JPH09238677A - 非寄生原生生物からのヌクレオチド−糖合成酵素 - Google Patents
非寄生原生生物からのヌクレオチド−糖合成酵素Info
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- JPH09238677A JPH09238677A JP9050203A JP5020397A JPH09238677A JP H09238677 A JPH09238677 A JP H09238677A JP 9050203 A JP9050203 A JP 9050203A JP 5020397 A JP5020397 A JP 5020397A JP H09238677 A JPH09238677 A JP H09238677A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 非寄生原生生物からヌクレオチド−糖合成酵
素を提供すること。 【解決手段】 本発明は非寄生原生生物からのヌクレオ
チド−糖合成酵素（ヌクレオチジルトランスフェラーゼ
又はピロホスホリラーゼ活性を有する酵素）と、その製
造方法と、ヌクレオチド糖の製造へのその使用とに関す
る。本発明による酵素は低コストの先駆体から工業規模
での種々なヌクレオチド糖の酵素的合成を可能にするか
又は非常に容易にする。発見された酵素によって、例え
ばＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グ
ルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトー
ス、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを
経済的な量で製造することが可能である。
素を提供すること。 【解決手段】 本発明は非寄生原生生物からのヌクレオ
チド−糖合成酵素（ヌクレオチジルトランスフェラーゼ
又はピロホスホリラーゼ活性を有する酵素）と、その製
造方法と、ヌクレオチド糖の製造へのその使用とに関す
る。本発明による酵素は低コストの先駆体から工業規模
での種々なヌクレオチド糖の酵素的合成を可能にするか
又は非常に容易にする。発見された酵素によって、例え
ばＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グ
ルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトー
ス、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを
経済的な量で製造することが可能である。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明はヌクレオチド糖合成
酵素、即ち、非寄生原生生物からのヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ活性又はピロホスホリラーゼ活性を有す
る酵素と、その製造方法と、ヌクレオチド糖を製造する
ためのその使用とに関する。
酵素、即ち、非寄生原生生物からのヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ活性又はピロホスホリラーゼ活性を有す
る酵素と、その製造方法と、ヌクレオチド糖を製造する
ためのその使用とに関する。
【０００２】
【従来の技術】オリゴ糖と多糖類は、自然において重要
な役割を果たしている。これらは細胞伝達（communicat
ion）プロセスにおける糖タンパク質と糖脂質との成分
として並びに例えば抗体、レクチン及びホルモンの結合
部位として本質的に重要である。これらはまた、例えば
溶解度、安定性及び３Ｄ構造のような、タンパク質の物
理的性質を決定的に決定する。さらに、これらはウイル
ス、細菌及び原生生物によって仲介される病的状態の受
容体としても作用する。
な役割を果たしている。これらは細胞伝達（communicat
ion）プロセスにおける糖タンパク質と糖脂質との成分
として並びに例えば抗体、レクチン及びホルモンの結合
部位として本質的に重要である。これらはまた、例えば
溶解度、安定性及び３Ｄ構造のような、タンパク質の物
理的性質を決定的に決定する。さらに、これらはウイル
ス、細菌及び原生生物によって仲介される病的状態の受
容体としても作用する。
【０００３】糖コンジュゲート中の炭水化物残基の応用
の広い機能の認識は、このような化合物の合成への関心
の高まりにも関連する。しかし、これらのオリゴ糖が非
常に複雑であり、化学選択性、位置選択性（regioselec
tivity）及び立体選択性を特異的に必要にするために、
低級オリゴ糖の化学的手段による合成でさえ極めて困難
である。糖類の複雑さが増大するにつれて、化学合成に
よってそれらを再現する困難さも増大する。この理由か
ら、複雑な糖類を合成するために、生物学的合成ルート
をコピーし、基質特異性、位置特異性及び立体特異性の
反応を通常触媒する酵素に頼ることは明らかである。
の広い機能の認識は、このような化合物の合成への関心
の高まりにも関連する。しかし、これらのオリゴ糖が非
常に複雑であり、化学選択性、位置選択性（regioselec
tivity）及び立体選択性を特異的に必要にするために、
低級オリゴ糖の化学的手段による合成でさえ極めて困難
である。糖類の複雑さが増大するにつれて、化学合成に
よってそれらを再現する困難さも増大する。この理由か
ら、複雑な糖類を合成するために、生物学的合成ルート
をコピーし、基質特異性、位置特異性及び立体特異性の
反応を通常触媒する酵素に頼ることは明らかである。
【０００４】糖コンジュゲートのオリゴ糖構築体は、位
置選択性及び立体選択性転移のためのドナー基質として
活性化糖（ヌクレオチド糖）を必要とするＬｅｌｏｉｒ
グリコシルトランスフェラーゼによってインビボで合成
される。ヌクレオチド糖はヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ又はピロホスホリラーゼ（例えば、ＥＣ２．７．
７．９〜２．７．７．１３、２．７．７．２３、２．
７．７．２９、２．７．７．３０）によってヌクレオシ
ドトリホスフェートを用いて合成される。この場合に、
ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）のヌクレオチ
ジル基の糖ホスフェート（糖（−１−Ｐ））への転移は
ピロホスフェート（ＰＰｉ）の遊離によって触媒され
る。
置選択性及び立体選択性転移のためのドナー基質として
活性化糖（ヌクレオチド糖）を必要とするＬｅｌｏｉｒ
グリコシルトランスフェラーゼによってインビボで合成
される。ヌクレオチド糖はヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ又はピロホスホリラーゼ（例えば、ＥＣ２．７．
７．９〜２．７．７．１３、２．７．７．２３、２．
７．７．２９、２．７．７．３０）によってヌクレオシ
ドトリホスフェートを用いて合成される。この場合に、
ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）のヌクレオチ
ジル基の糖ホスフェート（糖（−１−Ｐ））への転移は
ピロホスフェート（ＰＰｉ）の遊離によって触媒され
る。
【０００５】可能な治療剤（抑制剤、付着防止剤(antia
dhesive agent)、抗炎症剤、免疫原性刺激薬等）又は診
断助剤（決定基、レクチンリガンド）としてのオリゴ糖
