JPH09238689A - 植物の花の老化の制御 - Google Patents
植物の花の老化の制御Info
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- JPH09238689A JPH09238689A JP8095744A JP9574496A JPH09238689A JP H09238689 A JPH09238689 A JP H09238689A JP 8095744 A JP8095744 A JP 8095744A JP 9574496 A JP9574496 A JP 9574496A JP H09238689 A JPH09238689 A JP H09238689A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 広範囲の植物種にわたって、容易かつ効率的
に利用できる、植物及び植物の花の老化を制御するため
の非化学的方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、所望の植物組織において、Ａ
ＣＣ代謝酵素たとえばＡＣＣデアミナーゼ酵素を発現さ
せるものである。この目的において、植物はＡＣＣ代謝
酵素をコードする遺伝子を含有する構築体によって形質
転換される。ＡＣＣ代謝酵素コード遺伝子を含有する構
築体も本発明に包含される。植物中でＡＣＣ代謝酵素を
発現させることにより、エチレンの産生が低下し、植物
の成熟および老化が制御され、果実、野菜、切花の貯蔵
寿命および市場性は著しく増大する。本発明の方法を、
植物におけるエチレンの産生を低下させる他の方法と組
合せて、果実または植物のエチレン産生をさらに低下さ
せることもできる。
に利用できる、植物及び植物の花の老化を制御するため
の非化学的方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、所望の植物組織において、Ａ
ＣＣ代謝酵素たとえばＡＣＣデアミナーゼ酵素を発現さ
せるものである。この目的において、植物はＡＣＣ代謝
酵素をコードする遺伝子を含有する構築体によって形質
転換される。ＡＣＣ代謝酵素コード遺伝子を含有する構
築体も本発明に包含される。植物中でＡＣＣ代謝酵素を
発現させることにより、エチレンの産生が低下し、植物
の成熟および老化が制御され、果実、野菜、切花の貯蔵
寿命および市場性は著しく増大する。本発明の方法を、
植物におけるエチレンの産生を低下させる他の方法と組
合せて、果実または植物のエチレン産生をさらに低下さ
せることもできる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的には植物分
子生物学に関し、さらに詳しくは果実および野菜の成熟
の制御ならびに植物における老化の効果の制御、また所
望の制御に影響可能な組換えＤＮＡ分子に関する。
子生物学に関し、さらに詳しくは果実および野菜の成熟
の制御ならびに植物における老化の効果の制御、また所
望の制御に影響可能な組換えＤＮＡ分子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】果実、
野菜および切花の産業が直面している大きな問題の一つ
には、損傷によりかなりの量の商品の損失があることで
ある。果実および野菜生産物は、農場から出荷されてか
ら小売または加工販路に到達するまでに、その１２〜２
０％が損傷を受けると評価されている。切花工業におい
ては、効果的に売りさばかれる前に花の老化（凋萎また
は乾燥）が重要な問題である。果実、野菜および切花に
認められる傷みや老化過程が多くの望ましくない問題を
生じることになる。これらの問題の中で主要なものは、
商品の短い収穫期間と収穫後の商品の短い貯蔵寿命であ
る。さらに、これらの損傷による損失は、最終的には、
消費者への商品価値の上昇にはねかえることになる。
野菜および切花の産業が直面している大きな問題の一つ
には、損傷によりかなりの量の商品の損失があることで
ある。果実および野菜生産物は、農場から出荷されてか
ら小売または加工販路に到達するまでに、その１２〜２
０％が損傷を受けると評価されている。切花工業におい
ては、効果的に売りさばかれる前に花の老化（凋萎また
は乾燥）が重要な問題である。果実、野菜および切花に
認められる傷みや老化過程が多くの望ましくない問題を
生じることになる。これらの問題の中で主要なものは、
商品の短い収穫期間と収穫後の商品の短い貯蔵寿命であ
る。さらに、これらの損傷による損失は、最終的には、
消費者への商品価値の上昇にはねかえることになる。
【０００３】果実および野菜の損傷の一次的原因は、果
実または野菜の自然の成熟過程にある。果実または野菜
は熟するほど、柔らかくなり、また病気や他の損傷起因
物質の影響を受けやすくなる。植物中でのエチレンの生
成が果実の成熟を刺激し、果実や野菜の成熟におけるキ
ー成分であることが知られている。生産物の保存寿命お
よび／または収穫時期の延長を目指して、果実や野菜の
成熟の制御が試みられてきた。これらの試みの多くは、
果実や野菜自体への化学物質の局所適用である。これら
の化学的解決は、農場の植物への直接適用または果実も
しくは野菜自体への収穫後適用であった。これらの方法
のいくつかは、米国特許第４，９５７，７５７号または
米国特許第４，８５１，０３５号に記載されている。環
境へのこれ以上の侵襲を低減することの重要性が増大し
ていることから、化学的方法以外の方法による成熟の制
御が、この業界に対して有利かつ有益であろうと考えら
れる。
実または野菜の自然の成熟過程にある。果実または野菜
は熟するほど、柔らかくなり、また病気や他の損傷起因
物質の影響を受けやすくなる。植物中でのエチレンの生
成が果実の成熟を刺激し、果実や野菜の成熟におけるキ
ー成分であることが知られている。生産物の保存寿命お
よび／または収穫時期の延長を目指して、果実や野菜の
成熟の制御が試みられてきた。これらの試みの多くは、
果実や野菜自体への化学物質の局所適用である。これら
の化学的解決は、農場の植物への直接適用または果実も
しくは野菜自体への収穫後適用であった。これらの方法
のいくつかは、米国特許第４，９５７，７５７号または
米国特許第４，８５１，０３５号に記載されている。環
境へのこれ以上の侵襲を低減することの重要性が増大し
ていることから、化学的方法以外の方法による成熟の制
御が、この業界に対して有利かつ有益であろうと考えら
れる。
【０００４】さらに最近になって、トマトの成熟の制御
を目指して、植物のエチレン合成を遮断する分子生物学
的アプローチが用いられるようになった。このアプロー
チには、トマトの苗木の、エチレンの合成を阻害するア
ンチセンス遺伝子による形質転換が包含される。このア
ンチセンス遺伝子は、１−アミノシクロプロパン−１−
カルボン酸（ＡＣＣ）のエチレン形成酵素ＡＣＣオキシ
ターゼによるエチレンへの変換に関与するポリペプチド
をコードする（＋）鎖ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下
させる（−）鎖ＲＮＡを生成する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
ら、１９９０）。この方法は、ある程度の有用性を示す
ものの、アンチセンス遺伝子は多分、種もしくは遺伝子
特異的であって、形質転換を所望する植物の種ごとに別
のアンチセンス遺伝子を獲得する必要があることから、
他の植物へのこの技術の応用は容易でも効率的でもない
と思われる。
を目指して、植物のエチレン合成を遮断する分子生物学
的アプローチが用いられるようになった。このアプロー
チには、トマトの苗木の、エチレンの合成を阻害するア
ンチセンス遺伝子による形質転換が包含される。このア
ンチセンス遺伝子は、１−アミノシクロプロパン−１−
カルボン酸（ＡＣＣ）のエチレン形成酵素ＡＣＣオキシ
ターゼによるエチレンへの変換に関与するポリペプチド
をコードする（＋）鎖ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下
させる（−）鎖ＲＮＡを生成する（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
ら、１９９０）。この方法は、ある程度の有用性を示す
ものの、アンチセンス遺伝子は多分、種もしくは遺伝子
特異的であって、形質転換を所望する植物の種ごとに別
のアンチセンス遺伝子を獲得する必要があることから、
他の植物へのこの技術の応用は容易でも効率的でもない
と思われる。
【０００５】したがって、果実、野菜および切花の産業
には、広範囲の植物種にわたって容易かつ効率的に利用
できる、果実の成熟および植物の老化の制御のための非
化学的方法が求められている。
には、広範囲の植物種にわたって容易かつ効率的に利用
できる、果実の成熟および植物の老化の制御のための非
化学的方法が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】果実および野菜の成熟の
制御ならびに切花における老化の効果の制御の方法が提
供される。一般的には、この方法は、所望の植物組織に
おけるＡＣＣ代謝酵素、すなわち組織のＡＣＣレベルを
低下させ、したがって所望の植物組織のエチレンのレベ
ルを減少させる酵素の、発現に関する。さらに詳しく
は、植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機
能をもつプロモーター、ＡＣＣデアミナーゼ酵素をコー
ドするＲＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列およ
び植物細胞内においてＲＮＡ配列の３′末端への一連の
ポリアデニル化ヌクレオチドの付加を惹起する機能をも
つ３′非翻訳領域からなり、上記プロモーターは上記構
造ＤＮＡ配列に関して異種である、キメラ遺伝子で植物
細胞を形成転換し、ついでその植物を成熟まで成長させ
ることからなる。果実中におけるＡＣＣデアミナーゼの
発現は、成熟過程を遅延させ、それが収穫時期および生
産品の貯蔵寿命を延長させることになる。同様に、切花
産業における使用に適した植物種でのＡＣＣ代謝酵素の
発現は、花の老化を遅延させ、その結果、貯蔵寿命およ
び花の市場性が延長される。
制御ならびに切花における老化の効果の制御の方法が提
供される。一般的には、この方法は、所望の植物組織に
おけるＡＣＣ代謝酵素、すなわち組織のＡＣＣレベルを
低下させ、したがって所望の植物組織のエチレンのレベ
ルを減少させる酵素の、発現に関する。さらに詳しく
は、植物細胞内においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機
能をもつプロモーター、ＡＣＣデアミナーゼ酵素をコー
ドするＲＮＡ配列の産生を惹起する構造ＤＮＡ配列およ
び植物細胞内においてＲＮＡ配列の３′末端への一連の
ポリアデニル化ヌクレオチドの付加を惹起する機能をも
つ３′非翻訳領域からなり、上記プロモーターは上記構
造ＤＮＡ配列に関して異種である、キメラ遺伝子で植物
細胞を形成転換し、ついでその植物を成熟まで成長させ
ることからなる。果実中におけるＡＣＣデアミナーゼの
発現は、成熟過程を遅延させ、それが収穫時期および生
産品の貯蔵寿命を延長させることになる。同様に、切花
産業における使用に適した植物種でのＡＣＣ代謝酵素の
発現は、花の老化を遅延させ、その結果、貯蔵寿命およ
び花の市場性が延長される。
【０００７】本発明の他の態様においては、植物細胞内
においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機能をもつプロモ
ーター、ＡＣＣデアミナーゼ酵素をコードする構造ＤＮ
Ａ配列、およびＲＮＡ配列の３′末端への一連のポリア
デニルヌクレオチドの付加を惹起する機能をもつ３′非
翻訳領域からなり、プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関
して異種である、組換え二重鎖ＤＮＡ分子も提供する。
これにより、成熟および老化を制御するため、ＡＣＣデ
アミナーゼを発現できる植物を得ることができる。植物
細胞におけるＡＣＣデアミナーゼの発現は、植物におけ
るエチレンの産生が減少することにより、生産品の収穫
時期および貯蔵寿命を延長させる。
においてＲＮＡ配列の産生を惹起する機能をもつプロモ
ーター、ＡＣＣデアミナーゼ酵素をコードする構造ＤＮ
Ａ配列、およびＲＮＡ配列の３′末端への一連のポリア
デニルヌクレオチドの付加を惹起する機能をもつ３′非
翻訳領域からなり、プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関
して異種である、組換え二重鎖ＤＮＡ分子も提供する。
これにより、成熟および老化を制御するため、ＡＣＣデ
アミナーゼを発現できる植物を得ることができる。植物
細胞におけるＡＣＣデアミナーゼの発現は、植物におけ
るエチレンの産生が減少することにより、生産品の収穫
時期および貯蔵寿命を延長させる。
【０００８】本発明の多くの目的の中で、主要な一つの
目的は、多くの植物種に効果的に広く適用可能な分子生
物学的技術を利用して、植物の成熟および老化を制御す
る方法を提供することにある。
目的は、多くの植物種に効果的に広く適用可能な分子生
物学的技術を利用して、植物の成熟および老化を制御す
る方法を提供することにある。
【０００９】本発明の他の目的は、植物中に発現するＡ
ＣＣ代謝酵素、たとえばＡＣＣデアミナーゼまたはＡＣ
Ｃマロニルトランスフェラーゼを用いＡＣＣの定常状態
レベルを低下させることによって、植物中でのエチレン
の産生を制御し、果実、野菜および花の収穫時期および
貯蔵寿命を延長させる方法を提供することにある。
ＣＣ代謝酵素、たとえばＡＣＣデアミナーゼまたはＡＣ
Ｃマロニルトランスフェラーゼを用いＡＣＣの定常状態
レベルを低下させることによって、植物中でのエチレン
の産生を制御し、果実、野菜および花の収穫時期および
貯蔵寿命を延長させる方法を提供することにある。
【００１０】本発明のさらに他の目的は、植物中で酵素
ＡＣＣデアミナーゼを発現させることによって、植物中
でのエチレンの合成を低下させることにある。
ＡＣＣデアミナーゼを発現させることによって、植物中
でのエチレンの合成を低下させることにある。
【００１１】本発明のさらに他の目的は、花に、酵素Ａ
ＣＣデアミナーゼを発現させることによって、花でのエ
チレン合成による老化作用を低下させて、切花の市場寿
命を延長させることにある。
ＣＣデアミナーゼを発現させることによって、花でのエ
チレン合成による老化作用を低下させて、切花の市場寿
命を延長させることにある。
【００１２】本発明のさらに他の目的は、果実をつるで
成熟させる場合でもまた発生の未熟段階で摘取してその
後に成熟させる場合でも、果実の成熟を遅延させること
ができるように、植物中で酵素ＡＣＣデアミナーゼを発
現する形質転換植物を提供することにある。
成熟させる場合でもまた発生の未熟段階で摘取してその
後に成熟させる場合でも、果実の成熟を遅延させること
ができるように、植物中で酵素ＡＣＣデアミナーゼを発
現する形質転換植物を提供することにある。
【００１３】本発明はまた、植物の果実で特異的にＡＣ
Ｃデアミナーゼを発現できる担果実植物を提供すること
を、その主要な目的とするものである。
Ｃデアミナーゼを発現できる担果実植物を提供すること
を、その主要な目的とするものである。
【００１４】本発明の他の目的は、添付の図面を参照し
ながら以下の説明および特許請求の範囲を読むことによ
って明確になろう。
ながら以下の説明および特許請求の範囲を読むことによ
って明確になろう。
【００１５】
【発明の実施の形態】植物におけるエチレン産生の代謝
経路は次の通りである。
経路は次の通りである。
【００１６】
【化１】
【００１７】植物組織でのエチレンの生合成を阻害する
ための一つの可能性のある方法は、１−アミノシクロプ
ロパン−１−カルボン酸（以下ＡＣＣ）を代謝させ、そ
れを代謝プールから除去することであろう。ＡＣＣ代謝
酵素がエチレン生合成の阻害に十分なまでＡＣＣのレベ
ルを低下させることができるか否かは不明であったが、
このアプローチが検討された。多数の酵素がＡＣＣを代
謝できる。ＡＣＣ代謝酵素の例にはＡＣＣデアミナーゼ
およびＡＣＣマロニルトランスフェラーゼがある。ＡＣ
Ｃデアミナーゼ酵素はＡＣＣをα−ケト酪酸とアンモニ
アに変換することによって代謝する。すなわち、もし十
分な速度論的能力をもつ酵素ＡＣＣデアミナーゼ、また
は他のＡＣＣ代謝酵素が植物中に十分なレベルで発現で
きれば、エチレンの合成は、ＡＣＣ代謝酵素が発現する
組織における代謝プールからのＡＣＣの除去により、阻
害されるはずである。本発明の重要な態様は、植物組織
におけるＡＣＣの定常状態レベルを低下させ、これによ
って植物組織におけるエチレンのレベルを低下させるこ
とにより、果実の成熟および植物の老化を遅延させる機
構を提供することである。植物中のエチレンまたはＡＣ
Ｃの定常状態濃度は、非修飾栽培種の正常レベルから少
なくとも約７０％程度低下させることが好ましい。好ま
しくは、エチレンまたはＡＣＣ濃度は正常レベルから少
なくとも約９０％程度低下させる。植物または植物の果
実中のＡＣＣまたはエチレンの定常状態レベルの低下
は、様々な方法で達成できると考えられるが、これらは
すべて、本発明の範囲内に包含されるものである。
ための一つの可能性のある方法は、１−アミノシクロプ
ロパン−１−カルボン酸（以下ＡＣＣ）を代謝させ、そ
れを代謝プールから除去することであろう。ＡＣＣ代謝
酵素がエチレン生合成の阻害に十分なまでＡＣＣのレベ
ルを低下させることができるか否かは不明であったが、
このアプローチが検討された。多数の酵素がＡＣＣを代
謝できる。ＡＣＣ代謝酵素の例にはＡＣＣデアミナーゼ
およびＡＣＣマロニルトランスフェラーゼがある。ＡＣ
Ｃデアミナーゼ酵素はＡＣＣをα−ケト酪酸とアンモニ
アに変換することによって代謝する。すなわち、もし十
分な速度論的能力をもつ酵素ＡＣＣデアミナーゼ、また
は他のＡＣＣ代謝酵素が植物中に十分なレベルで発現で
きれば、エチレンの合成は、ＡＣＣ代謝酵素が発現する
組織における代謝プールからのＡＣＣの除去により、阻
害されるはずである。本発明の重要な態様は、植物組織
