ
ｓ （ｐＨ７，４）、３ ｍＭジスレイトール、１％Ｓ
ＤＳ及ヒ１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド
を含む溶液１００μｌに懸濁し、氷で冷却しながら、６
０秒間の渦動を６回行ない、細Ｉ＠１個と等容量の０．
５１がラスビーズで細＠を崩壊した。テーブルトップ（
ｚａｂｌｅ ｚｏｐ ） Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で
８００ 口ｘｇで６０秒間遠心して細胞の破片を除いた
。次いで、上清液を、８Ｉ１１ＭＴｒｉｓ （Ｐ）１８
．０ ） １２ Ｓ ｐｉ中で、室温下１時間、２０ｍ
Ｍヨードアセトアミドによジアルキル化した。２０μ！
アリコート１Ｄ１慣用的５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び０１ｓｏ
ｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９．５３６４’−
５３６７（１９８４）に記載されたと本質的に同様のフ
ルオログラフィー法によシ分析した。
還元され且つアルキル化された、〔３Ｈ〕脂肪酸ラベル
化蛋白負２０μｌ を、新たに調製した４Ｍヒドロキシ
ルアミン／ ２０ ｍＭ クリシフ（ｐｉ（１０）７μ
！で処理した。２６℃で４時間処理後、電気泳動用及び
上記したフルオログラフィー用にサンプルを調製した。
化蛋白負２０μｌ を、新たに調製した４Ｍヒドロキシ
ルアミン／ ２０ ｍＭ クリシフ（ｐｉ（１０）７μ
！で処理した。２６℃で４時間処理後、電気泳動用及び
上記したフルオログラフィー用にサンプルを調製した。
ＪＲ１５３の２ ［１，０００ダルトンのアシル蛋白質
への、〔３Ｈ〕ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定
化結合を測定するため、脂肪酸を加える前にセルレニン
２μｇ／ｍｌで１５分間細胞を処理する以外は前記した
と同様にして培養液をラベル化した。
への、〔３Ｈ〕ミリスチン酸のヒドロキシルアミン安定
化結合を測定するため、脂肪酸を加える前にセルレニン
２μｇ／ｍｌで１５分間細胞を処理する以外は前記した
と同様にして培養液をラベル化した。
セルレニンは、酵母の脂肪酸合成の抑制因子として知ら
れたものであＪ、ＪＲ１５３の特定のアシル蛋白質のラ
ベル化を数倍に促進するものである。
れたものであＪ、ＪＲ１５３の特定のアシル蛋白質のラ
ベル化を数倍に促進するものである。
次いで細胞蛋白質を調製し、前記したと同様にしＣＳＤ
８１２％ポリアクリルアミドデル電気泳動によシ分離し
た。この時、サンプルレーンに隣接して、あらかじめ発
色した分子量標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電
気泳動後１．２０，０００ダルトンの分子量領域におけ
る、未乾燥デルサンプルレーンから、２龍のゲルスライ
スを切シ出した。
８１２％ポリアクリルアミドデル電気泳動によシ分離し
た。この時、サンプルレーンに隣接して、あらかじめ発
色した分子量標準蛋白質を同時に電気泳動に付した。電
気泳動後１．２０，０００ダルトンの分子量領域におけ
る、未乾燥デルサンプルレーンから、２龍のゲルスライ
スを切シ出した。
ケ９ルスライスを、１０ｃｌ）メタノール水’Ｒ１ａ
０．５ ｍｌで素早くリンスし、次いで、Ｌａｂｑｕａ
ｋｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、 Ｂｅｒ
ｋｌｅｙ、 ４Ａ）で混合しながら５ Ｑ ｍＭ ＠炭
酸アンモニウム１廐中で、６７°Ｃで７２時間、プロナ
ーゼＥ （Ｓｉｇｍａ、 ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。
０．５ ｍｌで素早くリンスし、次いで、Ｌａｂｑｕａ
ｋｅミキサー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、 Ｂｅｒ
ｋｌｅｙ、 ４Ａ）で混合しながら５ Ｑ ｍＭ ＠炭
酸アンモニウム１廐中で、６７°Ｃで７２時間、プロナ
ーゼＥ （Ｓｉｇｍａ、 ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。
Ｋ１０）１〜を用いてそれぞれ消化した。微生物の生育
を抑えるために、消化１検体轟夛、１μｌのトルエンを
加えた。２４時間後に、新たなプロナーゼＥ１ｆｆｌｆ
を加えた。消化後、それぞれの消化体のアリコートにつ
いて放射活性を測定した。放射活性を有するスライスか
ら消化体を除き、ｒルスライスを０．１％ＳＤＳ ５０
０μノ で１回リンスし、消化体とリンス４４合わせ、
４ ＮＨ（Ｊ ４０μｌで−１−２とした。酸性化され
た溶液を、クロロホルム−メタノール（２： １ ＋’
Ｖ／ｖ）ｉ、５ｆｆｉｌで２回抽出した。有機層を集め
て、クロロホルム−メタノール−〇、０１ＮＨＣＪ（１
：１０：１０．ｖ／ｖ／ｖ）で１回洗浄し、有機層を窒
素気流で乾燥した。得られる残渣を、５０％メタノール
−５０％ＨＰＬＣバッファーＡ（後記参照）に再溶解し
た。抽出操作後に、もとの蛋白質消化体の放射活性の９
７％が回収された。サンプルを、Ｗａｚｅｒｓ μｍＢ
ｏｎｄａｐａｋＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに付
