JPS6253149B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6253149B2 JPS6253149B2 JP56031932A JP3193281A JPS6253149B2 JP S6253149 B2 JPS6253149 B2 JP S6253149B2 JP 56031932 A JP56031932 A JP 56031932A JP 3193281 A JP3193281 A JP 3193281A JP S6253149 B2 JPS6253149 B2 JP S6253149B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleotide pyrophosphatase
- nucleotide
- pyrophosphatase
- solution
- culture
- Prior art date
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- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヌクレオチドピロホスフアターゼを製
造する方法に関する。
造する方法に関する。
更に詳細には、本発明は、ヌクレオチドピロホ
スフアターゼを菌体外に生成させ、有効に採取す
る方法に関するものである。
スフアターゼを菌体外に生成させ、有効に採取す
る方法に関するものである。
一般に、ヌクレオチドピロホスフアターゼ
（3.6.1.9）は次の反応式に示される如く、FAD、
NAD、ADP−ribose、NADP、UDPG等のヌクレ
オチドを分解し、ヌクレオシドモノホスフエート
を生成させる酵素としてよく知られている。
（3.6.1.9）は次の反応式に示される如く、FAD、
NAD、ADP−ribose、NADP、UDPG等のヌクレ
オチドを分解し、ヌクレオシドモノホスフエート
を生成させる酵素としてよく知られている。
ヌクレオチドピロホスフアターゼの給源をジヤ
ガイモ、ハトなどの動植物や多くの微生物に求め
ることはできるが、動植物からではとうてい工業
的生産はできず、また、微生物においても、その
ほとんどが菌体内に生産するために、精製が困難
であつて、工業的生産には適していなかつた。
ガイモ、ハトなどの動植物や多くの微生物に求め
ることはできるが、動植物からではとうてい工業
的生産はできず、また、微生物においても、その
ほとんどが菌体内に生産するために、精製が困難
であつて、工業的生産には適していなかつた。
本発明者らは、ヌクレオチドピロホスフアター
ゼを有効に生産する菌を求めて多くの微生物を検
索したところ、ミクロコツカス属とサルシナ属に
属する菌においてヌクレオチドピロホスフアター
ゼを菌体外に生産し、工業生産的にきわめてすぐ
れた菌株があることを見出した。
ゼを有効に生産する菌を求めて多くの微生物を検
索したところ、ミクロコツカス属とサルシナ属に
属する菌においてヌクレオチドピロホスフアター
ゼを菌体外に生産し、工業生産的にきわめてすぐ
れた菌株があることを見出した。
本発明は、この知見より完成されたもので、ミ
クロコツカス属又はサルシナ属に属するヌクレオ
チドピロホスフアターゼ菌体外生産菌を培養し、
培養物よりヌクレオチドピロホスフアターゼを採
取することを特徴とするヌクレオチドピロホスフ
アターゼの製造法である。
クロコツカス属又はサルシナ属に属するヌクレオ
チドピロホスフアターゼ菌体外生産菌を培養し、
培養物よりヌクレオチドピロホスフアターゼを採
取することを特徴とするヌクレオチドピロホスフ
アターゼの製造法である。
本発明に使用するヌクレオチドピロホスフアタ
ーゼ菌体外生産菌の例示としては、 Micrococcus conglomeratus IAM 1459 Micrococcus radiodurans IAM 12271 Sarcina albida IAM 1012 があげられる。
ーゼ菌体外生産菌の例示としては、 Micrococcus conglomeratus IAM 1459 Micrococcus radiodurans IAM 12271 Sarcina albida IAM 1012 があげられる。
これら使用菌は培養培地で培養される。培地と
しては菌体外に酵素を生産させるために液体培地
が用いられる。培地は炭素源、窒素源、無機塩等
適宜含有するものであれば、いかなる培地でもよ
い。
しては菌体外に酵素を生産させるために液体培地
が用いられる。培地は炭素源、窒素源、無機塩等
適宜含有するものであれば、いかなる培地でもよ
い。
使用菌の種培養液を培養培地に接種した後、20
〜40℃で、通気撹拌で、20〜50時間培養される。
〜40℃で、通気撹拌で、20〜50時間培養される。
培養液は過もしくは遠心分離によつて菌体を