構築体の使用は、それらを得るための制限されない合成
アクセスを必要とする。
dhesive agent)、抗炎症剤、免疫原性刺激薬等）又は診
断助剤（決定基、レクチンリガンド）としてのオリゴ糖
構築体の使用は、それらを得るための制限されない合成
アクセスを必要とする。
【０００６】オリゴ糖構築体を合成するためには主とし
て２つの可能なアプローチ（化学的合成法と酵素的合成
法）が存在する。化学的合成法は、保護基手法を用いる
複雑な方策が一般に時間がかかり、ごく低い収率を生じ
るために、多くの欠点を付随している。このことはヌク
レオチド糖の化学的製造に同様に該当する。しかしなが
ら、複雑な合成法としばしば低い収率とのために、費用
は非常に高い。かくして、１０ｍｇの化学的に合成され
たＧＤＰ−β−Ｌ−フコースは約１０００ＤＭを要す
る。
て２つの可能なアプローチ（化学的合成法と酵素的合成
法）が存在する。化学的合成法は、保護基手法を用いる
複雑な方策が一般に時間がかかり、ごく低い収率を生じ
るために、多くの欠点を付随している。このことはヌク
レオチド糖の化学的製造に同様に該当する。しかしなが
ら、複雑な合成法としばしば低い収率とのために、費用
は非常に高い。かくして、１０ｍｇの化学的に合成され
たＧＤＰ−β−Ｌ−フコースは約１０００ＤＭを要す
る。
【０００７】オリゴ糖構築体の酵素的合成のために、現
在、幾つかのグリコシルトランスフェラーゼが利用可能
である。１００種を越えるグリコシルトランスフェラー
ゼが現在、真核生物から単離されている（Ｇｌｙｃｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，１９９５，５，４６３）。工業的合成の
ための決定的な前提条件は、高価なヌクレオチド糖への
酵素的アクセスである。この酵素的アクセスは、現在、
大きく要求され、大きな科学的関心がもたれている。か
くして、例えば、ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースの酵素的合
成は適当な酵素系の不存在下では工業的規模でまだ可能
ではない。
在、幾つかのグリコシルトランスフェラーゼが利用可能
である。１００種を越えるグリコシルトランスフェラー
ゼが現在、真核生物から単離されている（Ｇｌｙｃｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，１９９５，５，４６３）。工業的合成の
ための決定的な前提条件は、高価なヌクレオチド糖への
酵素的アクセスである。この酵素的アクセスは、現在、
大きく要求され、大きな科学的関心がもたれている。か
くして、例えば、ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースの酵素的合
成は適当な酵素系の不存在下では工業的規模でまだ可能
ではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】それ故、課題はヌクレ
オチド糖合成酵素を得るために大規模に発酵することが
できる新規な“微生物”ソースを発見することである。
驚くべきことに、これに関連して、今まで完全に無視さ
れていた微生物群（浮遊性(free-living)非寄生原生生
物）を、求められている酵素の新規で有望な産生体と見
なすことができることになった。
オチド糖合成酵素を得るために大規模に発酵することが
できる新規な“微生物”ソースを発見することである。
驚くべきことに、これに関連して、今まで完全に無視さ
れていた微生物群（浮遊性(free-living)非寄生原生生
物）を、求められている酵素の新規で有望な産生体と見
なすことができることになった。
【０００９】今までは、病原体又は条件的病原体のいず
れにしろ、寄生原生生物からは、例えばギアルジア（Gi
ardia）からのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロ
ホスホリラーゼ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ．１９９２，５６，３０１）、赤痢アメーバ(E
ntamoeba histolytica)からのＵＴＰ−ヘキソース−１
−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．
２．７．７．１０）とＵＤＰ−グルコースピロホスホリ
ラーゼ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．，１９８３，７，１７３と、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉ
ｔｏｌ．，１９７７，４３，１１５）、ハートマネーラ
クルバートソニ(Hartmanella culbertsoni)からのＵ
ＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（Ｊ．Ｐｒｏｔｏ
ｚｏｏｌ．，１９７１，１８，１１５）、及びアカント
アメーバ カステラニ(Acanthamoeba castellani)から
のＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７４，２４９，７８３２）のよう
な、ごく少数のピロホスホリラーゼが知られていたにす
ぎない。
れにしろ、寄生原生生物からは、例えばギアルジア（Gi
ardia）からのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンピロ
ホスホリラーゼ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓ
ｉｔｏｌ．１９９２，５６，３０１）、赤痢アメーバ(E
ntamoeba histolytica)からのＵＴＰ−ヘキソース−１
−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．
２．７．７．１０）とＵＤＰ−グルコースピロホスホリ
ラーゼ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌ．，１９８３，７，１７３と、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉ
ｔｏｌ．，１９７７，４３，１１５）、ハートマネーラ
クルバートソニ(Hartmanella culbertsoni)からのＵ
ＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（Ｊ．Ｐｒｏｔｏ
ｚｏｏｌ．，１９７１，１８，１１５）、及びアカント
アメーバ カステラニ(Acanthamoeba castellani)から
のＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７４，２４９，７８３２）のよう
な、ごく少数のピロホスホリラーゼが知られていたにす
ぎない。
【００１０】テトラヒメナ ピリホルミス(Tetrahymena
pyriformis)から（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．１９６８，１２７，７２）及びジクチオステ
リウム（Dictyostelium)から（Ｊ．Ｐａｕｌｏｖｉｃ
等，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．９，３７１〜３８２（１９８
８）；Ｊ．Ａ．Ｒａｇｈｅｂ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．１５，３８９１〜３８９６（１９８