し、バッファーＡとして０．１係トリフルオロ酢酸１０
．０５％トリエチルアミン水浴液、バッファーＢとして
０．１係トリフルオロ酢酸のアセトニトリルｈａを用い
１分間当シ１％のアセトニトリル景が上昇する勾配で流
速１ｒｎｌ ／ ｍｉｎで溶出せしめた。１分間のフラ
クションヲ集め、液体シンチレーションカクンターで放
射活性を測定した。ミリストイル−〔３Ｈ〕グリシン標
準物質は、ＴｏｗｌｅｒとＧｌａｓｅｒ 。
を抑えるために、消化１検体轟夛、１μｌのトルエンを
加えた。２４時間後に、新たなプロナーゼＥ１ｆｆｌｆ
を加えた。消化後、それぞれの消化体のアリコートにつ
いて放射活性を測定した。放射活性を有するスライスか
ら消化体を除き、ｒルスライスを０．１％ＳＤＳ ５０
０μノ で１回リンスし、消化体とリンス４４合わせ、
４ ＮＨ（Ｊ ４０μｌで−１−２とした。酸性化され
た溶液を、クロロホルム−メタノール（２： １ ＋’
Ｖ／ｖ）ｉ、５ｆｆｉｌで２回抽出した。有機層を集め
て、クロロホルム−メタノール−〇、０１ＮＨＣＪ（１
：１０：１０．ｖ／ｖ／ｖ）で１回洗浄し、有機層を窒
素気流で乾燥した。得られる残渣を、５０％メタノール
−５０％ＨＰＬＣバッファーＡ（後記参照）に再溶解し
た。抽出操作後に、もとの蛋白質消化体の放射活性の９
７％が回収された。サンプルを、Ｗａｚｅｒｓ μｍＢ
ｏｎｄａｐａｋＣ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに付
し、バッファーＡとして０．１係トリフルオロ酢酸１０
．０５％トリエチルアミン水浴液、バッファーＢとして
０．１係トリフルオロ酢酸のアセトニトリルｈａを用い
１分間当シ１％のアセトニトリル景が上昇する勾配で流
速１ｒｎｌ ／ ｍｉｎで溶出せしめた。１分間のフラ
クションヲ集め、液体シンチレーションカクンターで放
射活性を測定した。ミリストイル−〔３Ｈ〕グリシン標
準物質は、ＴｏｗｌｅｒとＧｌａｓｅｒ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｚｒｙ２５ａ ８７８−８８４（１
９８６）に記載されたと本質的に同様の方法によシ合成
し前記した如くにしてＨＰＬＣで分析した。
９８６）に記載されたと本質的に同様の方法によシ合成
し前記した如くにしてＨＰＬＣで分析した。
脂肪酸アシル化ペプチド標準物質の合成放射活性を有す
る対称性のミリスチン酸あるいはパルミチン酸の無水物
と、（）ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ −Ａ
ｌａ −Ａｒ ｇ−Ａｒ ｇとをビリシン中で反応せし
めてアシル化ペプチド標準物質の合成を行った。〔３Ｈ
〕脂肪酸１Ｑ Ｑ ｚｃｉを、それぞれの脂肪酸クロラ
イド４μｊで処理し、次いでそれぞれの非放射活性脂肪
酸４．８ηを含むピリジン１５０μ！中にＭ＆′せしめ
た。２６６Ｃで６０分間反応を進行せしめた。
る対称性のミリスチン酸あるいはパルミチン酸の無水物
と、（）ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ −Ａ
ｌａ −Ａｒ ｇ−Ａｒ ｇとをビリシン中で反応せし
めてアシル化ペプチド標準物質の合成を行った。〔３Ｈ
〕脂肪酸１Ｑ Ｑ ｚｃｉを、それぞれの脂肪酸クロラ
イド４μｊで処理し、次いでそれぞれの非放射活性脂肪
酸４．８ηを含むピリジン１５０μ！中にＭ＆′せしめ
た。２６６Ｃで６０分間反応を進行せしめた。
次いで、この溶液の６５ ｔｔｌを、Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ４
００−５００Ｍｇに加えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサー
で混合しながら、反応を１晩進行せしめた。次いで、ピ
リジンを減圧下に留去し、得られる残渣を石油エーテル
０．６Ｍで２回抽出し、５０％メタノール水溶液４００
μｌに再溶解した。反応生成物を精製し、前記したと同
様にして逆相ＨＰＬＣで分析した。化学合成標準物質と
酵素生成物とは、いずれもプロナーゼＥで消化された。
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ ４
００−５００Ｍｇに加えた。Ｌａｂｑｕａｋｅミキサー
で混合しながら、反応を１晩進行せしめた。次いで、ピ
リジンを減圧下に留去し、得られる残渣を石油エーテル
０．６Ｍで２回抽出し、５０％メタノール水溶液４００
μｌに再溶解した。反応生成物を精製し、前記したと同
様にして逆相ＨＰＬＣで分析した。化学合成標準物質と
酵素生成物とは、いずれもプロナーゼＥで消化された。
またこれらを、前記したと同様にして２０．０００ダル
トンのアシル化蛋白質について逆相ＨＰＬＣで分析した
。但しこの場合消化を完全に行なうためにはプロナーゼ
２００μｇで十分であった。
トンのアシル化蛋白質について逆相ＨＰＬＣで分析した
。但しこの場合消化を完全に行なうためにはプロナーゼ
２００μｇで十分であった。
酵母培養物を、前記したと同様にして生育せしめて、６
６０ ｎｍでのＯ，Ｄ、を１−３とした。培養液４Ｑｔ
ｎｌを、４６Ｃで７６’００ ｘｇで１０分間遠心して
細＠を集めた。上清液をデカンテーションし次いで、冷
却した１ ０ｍＴｒｉｓ （ｐ）１７．４ ） ｉＵに