におけるＡＣＣの定常状態レベルを低下させ、これによ
って植物組織におけるエチレンのレベルを低下させるこ
とにより、果実の成熟および植物の老化を遅延させる機
構を提供することである。植物中のエチレンまたはＡＣ
Ｃの定常状態濃度は、非修飾栽培種の正常レベルから少
なくとも約７０％程度低下させることが好ましい。好ま
しくは、エチレンまたはＡＣＣ濃度は正常レベルから少
なくとも約９０％程度低下させる。植物または植物の果
実中のＡＣＣまたはエチレンの定常状態レベルの低下
は、様々な方法で達成できると考えられるが、これらは
すべて、本発明の範囲内に包含されるものである。
【００１８】果実の成熟の遅延に関しては、つるの上で
の成熟からは１〜３０日間遅延させることが好ましい。
この遅延は、成熟の開始から、とくにトマトの場合に
は、果実が成熟のブレーカー段階に到達したときから起
算する。同様に、果実は好ましくは、つるから摘取後１
〜９０日、さらに好ましくは５〜３０日成熟を遅延させ
る。トマトに関しては、この成熟の遅延は、果実が成熟
グリーンまたは成熟のブレーカー段階に採取された場
合、果実のつるからの摘取の時点から起算する。つるか
ら摘取後の成熟のこの遅延は、冷所保存や本技術分野で
既知の他の方法に報告されている期間よりはるかに長く
延長できるものであることを理解すべきである。
の成熟からは１〜３０日間遅延させることが好ましい。
この遅延は、成熟の開始から、とくにトマトの場合に
は、果実が成熟のブレーカー段階に到達したときから起
算する。同様に、果実は好ましくは、つるから摘取後１
〜９０日、さらに好ましくは５〜３０日成熟を遅延させ
る。トマトに関しては、この成熟の遅延は、果実が成熟
グリーンまたは成熟のブレーカー段階に採取された場
合、果実のつるからの摘取の時点から起算する。つるか
ら摘取後の成熟のこの遅延は、冷所保存や本技術分野で
既知の他の方法に報告されている期間よりはるかに長く
延長できるものであることを理解すべきである。
【００１９】さらに実験を進めるために、酵素ＡＣＣデ
アミナーゼを選択した。ＡＣＣデアミナーゼが植物中で
自然に産生または発現することは、本技術分野では知ら
れていない。したがって、ＡＣＣの分解によって植物中
のエチレン合成を阻害する方法を追跡するためには、Ａ
ＣＣデアミナーゼをコードする遺伝子を同定し、ついで
植物中で発現可能にしなければならない。
アミナーゼを選択した。ＡＣＣデアミナーゼが植物中で
自然に産生または発現することは、本技術分野では知ら
れていない。したがって、ＡＣＣの分解によって植物中
のエチレン合成を阻害する方法を追跡するためには、Ａ
ＣＣデアミナーゼをコードする遺伝子を同定し、ついで
植物中で発現可能にしなければならない。
【００２０】ＡＣＣデアミナーゼはある種の微生物で発
現することが知られている（Ｈｏｎｍａ．Ｍ．＆ Ｓｈ
ｉｍｏｍｕｒａ．Ｔ．１９７８）。ＡＣＣデアミナーゼ
酵素を単離するためには、この酵素を発現する細菌を単
離する細菌スクリーンを、このような細菌もしくは微生
物の同定のために設計できる。ＡＣＣデアミナーゼ酵素
を同定する他の方法、たとえば酵母またはかびの株のス
クリーニングも同様に適用可能で、これらは本技術分野
の熟練者には定常的な手段になっている。以下は、ＡＣ
Ｃデアミナーゼ酵素発現細菌を同定した細菌スクリーニ
ングの説明である。
現することが知られている（Ｈｏｎｍａ．Ｍ．＆ Ｓｈ
ｉｍｏｍｕｒａ．Ｔ．１９７８）。ＡＣＣデアミナーゼ
酵素を単離するためには、この酵素を発現する細菌を単
離する細菌スクリーンを、このような細菌もしくは微生
物の同定のために設計できる。ＡＣＣデアミナーゼ酵素
を同定する他の方法、たとえば酵母またはかびの株のス
クリーニングも同様に適用可能で、これらは本技術分野
の熟練者には定常的な手段になっている。以下は、ＡＣ
Ｃデアミナーゼ酵素発現細菌を同定した細菌スクリーニ
ングの説明である。
【００２１】細菌株コレクション（Ｄｒａｈｏｓ，
Ｄ．，１９８８）について、ＡＣＣを分解できる生物体
をスクリーニングした。この細菌コレクションは５９７
の微生物から構成されている。大部分の生物体は、蛍光
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種であり、残りは土壌中に通常
見出される微生物である。細菌コレクションの一覧は図
１に示す。スクリーニングは、単独の窒素源として３．
０ｍＭのＡＣＣを含有する最小培地で生育する微生物を
選択できるように設計された。細菌コレクション中の各
細菌のサンプルを、９６−ウェルマイクロタイタープレ
ート中で、個々に、３０℃において４日間生育させた。
各ウェルにはＡＣＣを補充したＤＦ培地０．２ｍｌを含
有させた。ＤＦ培地は、オートクレーブ処理した水１リ
ットル中に、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ各１ｍｌおよびチ
アミン塩酸塩５ｍｇを混合して作成した。試薬Ａは、オ
ートクレーブ処理した水１００ｍｌ中、１ｍｇのＨ3 Ｂ
Ｏ3 、１ｍｇのＭｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１２．５ｍｇの
ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、８ｍｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ
2 Ｏ、ならびに１．７ｍｇのＮａＭｏＯ3 ・３Ｈ2 Ｏか
らなる。試薬Ｂは、オートクレーブ処理した水１００ｍ
ｌ中、０．１ｍｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏからなる。試
薬Ｃは、オートクレーブ処理した水１００ｍｌ中、２０
ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを含有する。混合した溶液
に、炭素源グルコース、グルコン酸およびクエン酸を最
終濃度各０．１％（ｗ／ｖ）、無機リン酸を最終濃度
１．０ｍＭ（ｗ／ｖ）、および単独窒素源としてＡＣＣ
を最終濃度３．０ｍＭ（ｗ／ｖ）添加する。最後に酵母
エキス（ＤＩＦＣＯ）を最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）
加える。
Ｄ．，１９８８）について、ＡＣＣを分解できる生物体
をスクリーニングした。この細菌コレクションは５９７
の微生物から構成されている。大部分の生物体は、蛍光
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種であり、残りは土壌中に通常
見出される微生物である。細菌コレクションの一覧は図
１に示す。スクリーニングは、単独の窒素源として３．
０ｍＭのＡＣＣを含有する最小培地で生育する微生物を
選択できるように設計された。細菌コレクション中の各
細菌のサンプルを、９６−ウェルマイクロタイタープレ
ート中で、個々に、３０℃において４日間生育させた。
各ウェルにはＡＣＣを補充したＤＦ培地０．２ｍｌを含
有させた。ＤＦ培地は、オートクレーブ処理した水１リ
ットル中に、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ各１ｍｌおよびチ
アミン塩酸塩５ｍｇを混合して作成した。試薬Ａは、オ
ートクレーブ処理した水１００ｍｌ中、１ｍｇのＨ3 Ｂ
Ｏ3 、１ｍｇのＭｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１２．５ｍｇの
ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、８ｍｇのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ
2 Ｏ、ならびに１．７ｍｇのＮａＭｏＯ3 ・３Ｈ2 Ｏか
らなる。試薬Ｂは、オートクレーブ処理した水１００ｍ
ｌ中、０．１ｍｇのＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏからなる。試
薬Ｃは、オートクレーブ処理した水１００ｍｌ中、２０
ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを含有する。混合した溶液
に、炭素源グルコース、グルコン酸およびクエン酸を最
終濃度各０．１％（ｗ／ｖ）、無機リン酸を最終濃度
１．０ｍＭ（ｗ／ｖ）、および単独窒素源としてＡＣＣ
を最終濃度３．０ｍＭ（ｗ／ｖ）添加する。最後に酵母
エキス（ＤＩＦＣＯ）を最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）
加える。
【００２２】このスクリーンに基づき、ＡＣＣ含有培地
上で生育できるものとして、３つの微生物が同定され
た。これらのＡＣＣ含有最小培地上での生育能は、同一
培地の３００ｍｌ液体培養液中で再生育させて確認し
た。ＡＣＣ上で最も良好な生育を示した２つの単離体に
ついて、さらにその特性を調べた。これらの２つの単離
体は３Ｆ２および６Ｇ５命名された。これらの生物体は
いずれも、さらに性質の調査に選ばれなかった生物体と
同じく、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであった。選択された
生物体はいずれも、以下に記載するインビトロアッセイ
により、ＡＣＣデアミナーゼ活性についてスクリーニン
グした。６Ｇ５単離体が、さらに以後の実験のために選
ばれた。６Ｇ５細菌は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９８２）によ
って報告された脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグ
ラフィー分析により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌ
ｏｒｏａｐｈｉｓ株として同定された。上述のスクリー
ニング結果から、さらに広範なスクリーニングを実施す
れば、ＡＣＣを分解する他の細菌株を同定できるであろ
うことは明白である。したがって、他のＡＣＣデアミナ
ーゼ、およびスクリーニングによって同定されたがその
後の実験には使用されなかったものも、本発明の範囲に
包含されるものと考えるべきである。
上で生育できるものとして、３つの微生物が同定され
た。これらのＡＣＣ含有最小培地上での生育能は、同一
培地の３００ｍｌ液体培養液中で再生育させて確認し
た。ＡＣＣ上で最も良好な生育を示した２つの単離体に
ついて、さらにその特性を調べた。これらの２つの単離
体は３Ｆ２および６Ｇ５命名された。これらの生物体は
いずれも、さらに性質の調査に選ばれなかった生物体と
同じく、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであった。選択された
生物体はいずれも、以下に記載するインビトロアッセイ
により、ＡＣＣデアミナーゼ活性についてスクリーニン
グした。６Ｇ５単離体が、さらに以後の実験のために選
ばれた。６Ｇ５細菌は、Ｍｉｌｌｅｒ（１９８２）によ
って報告された脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグ
ラフィー分析により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌ
ｏｒｏａｐｈｉｓ株として同定された。上述のスクリー
ニング結果から、さらに広範なスクリーニングを実施す
れば、ＡＣＣを分解する他の細菌株を同定できるであろ
うことは明白である。したがって、他のＡＣＣデアミナ
ーゼ、およびスクリーニングによって同定されたがその
後の実験には使用されなかったものも、本発明の範囲に
包含されるものと考えるべきである。
【００２３】ＡＣＣを分解できる多数の生物体が同様
に、様々な土壌サンプルから単離されている。これらの
生物体はＡＣＣを単独の栄養源として含む最小培地上で
生育が可能であることに基づいて単離された。土壌サン
プルは、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕ
ＳＡ）、Ｓａｒａｗａｋ（Ｍａｌａｙｓｉａ）、Ｉｑｕ
ｉｔｏｓ（Ｐｅｒｕ）、Ｓａｎ Ｊｕａｎ（Ｐｕｅｒｔ
ｏ Ｒｉｃｏ）およびＭｕｊｉｎｄｉ（Ｔａｎｚａｎｉ
ａ）から採集された。各土壌サンプル１ｇを９．９ｍｌ
の希釈緩衝液ボトル（Ｆｉｓｈｅｒ）中に懸濁し、よく
振盪し、土壌懸濁液を１：１００に希釈したのち平板培
養する。土壌サンプルの最終希釈度は１０-4であった。
希釈サンプル１００ｍｌを、ペトリ皿（１００×１５ｍ
ｍ）中の単離培地上にホッケースティック型のガラス棒
で広げた。単離培地には、Ｋ2 ＨＰＯ4 （１０ｇ／
ｌ）、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（５ｇ／ｌ）、および微量
元素：ＦｅＳＯ4 （１ｍｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ2 （１ｍｇ
／ｌ）、ＣｕＳＯ4 （１ｍｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ4 （１ｍ
ｇ／ｌ）、ＣａＣｌ2 （１ｍｇ／ｌ）の最小塩ベースを
含有する。ベースのｐＨを１Ｎ ＨＣｌで７．０に調製
したのち、オートクレーブ処理した。ＡＣＣ分解微生物
の単離には、以下の３種の培地：（１）ベース＋グルコ
ース（５ｇ／ｌ）＋ＡＣＣ（０．１〜１．０ｇ）；
（２）ベース＋ＮＨ4 ＮＯ3 （５ｇ／ｌ）＋ＡＣＣ（１
ｇ／ｌ）；または（３）ベース＋ＡＣＣ（１ｇ／ｌ）の
いずれかを使用できる。ＡＣＣ、グルコース、ＮＨ4 Ｎ
Ｏ3 は蒸留水に溶解し、滅菌濾過し、オートクレーブ処
理したベース培地を５０℃に冷却した中に添加した。平
板は３０℃で１週間インキュベートした。
に、様々な土壌サンプルから単離されている。これらの
生物体はＡＣＣを単独の栄養源として含む最小培地上で
生育が可能であることに基づいて単離された。土壌サン
プルは、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕ
ＳＡ）、Ｓａｒａｗａｋ（Ｍａｌａｙｓｉａ）、Ｉｑｕ
ｉｔｏｓ（Ｐｅｒｕ）、Ｓａｎ Ｊｕａｎ（Ｐｕｅｒｔ
ｏ Ｒｉｃｏ）およびＭｕｊｉｎｄｉ（Ｔａｎｚａｎｉ
ａ）から採集された。各土壌サンプル１ｇを９．９ｍｌ
の希釈緩衝液ボトル（Ｆｉｓｈｅｒ）中に懸濁し、よく
振盪し、土壌懸濁液を１：１００に希釈したのち平板培
養する。土壌サンプルの最終希釈度は１０-4であった。
希釈サンプル１００ｍｌを、ペトリ皿（１００×１５ｍ
ｍ）中の単離培地上にホッケースティック型のガラス棒
で広げた。単離培地には、Ｋ2 ＨＰＯ4 （１０ｇ／
ｌ）、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（５ｇ／ｌ）、および微量
元素：ＦｅＳＯ4 （１ｍｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ2 （１ｍｇ
／ｌ）、ＣｕＳＯ4 （１ｍｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ4 （１ｍ
ｇ／ｌ）、ＣａＣｌ2 （１ｍｇ／ｌ）の最小塩ベースを
含有する。ベースのｐＨを１Ｎ ＨＣｌで７．０に調製
したのち、オートクレーブ処理した。ＡＣＣ分解微生物
の単離には、以下の３種の培地：（１）ベース＋グルコ
ース（５ｇ／ｌ）＋ＡＣＣ（０．１〜１．０ｇ）；
（２）ベース＋ＮＨ4 ＮＯ3 （５ｇ／ｌ）＋ＡＣＣ（１
ｇ／ｌ）；または（３）ベース＋ＡＣＣ（１ｇ／ｌ）の
いずれかを使用できる。ＡＣＣ、グルコース、ＮＨ4 Ｎ
Ｏ3 は蒸留水に溶解し、滅菌濾過し、オートクレーブ処
理したベース培地を５０℃に冷却した中に添加した。平
板は３０℃で１週間インキュベートした。
【００２４】Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓから得られた土壌に
ＡＣＣを加えて、土壌中のＡＣＣ分解細菌を増強させ
た。この実験では、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラ
スコ中、０．５ｇのＳｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ土壌を含む希
釈緩衝液５０ｍｌにＡＣＣ（２５０ｍｇ）を加えた。フ
ラスコをロータリーシェーカー上（２５０ｒｐｍ、３０
℃）で３日間インキュベートした。ＡＣＣ強化サンプル
はついで、非強化サンプルについて記載したと同様にし
て平板培養した。平板上ＡＣＣの存在下に生育できる細
菌コロニーをついで純粋培養液中に単離し、以下の培
地：Ｋ2 ＨＰＯ4 （４ｇ／ｌ）、ＫＨ2 ＰＯ4 （６．５
ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（１ｇ／ｌ）、微量元
素（単離培地の場合と同じ）、およびＡＣＣ（０．３ｇ
／ｌ）を５ｍｌ含む試験管（２０×１５０）中で増殖さ
せた。細菌の増殖を助けるためにグルコース（２ｇ／
ｌ）を加えることもできる。最小塩培地中、単独炭素源
および窒素源としてＡＣＣを用いて増殖する細菌株を表
１に掲げる。
ＡＣＣを加えて、土壌中のＡＣＣ分解細菌を増強させ
た。この実験では、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラ
スコ中、０．５ｇのＳｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ土壌を含む希
釈緩衝液５０ｍｌにＡＣＣ（２５０ｍｇ）を加えた。フ
ラスコをロータリーシェーカー上（２５０ｒｐｍ、３０
℃）で３日間インキュベートした。ＡＣＣ強化サンプル
はついで、非強化サンプルについて記載したと同様にし
て平板培養した。平板上ＡＣＣの存在下に生育できる細
菌コロニーをついで純粋培養液中に単離し、以下の培
地：Ｋ2 ＨＰＯ4 （４ｇ／ｌ）、ＫＨ2 ＰＯ4 （６．５
ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ（１ｇ／ｌ）、微量元
素（単離培地の場合と同じ）、およびＡＣＣ（０．３ｇ
／ｌ）を５ｍｌ含む試験管（２０×１５０）中で増殖さ