７））のＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを除い
て、驚くべきことに、浮遊性非寄生原生生物におけるヌ
クレオチジルトランスフェラーゼは今までに開示されて
いない。
pyriformis)から（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．１９６８，１２７，７２）及びジクチオステ
リウム（Dictyostelium)から（Ｊ．Ｐａｕｌｏｖｉｃ
等，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．９，３７１〜３８２（１９８
８）；Ｊ．Ａ．Ｒａｇｈｅｂ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．１５，３８９１〜３８９６（１９８
７））のＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを除い
て、驚くべきことに、浮遊性非寄生原生生物におけるヌ
クレオチジルトランスフェラーゼは今までに開示されて
いない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】かくして、本発明はテト
ラヒメナ ピリホルミスとジクチオステリウムとからの
ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを除いた、非寄
生原生生物から得られるヌクレオチド糖合成酵素に関す
る。非病原性原生生物からのヌクレオチド糖合成酵素の
利点は下記を包含する： １．酵素が発酵プロセスによって大量に容易に生産可能
である。 ２．１菌株がしばしば、幾つかのヌクレオチジルトラン
スフェラーゼを同時に産生する。 ３．酵素が一般に安定である。数回の冷凍(freezing)後
も活性が保有される。 ４．比活性が場合によっては極めて高い（表１参照）。
ラヒメナ ピリホルミスとジクチオステリウムとからの
ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを除いた、非寄
生原生生物から得られるヌクレオチド糖合成酵素に関す
る。非病原性原生生物からのヌクレオチド糖合成酵素の
利点は下記を包含する： １．酵素が発酵プロセスによって大量に容易に生産可能
である。 ２．１菌株がしばしば、幾つかのヌクレオチジルトラン
スフェラーゼを同時に産生する。 ３．酵素が一般に安定である。数回の冷凍(freezing)後
も活性が保有される。 ４．比活性が場合によっては極めて高い（表１参照）。
【００１２】本発明による酵素は、好ましくは、ＵＤＰ
−Ｎ−アセチルガラクトサミンピロホスホリラーゼ（Ｕ
ＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ピロホスホリラーゼ）、ＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＥＣ
Ｎｏ．２．７．７．２３）、ＧＤＰ−フコースピロホス
ホリラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．３０）、ＧＴＰ
−マンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．１３）、ＵＤＰ−グ
ルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．
７．９）、ＵＴＰ−ガラクトース−１−ホスフェートウ
リジルトランスフェラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．
１０）、ＵＴＰ−キシロース−１−ホスフェートウリジ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．１
１）又はヌクレオシド−トリホスフェート−ヘキソース
−１−ホスフェートヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．２８）の活性を有する。Ｅ
Ｃ番号は“酵素命名法１９９２”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ社（サンジエゴ、ニューヨーク、ボストン）に
よる。
−Ｎ−アセチルガラクトサミンピロホスホリラーゼ（Ｕ
ＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ピロホスホリラーゼ）、ＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＥＣ
Ｎｏ．２．７．７．２３）、ＧＤＰ−フコースピロホス
ホリラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．３０）、ＧＴＰ
−マンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェ
ラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．１３）、ＵＤＰ−グ
ルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．
７．９）、ＵＴＰ−ガラクトース−１−ホスフェートウ
リジルトランスフェラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．
１０）、ＵＴＰ−キシロース−１−ホスフェートウリジ
ルトランスフェラーゼ（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．１
１）又はヌクレオシド−トリホスフェート−ヘキソース
−１−ホスフェートヌクレオチジルトランスフェラーゼ
（ＥＣ Ｎｏ．２．７．７．２８）の活性を有する。Ｅ
Ｃ番号は“酵素命名法１９９２”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ社（サンジエゴ、ニューヨーク、ボストン）に
よる。
【００１３】本発明による酵素は、好ましくは、繊毛虫
綱（例えば、テトラヒメナ属、パラメシウム(Parameciu
m)属、コルピジウム(Colpidium)属、コルポーダ(Colpod
a)属、グラウコマ(Glaucoma)属、プラチオフルヤ(Platy
ophrya)属、ボルチセラ(Vorticella)属、ポトマカス(Po
tomacus)属、シュードコーニレンバス(Pseudocohnilemb
us)属、ユープロテス(Euplotes)属、エンゲルマンニー
ラ(Engelmaniella)属及びスチロニチア(Stylonichia)
属）の原生生物、鞭毛虫綱亜門（鞭毛虫類(flagellate
s)）の原生生物、植物性鞭毛虫綱（例えば、ミドリムシ
(Euglena)属、アスタシア(Astasia)属、ヘマトコッカス
(Haematococcus)属及びクリプテコジニウム(Crypthecod
inium)属）の原生生物、動物性鞭毛虫綱の原生生物、根
足虫亜綱上綱の原生生物、ロボセア(Lobosea)綱（例え
ば、アメーバ(Amoeba)属）の原生生物、並びにユーマイ
セトゾエア(Eumycetozoea)綱（例えば、ジクチオステリ
ウム(Dictyostelium)属及びフィサルム(Physarum)属）
の原生生物（Ｈ．ＭｅｈｌｈｏｎとＡ．Ｒｕｔｈｍａｎ
ｎのＡｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌｏｇｉ
ｅ［原生動物学概論］，１９９２，Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉ
ｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｊｅｎａに基づく系統的命
名法）から又はこれらの非寄生原生生物の突然変異体か
ら得られる。
綱（例えば、テトラヒメナ属、パラメシウム(Parameciu
m)属、コルピジウム(Colpidium)属、コルポーダ(Colpod
a)属、グラウコマ(Glaucoma)属、プラチオフルヤ(Platy
ophrya)属、ボルチセラ(Vorticella)属、ポトマカス(Po
tomacus)属、シュードコーニレンバス(Pseudocohnilemb
us)属、ユープロテス(Euplotes)属、エンゲルマンニー
ラ(Engelmaniella)属及びスチロニチア(Stylonichia)
属）の原生生物、鞭毛虫綱亜門（鞭毛虫類(flagellate
s)）の原生生物、植物性鞭毛虫綱（例えば、ミドリムシ
(Euglena)属、アスタシア(Astasia)属、ヘマトコッカス
(Haematococcus)属及びクリプテコジニウム(Crypthecod
inium)属）の原生生物、動物性鞭毛虫綱の原生生物、根
足虫亜綱上綱の原生生物、ロボセア(Lobosea)綱（例え
ば、アメーバ(Amoeba)属）の原生生物、並びにユーマイ
セトゾエア(Eumycetozoea)綱（例えば、ジクチオステリ
ウム(Dictyostelium)属及びフィサルム(Physarum)属）
の原生生物（Ｈ．ＭｅｈｌｈｏｎとＡ．Ｒｕｔｈｍａｎ
ｎのＡｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌｏｇｉ
ｅ［原生動物学概論］，１９９２，Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉ
ｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｊｅｎａに基づく系統的命
名法）から又はこれらの非寄生原生生物の突然変異体か
ら得られる。
【００１４】本発明はさらに、このようなヌクレオチド
糖合成酵素の製造方法に関する。本発明による方法で
は、フィード(feed)有機体を含む無菌（axenic）の又は
化学的に特定された培地上で原生生物を培養する。この
場合の温度は１５〜４５℃の範囲内である。有機体はス
ピナーボトル中又は発酵器中での静置培養又は振とう培
養で増殖するように選択することができ、この発酵を好
ましくは回分（batch）発酵、流加（fed batch）発酵又
は連続発酵として設計することができる。
糖合成酵素の製造方法に関する。本発明による方法で
は、フィード(feed)有機体を含む無菌（axenic）の又は
化学的に特定された培地上で原生生物を培養する。この
場合の温度は１５〜４５℃の範囲内である。有機体はス
ピナーボトル中又は発酵器中での静置培養又は振とう培
養で増殖するように選択することができ、この発酵を好
ましくは回分（batch）発酵、流加（fed batch）発酵又
は連続発酵として設計することができる。
【００１５】酵素はバイオマスから得ることが好まし
い。バイオマスを例えば接線濾過(tangential filtrati
on)、沈降及び遠心分離によって回収することができ
る。その後の細胞破壊は例えば超音波又はUltraturrax
装置、ホモジナイザーによって又は凍結によって任意に
実施することができる。
い。バイオマスを例えば接線濾過(tangential filtrati
on)、沈降及び遠心分離によって回収することができ
る。その後の細胞破壊は例えば超音波又はUltraturrax
装置、ホモジナイザーによって又は凍結によって任意に
実施することができる。
【００１６】酵素含有粗抽出物はヌクレオチド糖の製造
に直接用いることができる。或いは、酵素を最初にクロ
マトグラフィープロセス（例えば、ゲル濾過、イオン交
換、アフィニティ及び／又は疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー）及び／又は沈降によって精製することができ
る。したがって、本発明はヌクレオチド糖の製造のため
の本発明による酵素の使用にも関する。
に直接用いることができる。或いは、酵素を最初にクロ
マトグラフィープロセス（例えば、ゲル濾過、イオン交
換、アフィニティ及び／又は疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー）及び／又は沈降によって精製することができ
る。したがって、本発明はヌクレオチド糖の製造のため
の本発明による酵素の使用にも関する。
【００１７】ヌクレオチド糖合成酵素の検出はいわゆる
“ヌクレオチジルトランスフェラーゼ基質スクリーニン
グアッセイ”（ＮＵＳＳＡ）によって行われる（ドイツ
特許出願第１９５１７０９３．８号）。このアッセイは
ＰＰｉ依存性ホスホフルクトキナーゼを用いる反応から
生じる生成物ＰＰｉの転化によってヌクレオチド糖合成
酵素を同定することを可能にする。その後の酵素カスケ
ードはＰＰｉの１モルにつき２モルのＮＡＤを生じる。
出発時に如何なるヌクレオシドトリホスフェート及び如
何なる糖−１−ホスフェートが基質として用いられるか
に依存して、種々なヌクレオチド糖合成酵素を識別する
ことができる。ＮＵＳＳＡの原理を下記スキームによっ
て説明する：
“ヌクレオチジルトランスフェラーゼ基質スクリーニン
グアッセイ”（ＮＵＳＳＡ）によって行われる（ドイツ
特許出願第１９５１７０９３．８号）。このアッセイは
ＰＰｉ依存性ホスホフルクトキナーゼを用いる反応から
生じる生成物ＰＰｉの転化によってヌクレオチド糖合成
酵素を同定することを可能にする。その後の酵素カスケ
ードはＰＰｉの１モルにつき２モルのＮＡＤを生じる。
出発時に如何なるヌクレオシドトリホスフェート及び如
何なる糖−１−ホスフェートが基質として用いられるか
に依存して、種々なヌクレオチド糖合成酵素を識別する
ことができる。ＮＵＳＳＡの原理を下記スキームによっ
て説明する：
【００１８】ヌクレオチジルトランスフェラーゼ基質ス
クリーニングアッセイ（ＮＵＳＳＡ）
クリーニングアッセイ（ＮＵＳＳＡ）
【化１】 １ 糖（−１−Ｐ）＋ＮＴＰ ⇔ Ｎ（Ｍ）ＤＰ糖＋ＰＰｉ ２ ＰＰｉ ＋ Ｆｒｕ−６−Ｐ ⇔ Ｆｒ−１，６−Ｐ2＋Ｐｉ ３ Ｆｒｕ−１，６−Ｐ2 ⇔ ＤＨＡＰ＋３−Ｐ−グリセルアルデヒド ４ ３−Ｐ−グリセルアルデヒド ⇔ ＤＨＡＰ ５２ＤＨＡＰ＋２ＮＡＤＨ＋２Ｈ(+) ⇔ ２グリセロール−３−Ｐ＋２ＮＡＤ
【００１９】酵素 １．ヌクレオチド糖合成酵素（ピロホスホリラーゼ又は
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．７．
７．） ２．ＰＰｉホスホフルクトキナーゼ（ジャガイモ，ＥＣ
２．７．１．９０） ３．フルクトース−１，６−Ｐ2アルドラーゼ（ウサギ
筋肉，ＥＣ４．１．２．１３） ４．トリオース−ホスフェートイソメラーゼ（ＥＣ５．
３．１．１） ５．グリセロール−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．
１．１．８）
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．７．
７．） ２．ＰＰｉホスホフルクトキナーゼ（ジャガイモ，ＥＣ