細胞ペレットをピペットで移し、次いでポリプロピレン
製の円椎状の１．５Ｍ遠心チューブに移して４°Ｃで７
６００ ｘｇで１０分間遠心し℃、ＭＪｉ＠を再びペレ
ット化した。次いでａＵ＠を、コールドアツセイ溶解バ
ッファー（１０ｍＭ Ｔｒｌｓ （ｐＨ７，４）ｔｉｍ
Ｍジテオスレイトール、０．１ｍＭエチレングリコール
−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ。
６０ ｎｍでのＯ，Ｄ、を１−３とした。培養液４Ｑｔ
ｎｌを、４６Ｃで７６’００ ｘｇで１０分間遠心して
細＠を集めた。上清液をデカンテーションし次いで、冷
却した１ ０ｍＴｒｉｓ （ｐ）１７．４ ） ｉＵに
細胞ペレットをピペットで移し、次いでポリプロピレン
製の円椎状の１．５Ｍ遠心チューブに移して４°Ｃで７
６００ ｘｇで１０分間遠心し℃、ＭＪｉ＠を再びペレ
ット化した。次いでａＵ＠を、コールドアツセイ溶解バ
ッファー（１０ｍＭ Ｔｒｌｓ （ｐＨ７，４）ｔｉｍ
Ｍジテオスレイトール、０．１ｍＭエチレングリコール
−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ。
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＣ）ＴＡ ）及び１０
μ９／ｍｌ ７ゾロテニン〕４００μｌにピペットで移
して再懸濁せしめた。０．５前がラスビーズ約４００μ
ｌを、再懸濁した細胞に加え、前記した放射活性ラベル
化細胞の崩壊の時と同様にして渦動せしめて細＠を溶解
した。ビーズが静置後、溶解物を集め、細胞の破片を、
４℃で１０００ ｘｇで１０分間遠心して除いた。次い
で上清液を、ＢｅＣｋｍａｎ７５ＴｉＯ−ター中で、４
℃で４５．０００ ｒｐｍで６０分間遠心した。上清液
を除き、粗膜ペレットを、コールドアッセイ溶解バッフ
ァー４００μｌにピペットで移して再懸濁した。３つの
細胞フラクションのアリコートについて、すぐに分析す
るかあるいは一６０°で保存した。粗膜ペレットの活性
は、−６０°で少なくとも３ケ月間安定であった。
μ９／ｍｌ ７ゾロテニン〕４００μｌにピペットで移
して再懸濁せしめた。０．５前がラスビーズ約４００μ
ｌを、再懸濁した細胞に加え、前記した放射活性ラベル
化細胞の崩壊の時と同様にして渦動せしめて細＠を溶解
した。ビーズが静置後、溶解物を集め、細胞の破片を、
４℃で１０００ ｘｇで１０分間遠心して除いた。次い
で上清液を、ＢｅＣｋｍａｎ７５ＴｉＯ−ター中で、４
℃で４５．０００ ｒｐｍで６０分間遠心した。上清液
を除き、粗膜ペレットを、コールドアッセイ溶解バッフ
ァー４００μｌにピペットで移して再懸濁した。３つの
細胞フラクションのアリコートについて、すぐに分析す
るかあるいは一６０°で保存した。粗膜ペレットの活性
は、−６０°で少なくとも３ケ月間安定であった。
蛋白質はＰｅｚｅｒｓｏｎの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 ８３１６４６−３５６（１９７７））によシ
測定した。
ｈｅｍ、 ８３１６４６−３５６（１９７７））によシ
測定した。
Ｎ−ミリストイルグリシルペプテドシンセターセゞ活性
の分析 以下の如くにして、〔３Ｈ〕脂肪酸アシル化ＣｏＡを酵
素的に合成し、インキュベーション体に加えた。アシル
ＣｏＡシンセターゼ反応は以下のものから構成される（
アッセイチューブ１個当り）。即ち、〔３Ｈ〕ミリスチ
ン酸０．５μＣｉ；２ＸアツセイバツフアーＣ２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐｉ（７，４） 、 ２ｍＭゾテオスレイ
トール、 １０ ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２ 、’ ０．２ ｍ
ＭＥＣ）ＴＡ 〕２５ ｔｔｌ ； ５ ｍＭ Ａ’［
’ｐ蒸留水浴液５μ）（ＮａＯＨでｐｉ−１７，０に調
ｕ ） ｙ ２０ ｍＭリチワムＣｏＡの蒸留水浴液２
．５ ｐｉ ； ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアシルＣｏＡ
シンセターゼ１ｍＵ ／ μｉの５ ［１ｍＭ Ｎ −
２−ヒドロキシエチルヒヘラジンーＮ’−２−エタンス
ルホン酸浴液（阻７．３ ） １５μｌ：及び蒸留水２
．５μｌから構成される。反応を３０°Ｃで２０分間進
行せしめた。Ｈｏ５ａｋａらの方法［Ｍｅｚｈ、 Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、 ７’Ｉａ３２５−３３３（１９８１））
の変法によ）測定した所、典型的には〔３Ｈ〕脂肪酸の
４０％−５０係が、この方法にニジそのＣｏＡエステル
に変換された。この変法は、６ ＮＨＣＪでｐ）１２．
０に酸性化し、５倍容量のヘプトンで６回抽出後に、反
応液中に残存する放射活性を測定して分析する方法であ
る。
の分析 以下の如くにして、〔３Ｈ〕脂肪酸アシル化ＣｏＡを酵
素的に合成し、インキュベーション体に加えた。アシル
ＣｏＡシンセターゼ反応は以下のものから構成される（
アッセイチューブ１個当り）。即ち、〔３Ｈ〕ミリスチ
ン酸０．５μＣｉ；２ＸアツセイバツフアーＣ２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐｉ（７，４） 、 ２ｍＭゾテオスレイ