せた。細菌の増殖を助けるためにグルコース（２ｇ／
ｌ）を加えることもできる。最小塩培地中、単独炭素源
および窒素源としてＡＣＣを用いて増殖する細菌株を表
１に掲げる。
【００２５】
【表１】
【００２６】これらの微生物はすべて、２つの基準でＡ
ＣＣデアミナーゼを発現することを示した。第一の基準
は、すべての生物体からの抽出物がＡＣＣをα−ケト酪
酸に変換できること、第二は、すべてが６Ｇ５ＡＣＣデ
アミナーゼ蛋白に対して作成した抗体と強力な交差反応
を示す約３７，０００ダルトンの蛋白を含有することと
した。さらに、これらの微生物の等価性を明らかにする
ため、単離ＡＣＣデアミナーゼ酵素のそれぞれについ
て、カイネティックパラメーターを測定した。
ＣＣデアミナーゼを発現することを示した。第一の基準
は、すべての生物体からの抽出物がＡＣＣをα−ケト酪
酸に変換できること、第二は、すべてが６Ｇ５ＡＣＣデ
アミナーゼ蛋白に対して作成した抗体と強力な交差反応
を示す約３７，０００ダルトンの蛋白を含有することと
した。さらに、これらの微生物の等価性を明らかにする
ため、単離ＡＣＣデアミナーゼ酵素のそれぞれについ
て、カイネティックパラメーターを測定した。
【００２７】各種土壌起源から単離されたＡＣＣデアミ
ナーゼのＫｍは粗製脱塩抽出物を用いて測定した。各細
菌株は水１リットル中、４ｇのＫ2 ＨＰＯ4 、６．５ｇ
のＫＨ2 ＰＯ4 、１ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｇの
グルコース、１ｍｇのＦｅＳＯ4 、１ｍｇのＭｎＣ
ｌ2 、１ｍｇのＺｎＳＯ4 、１ｍｇのＣｕＳＯ4 、１ｍ
ｇのＣａＣｌ2 および３００ｍｇのＡＣＣを含む液体培
地中で増殖させた。細胞は３０℃で３日間増殖させた。
細胞を遠心分離してペレット化し、０．１Ｍのリン酸
塩、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％β−メル
カプトエタノールを含有する抽出緩衝液中に再懸濁し
た。細胞をフレンチプレス１０００ｐｓｉで破壊し、細
胞屑を遠心分離してペレット化した。上清を、抽出緩衝
液で予め平衡化したＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラム上
で脱塩して、粗製の脱塩抽出物を得た。抽出物にグリセ
ロール（２０％ｖ／ｖ）を加え、酵素溶液は−２０℃で
保存した。ＡＣＣデアミナーゼ酵素アッセイは、以下の
実施例に記載のようにして行った。アッセイ混合物は、
１００μｌの０．２Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０、３０
μｌの５００ｍＭ ＡＣＣ溶液、および酵素溶液を含有
させ、最終容量２００μｌとした。反応は３０℃で行っ
た。１．８ｍｌの２Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。３
００μｌの０．１％２，４−ジニトロフェニルヒドラジ
ンを添加したのち、混合物を３０℃で１５分インキュベ
ートした。ついで、２ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨを加えて溶
液を塩基性にした。得られた赤褐色の溶液の光学密度
を、スペクトロフォトメーターを用いて、５４０ｎｍで
測定した。
ナーゼのＫｍは粗製脱塩抽出物を用いて測定した。各細
菌株は水１リットル中、４ｇのＫ2 ＨＰＯ4 、６．５ｇ
のＫＨ2 ＰＯ4 、１ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｇの
グルコース、１ｍｇのＦｅＳＯ4 、１ｍｇのＭｎＣ
ｌ2 、１ｍｇのＺｎＳＯ4 、１ｍｇのＣｕＳＯ4 、１ｍ
ｇのＣａＣｌ2 および３００ｍｇのＡＣＣを含む液体培
地中で増殖させた。細胞は３０℃で３日間増殖させた。
細胞を遠心分離してペレット化し、０．１Ｍのリン酸
塩、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％β−メル
カプトエタノールを含有する抽出緩衝液中に再懸濁し
た。細胞をフレンチプレス１０００ｐｓｉで破壊し、細
胞屑を遠心分離してペレット化した。上清を、抽出緩衝
液で予め平衡化したＳｅｐｈｄｅｘ Ｇ−２５カラム上
で脱塩して、粗製の脱塩抽出物を得た。抽出物にグリセ
ロール（２０％ｖ／ｖ）を加え、酵素溶液は−２０℃で
保存した。ＡＣＣデアミナーゼ酵素アッセイは、以下の
実施例に記載のようにして行った。アッセイ混合物は、
１００μｌの０．２Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．０、３０
μｌの５００ｍＭ ＡＣＣ溶液、および酵素溶液を含有
させ、最終容量２００μｌとした。反応は３０℃で行っ
た。１．８ｍｌの２Ｎ ＨＣｌで反応を停止させた。３
００μｌの０．１％２，４−ジニトロフェニルヒドラジ
ンを添加したのち、混合物を３０℃で１５分インキュベ
ートした。ついで、２ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨを加えて溶
液を塩基性にした。得られた赤褐色の溶液の光学密度
を、スペクトロフォトメーターを用いて、５４０ｎｍで
測定した。
【００２８】ＡＣＣデアミナーゼについての動力学的測
定値、Ｋｍは、単離された各ＡＣＣデアミナーゼ毎に酵
素基質として、ＡＣＣに対して測定した。ＡＣＣデアミ
ナーゼ活性は、飽和レベルのＡＣＣ（５０ｍＭ）を用い
ると、酵素濃度に関して直線性を示した。各抽出酵素に
つき、飽和下濃度のＡＣＣを用いて、概略のＫｍを測定
した。活性は、実際のＫｍの測定に用いた濃度でのＡＣ
Ｃ濃度に関して、常に直線性を示した。次に、各抽出物
について、推定Ｋｍの０．２×と２×の間のＡＣＣ濃
度、または１〜１０ｍＭ ＡＣＣのＡＣＣ濃度を用い
て、実際のＫｍを測定した。Ｋｍ値は、ｘ軸に基質濃度
の逆数、ｙ軸に速度（形成されたα−ケト酪酸）の逆数
をプロットする、両逆数プロットから計算した。ｘ切片
（ｙ＝０）が−１／Ｋｍになる。９種の異なる株から抽
出されたＡＣＣデアミナーゼのＫｍ値を測定したが、一
般的に他の３倍以内（〜４から〜１２ｍＭ）の値を示し
た。このＫｍのデータは、本質的にすべてのＡＣＣデア
ミナーゼが機能的に均等であり、本発明に使用できるこ
とを示している。様々な単離体からのＡＣＣデアミナー
ゼのＫｍ値を表２に掲げる。
定値、Ｋｍは、単離された各ＡＣＣデアミナーゼ毎に酵
素基質として、ＡＣＣに対して測定した。ＡＣＣデアミ
ナーゼ活性は、飽和レベルのＡＣＣ（５０ｍＭ）を用い
ると、酵素濃度に関して直線性を示した。各抽出酵素に
つき、飽和下濃度のＡＣＣを用いて、概略のＫｍを測定
した。活性は、実際のＫｍの測定に用いた濃度でのＡＣ
Ｃ濃度に関して、常に直線性を示した。次に、各抽出物
について、推定Ｋｍの０．２×と２×の間のＡＣＣ濃
度、または１〜１０ｍＭ ＡＣＣのＡＣＣ濃度を用い
て、実際のＫｍを測定した。Ｋｍ値は、ｘ軸に基質濃度
の逆数、ｙ軸に速度（形成されたα−ケト酪酸）の逆数
をプロットする、両逆数プロットから計算した。ｘ切片
（ｙ＝０）が−１／Ｋｍになる。９種の異なる株から抽
出されたＡＣＣデアミナーゼのＫｍ値を測定したが、一
般的に他の３倍以内（〜４から〜１２ｍＭ）の値を示し
た。このＫｍのデータは、本質的にすべてのＡＣＣデア
ミナーゼが機能的に均等であり、本発明に使用できるこ
とを示している。様々な単離体からのＡＣＣデアミナー
ゼのＫｍ値を表２に掲げる。
【００２９】
【表２】
【００３０】ＡＣＣを分解できる単離体が選択されたな
らば、ＡＣＣデアミナーゼをコードする遺伝子を単離し
なければならない。選択されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
株６Ｇ５からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の単離のため
の一般的戦略は次の通りである。６Ｇ５単離体は、さら
に詳細な実施態様のための例示的態様であって、他の単
離体も同様に有用と考えられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ株６Ｇ５のコスミドバンクを構築し、クローン化し、
大腸菌に導入する。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をもつク
ローンは、単独窒素源としてＡＣＣを含有する最小培地
上での選択により同定される。ついで、ＡＣＣデアミナ
ーゼのコード領域を同定し、配列を決定する。クローニ
ングおよび遺伝子取扱い技術は、とくに指示のない限
り、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の記載の通
りである。６Ｇ５株からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を
得るにはこの戦略を使用したが、他の戦略を使用しても
同様の成功が得られると考えられ、それらも本発明の範
囲に包含されるものである。６Ｇ５株からＡＣＣデアミ
ナーゼ遺伝子を単離する方法の詳細を以下に示す。
らば、ＡＣＣデアミナーゼをコードする遺伝子を単離し
なければならない。選択されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
株６Ｇ５からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の単離のため
の一般的戦略は次の通りである。６Ｇ５単離体は、さら
に詳細な実施態様のための例示的態様であって、他の単
離体も同様に有用と考えられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ株６Ｇ５のコスミドバンクを構築し、クローン化し、
大腸菌に導入する。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をもつク
ローンは、単独窒素源としてＡＣＣを含有する最小培地
上での選択により同定される。ついで、ＡＣＣデアミナ
ーゼのコード領域を同定し、配列を決定する。クローニ
ングおよび遺伝子取扱い技術は、とくに指示のない限
り、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の記載の通
りである。６Ｇ５株からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を
得るにはこの戦略を使用したが、他の戦略を使用しても
同様の成功が得られると考えられ、それらも本発明の範
囲に包含されるものである。６Ｇ５株からＡＣＣデアミ
ナーゼ遺伝子を単離する方法の詳細を以下に示す。
【００３１】株６Ｇ５のＬ−ブロス（Ｍｉｌｌｅｒ １
９７２）後期対数期培養体からの細胞ペレットを、染色
体ＤＮＡを得るために、１０ｍｌの溶液Ｉ（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ １９７９）に再懸濁した。ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度１％になるよ
うに加え、各サイクルがドライアイスへ１５分間ついで
７０℃の水へ１０分間の浸漬からなる凍結−解凍サイク
ルに３回付す。次に溶解物を等容量のフェノール：クロ
ロホルム（１：１；ＴＥ緩衝液ｐＨ８．０で飽和したフ
ェノール）（ＴＥ＝１０ｍＭトリス；１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）で４回抽出し、遠心分離し（１５０００ｇ、１０分
間）、相を分離する。上清に２容量のエタノールを加え
たのち短時間遠心分離して（８０００ｇ、５分間）、エ
タノール沈殿物質をペレット化する。ペレットを５ｍｌ
のＴＥ緩衝液に再懸濁し、４℃で２リットルのＴＥ緩衝
液に対して１６時間透析する。この方法で、約５５２μ
ｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液５ｍｌが得られる。
９７２）後期対数期培養体からの細胞ペレットを、染色
体ＤＮＡを得るために、１０ｍｌの溶液Ｉ（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ １９７９）に再懸濁した。ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度１％になるよ
うに加え、各サイクルがドライアイスへ１５分間ついで
７０℃の水へ１０分間の浸漬からなる凍結−解凍サイク
ルに３回付す。次に溶解物を等容量のフェノール：クロ
ロホルム（１：１；ＴＥ緩衝液ｐＨ８．０で飽和したフ
ェノール）（ＴＥ＝１０ｍＭトリス；１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）で４回抽出し、遠心分離し（１５０００ｇ、１０分
間）、相を分離する。上清に２容量のエタノールを加え
たのち短時間遠心分離して（８０００ｇ、５分間）、エ
タノール沈殿物質をペレット化する。ペレットを５ｍｌ
のＴＥ緩衝液に再懸濁し、４℃で２リットルのＴＥ緩衝
液に対して１６時間透析する。この方法で、約５５２μ
ｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液５ｍｌが得られる。
【００３２】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ６Ｇ５ＤＮＡの
５０μｇ分画３つをついで、ＥｃｏＲＩで部分消化し
て、２０Ｋｂより大きいフラグメントを生成させる。３
つの５０μｇ分画を、総容量各１．２５ｍｌ中、１μｇ
ＤＮＡあたりそれぞれ０．１２５、０．０６２および
０．０３２単位のＥｃｏＲＩで消化し、３７℃で３０分
間インキュベートする。分画をプールし、ＴＥ緩衝液ｐ
Ｈ７．６で飽和したフェノール；クロロホルム等容量で
１回抽出して、酵素を除去する。２容量のエタノールで
ＤＮＡを沈殿させ、遠心分離（１２０００ｇ、５分間）
してペレット化する。乾燥したＤＮＡペレットを５００
μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、蔗糖勾配の頂部に載せ
る。１０〜４０％蔗糖勾配は、５０ｍＭトリスｐＨ８．
０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＮａＣｌ中蔗糖を
５％ずつ増量して用い、７つの５．５ｍｍ層に調製す
る。勾配をＢｅｃｋｍａｎｎ ＳＷ２８ローター中２
６，０００ｒｐｍで１８時間遠心分離する。チューブを
底から穿刺し、１ｍｌの分画を集める。各分画から、そ
の一部２０μｌを、ラムダＤＮＡ Ｈｉｎｄ III 消化
サイズ標準とともに、１％アガロースゲル上を流す。２
０Ｋｂより大きいＤＮＡフラグメントを含む分画を混合
する。この場合は、７つの分画を混合した。プールした
サンプルを脱塩し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
−１０R カラム上で濃縮する。０．５ｍｌの濃縮サンプ
ルを２ｍｌのＴＥ緩衝液で洗浄し、再び０．５ｍｌに濃
縮する。ＤＮＡサンプルを１ｍｌのエタノールで沈殿さ
せ、乾燥ペレットを５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁す
る。ＤＮＡの収率を評価するために、サンプル２μｌ
を、標準としてＢｓｔＥIIで切断したラムダＤＮＡ０．
８μｇとともに１％アガロースゲル上を流す。このゲル
から、濃度は、２０Ｋｂより大きいＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ６Ｇ５ＤＮＡ部分ＥｃｏＲＩフラグメントで、３
５μｇ／μｌと評価される。
５０μｇ分画３つをついで、ＥｃｏＲＩで部分消化し
て、２０Ｋｂより大きいフラグメントを生成させる。３
つの５０μｇ分画を、総容量各１．２５ｍｌ中、１μｇ
ＤＮＡあたりそれぞれ０．１２５、０．０６２および
０．０３２単位のＥｃｏＲＩで消化し、３７℃で３０分
間インキュベートする。分画をプールし、ＴＥ緩衝液ｐ
Ｈ７．６で飽和したフェノール；クロロホルム等容量で
１回抽出して、酵素を除去する。２容量のエタノールで
ＤＮＡを沈殿させ、遠心分離（１２０００ｇ、５分間）
してペレット化する。乾燥したＤＮＡペレットを５００
μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、蔗糖勾配の頂部に載せ
る。１０〜４０％蔗糖勾配は、５０ｍＭトリスｐＨ８．
０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＮａＣｌ中蔗糖を
５％ずつ増量して用い、７つの５．５ｍｍ層に調製す
る。勾配をＢｅｃｋｍａｎｎ ＳＷ２８ローター中２
６，０００ｒｐｍで１８時間遠心分離する。チューブを
底から穿刺し、１ｍｌの分画を集める。各分画から、そ
の一部２０μｌを、ラムダＤＮＡ Ｈｉｎｄ III 消化
サイズ標準とともに、１％アガロースゲル上を流す。２
０Ｋｂより大きいＤＮＡフラグメントを含む分画を混合
する。この場合は、７つの分画を混合した。プールした
サンプルを脱塩し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ
−１０R カラム上で濃縮する。０．５ｍｌの濃縮サンプ
ルを２ｍｌのＴＥ緩衝液で洗浄し、再び０．５ｍｌに濃
縮する。ＤＮＡサンプルを１ｍｌのエタノールで沈殿さ
せ、乾燥ペレットを５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁す
る。ＤＮＡの収率を評価するために、サンプル２μｌ
を、標準としてＢｓｔＥIIで切断したラムダＤＮＡ０．
８μｇとともに１％アガロースゲル上を流す。このゲル
から、濃度は、２０Ｋｂより大きいＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ６Ｇ５ＤＮＡ部分ＥｃｏＲＩフラグメントで、３
５μｇ／μｌと評価される。
【００３３】コスミドバンクはベクターｐＭＯＮ１７０
１６を用いて構築される。このベクターはファージラム
ダｃｏｓプラスミドｐＨＣ７９の誘導体である（Ｈｏｈ