２．７．１．９０） ３．フルクトース−１，６−Ｐ2アルドラーゼ（ウサギ
筋肉，ＥＣ４．１．２．１３） ４．トリオース−ホスフェートイソメラーゼ（ＥＣ５．
３．１．１） ５．グリセロール−３−Ｐデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．
１．１．８）
【００２０】ヌクレオチド糖合成酵素は、ＮＵＳＳＡ
（ヌクレオチジルトランスフェラーゼ基質スクリーニン
グアッセイ）の他に、ＨＰＬＣプロセス及び薄層クロマ
トグラフィープロセスによって同定することもできる。 １．ＨＰＬＣ サンプルを例えば実施例１に説明するように得る。次
に、サンプルの適当な希釈物を、適当なヌクレオチドト
リホスフェート（例えば、ＧＴＰ、ＡＴＰ）と糖ホスフ
ェート（例えば、フコース １−ホスフェート）とを含
む緩衝剤系（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）中
に導入する。インキュベーションは例えば３０℃におい
て１０分間を含むことができる。サンプル中に存在する
ヌクレオチド糖合成酵素（例えば、ＧＤＰ−フコースピ
ロホスホリラーゼ）の活性によって形成される糖ヌクレ
オチド（例えば、ＧＤＰ−フコース）を次に、例えばア
セトニトリル濃度を高める勾配溶離を実施するＨＰＬＣ
（例えば、ＲＰ18カラム上）によって、クロマトグラフ
ィー的に同定する。溶液Ａは５ｍＭの硫酸水素テトラブ
チルアンモニウムと、３０ｍＭのリン酸２水素カリウム
と、４％のアセトニトリルとから成り、ｐＨ６である。
溶液Ｂは純粋なアセトニトリルから成る。適当な勾配は
例えば０〜４０％Ｂであり、流量は好ましくは１〜２ｍ
ｌ／分である。測定はＵＶ検出器とインテグレータとに
よって行う。硫酸水素テトラブチルアンモニウムに代わ
るものとして、臭化テトラブチルアンモニウムを用いる
こともできる。
（ヌクレオチジルトランスフェラーゼ基質スクリーニン
グアッセイ）の他に、ＨＰＬＣプロセス及び薄層クロマ
トグラフィープロセスによって同定することもできる。 １．ＨＰＬＣ サンプルを例えば実施例１に説明するように得る。次
に、サンプルの適当な希釈物を、適当なヌクレオチドト
リホスフェート（例えば、ＧＴＰ、ＡＴＰ）と糖ホスフ
ェート（例えば、フコース １−ホスフェート）とを含
む緩衝剤系（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）中
に導入する。インキュベーションは例えば３０℃におい
て１０分間を含むことができる。サンプル中に存在する
ヌクレオチド糖合成酵素（例えば、ＧＤＰ−フコースピ
ロホスホリラーゼ）の活性によって形成される糖ヌクレ
オチド（例えば、ＧＤＰ−フコース）を次に、例えばア
セトニトリル濃度を高める勾配溶離を実施するＨＰＬＣ
（例えば、ＲＰ18カラム上）によって、クロマトグラフ
ィー的に同定する。溶液Ａは５ｍＭの硫酸水素テトラブ
チルアンモニウムと、３０ｍＭのリン酸２水素カリウム
と、４％のアセトニトリルとから成り、ｐＨ６である。
溶液Ｂは純粋なアセトニトリルから成る。適当な勾配は
例えば０〜４０％Ｂであり、流量は好ましくは１〜２ｍ
ｌ／分である。測定はＵＶ検出器とインテグレータとに
よって行う。硫酸水素テトラブチルアンモニウムに代わ
るものとして、臭化テトラブチルアンモニウムを用いる
こともできる。
【００２１】２．薄層クロマトグラフィー 形成される糖ヌクレオチドの濃度が充分に高い場合に
は、ＴＬＣによる検出も可能である。適当な可動相は例
えば６：４の比でのアセトニトリル／０．１ＭＮＨ4Ｃ
ｌである。使用可能なスプレー試薬はナフトレゾルシノ
ール（２０ｍｇ）とジフェニルアミン（４０ｍｇ）とエ
タノール（１０ｍｌ）と硫酸（４００μｌ）との溶液で
ある。用いるプレートは０．２５ｍｍのシリカゲルのＴ
ＬＣガラスプレートである。
は、ＴＬＣによる検出も可能である。適当な可動相は例
えば６：４の比でのアセトニトリル／０．１ＭＮＨ4Ｃ
ｌである。使用可能なスプレー試薬はナフトレゾルシノ
ール（２０ｍｇ）とジフェニルアミン（４０ｍｇ）とエ
タノール（１０ｍｌ）と硫酸（４００μｌ）との溶液で
ある。用いるプレートは０．２５ｍｍのシリカゲルのＴ
ＬＣガラスプレートである。
【００２２】本発明はさらに、ヌクレオチド糖の製造の
ための、ヌクレオチド合成酵素を産生する非寄生原生生
物の使用に関する。
ための、ヌクレオチド合成酵素を産生する非寄生原生生
物の使用に関する。
【００２３】
実施例： １．テトラヒメナ サーモフィラ(Tetrahymena thermop
hila)：それぞれ５００ｍｌの脱脂乳培地（２％の脱脂
乳粉末、０．５％の酵母エキス、０．００３％のＳｅｑ
ｕｅｓｔｒｅｎｅ；ＫｉｙとＴｉｅｄｔｋｅ、１９９
２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，３７，５７６による）を含む２リットルのエー
レンマイヤーフラスコを３０℃及び１００ｒｐｍにおい
て４８時間インキュベートした。培養物をＦＩＬＴＲＯ
Ｎ接線濾過系（孔度０．３μｍ）中で８３５，０００細
胞／ｍｌの細胞密度において回収した。濃縮細胞懸濁液
を再び遠心分離した（ＳＯＲＶＡＬＬ ＲＣ−５Ｂ、Ｇ
ＳＡ Ｒｏｔｏｒ、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）。
細胞ペレットを−２０℃で凍結することによって破壊し
た。
hila)：それぞれ５００ｍｌの脱脂乳培地（２％の脱脂
乳粉末、０．５％の酵母エキス、０．００３％のＳｅｑ
ｕｅｓｔｒｅｎｅ；ＫｉｙとＴｉｅｄｔｋｅ、１９９
２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，３７，５７６による）を含む２リットルのエー
レンマイヤーフラスコを３０℃及び１００ｒｐｍにおい
て４８時間インキュベートした。培養物をＦＩＬＴＲＯ
Ｎ接線濾過系（孔度０．３μｍ）中で８３５，０００細
胞／ｍｌの細胞密度において回収した。濃縮細胞懸濁液
を再び遠心分離した（ＳＯＲＶＡＬＬ ＲＣ−５Ｂ、Ｇ
ＳＡ Ｒｏｔｏｒ、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）。
細胞ペレットを−２０℃で凍結することによって破壊し
た。
【００２４】解凍後に、サンプルを適当に希釈してＮＵ
ＳＳＡに導入した。ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ
−ガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、ＧＤＰ−フコース及びＧＤＰ−マンノースを合成し
た酵素を粗抽出物中で同定した（表１）。驚くべきこと
に、これらの酵素（ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−及びＧＤＰ−マ
ンノース−合成酵素）のあるものもまた細胞を含まない
培養濾液中に存在した（表２）。
ＳＳＡに導入した。ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−Ｎ−
アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ
−ガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、ＧＤＰ−フコース及びＧＤＰ−マンノースを合成し
た酵素を粗抽出物中で同定した（表１）。驚くべきこと
に、これらの酵素（ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−及びＧＤＰ−マ