トール、 １０ ｍＭ Ｍｇ（Ｊ２ 、’ ０．２ ｍ
ＭＥＣ）ＴＡ 〕２５ ｔｔｌ ； ５ ｍＭ Ａ’［
’ｐ蒸留水浴液５μ）（ＮａＯＨでｐｉ−１７，０に調
ｕ ） ｙ ２０ ｍＭリチワムＣｏＡの蒸留水浴液２
．５ ｐｉ ； ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアシルＣｏＡ
シンセターゼ１ｍＵ ／ μｉの５ ［１ｍＭ Ｎ −
２−ヒドロキシエチルヒヘラジンーＮ’−２−エタンス
ルホン酸浴液（阻７．３ ） １５μｌ：及び蒸留水２
．５μｌから構成される。反応を３０°Ｃで２０分間進
行せしめた。Ｈｏ５ａｋａらの方法［Ｍｅｚｈ、 Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、 ７’Ｉａ３２５−３３３（１９８１））
の変法によ）測定した所、典型的には〔３Ｈ〕脂肪酸の
４０％−５０係が、この方法にニジそのＣｏＡエステル
に変換された。この変法は、６ ＮＨＣＪでｐ）１２．
０に酸性化し、５倍容量のヘプトンで６回抽出後に、反
応液中に残存する放射活性を測定して分析する方法であ
る。
この反応液５０μノヲ、アッセイ抽出バッファー（前記
参照） ４０ ｔｉｌｌ及び１ ｍＭ Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
１０ ｐｌを含むチューブに加えた。チューブ１個当シ
酵母細胞抽出物１０μｌ（典型的には蛋白質５０μ９）
を加えて６０℃で１０分間インキュベーションしてアッ
セイを開始した。１チユーブ当υメタノール１１０μｌ
及び１００％トリクロロ酢酸（ｗ／’ｖ ） １０ ｔ
ｔｌ ｔ−加えて氷で１０分間冷却してアッセイを終止
した。沈誠した蛋白質を、テーブルトップＥｐｅｎｄｏ
ｒｆ遠心機で８０００ ｘｇで６会商遠心して除いた（
この条件下では、合成Ｃ’ＨＩ ミリストイルペプチド
あるいは〔３Ｈ〕バルミトイルペプチドの９５％は、ア
ッセイ混合物に加えた時溶解した１まである）。
参照） ４０ ｔｉｌｌ及び１ ｍＭ Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
１０ ｐｌを含むチューブに加えた。チューブ１個当シ
酵母細胞抽出物１０μｌ（典型的には蛋白質５０μ９）
を加えて６０℃で１０分間インキュベーションしてアッ
セイを開始した。１チユーブ当υメタノール１１０μｌ
及び１００％トリクロロ酢酸（ｗ／’ｖ ） １０ ｔ
ｔｌ ｔ−加えて氷で１０分間冷却してアッセイを終止
した。沈誠した蛋白質を、テーブルトップＥｐｅｎｄｏ
ｒｆ遠心機で８０００ ｘｇで６会商遠心して除いた（
この条件下では、合成Ｃ’ＨＩ ミリストイルペプチド
あるいは〔３Ｈ〕バルミトイルペプチドの９５％は、ア
ッセイ混合物に加えた時溶解した１まである）。
上清液５０μｌを、メタノール７５μｌ及びＨＰＬＣバ
ッファーＡ ７５ μｉと混合し、３０ ＧｒｒＬＷａ
ｚｅｒｓ μｍＢｏｎｄａｐａｋ ＣＢカラムの６．９
目及び前記したと同じＨＰＬＣバッファーを用いて逆相
ＨＰＬＣによシ分析した。３５％アセトニトリルで溶出
をスタートし、次いで１分間当り１％のアセトニトリル
量が上昇する勾配で溶出せしめた。１分間のフラクショ
ンを集め、それぞれのフラクションの放射活性を、液体
シンチレーションカウンターで測定した。
ッファーＡ ７５ μｉと混合し、３０ ＧｒｒＬＷａ
ｚｅｒｓ μｍＢｏｎｄａｐａｋ ＣＢカラムの６．９
目及び前記したと同じＨＰＬＣバッファーを用いて逆相
ＨＰＬＣによシ分析した。３５％アセトニトリルで溶出
をスタートし、次いで１分間当り１％のアセトニトリル
量が上昇する勾配で溶出せしめた。１分間のフラクショ
ンを集め、それぞれのフラクションの放射活性を、液体
シンチレーションカウンターで測定した。
〔３Ｈ〕−ミリストイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは２４分後に溶
出し、〔３Ｈ〕バルミトイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは３０分後
に浴出した。
ｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは２４分後に溶
出し、〔３Ｈ〕バルミトイル−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇは３０分後
に浴出した。
結果
前述した如くにして調整した［３Ｈ） −ミ！ｊストイ
ルグリシルペプチド及び〔３Ｈ〕バルミトイルグリシル
ペプチドの化学合成標準物質は、サンプルの分析と同様
の条件下で、逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９％
アセトニトリル、６５％アセトニトリルの時に浴出した
。細胞溶解調製物は、粗膜７ラクシヨンと溶解フラクシ
ョンに分別きれ、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシ
ンセターゼ活性は、粗膜フラクションと溶解フラクショ
ンの両者で検出された。全比活性、溶解フラクションの
比活性及び膜フラクションの比活性は、それぞれ１０分
間アッセイでの蛋白質１μｇ当！Ｄ、１４１０゜１３２