分離除去し、除菌液を得る。
分離除去し、除菌液を得る。
得られた培養除菌液は、限外過膜（Ｇ−
05T）によつて濃縮し、更にSephadexG100ゲル
過、WhatmanDE−52等による精製を行うこと
によつてヌクレオチドピロホスフアターゼを精製
単離することができる。
05T）によつて濃縮し、更にSephadexG100ゲル
過、WhatmanDE−52等による精製を行うこと
によつてヌクレオチドピロホスフアターゼを精製
単離することができる。
本発明における精製ヌクレオチドピロホスフア
ターゼはこのまま分析用、生産用等に使用するこ
とができるが、必要によつては液状物を凍結乾燥
して粉末状とて単離することも可能である。
ターゼはこのまま分析用、生産用等に使用するこ
とができるが、必要によつては液状物を凍結乾燥
して粉末状とて単離することも可能である。
次に、本発明において得られるヌクレオチドピ
ロホスフアターゼの理化学的性質を示す。
ロホスフアターゼの理化学的性質を示す。
１ FAD（flavin adenine dinucleotide）、
NAD（nicotinamide adenine
dinucleotide）、 ADP−ribose（adenosine diphosphate−
ribose）、 NADP（nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate）、 UDP−GlcNAc（uridine diphosphate Ｎ−
acetyl glucosamine） に作用して、各ヌクレオシドモノホスフエート
を生成する。
dinucleotide）、 ADP−ribose（adenosine diphosphate−
ribose）、 NADP（nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate）、 UDP−GlcNAc（uridine diphosphate Ｎ−
acetyl glucosamine） に作用して、各ヌクレオシドモノホスフエート
を生成する。
２ AMP、ADP、ATP、NMN、FMNには作用
しない。
しない。
３ 至適PHは7.0〜9.0である。
４ 安定PH：PH７〜９の範囲で、５℃で安定。
５ 温度安定性：30℃60分処理では安定。
６ 至適温度：30℃附近にある。
７ 金属イオンの影響：１ｍＭのZnCl2
１ｍＭのCuCl2
１ｍＭのSnCl2
１ｍＭのFeCl3
によつて阻害される。
８ 分子量：約４万（ゲル過法による）
本酵素は酵素分類3.6.1.9nucleotide
pyrophosphataseと一致するものである。
pyrophosphataseと一致するものである。
次に本発明の実施例を示す。
なお、ヌクレオチドピロホスフアターゼの活性
測定は、270μの酵素標品にNAD（20mg／ml）
30μを加え、30℃１〜６時間反応し、該反応を
95％エタノール0.1mlを含む50ｍＭのソデイウム
ピロホスフエート（PH8.8）2.5mlにてストツプさ
せ、ついでアルコールデヒドロゲナーゼを0.1％
アルブミンを含む10ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.5）に
て溶解し20u／mlとしたもの0.1mlを添加し、還元
型NADの340nｍでのODの減少をみることにより
求められる。対照には酵素標品の代わりにトリス
緩衝液を用いる。この場合の単位の表示は１分当
りOD340nｍの吸光度0.001の減少を1uとする。
測定は、270μの酵素標品にNAD（20mg／ml）
30μを加え、30℃１〜６時間反応し、該反応を
95％エタノール0.1mlを含む50ｍＭのソデイウム
ピロホスフエート（PH8.8）2.5mlにてストツプさ
せ、ついでアルコールデヒドロゲナーゼを0.1％
アルブミンを含む10ｍＭ燐酸緩衝液（PH7.5）に
て溶解し20u／mlとしたもの0.1mlを添加し、還元
型NADの340nｍでのODの減少をみることにより
求められる。対照には酵素標品の代わりにトリス
緩衝液を用いる。この場合の単位の表示は１分当
りOD340nｍの吸光度0.001の減少を1uとする。
実施例 １
（普通ブイヨン培地）
肉エキス ３ｇ
ペプトン 10ｇ
NaCl ５ｇ
水を加えて１とする（PH7.0）
上記組成の培地100mlにSarcina
albidaIAM1012を接種し、30℃で24時間種培養
し、得られた種培養液100mlを同じ組成の培地10
に添加して30℃で40時間好気的に培養した。
albidaIAM1012を接種し、30℃で24時間種培養
し、得られた種培養液100mlを同じ組成の培地10
に添加して30℃で40時間好気的に培養した。
得られた培養液を3000rpmで15分間遠心分離処
理し、次に、液をＧ−05Tで限外過濃縮し、