ンノース−合成酵素）のあるものもまた細胞を含まない
培養濾液中に存在した（表２）。
【００２５】２．テトラヒメナ サーモフィラ：Ｔ．サ
ーモフィラを２リットル撹拌発酵器（ＢＲＡＵＮ ＢＩ
ＯＴＥＣＨ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）中で３０℃
において培養する。撹拌をパドルインペラー(paddle im
peller)によって行い、ｐＯ2を３０％に維持し、ｐＨを
７．０に維持した。用いた培地は上記脱脂乳培地であっ
た。静止期に達した後に、５倍濃縮脱脂乳培地を繰り返
して加えた。１０日間後に、細胞を７，０００，０００
細胞／ｍｌの細胞密度で回収し、１で述べたように、さ
らに処理した。１と同じ酵素がＮＵＳＳＡによって同定
された（表３）。下記酵素が細胞を含まない培養濾液中
に検出された：（表４参照）。
ーモフィラを２リットル撹拌発酵器（ＢＲＡＵＮ ＢＩ
ＯＴＥＣＨ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）中で３０℃
において培養する。撹拌をパドルインペラー(paddle im
peller)によって行い、ｐＯ2を３０％に維持し、ｐＨを
７．０に維持した。用いた培地は上記脱脂乳培地であっ
た。静止期に達した後に、５倍濃縮脱脂乳培地を繰り返
して加えた。１０日間後に、細胞を７，０００，０００
細胞／ｍｌの細胞密度で回収し、１で述べたように、さ
らに処理した。１と同じ酵素がＮＵＳＳＡによって同定
された（表３）。下記酵素が細胞を含まない培養濾液中
に検出された：（表４参照）。
【００２６】３．テトラヒメナ セトーサ(Tetrahymena
setosa)：細胞を１に述べたように培養した。培養物を
１，３２０，０００細胞／ｍｌの細胞密度で回収した。
ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤ
Ｐ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトー
ス−、ＵＤＰ−ガラクトサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−
マンノース−合成酵素が粗抽出物中に同定された（表
５）。ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤＰ−グルコサミン
−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガ
ラクトース−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン
−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノース−合成
酵素が細胞を含まない培養濾液中に検出可能であった
（表６）。
setosa)：細胞を１に述べたように培養した。培養物を
１，３２０，０００細胞／ｍｌの細胞密度で回収した。
ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤ
Ｐ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトー
ス−、ＵＤＰ−ガラクトサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−
マンノース−合成酵素が粗抽出物中に同定された（表
５）。ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤＰ−グルコサミン
−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガ
ラクトース−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン
−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノース−合成
酵素が細胞を含まない培養濾液中に検出可能であった
（表６）。
【００２７】４．テトラヒメナ ピリホルミス：Ｔ．ピ
リホルミスをＰＰＹＳ培地（１％のプロテオースペプト
ン、０．１％の酵母エキス、０．００３％のＳｅｑｕｅ
ｓｔｒｅｎｅ）中で２７℃及び６０ｒｐｍにおいて培養
した。培養物を５００，０００細胞／ｍｌの細胞密度で
回収し、１で述べたように、さらに処理した。ＵＤＰ−
グルコース−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、
ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラク
トサミン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノー
ス−合成酵素が粗抽出物中に同定された（表７）。さら
に、ＵＤＰ−グルコサミン−とＵＤＰ−ガラクトサミン
−合成酵素が細胞を含まない培養濾液中に検出された
（表８）。
リホルミスをＰＰＹＳ培地（１％のプロテオースペプト
ン、０．１％の酵母エキス、０．００３％のＳｅｑｕｅ
ｓｔｒｅｎｅ）中で２７℃及び６０ｒｐｍにおいて培養
した。培養物を５００，０００細胞／ｍｌの細胞密度で
回収し、１で述べたように、さらに処理した。ＵＤＰ−
グルコース−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、
ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラク
トサミン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノー
ス−合成酵素が粗抽出物中に同定された（表７）。さら
に、ＵＤＰ−グルコサミン−とＵＤＰ−ガラクトサミン
−合成酵素が細胞を含まない培養濾液中に検出された
（表８）。
【００２８】５．コルピジウム カンピルム(Colpidium
campylum)：この繊毛虫を脱脂乳培地上で２５℃及び６
０ｒｐｍにおいて３日間インキュベートした。培養物を
２５０，０００細胞／ｍｌの細胞密度で回収し、１で述
べたように、さらに処理した。ＵＤＰ−グルコース−、
ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコ
サミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−ガラクト
サミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−、Ｇ
ＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノース−合成酵素が
粗抽出物中に同定された（表９）。ＵＤＰ−グルコース
−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガ
ラクトース−及びＧＤＰ−マンノース−合成酵素が細胞
を含まない培養濾液中に検出された（表１０）。
campylum)：この繊毛虫を脱脂乳培地上で２５℃及び６
０ｒｐｍにおいて３日間インキュベートした。培養物を
２５０，０００細胞／ｍｌの細胞密度で回収し、１で述
べたように、さらに処理した。ＵＤＰ−グルコース−、
ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコ
サミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−ガラクト
サミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−、Ｇ
ＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノース−合成酵素が
粗抽出物中に同定された（表９）。ＵＤＰ−グルコース
−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガ
ラクトース−及びＧＤＰ−マンノース−合成酵素が細胞
を含まない培養濾液中に検出された（表１０）。
【００２９】６．ポトマカス ポットシ(Potomacus pot
tsi)：Ｐ．ポットシを脱脂乳培地上で２５℃における静
置培養として８日間インキュベートした。細胞が１６
０，０００／ｍｌの密度に達した後に、培養物を１で述
べたように仕上げ処理した。粗抽出物はＵＤＰ−グルコ
ース−、ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−
ガラクトサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノース−合
成酵素を含有した（表１１）。また、ＵＤＰ−グルコー
ス−、ＵＤＰ−グルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−ガラ
クトサミン−及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン
−合成酵素が培養濾液中で検出可能であった（表１
２）。
tsi)：Ｐ．ポットシを脱脂乳培地上で２５℃における静
置培養として８日間インキュベートした。細胞が１６
０，０００／ｍｌの密度に達した後に、培養物を１で述
べたように仕上げ処理した。粗抽出物はＵＤＰ−グルコ
ース−、ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−
ガラクトサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−マンノース−合
成酵素を含有した（表１１）。また、ＵＤＰ−グルコー
ス−、ＵＤＰ−グルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、ＵＤＰ−ガラ
クトサミン−及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン
−合成酵素が培養濾液中で検出可能であった（表１
２）。
【００３０】７．ヨーグレナ グラシリス(Euglena gra
cilis)：この鞭毛虫を培地９（１ｇ／ｌの酢酸Ｎａ、１
ｇ／ｌのミートエキス、２ｇ／ｌのバクトトリプトン、
２ｇ／ｌの酵母エキス、３０ｍｌ／ｌの土壌ストック(s
oil stock)溶液）中で２５℃における静置培養として７
日間インキュベートした。細胞を１，２３０，０００細
胞／ｍｌの細胞密度において、１で述べたように回収し
た。細胞をＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘで破壊した。ＵＤＰ
−グルコース−、ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−、ＧＤＰ−フコ
ース−及びＧＤＰ−マンノース−合成酵素が粗抽出物中
で同定された（表１３）。ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤ
Ｐ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトー
ス−、ＵＤＰ−ガラクトサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−
マンノース−合成酵素が培養濾液中で検出された（表１
４）。
cilis)：この鞭毛虫を培地９（１ｇ／ｌの酢酸Ｎａ、１
ｇ／ｌのミートエキス、２ｇ／ｌのバクトトリプトン、
２ｇ／ｌの酵母エキス、３０ｍｌ／ｌの土壌ストック(s
oil stock)溶液）中で２５℃における静置培養として７
日間インキュベートした。細胞を１，２３０，０００細
胞／ｍｌの細胞密度において、１で述べたように回収し
た。細胞をＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘで破壊した。ＵＤＰ
−グルコース−、ＵＤＰ−グルコサミン−、ＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトース−、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン−、ＧＤＰ−フコ
ース−及びＧＤＰ−マンノース−合成酵素が粗抽出物中
で同定された（表１３）。ＵＤＰ−グルコース−、ＵＤ
Ｐ−Ｎ−アセチルグルコサミン−、ＵＤＰ−ガラクトー
ス−、ＵＤＰ−ガラクトサミン−、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン−、ＧＤＰ−フコース−及びＧＤＰ−
マンノース−合成酵素が培養濾液中で検出された（表１
４）。
【００３１】表１
【表１】
【００３２】表２
【表２】
【００３３】表３
【表３】
【００３４】表４
【表４】
【００３５】表５
【表５】
【００３６】表６
【表６】
【００３７】表７
【表７】
【００３８】表８
【表８】
【００３９】表９
【表９】
【００４０】表１０
【表１０】
【００４１】表１１
【表１１】
【００４２】表１２
【表１２】
【００４３】表１３
【表１３】
【００４４】表１４
【表１４】
【００４５】表１５ＮＵＳＳＡにおいて、比活性≧５０
ｍＵ／ｍｇ
ｍＵ／ｍｇ
【表１５】 １Ｕは１分間につき１μｍｏｌのフルクトース １，６
−ジホスフェートの産生を生じる酵素活性である。
−ジホスフェートの産生を生じる酵素活性である。
Claims (48)
- 【請求項１】 テトラヒメナ ピリホルミスからとジク
チオステリウムからのＵＤＰ−グルコースピロホスホリ
ラーゼを除いた、非寄生原生生物から得られるヌクレオ
チド糖合成酵素。 - 【請求項２】 非寄生原生生物が繊毛虫綱に属する、請
求項１記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項３】 非寄生原生生物がテトラヒメナ属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項４】 非寄生原生生物がパラメシウム属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項５】 非寄生原生生物がコルピジウム属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項６】 非寄生原生生物がコルポーダ属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項７】 非寄生原生生物がグラウコマ属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項８】 非寄生原生生物がプラチオフルヤ属に属
する、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項９】 非寄生原生生物がボルチセラ属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１０】 非寄生原生生物がポトマカス属に属す