０ 、２２６０ ｄｐｎであった。最初の反応速度から
判断して、活性の６５％は粗膜フラクション中に存在し
ているものと考えられる。
ルグリシルペプチド及び〔３Ｈ〕バルミトイルグリシル
ペプチドの化学合成標準物質は、サンプルの分析と同様
の条件下で、逆相ＨＰＬＣカラムから、それぞれ５９％
アセトニトリル、６５％アセトニトリルの時に浴出した
。細胞溶解調製物は、粗膜７ラクシヨンと溶解フラクシ
ョンに分別きれ、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシ
ンセターゼ活性は、粗膜フラクションと溶解フラクショ
ンの両者で検出された。全比活性、溶解フラクションの
比活性及び膜フラクションの比活性は、それぞれ１０分
間アッセイでの蛋白質１μｇ当！Ｄ、１４１０゜１３２
０ 、２２６０ ｄｐｎであった。最初の反応速度から
判断して、活性の６５％は粗膜フラクション中に存在し
ているものと考えられる。
酵素反応生成物と化学的に合成した標準物質〔３Ｈ〕−
ミリストイルペプチドは、同じであシ、グリシンに共有
結合したミリステートラ有していることが、前記した逆
相ＨＰＬＣで分析した時に証明された。
ミリストイルペプチドは、同じであシ、グリシンに共有
結合したミリステートラ有していることが、前記した逆
相ＨＰＬＣで分析した時に証明された。
ペプチド基質に対するＮ−ミリストイルグリシルペプチ
ドの特異性を証明するために、他のグリシルペプチドが
（）ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ａｒｇのアシル化を競争的に抑制する能力を調
べた。
ドの特異性を証明するために、他のグリシルペプチドが
（）ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ａｒｇのアシル化を競争的に抑制する能力を調
べた。
下記する表Ｉのテスト１から明らかなように、１ｍＭジ
ペプチド、１ｍＭテトラペプチド、１ｍＭデカペプチド
のいずれも、１８μＭペグチドのミリストイル化に対し
て何んらの効果も及はさなかった（約匂のｎ値）。しか
して、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターセ
゛は、オクタペプチド基質に対して特異性を示すことが
判る。
ペプチド、１ｍＭテトラペプチド、１ｍＭデカペプチド
のいずれも、１８μＭペグチドのミリストイル化に対し
て何んらの効果も及はさなかった（約匂のｎ値）。しか
して、Ｎ−ミリストイルグリシルペプチドシンセターセ
゛は、オクタペプチド基質に対して特異性を示すことが
判る。
表−■
ミリストイルペプチドの
テ ス ト 合成速度
ＤＰＭＸ１０３／１０ ｍ１ｎ
１ コントロール １１１− ＡＴ
Ｐ ９− ＣｏＡ
１２ コントロール
８３加熱した膜フラクション
２（５ｍ１ｎ／６５°） ３ コントロール ２６．７＋
ｉ ｍＭ ＧＮ ２８．０＋
１ ｍＭ ＧＰＲＰ ２５．６＋
１ｍＭ Ｇ５５ＫＳＰＫＤＰＳ ２７．４酵
母からの粗膜７ラクシヨンを用いて上記表１の如く変化
せしめて、前記した如くにしてアッセイを行なった。テ
スト１では、アッセイのＡＴＰ及びＣｏＡに対する依存
性を、外因性の脂肪酸ＣｏＡ リが一ゼの非存在下にテ
ストした。テスト２では、酵母の酵素は熱に不安定であ
ることが証明されており、テスト３では、Ｎ−末端グリ
シンを含む他のペプチドでは反応は抑制されないことが
証明されている。このテストでは、可能な抑制効果を最
大限に発揮せしめるために、通常用いる９０μＭではな
く１８μＭのペプチド基質を用いて測定した。
Ｐ ９− ＣｏＡ
１２ コントロール
８３加熱した膜フラクション
２（５ｍ１ｎ／６５°） ３ コントロール ２６．７＋
ｉ ｍＭ ＧＮ ２８．０＋
１ ｍＭ ＧＰＲＰ ２５．６＋
１ｍＭ Ｇ５５ＫＳＰＫＤＰＳ ２７．４酵
母からの粗膜７ラクシヨンを用いて上記表１の如く変化
せしめて、前記した如くにしてアッセイを行なった。テ
スト１では、アッセイのＡＴＰ及びＣｏＡに対する依存
性を、外因性の脂肪酸ＣｏＡ リが一ゼの非存在下にテ
ストした。テスト２では、酵母の酵素は熱に不安定であ
ることが証明されており、テスト３では、Ｎ−末端グリ
シンを含む他のペプチドでは反応は抑制されないことが
証明されている。このテストでは、可能な抑制効果を最
大限に発揮せしめるために、通常用いる９０μＭではな
く１８μＭのペプチド基質を用いて測定した。
実施例６
実施例１と本質的に同様にして、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
の固相法によシ、本発明の他のペプチドを合成し次いで
酵母（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３）のミ
リストイル化酵素に対する基質としての活性をテストし
た。アッセイチューブ１個当夛（３ＨＥ−ミリスチン酸
１μＣ１を用いる以外は、実施例２のアッセイ条件と同
様にして、酵素に対するペプチド基質の特異性をテスト
した。本実施例で用いた酵母の酵素は、酵母の培養細胞
の粗ホモゾエネートを５１−７０％（ＮＨ４）２８０４
で分別し、ＢＥＡ五−セファロース［Ｆ］ＣＬ−（ＳＢ
（ファルマシャ）を用いたイオン又換カラムクロマトグ
ラフィー次いでＣｏＡ −アがロースアフィニティーマ