液510mlを得る。この液はヌクレオチドピロ
ホスフアターゼ活性0.4u／mlであつた。
理し、次に、液をＧ−05Tで限外過濃縮し、
液510mlを得る。この液はヌクレオチドピロ
ホスフアターゼ活性0.4u／mlであつた。
得られた液510mlを1.2SephadexG100カラ
ムに60mlずつチヤージし、流速60ml／hrで、24
ml／tubeで分画し、フラクシヨンNo.46、47、
48、49、50、51を集め、これをＧ−05Tで限外
過濃縮し、液650mlを得る。この液はヌクレ
オチドピロホスフアターゼ活性4.5u／mlであつ
た。更に、該液中のヌクレオチドピロホスフア
ターゼをトリス緩衝液で緩衝化したワツトマン
DE−52に吸着せしめ、次いで、０〜0.5Mの食塩
水でグラジエント溶出し、活性画分を集めた。こ
の溶出液64mlのヌクレオチドピロホスフアターゼ
活性は34.8u／mlであつた。
ムに60mlずつチヤージし、流速60ml／hrで、24
ml／tubeで分画し、フラクシヨンNo.46、47、
48、49、50、51を集め、これをＧ−05Tで限外
過濃縮し、液650mlを得る。この液はヌクレ
オチドピロホスフアターゼ活性4.5u／mlであつ
た。更に、該液中のヌクレオチドピロホスフア
ターゼをトリス緩衝液で緩衝化したワツトマン
DE−52に吸着せしめ、次いで、０〜0.5Mの食塩
水でグラジエント溶出し、活性画分を集めた。こ
の溶出液64mlのヌクレオチドピロホスフアターゼ
活性は34.8u／mlであつた。
実施例 ２
Micrococcus conglomeratusIAM1459を用いて
実施例１と全く同様に処理し、ヌクレオチドピロ
ホスフアターゼ活性0.5u／mlの液を得た。
実施例１と全く同様に処理し、ヌクレオチドピロ
ホスフアターゼ活性0.5u／mlの液を得た。
Claims (1)
- １ ミクロコツカス属又はサルシナ属に属するヌ
クレオチドピロホスフアターゼ菌体外生産菌を培
養し、培養物よりヌクレオチドピロホスフアター
ゼを採取することを特徴とするヌクレオチドピロ
ホスフアターゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56031932A JPS57146574A (en) | 1981-03-07 | 1981-03-07 | Preparation of nucleotide pyrophosphatase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56031932A JPS57146574A (en) | 1981-03-07 | 1981-03-07 | Preparation of nucleotide pyrophosphatase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57146574A JPS57146574A (en) | 1982-09-10 |
| JPS6253149B2 true JPS6253149B2 (ja) | 1987-11-09 |
Family
ID=12344738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56031932A Granted JPS57146574A (en) | 1981-03-07 | 1981-03-07 | Preparation of nucleotide pyrophosphatase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57146574A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8187646B2 (en) | 2004-06-29 | 2012-05-29 | Puratos N.V. | Nucleotide pyrophosphatase inhibitor and coenzyme regenerating systems |
| WO2006000066A2 (en) * | 2004-06-29 | 2006-01-05 | Puratos Naamloze Vennootschap | Dough comprising nucleotide pyrophosphatase inhibitor |
-
1981
- 1981-03-07 JP JP56031932A patent/JPS57146574A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57146574A (en) | 1982-09-10 |
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