る、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１１】 非寄生原生生物がシュードコーニレン
バス属に属する、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵
素。 - 【請求項１２】 非寄生原生生物がユープロテス属に属
する、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１３】 非寄生原生生物がエンゲルマンニーラ
属に属する、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１４】 非寄生原生生物がスチロニチア属に属
する、請求項２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１５】 非寄生原生生物が鞭毛虫綱亜門に属す
る、請求項１記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１６】 非寄生原生生物が植物性鞭毛虫綱に属
する、請求項１５記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１７】 非寄生原生生物がミドリムシ属に属す
る、請求項１６記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１８】 非寄生原生生物がアスタシア属に属す
る、請求項１６記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項１９】 非寄生原生生物がヘマトコッカス属に
属する、請求項１６記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２０】 非寄生原生生物がクリプテコジニウム
属に属する、請求項１６記載のヌクレオチド糖合成酵
素。 - 【請求項２１】 非寄生原生生物が動物性鞭毛虫綱に属
する、請求項１５記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２２】 非寄生原生生物が根足虫亜綱上綱に属
する、請求項１記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２３】 非寄生原生生物がロボセア綱に属す
る、請求項２２記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２４】 非寄生原生生物がアメーバ属に属す
る、請求項２３記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２５】 非寄生原生生物がユーマイセトゾエア
綱に属する、請求項１記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２６】 非寄生原生生物がジクチオステリウム
属に属する、請求項２５記載のヌクレオチド糖合成酵
素。 - 【請求項２７】 非寄生原生生物がフィサルム属に属す
る、請求項２５記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項２８】 非寄生原生生物が突然変異体である、
請求項１〜２７のいずれかに記載のヌクレオチド糖合成
酵素。 - 【請求項２９】 該ヌクレオチド糖合成酵素がＵＤＰ−
Ｎ−アセチルガラクトサミンピロホスホリラーゼ活性を
有する、請求項１〜２８のいずれかに記載のヌクレオチ
ド糖合成酵素。 - 【請求項３０】 該ヌクレオチド糖合成酵素がＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有
する、請求項１〜２８のいずれかに記載のヌクレオチド
糖合成酵素。 - 【請求項３１】 該ヌクレオチド糖合成酵素がＧＤＰ−
フコースピロホスホリラーゼ活性を有する、請求項１〜
２８のいずれかに記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項３２】 該ヌクレオチド糖合成酵素がＧＴＰ−
マンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェラ
ーゼ活性を有する、請求項１〜２８のいずれかに記載の
ヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項３３】 該ヌクレオチド糖合成酵素がＵＤＰ−
グルコースピロホスホリラーゼ活性を有する、請求項１
〜２８のいずれかに記載のヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項３４】 該ヌクレオチド糖合成酵素がガラクト
ース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ活
性を有する、請求項１〜２８のいずれかに記載のヌクレ
オチド糖合成酵素。 - 【請求項３５】 該ヌクレオチド糖合成酵素がＵＴＰ−
キシロース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラ
ーゼ活性を有する、請求項１〜２８のいずれかに記載の
ヌクレオチド糖合成酵素。 - 【請求項３６】 該ヌクレオチド糖合成酵素がヌクレオ
シド−トリホスフェート−ヘキソース−１−ホスフェー
トヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する、請
求項１〜２８のいずれかに記載のヌクレオチド糖合成酵
素。 - 【請求項３７】 フィード有機体を含む無菌の又は化学
的に特定された培地上で非寄生原生生物の培養物を発酵
させ、その後に酵素を単離することを含む、請求項１〜
３６のいずれかに記載のヌクレオチド糖合成酵素の製造
方法。 - 【請求項３８】 培養物を静置培養又は振とう培養で発
酵させる、請求項３７記載の方法。 - 【請求項３９】 培養物をスピナーボトル中で発酵させ
る、請求項３７記載の方法。 - 【請求項４０】 培養物を発酵器中で発酵させる、請求
項３７記載の方法。 - 【請求項４１】 発酵が回分発酵として設計される、請
求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４２】 発酵が流加発酵として設計される、請
求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４３】 発酵が連続発酵として設計される、請
求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４４】 原生生物の細胞から本質的に成るバイ
オマスの接線濾過、沈降又は遠心分離と、その後の細胞
破壊と、次にこのようにして得られた酵素粗抽出物のク
ロマトグラフィーによる精製とによって酵素を単離す
る、請求項３７〜４３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４５】 ヌクレオチド糖を製造するための請求
項１〜３６のいずれかに記載のヌクレオチド糖合成酵素
の使用。 - 【請求項４６】 細胞ホモジネートを酵素として用い
る、請求項４５記載の使用。 - 【請求項４７】 精製した酵素を酵素として用いる、請
求項４５記載の使用。 - 【請求項４８】 ヌクレオチド糖を製造するための、請
求項１〜３６のいずれかに記載の１種またはそれ以上の
ヌクレオチド糖合成酵素を産生する請求項１〜２８のい
ずれかに記載の原生生物の使用。
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