トリックス（ファルマシア）を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーで部分精製して得たものである。ペプ
チドは衣用に示すように、それぞれの動力学的データＫ
ｎ１ ｎ ”ｍａＸ Ｋよシ特徴付けを行なった。
の固相法によシ、本発明の他のペプチドを合成し次いで
酵母（Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲ１５３）のミ
リストイル化酵素に対する基質としての活性をテストし
た。アッセイチューブ１個当夛（３ＨＥ−ミリスチン酸
１μＣ１を用いる以外は、実施例２のアッセイ条件と同
様にして、酵素に対するペプチド基質の特異性をテスト
した。本実施例で用いた酵母の酵素は、酵母の培養細胞
の粗ホモゾエネートを５１−７０％（ＮＨ４）２８０４
で分別し、ＢＥＡ五−セファロース［Ｆ］ＣＬ−（ＳＢ
（ファルマシャ）を用いたイオン又換カラムクロマトグ
ラフィー次いでＣｏＡ −アがロースアフィニティーマ
トリックス（ファルマシア）を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーで部分精製して得たものである。ペプ
チドは衣用に示すように、それぞれの動力学的データＫ
ｎ１ ｎ ”ｍａＸ Ｋよシ特徴付けを行なった。
＊：標準コントロールオクタペプテＰのＶｍａＸは、部
分精製した酵母の酵素１ＴＩＬｇ当）の１分間（（形成
されるミリストイル化ペプチドの量２８４０ｐｍｏｌで
あった。
分精製した酵母の酵素１ＴＩＬｇ当）の１分間（（形成
されるミリストイル化ペプチドの量２８４０ｐｍｏｌで
あった。
実施例４
ＢＣ３Ｈｌマウスの筋肉細胞から、寿だミリストイル化
酵素に対するオクタペプチド基質特異性金、実施例２と
類似の方法によυ、いくつかのオクタペプチドについて
テストした。このマクス筋肉細胞は、０１ｓｏｎら、Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５８ 、２６４４−２
６５２（１９８３）に記載されたと本質的に同様の方法
によシ培養した。酵素のアッセイは、マウス筋肉細胞か
ら得た、核のない上？＃液のフラクションを用いて実施
した。トリクロロ酢酸−メタノールアッセイ上消液の５
０μｌについて、実施例２と本質的に同様にしてＨＰＬ
Ｃで分析した。
酵素に対するオクタペプチド基質特異性金、実施例２と
類似の方法によυ、いくつかのオクタペプチドについて
テストした。このマクス筋肉細胞は、０１ｓｏｎら、Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５８ 、２６４４−２
６５２（１９８３）に記載されたと本質的に同様の方法
によシ培養した。酵素のアッセイは、マウス筋肉細胞か
ら得た、核のない上？＃液のフラクションを用いて実施
した。トリクロロ酢酸−メタノールアッセイ上消液の５
０μｌについて、実施例２と本質的に同様にしてＨＰＬ
Ｃで分析した。
衣１では、このテストにおけるオクタペプチド基質の特
異性が示されている。
異性が示されている。
表１の標準コントロールペプチド（＊印を付けた）及び
最後のオクタペプチドは、他の３つのオクタペプチドに
比べて極めて高い活性を示した。
最後のオクタペプチドは、他の３つのオクタペプチドに
比べて極めて高い活性を示した。
他の６つのオクタペプチドは、バックグランドＤＰＭ
（１分間当シの分解量）に比べ１本質的に不活性であっ
た。
（１分間当シの分解量）に比べ１本質的に不活性であっ
た。
本明細書に用いたアミノ酸の略号は以下に示す意′＃、
を有する。
を有する。
Ｌ−アラニン Ａｌａ又はＡＬ−アルギニ
ン Ａｒｇ又はＲＬ−アスパラギン
Ａｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸 Ａｓｐ又は
ＤＬ−グルタミン Ｃ）Ｉｎ又はＱＬ−グリ
シン Ｇｌｙ又はＧＬ−ロイシン
Ｌｅｕ又はＬＬ−リシン Ｌｙｓ
又はＫＬ−フェニルアラニン Ｐｈｅ又はＦＬ−プ
ロリン Ｐｒｏ又はＰＬ−セリン
Ｓｅｒ又はＳＬ−チロシン Ｔｙ
ｒ又はＹＬ−バリン Ｖａｌ又はＶ本明
細書の記述から、本発明の精神及び範囲内での他の例は
、当業者にとって明らかであろう。
ン Ａｒｇ又はＲＬ−アスパラギン
Ａｓｎ又はＮＬ−アスパラギン酸 Ａｓｐ又は
ＤＬ−グルタミン Ｃ）Ｉｎ又はＱＬ−グリ
シン Ｇｌｙ又はＧＬ−ロイシン
Ｌｅｕ又はＬＬ−リシン Ｌｙｓ
又はＫＬ−フェニルアラニン Ｐｈｅ又はＦＬ−プ
ロリン Ｐｒｏ又はＰＬ−セリン
Ｓｅｒ又はＳＬ−チロシン Ｔｙ
ｒ又はＹＬ−バリン Ｖａｌ又はＶ本明
細書の記述から、本発明の精神及び範囲内での他の例は
、当業者にとって明らかであろう。
そしてかかる例も、不明ｍＵ替の特許請求の範囲内のも
のである。しかして、本明細書に記載した如き、ミリス
トイル化酵素に対する基質としての生物学的活性に不利
な、あるいは決定的な影響を及ぼさない限り１０個々の
アミノ酸及び／又はペプチドの長さを変えることは任意
であり、こ７１らの変化したものも、本明細書の特許請
求の範囲内のものである。
のである。しかして、本明細書に記載した如き、ミリス
トイル化酵素に対する基質としての生物学的活性に不利
な、あるいは決定的な影響を及ぼさない限り１０個々の
アミノ酸及び／又はペプチドの長さを変えることは任意