ｎ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ １９８０）。ｐＭＯＮ１７０１
６は、ファージＴ７からの遺伝子１０プロモーター領域
を含有するｐＴ７−７（Ｔａｂｏｒ ＆ Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ １９８５）からのＨｉｎｄ III-Ｂｇｌ II
フラグメントを、Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ切断ｐＨＣ
７９に導入することによって構築する。クローンはｐＨ
Ｃ７９のテトラサイクリン抵抗性遺伝子を中断し不活性
化するが、アンピシリン抵抗性遺伝子は無傷のまま残
す。導入されたＴ７プロモーターはコスミドクローンの
機能には必要でない。ｐＭＯＮ１７０１６ベクターをＥ
ｃｏＲＩで切断し、ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡ
Ｐ）で処理し、クローニングに備える。ベクターと標的
配列は次のようにしてリゲートする。ｐＭＯＮ１７０１
６ベクターＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＣＡＰ）１．２５μｇ
（５０ｎｇ／μｌ、２５μｌ）を０．６３μｇ（３５ｎ
ｇ／μｌ、１８μｌ）のサイズ分画６Ｇ５ＥｃｏＲＩフ
ラグメントと混合し、２容量のエタノールで沈殿させ
る。サンプルを遠心分離し、乾燥ＤＮＡペレットを６μ
ｌの水に再懸濁する。この溶液に、１μｌの１０×リゲ
ーション緩衝液（２５０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ８．０、
１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭジチオスレイトー
ル、２ｍＭスペルミジン）、２μｌの１００ｍＭ ＡＴ
Ｐ（アデノシン５′−三リン酸）溶液、ならびに１μｌ
の４０単位／μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加える。リゲーショ
ン混合物は室温（ＲＴ）で６時間インキュベートする。
１６を用いて構築される。このベクターはファージラム
ダｃｏｓプラスミドｐＨＣ７９の誘導体である（Ｈｏｈ
ｎ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ １９８０）。ｐＭＯＮ１７０１
６は、ファージＴ７からの遺伝子１０プロモーター領域
を含有するｐＴ７−７（Ｔａｂｏｒ ＆ Ｒｉｃｈａｒ
ｄｓｏｎ １９８５）からのＨｉｎｄ III-Ｂｇｌ II
フラグメントを、Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ切断ｐＨＣ
７９に導入することによって構築する。クローンはｐＨ
Ｃ７９のテトラサイクリン抵抗性遺伝子を中断し不活性
化するが、アンピシリン抵抗性遺伝子は無傷のまま残
す。導入されたＴ７プロモーターはコスミドクローンの
機能には必要でない。ｐＭＯＮ１７０１６ベクターをＥ
ｃｏＲＩで切断し、ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡ
Ｐ）で処理し、クローニングに備える。ベクターと標的
配列は次のようにしてリゲートする。ｐＭＯＮ１７０１
６ベクターＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＣＡＰ）１．２５μｇ
（５０ｎｇ／μｌ、２５μｌ）を０．６３μｇ（３５ｎ
ｇ／μｌ、１８μｌ）のサイズ分画６Ｇ５ＥｃｏＲＩフ
ラグメントと混合し、２容量のエタノールで沈殿させ
る。サンプルを遠心分離し、乾燥ＤＮＡペレットを６μ
ｌの水に再懸濁する。この溶液に、１μｌの１０×リゲ
ーション緩衝液（２５０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ８．０、
１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭジチオスレイトー
ル、２ｍＭスペルミジン）、２μｌの１００ｍＭ ＡＴ
Ｐ（アデノシン５′−三リン酸）溶液、ならびに１μｌ
の４０単位／μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加える。リゲーショ
ン混合物は室温（ＲＴ）で６時間インキュベートする。
【００３４】１０μｌのｐＭＯＮ１７０１６／６Ｇ５リ
ゲートＤＮＡサンプルから、３μｌをラムダーファージ
粒子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｐｌ
ｕｓ）に、製造業者の操作を用いてパッケージする。コ
スミドの力価を確立するため、希釈系列を作成し、宿主
細菌のインフェクトに使用する。宿主ＭＭ２９４（Ｔａ
ｌｍａｄｇｅ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ １９８０）大腸菌
は０．２％マルトース含有Ｌ−ブロス中３０℃で生育さ
せる。ＭＭ２９４サンプル１００μｌを１００μｌのＳ
Ｍ緩衝液（ＳＭ＝５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．０１％ゼラチ
ン）で希釈し、パッケージコスミドの１０μｌ分画でイ
ンフェクトする。サンプルはＲＴで１５分間インキュベ
ートする。サンプルに１ｍｌのＬ−ブロスを加え、３７
℃で３０分間インキュベートする。インフェクトした細
菌をついで、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４分間）によ
って濃縮し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む
Ｌ−ブロスアガールプレート上で平板培養する。プレー
トは、３７℃で一夜インキュベートする。通常認められ
るコスミド力価は、３μｌのリゲートｐＭＯＮ１７０１
６／６Ｇ５ ＤＮＡから計約８．５×１０5 クローン、
または２．８×１０6 クローン／μｇ ６Ｇ５ Ｅｃｏ
ＲＩ ＤＮＡと評価される。
ゲートＤＮＡサンプルから、３μｌをラムダーファージ
粒子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｇｉｇａｐａｃｋ Ｐｌ
ｕｓ）に、製造業者の操作を用いてパッケージする。コ
スミドの力価を確立するため、希釈系列を作成し、宿主
細菌のインフェクトに使用する。宿主ＭＭ２９４（Ｔａ
ｌｍａｄｇｅ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ １９８０）大腸菌
は０．２％マルトース含有Ｌ−ブロス中３０℃で生育さ
せる。ＭＭ２９４サンプル１００μｌを１００μｌのＳ
Ｍ緩衝液（ＳＭ＝５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．０１％ゼラチ
ン）で希釈し、パッケージコスミドの１０μｌ分画でイ
ンフェクトする。サンプルはＲＴで１５分間インキュベ
ートする。サンプルに１ｍｌのＬ−ブロスを加え、３７
℃で３０分間インキュベートする。インフェクトした細
菌をついで、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４分間）によ
って濃縮し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む
Ｌ−ブロスアガールプレート上で平板培養する。プレー
トは、３７℃で一夜インキュベートする。通常認められ
るコスミド力価は、３μｌのリゲートｐＭＯＮ１７０１
６／６Ｇ５ ＤＮＡから計約８．５×１０5 クローン、
または２．８×１０6 クローン／μｇ ６Ｇ５ Ｅｃｏ
ＲＩ ＤＮＡと評価される。
【００３５】ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を含有するコス
ミドクローンの選択には、６Ｇ５ライブラリーをつい
で、単独窒素源としてＡＣＣを含有する培地上で平板培
養する。平板は窒素を含まないアガール１．５％、２ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ4 、０．２％グルコース、０．１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2 、１×Ｍ９塩（Ｍ９塩＝６ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4
・Ｈ2 Ｏ、３ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 、１．５ｇ ＮａＣｌ／
ｌ）、１ｍＭチアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌカルベ
ニシリン、および３ｍＭ ＡＣＣを含有する。ＭＭ２９
４細胞を３５μｌ（約５．６×１０4 クローン）のパッ
ケージコスミドと上述のようにインフェクトし、１×Ｍ
９塩で２回洗浄し、５つのプレート上で平板培養する。
生育は３７℃、３日間のインキュベーションで明らかで
あった。６日間のインキュベーション後、約３０００コ
スミド（２００あたり１）が、単独窒素源としてＡＣＣ
を含む最小培地プレート上に生育した。補給窒素源とし
てＡＣＣを含まなかった対照プレート上には、６日後も
生育の兆候はない。
ミドクローンの選択には、６Ｇ５ライブラリーをつい
で、単独窒素源としてＡＣＣを含有する培地上で平板培
養する。平板は窒素を含まないアガール１．５％、２ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ4 、０．２％グルコース、０．１ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2 、１×Ｍ９塩（Ｍ９塩＝６ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4
・Ｈ2 Ｏ、３ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 、１．５ｇ ＮａＣｌ／
ｌ）、１ｍＭチアミン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌカルベ
ニシリン、および３ｍＭ ＡＣＣを含有する。ＭＭ２９
４細胞を３５μｌ（約５．６×１０4 クローン）のパッ
ケージコスミドと上述のようにインフェクトし、１×Ｍ
９塩で２回洗浄し、５つのプレート上で平板培養する。
生育は３７℃、３日間のインキュベーションで明らかで
あった。６日間のインキュベーション後、約３０００コ
スミド（２００あたり１）が、単独窒素源としてＡＣＣ
を含む最小培地プレート上に生育した。補給窒素源とし
てＡＣＣを含まなかった対照プレート上には、６日後も
生育の兆候はない。
【００３６】ＡＣＣ含有最小培地上で生育した数種のコ
ロニーを、ついでスクリーニングする。この記述の場合
は、すべてのサンプルがサイズの異なるコスミド挿入体
を有し、大部分はいくつかの共通ＥｃｏＲＩフラグメン
トを含んでいた。３つの最も小さいクローンを制限欠失
および共通フラグメントのサブクローニングによってス
クリーニングする。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の活性
は、クローンを上述のようにＡＣＣ含有最小培地上で平
板培養してモニタリングする。スクリーニングにより、
活性を保持する約１０．６Ｋｂの挿入体を含有するクロ
ーンが同定された。挿入体を次に、ｐＵＣ１１８プラス
ミド（Ｖｉｅｒａ ＆ Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８７）中の
ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントにサブクローニング
する。続いてＨｉｎｄ IIIおよびＳｍａＩ欠失により、
ＡＣＣデアミナーゼ活性は、単独窒素源としてＡＣＣを
含む最小培地上でクローンを生育させる２．４Ｋｂまで
短縮された。この２．４Ｋｂ挿入体を含むｐＵＣ１１８
プラスミドはｐＭＯＮ１００２７と命名する。
ロニーを、ついでスクリーニングする。この記述の場合
は、すべてのサンプルがサイズの異なるコスミド挿入体
を有し、大部分はいくつかの共通ＥｃｏＲＩフラグメン
トを含んでいた。３つの最も小さいクローンを制限欠失
および共通フラグメントのサブクローニングによってス
クリーニングする。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の活性
は、クローンを上述のようにＡＣＣ含有最小培地上で平
板培養してモニタリングする。スクリーニングにより、
活性を保持する約１０．６Ｋｂの挿入体を含有するクロ
ーンが同定された。挿入体を次に、ｐＵＣ１１８プラス
ミド（Ｖｉｅｒａ ＆ Ｍｅｓｓｉｎｇ１９８７）中の
ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントにサブクローニング
する。続いてＨｉｎｄ IIIおよびＳｍａＩ欠失により、
ＡＣＣデアミナーゼ活性は、単独窒素源としてＡＣＣを
含む最小培地上でクローンを生育させる２．４Ｋｂまで
短縮された。この２．４Ｋｂ挿入体を含むｐＵＣ１１８
プラスミドはｐＭＯＮ１００２７と命名する。
【００３７】ｐＭＯＮ１００２７の２．４Ｋｂ挿入体の
両鎖をついで、ＵＳＢ ＳｅｑｕｅｎａｓｅR ＤＮＡ配
列決定キットを製造業者の指示に従って使用し、配列決
定した。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子のコード配列とし
て、１０１７塩基対（ｂｐ）のオープンリーディングフ
レームが同定された（図２）。この配列は配列番号１と
する。
両鎖をついで、ＵＳＢ ＳｅｑｕｅｎａｓｅR ＤＮＡ配
列決定キットを製造業者の指示に従って使用し、配列決
定した。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子のコード配列とし
て、１０１７塩基対（ｂｐ）のオープンリーディングフ
レームが同定された（図２）。この配列は配列番号１と
する。
【００３８】異なる生物からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝
子の同等性をさらに明らかにするため、第二の遺伝子の
ＤＮＡ配列を決定した。最初のスクリーニングにおい
て、上述のように、単独窒素源としてＡＣＣを含む最小
培地上で生育できる生物体としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ３Ｆ２単離体が同定されていた。インビトロでのＡＣ
Ｃのα−ケト酪酸への変換は（６Ｇ５生物体について述
べたように）この生物が同じくＡＣＣデアミナーゼ酵素
を含むことを示している。３Ｆ２ＡＣＣデアミナーゼの
クローン化にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用
した。既知の６Ｇ５配列に基づき、３Ｆ２ＤＮＡのプラ
イムオフ用オリゴデオキシヌクレオチドを設計した。
５′および３′オリゴヌクレオチドの配列は次の通りで
ある。
子の同等性をさらに明らかにするため、第二の遺伝子の
ＤＮＡ配列を決定した。最初のスクリーニングにおい
て、上述のように、単独窒素源としてＡＣＣを含む最小
培地上で生育できる生物体としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ３Ｆ２単離体が同定されていた。インビトロでのＡＣ
Ｃのα−ケト酪酸への変換は（６Ｇ５生物体について述
べたように）この生物が同じくＡＣＣデアミナーゼ酵素
を含むことを示している。３Ｆ２ＡＣＣデアミナーゼの
クローン化にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用
した。既知の６Ｇ５配列に基づき、３Ｆ２ＤＮＡのプラ
イムオフ用オリゴデオキシヌクレオチドを設計した。
５′および３′オリゴヌクレオチドの配列は次の通りで
ある。
【００３９】 ５′オリゴヌクレオチド： CCCGGATCCATGAATCTGAATCGTTTT （配列番号１１） ３′オリゴヌクレオチド： CCCGGATCCGCCGTTACGAAACAGGAA （配列番号１２） これらのオリゴヌクレオチドは、次のクローニングを容
易にするためＰＣＲ生成物へＢａｍＨＩ部位を導入する
配列で始まる。いずれも、最初の１８（５′）また最後
の１８（３′）の下線を施したヌクレオチド配列は６Ｇ
５の場合と同一である。３Ｆ２ＤＮＡは６Ｇ５について
前述したのと同様にして調製した。ＰＣＲ反応は、３Ｆ
２と６Ｇ５の配列の間にある程度のミスマッチがあって
も、３Ｆ２ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドのアリーニン
グが可能なような条件下に実施した。ＰＣＲ反応は、そ
れぞれの次のサイクルは１０秒延長して３０サイクル行
った。各サイクルは次の通りとした。
易にするためＰＣＲ生成物へＢａｍＨＩ部位を導入する
配列で始まる。いずれも、最初の１８（５′）また最後
の１８（３′）の下線を施したヌクレオチド配列は６Ｇ
５の場合と同一である。３Ｆ２ＤＮＡは６Ｇ５について
前述したのと同様にして調製した。ＰＣＲ反応は、３Ｆ
２と６Ｇ５の配列の間にある程度のミスマッチがあって
も、３Ｆ２ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドのアリーニン
グが可能なような条件下に実施した。ＰＣＲ反応は、そ
れぞれの次のサイクルは１０秒延長して３０サイクル行
った。各サイクルは次の通りとした。
【００４０】 ９４℃ １分 ４０℃ ２分 ７２℃ ３分プラス１５秒延長 ＰＣＲ−増幅３Ｆ２ＤＮＡは、オリゴヌクレオチド中に
導入された単離６Ｇ５のＡＣＣデアミナーゼヌクレオチ
ド配列の最初の１８（５′）および最後の１８（３′）
のヌクレオチドを含み、したがって最初および最後の１
８ヌクレオチドの領域は実際の３Ｆ２遺伝子に相当しな
いかもしれない。すなわち３Ｆ２ ＡＣＣデアミナーゼ
の最初および最後の６個のアミノ酸の実体は、元の３Ｆ
２生物における酵素と同一ではないかもしれない。ＤＮ
Ａ増幅が成功するためには、３Ｆ２ＤＮＡとオリゴヌク
レオチドプライマーとの間に高度のホモロジーが必須で
あるから、３Ｆ２と６Ｇ５の配列は極めて類似するもの
でなければならない。
導入された単離６Ｇ５のＡＣＣデアミナーゼヌクレオチ
ド配列の最初の１８（５′）および最後の１８（３′）
のヌクレオチドを含み、したがって最初および最後の１
８ヌクレオチドの領域は実際の３Ｆ２遺伝子に相当しな
いかもしれない。すなわち３Ｆ２ ＡＣＣデアミナーゼ
の最初および最後の６個のアミノ酸の実体は、元の３Ｆ
２生物における酵素と同一ではないかもしれない。ＤＮ
Ａ増幅が成功するためには、３Ｆ２ＤＮＡとオリゴヌク
レオチドプライマーとの間に高度のホモロジーが必須で
あるから、３Ｆ２と６Ｇ５の配列は極めて類似するもの
でなければならない。
【００４１】ＰＣＲ増幅の生成物をＢａｍＨＩ切断ｐＢ
ＳＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、
前述のように、ジデオキシＤＮＡ配列決定法に付した。
遺伝子の配列は、内部ＤＮＡ配列由来の一連のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて決定した。３Ｆ２遺伝子
の配列およびそれから帰納されるＡＣＣデアミナーゼの
アミノ酸配列を図１７に示す。ヌクレオチド配列は配列
番号１５、アミノ酸配列は配列番号１６とした。６Ｇ５
と３Ｆ２酵素の推定アミノ酸配列を比較すると、それら
は、９６％が同一で、保存的アミノ酸置換を考慮すれば
９９％が類似という高いホモロジーを有する。これらの
２つの酵素について認められたカイネティックデータを
考え合わせると、この配列保存は、天然のＡＣＣデアミ
ナーゼの保存的性質を示すものである。
ＳＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、
前述のように、ジデオキシＤＮＡ配列決定法に付した。
遺伝子の配列は、内部ＤＮＡ配列由来の一連のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて決定した。３Ｆ２遺伝子
の配列およびそれから帰納されるＡＣＣデアミナーゼの
アミノ酸配列を図１７に示す。ヌクレオチド配列は配列
番号１５、アミノ酸配列は配列番号１６とした。６Ｇ５
と３Ｆ２酵素の推定アミノ酸配列を比較すると、それら
は、９６％が同一で、保存的アミノ酸置換を考慮すれば
９９％が類似という高いホモロジーを有する。これらの
２つの酵素について認められたカイネティックデータを
考え合わせると、この配列保存は、天然のＡＣＣデアミ
ナーゼの保存的性質を示すものである。
【００４２】ＡＣＣデアミナーゼが同定され、単離され
たならば、それを植物での発現のために操作する必要が
ある。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を植物に導入するため
には、適当なキメラ遺伝子およびトランスホーメーショ
ンベクターの構築が必要になる。植物へのトランスホー
メーションのための代表的キメラ遺伝子は、プロモータ
ー領域、異種構造ＤＮＡコード配列および３′非翻訳ポ
リアデニル化部位を包含する。異種構造ＤＮＡコード配
列とは、トランスホームされる植物にネイティブではな
い構造コード配列、またはその蛋白生成物の性質を改良
するために操作された構造コード配列を意味する。プロ
モーターに関して異種とは、コード配列が、それと連結
しようとするプロモーターと、天然には同一遺伝子内に
存在しないことを意味する。キメラは、異種遺伝子の部
分からなる新規な天然には存在しない遺伝子を意味す
る。トランスホーメーションベクターの調製に際して
は、各種のＤＮＡフラグメントを必要に応じて操作し、
所望のベクターを調製することができる。これには、必
要に応じてリンカーまたはアダプターを使用して適当な
制限部位の形成もしくは望ましくない制限部位の除去、
または本技術分野の熟練者にはよく知られた他の同様の
操作が包含される。
たならば、それを植物での発現のために操作する必要が
ある。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を植物に導入するため
には、適当なキメラ遺伝子およびトランスホーメーショ
ンベクターの構築が必要になる。植物へのトランスホー
メーションのための代表的キメラ遺伝子は、プロモータ
ー領域、異種構造ＤＮＡコード配列および３′非翻訳ポ
リアデニル化部位を包含する。異種構造ＤＮＡコード配
列とは、トランスホームされる植物にネイティブではな
い構造コード配列、またはその蛋白生成物の性質を改良
するために操作された構造コード配列を意味する。プロ
モーターに関して異種とは、コード配列が、それと連結
しようとするプロモーターと、天然には同一遺伝子内に
存在しないことを意味する。キメラは、異種遺伝子の部
分からなる新規な天然には存在しない遺伝子を意味す
る。トランスホーメーションベクターの調製に際して
は、各種のＤＮＡフラグメントを必要に応じて操作し、
所望のベクターを調製することができる。これには、必
要に応じてリンカーまたはアダプターを使用して適当な
制限部位の形成もしくは望ましくない制限部位の除去、
または本技術分野の熟練者にはよく知られた他の同様の
操作が包含される。
【００４３】植物細胞中でＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の
転写を起こすことが知られているかまたはそれが見出さ
れたプロモーターが、本発明に使用できる。このような
プロモーターは、植物、植物病原性細菌または植物ウイ
ルスから得ることができる。必ずしもこれらに限定され
るものではないが、カリフラワーモザイクウイルスの３
５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓおよび
ＣａＭＶ１９Ｓ）、ゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モ
ザイクウイルスからの完全長転写プロモーター（ＦＭＶ
３５Ｓ）およびＥＰＳＰシンターゼ、ｓｓＲＵＢＩＳＣ
Ｏ遺伝子のような植物遺伝子から単離されるプロモータ
ー、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ遺伝子たとえばノパリンおよ
びマノピンシンターゼから得られるプロモーターを挙げ
ることができる。選択された特定のプロモーターは、エ
チレンの産生を実質的に阻害する有効量のＡＣＣデアミ
ナーゼの産生を生じる十分な発現を起こすことができる
ものでなければならない。本技術分野の熟練者であれ
ば、エチレンの産生を阻害するのに必要なＡＣＣデアミ
ナーゼの量が、関連する植物の種類および植物内の組織
によって変動することは自明であろう。
転写を起こすことが知られているかまたはそれが見出さ
れたプロモーターが、本発明に使用できる。このような
プロモーターは、植物、植物病原性細菌または植物ウイ
ルスから得ることができる。必ずしもこれらに限定され
るものではないが、カリフラワーモザイクウイルスの３
５Ｓおよび１９Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓおよび
ＣａＭＶ１９Ｓ）、ゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モ
ザイクウイルスからの完全長転写プロモーター（ＦＭＶ
３５Ｓ）およびＥＰＳＰシンターゼ、ｓｓＲＵＢＩＳＣ
Ｏ遺伝子のような植物遺伝子から単離されるプロモータ
ー、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ遺伝子たとえばノパリンおよ
びマノピンシンターゼから得られるプロモーターを挙げ
ることができる。選択された特定のプロモーターは、エ
チレンの産生を実質的に阻害する有効量のＡＣＣデアミ
ナーゼの産生を生じる十分な発現を起こすことができる
ものでなければならない。本技術分野の熟練者であれ
ば、エチレンの産生を阻害するのに必要なＡＣＣデアミ
ナーゼの量が、関連する植物の種類および植物内の組織
によって変動することは自明であろう。
【００４４】本発明における使用にとくに有用なプロモ
ーターは、果実におけるエチレン産生時に発現される果
実特異的プロモーターおよびゴマノハグサモザイクウィ
ルスからの完全長転写プロモーター（ＦＭＶ３５Ｓ）で
ある。ＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、植物組織において
均一かつ高レベルのＡＣＣ発現を生じるその能力から、
とくに有用である。ＦＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ
配列は、図２２に示し、配列番号１７とする。果実特異
的プロモーターの例には、トマトからのＥ８、Ｅ４、Ｅ
１７およびＪ４９プロモーター（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｊ．
Ｅ．＆ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８８）、ならび
に米国特許第４，９４３，６７４号に記載された２Ａｌ
ｌプロモーターが包含される。
ーターは、果実におけるエチレン産生時に発現される果
実特異的プロモーターおよびゴマノハグサモザイクウィ
ルスからの完全長転写プロモーター（ＦＭＶ３５Ｓ）で
ある。ＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、植物組織において
均一かつ高レベルのＡＣＣ発現を生じるその能力から、
とくに有用である。ＦＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ
配列は、図２２に示し、配列番号１７とする。果実特異
的プロモーターの例には、トマトからのＥ８、Ｅ４、Ｅ
１７およびＪ４９プロモーター（Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｊ．
Ｅ．＆ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｌ．１９８８）、ならび
に米国特許第４，９４３，６７４号に記載された２Ａｌ
ｌプロモーターが包含される。
【００４５】本発明のＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の発現
に使用されるプロモーターは、それらの発現特性を変え
ることが望まれる場合には、さらに修飾することもでき
る。たとえば、光の不存在下でｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発
現を抑制するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の部分をＣａＭ
Ｖ３５Ｓにリゲートすると、葉では活性であるが根では
活性を示さないプロモーターを創製できる。得られたキ
メラプロモーターは、本明細書に記載するようにして、
使用できる。本明細書において用いられる「ＣａＭＶ３
５Ｓ」または「ＦＭＶ３５Ｓ」の語には、これらのプロ
モーターの変異体、たとえばオペレーター領域とのリゲ
ーション、ランダムなまたは制御された突然変異誘発、
エンハンサー配列の付加または二重化等により誘導され
たプロモーターが包含される。
に使用されるプロモーターは、それらの発現特性を変え
ることが望まれる場合には、さらに修飾することもでき
る。たとえば、光の不存在下でｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発
現を抑制するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の部分をＣａＭ
Ｖ３５Ｓにリゲートすると、葉では活性であるが根では
活性を示さないプロモーターを創製できる。得られたキ
メラプロモーターは、本明細書に記載するようにして、
使用できる。本明細書において用いられる「ＣａＭＶ３
５Ｓ」または「ＦＭＶ３５Ｓ」の語には、これらのプロ
モーターの変異体、たとえばオペレーター領域とのリゲ
ーション、ランダムなまたは制御された突然変異誘発、
エンハンサー配列の付加または二重化等により誘導され
たプロモーターが包含される。
【００４６】３′非翻訳領域は、植物で、ＲＮＡ配列の
３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じる
機能を有するポリアデニル化シグナルを含有する。適当
な３′領域の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、たとえばノパリ
ンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）、ならびに７ｓ大豆保存
蛋白遺伝子およびＲｕＢＰカルボキシラーゼ遺伝子のＥ
９サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ参照）のような植
物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３′転写
非翻訳領域がある。
３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じる
機能を有するポリアデニル化シグナルを含有する。適当
な３′領域の例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、たとえばノパリ
ンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）、ならびに７ｓ大豆保存
蛋白遺伝子およびＲｕＢＰカルボキシラーゼ遺伝子のＥ
９サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ参照）のような植
物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３′転写
非翻訳領域がある。
【００４７】本発明のＤＮＡ構築体によって生成される
ＲＮＡはまた、５′非翻訳リーダー配列を含有すること
が好ましい。この配列は、その遺伝子を発現する選ばれ
たプロモーターから誘導できて、ｍＲＮＡの翻訳を増大
するように特異的に修飾できる。５′非翻訳領域はま
た、ウィルスＲＮＡから、適当な真核生物遺伝子から、
または合成遺伝子配列から得ることができる。本発明
は、以下の実施例に示すように、プロモーター配列に伴
う５′非翻訳配列から非翻訳領域が誘導される場合、構
築体に限定されるものではない。むしろ、非翻訳リーダ
ー配列は、異種コード配列についてのネイティブコード
配列の非翻訳領域の５′末端の一部、プロモーター配列
の一部とすることも、または上述のように無関係なプロ
モーターもしくはコード配列から誘導することもでき
る。
ＲＮＡはまた、５′非翻訳リーダー配列を含有すること
が好ましい。この配列は、その遺伝子を発現する選ばれ
たプロモーターから誘導できて、ｍＲＮＡの翻訳を増大
するように特異的に修飾できる。５′非翻訳領域はま
た、ウィルスＲＮＡから、適当な真核生物遺伝子から、
または合成遺伝子配列から得ることができる。本発明
は、以下の実施例に示すように、プロモーター配列に伴
う５′非翻訳配列から非翻訳領域が誘導される場合、構
築体に限定されるものではない。むしろ、非翻訳リーダ
ー配列は、異種コード配列についてのネイティブコード
配列の非翻訳領域の５′末端の一部、プロモーター配列
の一部とすることも、または上述のように無関係なプロ
モーターもしくはコード配列から誘導することもでき
る。
【００４８】本発明のＤＮＡ構築体は任意の適当な方法
で、植物のゲノムに挿入することができる。適当な植物
トランスホーメーションベクターとしては、Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラ
スミドから誘導されるもの、たとえば、Ｈｅｒｒｅｒａ
−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９８３）、Ｂａｖａｎ（１９８
３）、Ｋｌｅｅ（１９８５）および米国特許第４，９８
０，８３８号によって開示されたものがある。Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉまたは根誘導（Ｒｉ）プラス
ミドから誘導される植物トランスホーメーションベクタ
ーに加えて、別法として、本発明のＤＮＡ構築体を植物
細胞に挿入することもできる。このような方法には、た
とえば、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離Ｄ
ＮＡの取り込みを増大させる化学剤、微粒子ガン技術、
およびウィルス利用トランスホーメーションが包含され
る。ベクターをトーモロコシまたは他の単子葉植物細胞
に導入する方法としては、それらに限定されるものでは
ないが、Ｎｅｕｈａｕｓらのインジェクション法（１９
８７）、ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａらのインジェクション法
（１９８７）またはＫｌｅｉｎら（１９８７）およびＭ
ｃＣａｂｅら（１９８８）のマイクロプロジェクタイル
法がある。
で、植物のゲノムに挿入することができる。適当な植物
トランスホーメーションベクターとしては、Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラ
スミドから誘導されるもの、たとえば、Ｈｅｒｒｅｒａ
−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９８３）、Ｂａｖａｎ（１９８
３）、Ｋｌｅｅ（１９８５）および米国特許第４，９８
０，８３８号によって開示されたものがある。Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉまたは根誘導（Ｒｉ）プラス
ミドから誘導される植物トランスホーメーションベクタ