であり、こ７１らの変化したものも、本明細書の特許請
求の範囲内のものである。
Claims (12)
- （１）以下に示すアミノ酸配列からなる群より選ばれた
アミノ酸配列を有する、ミリストイル化酵素の基質ペプ
チド又はその生理学的に許容し得るアミド誘導体もしく
は塩誘導体： 【アミノ酸配列があります】又は 【アミノ酸配列があります】 （ここでＲはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＳｅｒ；Ｓは
Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ又はＳｅｒ； ＴはＡｌａ又はＬｙｅ； ＷはＡｌａ又はＳｅｒ； ＸはＡｌａ、Ｔｙｒ、又はＬｙｓ； ＹはＡｒｇ又はＰｒｏ； ＺはＡｒｇ、Ｌｅｕ又はＬｙｅを表わし、 但しＳ−Ｔ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚが Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒである
ときＲはＡｓｎでない。）。 - （２）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド： Ｇｌｙ−Ｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ（ここでＲはＧｌｎ又はＳｅｒを表わす）。 - （３）ＲがＳｅｒである特許請求の範囲第２項記載の基
質ペプチド。 - （４）ＲがＧｌｎである特許請求の範囲第２項記載の基
質ペプチド。 - （５）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド： Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ。 - （６）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド： Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ。 - （７）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド： Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ。 - （８）以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲
第１項記載の基質ペプチド： Ｇｌｙ−Ｒ−Ｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ（ここでＲはＡｌａ又はＡｓｎ、 ＳはＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＰｈｅを表わす）。 - （９）ＲがＡｓｎであり、ＳがＰｈｅである特許請求の
範囲第８項記載の基質ペプチド。 - （１０）アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ａｌａを有する特許請求の範囲第１項記載の
基質ペプチド。 - （１１）アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｓｅｒを有する特許請求の範囲第１項記載の基質ペプ
チド。 - （１２）特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１
項記載のアミノ酸配列となるようにアミノ酸を縮合せし
めることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第１１項
のいずれか１項記載の基質ペプチドを調製する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89423586A | 1986-08-07 | 1986-08-07 | |
| US924543 | 1986-10-29 | ||
| US06/924,543 US4740588A (en) | 1986-08-07 | 1986-10-29 | Novel substrate peptides |
| US894235 | 1986-10-29 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9003145A Division JPH09235295A (ja) | 1986-08-07 | 1997-01-10 | 新規基質ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6344597A true JPS6344597A (ja) | 1988-02-25 |
| JP2674753B2 JP2674753B2 (ja) | 1997-11-12 |
Family
ID=27129082
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62195443A Expired - Lifetime JP2674753B2 (ja) | 1986-08-07 | 1987-08-06 | 新規基質ペプチド |