ーに加えて、別法として、本発明のＤＮＡ構築体を植物
細胞に挿入することもできる。このような方法には、た
とえば、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離Ｄ
ＮＡの取り込みを増大させる化学剤、微粒子ガン技術、
およびウィルス利用トランスホーメーションが包含され
る。ベクターをトーモロコシまたは他の単子葉植物細胞
に導入する方法としては、それらに限定されるものでは
ないが、Ｎｅｕｈａｕｓらのインジェクション法（１９
８７）、ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａらのインジェクション法
（１９８７）またはＫｌｅｉｎら（１９８７）およびＭ
ｃＣａｂｅら（１９８８）のマイクロプロジェクタイル
法がある。
【００４９】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ仲介送達によって植物ゲノムに挿入可能な
ベクターの構築は、本技術分野の通常の熟練者にはよく
知られている。代表的な植物クローニングベクターは、
選択および評価可能なマーカー遺伝子、Ｔ−ＤＮＡボー
ダー、クローニング部位、トランスコンジュゲートの同
定を容易にする適当な細菌遺伝子、広範囲の宿主での複
製および可動機能、および所望される他の要素から構成
される。
ａｃｉｅｎｓ仲介送達によって植物ゲノムに挿入可能な
ベクターの構築は、本技術分野の通常の熟練者にはよく
知られている。代表的な植物クローニングベクターは、
選択および評価可能なマーカー遺伝子、Ｔ−ＤＮＡボー
ダー、クローニング部位、トランスコンジュゲートの同
定を容易にする適当な細菌遺伝子、広範囲の宿主での複
製および可動機能、および所望される他の要素から構成
される。
【００５０】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介送達が選
ばれ、ベクターが無毒化Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株
に導入されたならば、所望の植物をトランスホームする
ことができる。所望の植物に有効な任意のトランスホー
メーション法が利用できる。
ばれ、ベクターが無毒化Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株
に導入されたならば、所望の植物をトランスホームする
ことができる。所望の植物に有効な任意のトランスホー
メーション法が利用できる。
【００５１】本発明における使用にとくに適した植物
は、トマト、バナナ、キーウィ、アボガド、メロン、マ
ンゴ、パパイヤ、林檎、桃、および他のクリマクテリッ
ク型担果実植物である。本発明はまた、以下の非クリマ
クテリック型種、すなわち、苺、レタス、キャベツ、カ
リフラワー、玉葱、ブロッコリー、綿、カノラおよびア
ブラナに使用するのに適している。エチレン誘発成熟過
程によって影響される他の植物種、とくに植物の生育ま
たは植物の果実の成熟もしくは発生にエチレン産生が重
要な植物種には、本発明の教示は有益である。生花工業
においてとくに望ましい花種は、カーネーション、バラ
等である。なお、以上の一覧は単なる例示であって、い
かなる意味においても本発明を限定するものではない。
は、トマト、バナナ、キーウィ、アボガド、メロン、マ
ンゴ、パパイヤ、林檎、桃、および他のクリマクテリッ
ク型担果実植物である。本発明はまた、以下の非クリマ
クテリック型種、すなわち、苺、レタス、キャベツ、カ
リフラワー、玉葱、ブロッコリー、綿、カノラおよびア
ブラナに使用するのに適している。エチレン誘発成熟過
程によって影響される他の植物種、とくに植物の生育ま
たは植物の果実の成熟もしくは発生にエチレン産生が重
要な植物種には、本発明の教示は有益である。生花工業
においてとくに望ましい花種は、カーネーション、バラ
等である。なお、以上の一覧は単なる例示であって、い
かなる意味においても本発明を限定するものではない。
【００５２】植物において、ＡＣＣ遺伝子の構造的発現
を達成するには、遺伝子をトランスホーメーションベク
ターｐＭＯＮ９７７にクローニングした。ここで調製し
たトランスホーメーションベクターには、６Ｇ５単離体
から単離されたＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を使用した。
ｐＭＯＮ９７７プラスミド（図３）は以下の、性質が十
分明らかにされたＤＮＡセグメントを含有する。すなわ
ち、第一に、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイ
シン抵抗性（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）をコードし、大腸菌およ
びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓにおける選択決定因子（Ｆｌｉｎｇら１９８５）であ
るトランスポゾンＴｎ７から単離された０．９３Ｋｂフ
ラグメントである。これはトランスホームされた組織の
選択を可能にするため、植物発現用に操作したキメラカ
ナマイシン抵抗性遺伝子に連結する。キメラ遺伝子は
０．３５Ｋｂカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロ
モーター（Ｐ３５Ｓ、Ｏｄｅｌｌら１９８５）、０．８
３ＫｂネオマイシンホスホトランスフェラーゼII型遺伝
子（ＮＰＴII）、およびノパリンシンターゼ遺伝子の
０．２６Ｋｂ ３′非翻訳領域（ＮＯＳ３′）（Ｆｒａ
ｌｅｙら、１９８３）から構成される。次のセグメント
はＲＫ２プラスミドからの０．７５Ｋｂ複製の起源（ｏ
ｒｉ−Ｖ）（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８１）である。こ
れは、ｐＢＲ３２２からの３．１Ｋｂ ＳａｌＩ−Ｐｖ
ｕＩフラグメントに連結する。これは、大腸菌（ｏｒｉ
−３２２）中に維持するための複製の起源およびＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞内
への接合移入のためのｂｏｍ部位を提供する。次はｐＴ
ｉＴ３７プラスミドからの０．３６Ｋｂ ＰｖｕＩ−Ｂ
ｃｌＩフラグメントである。これはノパリン型Ｔ−ＤＮ
Ａ右ボーダー領域を含有する（Ｆｒａｌｅｙら、１９８
５）。最後のセグメントは、プロモーター配列の二重化
によって増強された０．６５Ｋｂカリフラワーモザイク
ウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｐ−Ｅ３５
Ｓ）（Ｋａｙら、１９８７）、いくつかのユニーククロ
ーニング部位を有する合成マルチリンカー、およびエン
ドウｒｂｃ Ｓ−Ｅ９遺伝子の０．７Ｋｂ３′非翻訳領
域（Ｅ９３′）（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４およびＭ
ｏｒｅｌｌｉら、１９８５）からなる発現カセットであ
る。
を達成するには、遺伝子をトランスホーメーションベク
ターｐＭＯＮ９７７にクローニングした。ここで調製し
たトランスホーメーションベクターには、６Ｇ５単離体
から単離されたＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を使用した。
ｐＭＯＮ９７７プラスミド（図３）は以下の、性質が十
分明らかにされたＤＮＡセグメントを含有する。すなわ
ち、第一に、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイ
シン抵抗性（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）をコードし、大腸菌およ
びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓにおける選択決定因子（Ｆｌｉｎｇら１９８５）であ
るトランスポゾンＴｎ７から単離された０．９３Ｋｂフ
ラグメントである。これはトランスホームされた組織の
選択を可能にするため、植物発現用に操作したキメラカ
ナマイシン抵抗性遺伝子に連結する。キメラ遺伝子は
０．３５Ｋｂカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロ
モーター（Ｐ３５Ｓ、Ｏｄｅｌｌら１９８５）、０．８
３ＫｂネオマイシンホスホトランスフェラーゼII型遺伝
子（ＮＰＴII）、およびノパリンシンターゼ遺伝子の
０．２６Ｋｂ ３′非翻訳領域（ＮＯＳ３′）（Ｆｒａ
ｌｅｙら、１９８３）から構成される。次のセグメント
はＲＫ２プラスミドからの０．７５Ｋｂ複製の起源（ｏ
ｒｉ−Ｖ）（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８１）である。こ
れは、ｐＢＲ３２２からの３．１Ｋｂ ＳａｌＩ−Ｐｖ
ｕＩフラグメントに連結する。これは、大腸菌（ｏｒｉ
−３２２）中に維持するための複製の起源およびＡｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞内
への接合移入のためのｂｏｍ部位を提供する。次はｐＴ
ｉＴ３７プラスミドからの０．３６Ｋｂ ＰｖｕＩ−Ｂ
ｃｌＩフラグメントである。これはノパリン型Ｔ−ＤＮ
Ａ右ボーダー領域を含有する（Ｆｒａｌｅｙら、１９８
５）。最後のセグメントは、プロモーター配列の二重化
によって増強された０．６５Ｋｂカリフラワーモザイク
ウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｐ−Ｅ３５
Ｓ）（Ｋａｙら、１９８７）、いくつかのユニーククロ
ーニング部位を有する合成マルチリンカー、およびエン
ドウｒｂｃ Ｓ−Ｅ９遺伝子の０．７Ｋｂ３′非翻訳領
域（Ｅ９３′）（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４およびＭ
ｏｒｅｌｌｉら、１９８５）からなる発現カセットであ
る。
【００５３】いずれもｐＭＯＮ１００２７からのＡＣＣ
デアミナーゼ遺伝子を含有する２つのサイズの異なるフ
ラグメントをＥ３５ＳプロモーターとｐＭＯＮ９７７の
Ｅ９３′末端の間に導入した。最初、ｐＭＯＮ１００２
７からの１０７１ｂｐＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩフラグメン
トをＳｔｕＩ−ＳａｃＩ切断ｐＭＯＮ９７７に導入し、
ｐＭＯＮ１００２８ベクター（図４）を生成させる。第
二に、ｐＭＯＮ１００２７からの１１４５ｂｐＥｃｏＲ
Ｖ−ＥｃｏＶフラグメントをＳｔｕII切断ｐＭＯＮ９７
７に導入して、ｐＭＯＮ１００３７ベクター（図５）を
生成させる。
デアミナーゼ遺伝子を含有する２つのサイズの異なるフ
ラグメントをＥ３５ＳプロモーターとｐＭＯＮ９７７の
Ｅ９３′末端の間に導入した。最初、ｐＭＯＮ１００２
７からの１０７１ｂｐＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩフラグメン
トをＳｔｕＩ−ＳａｃＩ切断ｐＭＯＮ９７７に導入し、
ｐＭＯＮ１００２８ベクター（図４）を生成させる。第
二に、ｐＭＯＮ１００２７からの１１４５ｂｐＥｃｏＲ
Ｖ−ＥｃｏＶフラグメントをＳｔｕII切断ｐＭＯＮ９７
７に導入して、ｐＭＯＮ１００３７ベクター（図５）を
生成させる。
【００５４】果実に特異的にＡＣＣデアミナーゼの発現
を指図することができるベクターを構築するためには、
トマト果実特異的な転写プロモーターの単離を必要とし
た。選択されたプロモーターは、エチレンの存在下に高
レベルの発現を誘導することが知られていて、また、ト
マト果実に限定されることが知られている（Ｌｉｎｃｏ
ｌｎ，Ｊ．＆ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．１９８８）。この
遺伝子のためのプロモーター、Ｅ８のＤＮＡ配列は報告
されている（Ｄｅｉｋｍａｎら、１９８８）。Ｅ８プロ
モーターのＤＮＡ配列は配列番号１０とし、図１４に示
す。このプロモーターを選択した場合、他の果実特異的
プロモーターも有用であり、それらの同定および単離は
本技術分野の通常の熟練者にはルーチンな作業である。
プロモーターフラグメントＥ８は、標準的ポリメラーゼ
連鎖反応法を用いて単離された。Ｅ８に相補性のオリゴ
ヌクレオチドが合成された。５′および３′オリゴヌク
レオチドのＤＮＡ配列は次の通りであった。
を指図することができるベクターを構築するためには、
トマト果実特異的な転写プロモーターの単離を必要とし
た。選択されたプロモーターは、エチレンの存在下に高
レベルの発現を誘導することが知られていて、また、ト
マト果実に限定されることが知られている（Ｌｉｎｃｏ
ｌｎ，Ｊ．＆ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．１９８８）。この
遺伝子のためのプロモーター、Ｅ８のＤＮＡ配列は報告
されている（Ｄｅｉｋｍａｎら、１９８８）。Ｅ８プロ
モーターのＤＮＡ配列は配列番号１０とし、図１４に示
す。このプロモーターを選択した場合、他の果実特異的
プロモーターも有用であり、それらの同定および単離は
本技術分野の通常の熟練者にはルーチンな作業である。
プロモーターフラグメントＥ８は、標準的ポリメラーゼ
連鎖反応法を用いて単離された。Ｅ８に相補性のオリゴ
ヌクレオチドが合成された。５′および３′オリゴヌク
レオチドのＤＮＡ配列は次の通りであった。
【００５５】 ５′オリゴヌクレオチド： GAAGGAAGCT TCACGAAATC GGCCCTTATT C （配列番号２） ３′オリゴヌクレオチド： GGGGCTTTAG ATCTTCTTTT GCACTGTGAA TG （配列番号３） ５′オリゴヌクレオチドは、転写の開始点に対し約１０
４０ヌクレオチド５′にＨｉｎｄ III部位を導入する。
３′オリゴヌクレオチドは転写開始点を越えて約２０ヌ
クレオチドにＢｇｌII部位を導入する。ＰＣＲ生成物は
Ｈｉｎｄ III〜Ｂｇｌ II フラグメントとしてクローン
化できる約１０６０ヌクレオチドのフラグメントであ
る。このプロモーターフラグメントは、任意のコード配
列を適当な方向でそれに隣接させて配置すると、組織特
異的発現性を付与する。
４０ヌクレオチド５′にＨｉｎｄ III部位を導入する。
３′オリゴヌクレオチドは転写開始点を越えて約２０ヌ
クレオチドにＢｇｌII部位を導入する。ＰＣＲ生成物は
Ｈｉｎｄ III〜Ｂｇｌ II フラグメントとしてクローン
化できる約１０６０ヌクレオチドのフラグメントであ
る。このプロモーターフラグメントは、任意のコード配
列を適当な方向でそれに隣接させて配置すると、組織特
異的発現性を付与する。
【００５６】ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐキット（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）の製造業者によ
って推薦された操作にほぼ従って実施した。反応混合物
の組成は次の通りである。
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）の製造業者によ
って推薦された操作にほぼ従って実施した。反応混合物
の組成は次の通りである。
【００５７】 水 ５８．５μｌ １０×緩衝液 １０μｌ ｄ ＮＴＰ ミックス １６μｌ ５′プライマー ７５ｐＭ（３．０μｌ中） ３′プライマー ７５ｐＭ（３．０μｌ中） トマト ＤＮＡ １．２４μｇ（２μｌ中） Ａｍｐｌｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５μｌ ＰＣＲ反応は、以下の温度／時間の組合せで２８サイク
ル行った。
ル行った。
【００５８】 ９４℃ １分 ６０℃ ２分 ７２℃ ３分 完了後、正しいサイズのＰＣＲ生成物が観察された。フ
ラグメントを、等容量の１：１フェノール／クロロホル
ムによる抽出、ついでエタノール沈殿で精製した。ＰＣ
Ｒフラグメントをついで、ｐＭＯＮ１００３７ＤＮＡに
リゲートできるように、Ｈｉｎｄ IIIおよびＢｇｌIIで
切断した。ついで、ＰＣＲフラグメントを、同じ酵素で
予め切断してＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列を除去し
たｐＭＯＮ１００３７ＤＮＡにリゲートした。得られた
プラスミドは、ｐＭＯＮ１００３７ＤＮＡのＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターと同じ位置にＥ８プロモーターを含有
し、ｐＭＯＮ１００５４（図５）と命名された。
ラグメントを、等容量の１：１フェノール／クロロホル
ムによる抽出、ついでエタノール沈殿で精製した。ＰＣ
Ｒフラグメントをついで、ｐＭＯＮ１００３７ＤＮＡに
リゲートできるように、Ｈｉｎｄ IIIおよびＢｇｌIIで
切断した。ついで、ＰＣＲフラグメントを、同じ酵素で
予め切断してＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列を除去し
たｐＭＯＮ１００３７ＤＮＡにリゲートした。得られた
プラスミドは、ｐＭＯＮ１００３７ＤＮＡのＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターと同じ位置にＥ８プロモーターを含有
し、ｐＭＯＮ１００５４（図５）と命名された。
【００５９】ｐＭＯＮ１００２８およびｐＭＯＮ１００
３７ベクターは、いずれも、ＡＢＩＡｇｒｏ−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株に移入できる。ＡＢＩ株は、無毒化ｐＴｉ
５８プラスミドｐＭＰ９０ＲＫをもつＡ２０８ Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである
（Ｋｏｎｃｚ ＆ Ｓｃｈｅｌｌ １９８６）。Ｔｉプ
ラスミドはＴ−ＤＮＡフィトホルモン遺伝子をもたず、
したがってこの株はクラウンゴール病を生じない。ｐＭ
ＯＮベクターのＡＢＩへのメイティングは、ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａら、１９８０）を