| JP9003145A Pending JPH09235295A (ja) | 1986-08-07 | 1997-01-10 | 新規基質ペプチド |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9003145A Pending JPH09235295A (ja) | 1986-08-07 | 1997-01-10 | 新規基質ペプチド |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4740588A (ja) |
| EP (1) | EP0258203B1 (ja) |
| JP (2) | JP2674753B2 (ja) |
| AT (1) | ATE124955T1 (ja) |
| AU (1) | AU585167B2 (ja) |
| CA (1) | CA1308217C (ja) |
| DE (1) | DE3751398T2 (ja) |
| ES (1) | ES2076933T3 (ja) |
| GR (1) | GR3017297T3 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4709012A (en) * | 1986-08-07 | 1987-11-24 | Washington University | Novel inhibitor peptides |
| DE68901781T2 (de) * | 1988-02-03 | 1993-01-07 | Univ Washington | Enzymsubstrate auf der basis neuer fettsaeureanaloge. |
| US5073571A (en) * | 1988-06-16 | 1991-12-17 | Washington University | Method of inhibiting virus |
| US5082967A (en) * | 1988-06-16 | 1992-01-21 | Washington University | Novel fatty acid analog enzyme substrates |
| US5571689A (en) * | 1988-06-16 | 1996-11-05 | Washington University | Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid |
| US5320945A (en) * | 1989-07-14 | 1994-06-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of antithrombin III |
| CA2036965A1 (en) * | 1990-02-26 | 1991-08-27 | Robert J. Duronio | Method for protein n-myristoylation |
| US5444042A (en) * | 1990-12-28 | 1995-08-22 | Cortex Pharmaceuticals | Method of treatment of neurodegeneration with calpain inhibitors |
| US5362629A (en) * | 1991-08-05 | 1994-11-08 | President And Fellows Of Harvard College | Detection of immunosuppressants |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4320118A (en) * | 1980-12-22 | 1982-03-16 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Deca-, undeca-, dodeca- and tridecapeptides with thymic activity |
| EP0105481A1 (en) * | 1982-09-30 | 1984-04-18 | The Wellcome Foundation Limited | Novel antigens and vaccines containing them |
| FR2546164B1 (fr) * | 1983-05-16 | 1987-07-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux derives de peptides, leur preparation et leur application comme inhibiteurs de l'elastase |
| US4709012A (en) * | 1986-08-07 | 1987-11-24 | Washington University | Novel inhibitor peptides |
-
1986
- 1986-10-29 US US06/924,543 patent/US4740588A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
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