用いる三親接合系によって行った。植物細胞をＡＢＩ::
ｐＭＯＮ接合体とインキュベートする場合には、ベクタ
ーは、無毒化ｐＭＰ９０ＲＫＴｉプラスミドによってコ
ードされるｖｉｒ機能により植物細胞に移入する。ベク
ターはＴ−ＤＮＡボーダー領域において開裂し、全ｐＭ
ＯＮベクター配列が宿主植物染色体に挿入される。Ｔｉ
プラスミドは植物細胞には移入されず、Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ内に残る。
３７ベクターは、いずれも、ＡＢＩＡｇｒｏ−ｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株に移入できる。ＡＢＩ株は、無毒化ｐＴｉ
５８プラスミドｐＭＰ９０ＲＫをもつＡ２０８ Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである
（Ｋｏｎｃｚ ＆ Ｓｃｈｅｌｌ １９８６）。Ｔｉプ
ラスミドはＴ−ＤＮＡフィトホルモン遺伝子をもたず、
したがってこの株はクラウンゴール病を生じない。ｐＭ
ＯＮベクターのＡＢＩへのメイティングは、ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａら、１９８０）を
用いる三親接合系によって行った。植物細胞をＡＢＩ::
ｐＭＯＮ接合体とインキュベートする場合には、ベクタ
ーは、無毒化ｐＭＰ９０ＲＫＴｉプラスミドによってコ
ードされるｖｉｒ機能により植物細胞に移入する。ベク
ターはＴ−ＤＮＡボーダー領域において開裂し、全ｐＭ
ＯＮベクター配列が宿主植物染色体に挿入される。Ｔｉ
プラスミドは植物細胞には移入されず、Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ内に残る。
【００６０】
【実施例】以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様
のいくつかを、さらに示すものである。本技術分野の熟
練者には、ここに述べる特定の実施態様に対し多くの均
等な態様を認識できるものと考えられる。このような均
等な態様は本発明の範囲内に包含される。
のいくつかを、さらに示すものである。本技術分野の熟
練者には、ここに述べる特定の実施態様に対し多くの均
等な態様を認識できるものと考えられる。このような均
等な態様は本発明の範囲内に包含される。
【００６１】実施例１ ＡＢＩ::ｐＭＯＮ１００２８およびＡＢＩ::ｐＭＯＮ１
００３７ベクターを用いて形質転換タバコ植物を生成さ
せ、植物中におけるＡＣＣデアミナーゼの発現を示す。
００３７ベクターを用いて形質転換タバコ植物を生成さ
せ、植物中におけるＡＣＣデアミナーゼの発現を示す。
【００６２】タバコ細胞はタバコ葉ディスク法を用いて
トランスホームした。タバコ葉ディスクトランスホーメ
ーションのプロトコールでは、約１月齢の健康な葉組織
を使用した。１０％Ｃｌｏｒｏｘおよび界面活性剤で表
面を１５〜２０分間殺菌したのち、タバコの葉を滅菌水
で３回すすいだ。滅菌した紙パンチを用いて、葉のディ
スクを打ち抜き、上面を下にしてＭＳ１０４培地（ＭＳ
塩４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン５００
×２ｍｌ／ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／ｍｌ、およびＢＡ
１．０ｍｇ／ｌ）上に置き、１日前培養した。
トランスホームした。タバコ葉ディスクトランスホーメ
ーションのプロトコールでは、約１月齢の健康な葉組織
を使用した。１０％Ｃｌｏｒｏｘおよび界面活性剤で表
面を１５〜２０分間殺菌したのち、タバコの葉を滅菌水
で３回すすいだ。滅菌した紙パンチを用いて、葉のディ
スクを打ち抜き、上面を下にしてＭＳ１０４培地（ＭＳ
塩４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン５００
×２ｍｌ／ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／ｍｌ、およびＢＡ
１．０ｍｇ／ｌ）上に置き、１日前培養した。
【００６３】ディスクについで、１／５に希釈した（す
なわち、約０．６ＯＤ）目的のベクターを含む無毒化Ａ
ｂｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩの一夜培養液を接
種した。接種は、培養体を入れた遠沈管中にディスクを
置いて行った。３０〜６０秒後に、液体をきり、ディス
クを滅菌した濾紙の間に挟んで液を吸い取った。ディス
クをついで上面を下にしてＭＳ１０４フィーダープレー
ト上に濾紙ディスクとともに置き、共培養した。
なわち、約０．６ＯＤ）目的のベクターを含む無毒化Ａ
ｂｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩの一夜培養液を接
種した。接種は、培養体を入れた遠沈管中にディスクを
置いて行った。３０〜６０秒後に、液体をきり、ディス
クを滅菌した濾紙の間に挟んで液を吸い取った。ディス
クをついで上面を下にしてＭＳ１０４フィーダープレー
ト上に濾紙ディスクとともに置き、共培養した。
【００６４】２〜３日間共培養したのち、ディスクの上
面を下にしたままＭＳ１０４培地とともに選択プレート
に移した。２〜３週後、カルスが形成した。各クランプ
を葉のディスクから分離した。芽が葉柄から十分識別で
きる程度に大きくなったらば、芽をカルスから清潔に切
り取った。芽を、ホルモンを含まない根培地（ＭＳＯ：
ＭＳ塩 ４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌおよびＢ５ビタ
ミン５００×２ｍｌ／１）上に置き、選択した。１〜２
週で根が形成された。なお滅菌状態で、根が形成した芽
について、好ましくは、葉カルスアッセイを実施した。
根をもった芽は土壌中に置き、高湿度環境（すなわち、
プラスチック容器または袋）に保持した。芽は常湿度条
件に徐々に暴露して丈夫にした。
面を下にしたままＭＳ１０４培地とともに選択プレート
に移した。２〜３週後、カルスが形成した。各クランプ
を葉のディスクから分離した。芽が葉柄から十分識別で
きる程度に大きくなったらば、芽をカルスから清潔に切
り取った。芽を、ホルモンを含まない根培地（ＭＳＯ：
ＭＳ塩 ４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌおよびＢ５ビタ
ミン５００×２ｍｌ／１）上に置き、選択した。１〜２
週で根が形成された。なお滅菌状態で、根が形成した芽
について、好ましくは、葉カルスアッセイを実施した。
根をもった芽は土壌中に置き、高湿度環境（すなわち、
プラスチック容器または袋）に保持した。芽は常湿度条
件に徐々に暴露して丈夫にした。
【００６５】葉中のＡＣＣデアミナーゼのアッセイに
は、タバコ葉サンプルを集め、液体窒素中で凍結させ
た。組織１ｇを液体窒素下に凍結したまま微粉末に粉砕
した。抽出緩衝液（１００ｍｌトリスｐＨ７．１、１０
ｍＭ ＥＤＴＡ、３５ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロー
ル、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、１
ｍＭベンザミジン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）１ｍｌをサ
ンプルに加え、４５秒間磨砕し、直ちに遠心分離（１
２，０００ｇ、３分）して葉屑を除去した。小分子を除
去するため、２５０μｌの抽出液を、予め上記抽出緩衝
液（ＢＳＡ減量）で平衡化した１ｍｌのＳｅｐｈｄｅｘ
−Ｇ５０スピンカラムを通した。抽出物を検定し、形質
転換植物組織中のＡＣＣデアミナーゼ活性の相対量を調
べた。ＡＣＣデアミナーゼ酵素はＡＣＣ基質をα−ケト
酪酸とアンモニアに変換する。α−ケト酪酸を２，４−
ジヒドロフェニルヒドラジンと反応させてヒドラゾン誘
導体を形成させ、ＮａＯＨを添加したのちその光学密度
を５２０ｎｍで測定した。この光学密度は、植物抽出物
中のＡＣＣデアミナーゼの量の指標となる。アッセイ反
応混合物には、５０μｌのタバコ葉抽出物サンプル、１
００ｍＭトリスｐＨ８．６、および５０ｍＭ ＡＣＣを
最終容量１５０μｌ中に含有させた。反応は３０℃で１
分間インキュベートして行い、５０μｌの０．５６Ｍ
ＨＣｌで終結させた。２Ｎ ＨＣｌ中０．１％２，４−
ジヒドロフェニルヒドラジン０．６ｍｌを添加した。サ
ンプルを２分間煮沸し、室温に冷却し、０．２ｍｌの４
０％ＮａＯＨを加えた。遠心分離して沈殿を除去した
（１２，０００ｇ、５分間）。上清の光学密度を５２０
ｎｍで測定した。この値は植物中で生成されたＡＣＣデ
アミナーゼ酵素の相対量を示す。非形質転換タバコ植物
を陰性対照として用いた。
は、タバコ葉サンプルを集め、液体窒素中で凍結させ
た。組織１ｇを液体窒素下に凍結したまま微粉末に粉砕
した。抽出緩衝液（１００ｍｌトリスｐＨ７．１、１０
ｍＭ ＥＤＴＡ、３５ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロー
ル、５ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、１
ｍＭベンザミジン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）１ｍｌをサ
ンプルに加え、４５秒間磨砕し、直ちに遠心分離（１
２，０００ｇ、３分）して葉屑を除去した。小分子を除
去するため、２５０μｌの抽出液を、予め上記抽出緩衝
液（ＢＳＡ減量）で平衡化した１ｍｌのＳｅｐｈｄｅｘ
−Ｇ５０スピンカラムを通した。抽出物を検定し、形質
転換植物組織中のＡＣＣデアミナーゼ活性の相対量を調
べた。ＡＣＣデアミナーゼ酵素はＡＣＣ基質をα−ケト
酪酸とアンモニアに変換する。α−ケト酪酸を２，４−
ジヒドロフェニルヒドラジンと反応させてヒドラゾン誘
導体を形成させ、ＮａＯＨを添加したのちその光学密度
を５２０ｎｍで測定した。この光学密度は、植物抽出物
中のＡＣＣデアミナーゼの量の指標となる。アッセイ反
応混合物には、５０μｌのタバコ葉抽出物サンプル、１
００ｍＭトリスｐＨ８．６、および５０ｍＭ ＡＣＣを
最終容量１５０μｌ中に含有させた。反応は３０℃で１
分間インキュベートして行い、５０μｌの０．５６Ｍ
ＨＣｌで終結させた。２Ｎ ＨＣｌ中０．１％２，４−
ジヒドロフェニルヒドラジン０．６ｍｌを添加した。サ
ンプルを２分間煮沸し、室温に冷却し、０．２ｍｌの４
０％ＮａＯＨを加えた。遠心分離して沈殿を除去した
（１２，０００ｇ、５分間）。上清の光学密度を５２０
ｎｍで測定した。この値は植物中で生成されたＡＣＣデ
アミナーゼ酵素の相対量を示す。非形質転換タバコ植物
を陰性対照として用いた。
【００６６】数種のタバコ葉抽出物についてアッセイを
行ったところ、ＡＣＣデアミナーゼ活性は０．６〜７．
５ｍｍｏｌ生成物（α−ケト酪酸）／ｍｇ総蛋白／分の
範囲であった。これらのアッセイ結果は、タバコ植物中
でＡＣＣデアミナーゼが発現したことを実証するもので
ある。
行ったところ、ＡＣＣデアミナーゼ活性は０．６〜７．
５ｍｍｏｌ生成物（α−ケト酪酸）／ｍｇ総蛋白／分の
範囲であった。これらのアッセイ結果は、タバコ植物中
でＡＣＣデアミナーゼが発現したことを実証するもので
ある。
【００６７】実施例２ ＡＢＩ::ｐＭＯＮ１００２８およびＡＢＩ::ｐＭＯＮ１
００３７ベクターを用いて形質転換トマト植物を生成さ
せ、植物中におけるＡＣＣデアミナーゼの発現を証明す
る。
００３７ベクターを用いて形質転換トマト植物を生成さ
せ、植物中におけるＡＣＣデアミナーゼの発現を証明す
る。
【００６８】トマト細胞は、上述のＡｂｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株を用い、ほぼＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９
８６）の記載した方法に従って、トランスホームした。
とくに、７〜８日齢の若木からコチレドンを得た。種子
を３０％Ｃｌｏｒｏｘブリーチ中で２０分間殺菌し、Ｐ
ｌａｎｔｃｏｎｓボックス中、Ｄａｖｉｓ発芽培地上で
発芽させた。Ｄａｖｉｓの発芽培地の組成は、ＭＳ塩
４．３ｇ／ｌ、蔗糖２０ｇ／ｌ、およびＮｉｔｓｃｈビ
タミン１０ｍｌ、ｐＨ５．８である。Ｎｉｔｓｃｈビタ
ミン溶液は、ミオイノシトール１００ｍｇ／ｍｌ、ニコ
チン酸５ｍｇ／ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．５ｍｇ／
ｌ、チアミン塩酸塩０．５ｍｇ／ｌ、葉酸０．０５ｍｇ
／ｌ、ビオチン０．０５ｍｇ／ｌ、グリシン２ｍｇ／ｌ
である。種子は生育チャンバー中、２５℃、湿度４０
％、強度８０アインシュタインｍ-2ｓ-1の冷白色光下に
７〜８日間発芽させた。光周期は明期１６時間、暗期８
時間とした。
ｅｒｉｕｍ株を用い、ほぼＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（１９
８６）の記載した方法に従って、トランスホームした。
とくに、７〜８日齢の若木からコチレドンを得た。種子
を３０％Ｃｌｏｒｏｘブリーチ中で２０分間殺菌し、Ｐ
ｌａｎｔｃｏｎｓボックス中、Ｄａｖｉｓ発芽培地上で
発芽させた。Ｄａｖｉｓの発芽培地の組成は、ＭＳ塩
４．３ｇ／ｌ、蔗糖２０ｇ／ｌ、およびＮｉｔｓｃｈビ
タミン１０ｍｌ、ｐＨ５．８である。Ｎｉｔｓｃｈビタ
ミン溶液は、ミオイノシトール１００ｍｇ／ｍｌ、ニコ
チン酸５ｍｇ／ｌ、ピリドキシン塩酸塩０．５ｍｇ／
ｌ、チアミン塩酸塩０．５ｍｇ／ｌ、葉酸０．０５ｍｇ
／ｌ、ビオチン０．０５ｍｇ／ｌ、グリシン２ｍｇ／ｌ
である。種子は生育チャンバー中、２５℃、湿度４０
％、強度８０アインシュタインｍ-2ｓ-1の冷白色光下に
７〜８日間発芽させた。光周期は明期１６時間、暗期８
時間とした。
【００６９】発芽が起こったならば、コレチドンを、＃
１５のカミソリを使って、頂端分裂組織および胚軸を切
断して移植し、矩形の移植片を作成した。発芽している
コレチドンの短端でのこれらの切断は、インフェクショ
ンのための表面積を増大させた。移植片は滅菌Ｄａｖｉ
ｓ再生液に浸漬して乾燥を防止した。Ｄａｖｉｓ再生培
地の組成は、１×ＭＳ塩、３％蔗糖、１×Ｎｉｔｓｃｈ
ビタミン、２０ｍｇ／ｍｌゼアチン、ｐＨ５．８であ
る。この溶液は０．８％貴アガールとともにオートクレ
ーブ処理した。
１５のカミソリを使って、頂端分裂組織および胚軸を切
断して移植し、矩形の移植片を作成した。発芽している
コレチドンの短端でのこれらの切断は、インフェクショ
ンのための表面積を増大させた。移植片は滅菌Ｄａｖｉ
ｓ再生液に浸漬して乾燥を防止した。Ｄａｖｉｓ再生培
地の組成は、１×ＭＳ塩、３％蔗糖、１×Ｎｉｔｓｃｈ
ビタミン、２０ｍｇ／ｍｌゼアチン、ｐＨ５．８であ
る。この溶液は０．８％貴アガールとともにオートクレ
ーブ処理した。
【００７０】コレチドンは、抗生物質を含まない培地か
らなる「フィーダープレート」上で前培養した。この培
地は、ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、ミオイノ
シトール０．１ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ2 ＰＯ4 、
０．９ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩溶液１．４５ｍｌ／
ｌ、キネチンの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液０．２ｍｌ、およ
び２，４Ｄの０．２ｍｇ／ｍｌ溶液０．１ｍｌからな
る。この溶液をＫＯＨによりｐＨ６．０に調整した。こ
れらのプレートを１．５〜２．０ｍｌのトマト懸濁細胞
および２ＣＯＯ５Ｋ培地に浸漬したＷｈｉｔｍａｎ濾紙
で覆った。２ＣＯＯ５Ｋ培地の組成は、ＧｉｂｃｏＭＳ
塩混合物４．３ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン（１０００×保存
液）１ｍｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、２ｍｌのＰＣＰＡ（２ｍ
ｇ／ｍｌの保存液から）、およびキネチンの１０μｌ／
ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌの保存液から）である。コチレ
ドンは生育チャンバー中、２５℃、強度４０〜５０アイ
ンシュタインｍ-2ｓ-1の冷白色光下、連続明期の光周期
で、１日培養した。
らなる「フィーダープレート」上で前培養した。この培
地は、ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、ミオイノ
シトール０．１ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌのＫＨ2 ＰＯ4 、
０．９ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩溶液１．４５ｍｌ／
ｌ、キネチンの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液０．２ｍｌ、およ
び２，４Ｄの０．２ｍｇ／ｍｌ溶液０．１ｍｌからな
る。この溶液をＫＯＨによりｐＨ６．０に調整した。こ
れらのプレートを１．５〜２．０ｍｌのトマト懸濁細胞
および２ＣＯＯ５Ｋ培地に浸漬したＷｈｉｔｍａｎ濾紙
で覆った。２ＣＯＯ５Ｋ培地の組成は、ＧｉｂｃｏＭＳ
塩混合物４．３ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン（１０００×保存
液）１ｍｌ、蔗糖３０ｇ／ｌ、２ｍｌのＰＣＰＡ（２ｍ
ｇ／ｍｌの保存液から）、およびキネチンの１０μｌ／
ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌの保存液から）である。コチレ
ドンは生育チャンバー中、２５℃、強度４０〜５０アイ
ンシュタインｍ-2ｓ-1の冷白色光下、連続明期の光周期
で、１日培養した。
【００７１】ついでコチレドンを、所望のトランスジェ
ニック遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの対数
期溶液で接種した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度
は約５×１０8 細胞／ｍｌとした。コチレドンを細菌溶
液に６分間浸漬させ、ついで滅菌Ｗｈａｉｍａｎ濾紙デ
ィスク上で吸取って過剰の溶液を除去し、次に、最初の
フィーダープレートを置換して、２日間共培養させた。
２日後にコチレドンを、２ｍｇ／ｌのゼアリンリボシ
ド、５００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１００μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＤａｖｉｓ再生培地を
含む選択プレートに移した。２〜３週後、カルスおよび
／または若芽を形成したコチレドンを、カルベニシリン
およびカナマイシンを同レベルで含有する新鮮なＤａｖ
ｉｓ再生プレートに移した。この時点で、トランスホー
マントについて、実験を評価した。カルス組織を規則的
に３週間隔で継代培養し、異常な構造があれば摘み取っ
た。若芽は３〜４月以内に発生した。
ニック遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの対数
期溶液で接種した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの濃度
は約５×１０8 細胞／ｍｌとした。コチレドンを細菌溶
液に６分間浸漬させ、ついで滅菌Ｗｈａｉｍａｎ濾紙デ
ィスク上で吸取って過剰の溶液を除去し、次に、最初の
フィーダープレートを置換して、２日間共培養させた。
２日後にコチレドンを、２ｍｇ／ｌのゼアリンリボシ
ド、５００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１００μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＤａｖｉｓ再生培地を
含む選択プレートに移した。２〜３週後、カルスおよび
／または若芽を形成したコチレドンを、カルベニシリン
およびカナマイシンを同レベルで含有する新鮮なＤａｖ
ｉｓ再生プレートに移した。この時点で、トランスホー
マントについて、実験を評価した。カルス組織を規則的
に３週間隔で継代培養し、異常な構造があれば摘み取っ
た。若芽は３〜４月以内に発生した。
【００７２】若芽が発生したならば、カルス組織から清
潔に切断し、発根選択プレート上に移植した。これらの
プレートには、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５
００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む０．５×ＭＳを
含有させた。これらの若芽には、選択培地上で２週間以
内に根が形成された。２週間後にも発根が認められなか
った場合は、若芽を摘み取り、選択培地に再移植した。
若芽培養体は、パーシバル中２２℃の温度でインキュベ
ートした。根をもった若芽は、根の長さが約２ｃｍにな
ったときに、植木鉢に移した。この植物は生育チャンバ
ー中２１℃において、明期１８時間、暗期６時間の光周
期で２〜３週間生育させて丈夫にしたのち、温室に移し
た。温室では、植物は、昼間２６℃、夜間２１℃の温度
で生育させた。光周期は明期１３時間、暗期１１時間
で、植物はそのまま成熟させた。
潔に切断し、発根選択プレート上に移植した。これらの
プレートには、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５
００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む０．５×ＭＳを
含有させた。これらの若芽には、選択培地上で２週間以
内に根が形成された。２週間後にも発根が認められなか
った場合は、若芽を摘み取り、選択培地に再移植した。
若芽培養体は、パーシバル中２２℃の温度でインキュベ
ートした。根をもった若芽は、根の長さが約２ｃｍにな
ったときに、植木鉢に移した。この植物は生育チャンバ
ー中２１℃において、明期１８時間、暗期６時間の光周
期で２〜３週間生育させて丈夫にしたのち、温室に移し
た。温室では、植物は、昼間２６℃、夜間２１℃の温度
で生育させた。光周期は明期１３時間、暗期１１時間
で、植物はそのまま成熟させた。
【００７３】グリーンのトマト果実および葉サンプルを
集め、液体窒素中で凍結させた。サンプルを抽出し、タ
バコについて記載した操作を用いたアッセイに付した。
トマト抽出緩衝液には、１００ｍｌトリスｐＨ７．１、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、１ｍＭベンザミジ
ン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有させた。抽出物をアッ
セイしたところ、ＡＣＣデアミナーゼ活性は、葉組織に
ついては１．６〜１１．２ｍｍｏｌ生成物／ｍｇ総蛋白
／反応時間（分）、果実組織については３．０〜２５．
１ｍｍｏｌ生成物／ｍｇ総蛋白／反応時間（分）であっ
た。これらのアッセイ結果は、ＡＣＣデアミナーゼがト
マト植物中で構造的発現を示したことを実証するもので
ある。
集め、液体窒素中で凍結させた。サンプルを抽出し、タ
バコについて記載した操作を用いたアッセイに付した。
トマト抽出緩衝液には、１００ｍｌトリスｐＨ７．１、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、５ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、１ｍＭベンザミジ
ン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有させた。抽出物をアッ
セイしたところ、ＡＣＣデアミナーゼ活性は、葉組織に
ついては１．６〜１１．２ｍｍｏｌ生成物／ｍｇ総蛋白
／反応時間（分）、果実組織については３．０〜２５．
１ｍｍｏｌ生成物／ｍｇ総蛋白／反応時間（分）であっ
た。これらのアッセイ結果は、ＡＣＣデアミナーゼがト
マト植物中で構造的発現を示したことを実証するもので
ある。
【００７４】実施例３ ＡＣＣデアミナーゼをコードするキメラ遺伝子で形質転
換されたトマト植物については、トマト植物の果実の成
熟に対するＡＣＣデアミナーゼの発現の効果を明らかに
するためのアッセイも行った。
換されたトマト植物については、トマト植物の果実の成
熟に対するＡＣＣデアミナーゼの発現の効果を明らかに
するためのアッセイも行った。
【００７５】プラスミドｐＭＯＮ１００２８およびｐＭ
ＯＮ１００３７を、実施例２の記載と同様にして、トマ
ト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ｃｖ．ＵＣ８２Ｂ）に導入した。
ＯＮ１００３７を、実施例２の記載と同様にして、トマ
ト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ｃｖ．ＵＣ８２Ｂ）に導入した。
【００７６】この遺伝子を含む植物は最初、カナマイシ
ン抵抗性によって同定した。カナマイシン抵抗性植物は
さらに、ＡＣＣデアミナーゼ酵素アッセイ（上述）およ
び精製ＡＣＣデアミナーゼ蛋白に対して作成した抗体を
用いる定常的ウエスタンブロット分析によって分析し
た。ＡＣＣデアミナーゼ蛋白を発現する植物を選択し、
さらに分析を行った。
ン抵抗性によって同定した。カナマイシン抵抗性植物は
さらに、ＡＣＣデアミナーゼ酵素アッセイ（上述）およ
び精製ＡＣＣデアミナーゼ蛋白に対して作成した抗体を
用いる定常的ウエスタンブロット分析によって分析し
た。ＡＣＣデアミナーゼ蛋白を発現する植物を選択し、
さらに分析を行った。
【００７７】ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を発現すると同
定されたトマト植物について、果実の成熟の阻害を調べ
た。５６７３および５８５４と命名された２系統からの
一トランスホーマントのＲ１子孫、ならびに非形質転換
ＵＣ８２Ｂ植物を、温室中、同一条件で生育させた。ト
ランスジェニック植物の子孫は、Ｔ−ＤＮＡの継承を示
すＮＰＴII遺伝子の存在についてスクリーニングした。
ＵＣ８２Ｂ対照も含めて、すべての植物が花をつけ、同
時に果実の発生が開始された。各植物について、つい
で、それが成熟の開始を示すブレーカーステージ（果実
が赤くなり始めるステージ）に入った日を評価した。両
トランスジェニック系統からのＮＰＴII陽性と評価され
た植物では、成熟の開始に有意な遅延が認められた。成
熟の開始の遅延はほぼ１週であった。トランスジェニッ
ク植物ならびにＵＣ８２Ｂ対照からの果実は、ブレーカ
ーステージで植物から摘取した。果実は個々に、２００
ｍｌのビーカー中に室温で保存し、そのまま成熟させ
た。トランスジェニック植物からの果実は、それが完全
な成熟状態に到達する時期に、２〜６週の遅延を示し
た。すなわち、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を発現する植
物は、成熟の開始ならびに成熟過程が開始したのち成熟
段階を通じてその進行に要する時間の両者で、遅延を示
した。
定されたトマト植物について、果実の成熟の阻害を調べ
た。５６７３および５８５４と命名された２系統からの
一トランスホーマントのＲ１子孫、ならびに非形質転換
ＵＣ８２Ｂ植物を、温室中、同一条件で生育させた。ト
ランスジェニック植物の子孫は、Ｔ−ＤＮＡの継承を示
すＮＰＴII遺伝子の存在についてスクリーニングした。
ＵＣ８２Ｂ対照も含めて、すべての植物が花をつけ、同
時に果実の発生が開始された。各植物について、つい
で、それが成熟の開始を示すブレーカーステージ（果実
が赤くなり始めるステージ）に入った日を評価した。両
トランスジェニック系統からのＮＰＴII陽性と評価され
た植物では、成熟の開始に有意な遅延が認められた。成
熟の開始の遅延はほぼ１週であった。トランスジェニッ
ク植物ならびにＵＣ８２Ｂ対照からの果実は、ブレーカ
ーステージで植物から摘取した。果実は個々に、２００
ｍｌのビーカー中に室温で保存し、そのまま成熟させ
た。トランスジェニック植物からの果実は、それが完全
な成熟状態に到達する時期に、２〜６週の遅延を示し
た。すなわち、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を発現する植
物は、成熟の開始ならびに成熟過程が開始したのち成熟
段階を通じてその進行に要する時間の両者で、遅延を示
した。
【００７８】実施例４ 上述のようにｐＭＯＮ１００２８およびｐＭＯＮ１００
７７によって形質転換したＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａ
ｃｕｍ植物について、植物中でのＡＣＣデアミナーゼの
発現がタバコの花の寿命に与える効果についても検討す
るため、アッセイを行った。ＡＣＣデアミナーゼを発現
するタバコ植物は、トマト植物について使用したのと同
じ酵素アッセイを用いて同定した。酵素アッセイは、タ
バコの葉および花について実施した。この遺伝子を発現
する植物について、花が維持される時間の長さを検定し
た。花には開花時に札をつけ、老化段階に達するまでの
時間を測定した。対照からの花は開花後２日で有意な凋
萎を示したが、ＡＣＣデアミナーゼを発現するトランス
ジェニック植物からの花では、凋萎が丸１日遅延した。
７７によって形質転換したＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａ
ｃｕｍ植物について、植物中でのＡＣＣデアミナーゼの
発現がタバコの花の寿命に与える効果についても検討す
るため、アッセイを行った。ＡＣＣデアミナーゼを発現
するタバコ植物は、トマト植物について使用したのと同
じ酵素アッセイを用いて同定した。酵素アッセイは、タ
バコの葉および花について実施した。この遺伝子を発現
する植物について、花が維持される時間の長さを検定し
た。花には開花時に札をつけ、老化段階に達するまでの
時間を測定した。対照からの花は開花後２日で有意な凋
萎を示したが、ＡＣＣデアミナーゼを発現するトランス
ジェニック植物からの花では、凋萎が丸１日遅延した。
【００７９】実施例５ 本発明の方法はまた、果実の成熟を遅延させることが知
られている他の方法と組合せて使用することもできる。
このような組合せの一つに、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子
を、エチレン産生を阻害するアンチセンス遺伝子と組合
せる使用法がある。この目的で、ＡＣＣデアミナーゼを
ｐＴＯＭ１３ ｃＤＮＡについてのアンチセンス遺伝子
と組合せて含有するプラスミドを調製した（Ｈｏｌｄｓ
ｗｏｒｔｈら、１９８７）。ｐＴＯＭ１３と命名された
遺伝子は、以前、植物中にアンチセンス方向に配置させ
ると、エチレンの産生を阻害することが示されている
（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８０）。この遺伝子はＡＣ
Ｃをエチレンに変換する酵素（多分、この酵素はＡＣＣ
オキシダーゼであろう）をコードし、アンチセンスＲＮ
Ａによるこの酵素の合成の阻害は植物組織中へのＡＣＣ
の蓄積を招来するものと考えられている。ｐＴＯＭ１３
遺伝子に相当するｃＤＮＡクローンが、公開されたｐＴ
ＯＭ１３配列から調製された合成オリゴヌクレオチドへ
のハイブリダイズ能に基づいて、成熟中のトマト果実か
ら作成されたｃＤＮＡライブラリーから単離された。
られている他の方法と組合せて使用することもできる。
このような組合せの一つに、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子
を、エチレン産生を阻害するアンチセンス遺伝子と組合
せる使用法がある。この目的で、ＡＣＣデアミナーゼを
ｐＴＯＭ１３ ｃＤＮＡについてのアンチセンス遺伝子
と組合せて含有するプラスミドを調製した（Ｈｏｌｄｓ
ｗｏｒｔｈら、１９８７）。ｐＴＯＭ１３と命名された
遺伝子は、以前、植物中にアンチセンス方向に配置させ
ると、エチレンの産生を阻害することが示されている
（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８０）。この遺伝子はＡＣ
Ｃをエチレンに変換する酵素（多分、この酵素はＡＣＣ
オキシダーゼであろう）をコードし、アンチセンスＲＮ
Ａによるこの酵素の合成の阻害は植物組織中へのＡＣＣ
の蓄積を招来するものと考えられている。ｐＴＯＭ１３
遺伝子に相当するｃＤＮＡクローンが、公開されたｐＴ
ＯＭ１３配列から調製された合成オリゴヌクレオチドへ
のハイブリダイズ能に基づいて、成熟中のトマト果実か
ら作成されたｃＤＮＡライブラリーから単離された。
【００８０】ｃＤＮＡライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ（Ｃａｔ．＃９３６００４）から購入した。このラ
イブラリーは、バクテリオファージλクローニングベク
ター、λ−ＺＡＰII中、成熟中のトマト果実から単離さ
れたＲＮＡから作成された。オリゴマーヌクレオチドプ
ローブは、公開されたｐＴＯＭ１３配列のセグメントか
ら、次のように作成された。
ｎｅ（Ｃａｔ．＃９３６００４）から購入した。このラ
イブラリーは、バクテリオファージλクローニングベク
ター、λ−ＺＡＰII中、成熟中のトマト果実から単離さ
れたＲＮＡから作成された。オリゴマーヌクレオチドプ
ローブは、公開されたｐＴＯＭ１３配列のセグメントか
ら、次のように作成された。
【００８１】 オリゴヌクレオチド１： 5′GGTGAACCATGGAATTCCACATG 3′（配列番号４） オリゴヌクレオチド２： 5′GCAATTGGATCCCTTTCCATAGC 3′（配列番号５） ２万個のファージを、製造業者の推薦に従い、アガール
含有プレート上で平板培養した。製造業者によって供給
された大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅをファージの調製に使
用した。ファージプラークをニトロセルロース濾紙に移
し、８０℃のオーブンで２時間ベーキングした。プレー
トは２５℃で２時間、以下の溶液中でプレハイブリダイ
ズした。
含有プレート上で平板培養した。製造業者によって供給
された大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅをファージの調製に使
用した。ファージプラークをニトロセルロース濾紙に移
し、８０℃のオーブンで２時間ベーキングした。プレー
トは２５℃で２時間、以下の溶液中でプレハイブリダイ
ズした。
【００８２】６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、
１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、２０ｍＭトリス
塩酸塩、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳ、１．０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ。
１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、２０ｍＭトリス
塩酸塩、ｐＨ７．０、０．１％ＳＤＳ、１．０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ。
【００８３】５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液＝水中各Ｆｉ
ｃｏｌｌ １．０％、ポリビニルピロリドン、ウシ血清
アルブミン（分画Ｖ；Ｓｉｇｍａ）。
ｃｏｌｌ １．０％、ポリビニルピロリドン、ウシ血清
アルブミン（分画Ｖ；Ｓｉｇｍａ）。
【００８４】２０×ＳＳＣ＝水１リットルあたり１７５
ｇ食塩および８８．２ｇクエン酸ナトリウム、ＮａＯＨ
でｐＨを７．０に調整。
ｇ食塩および８８．２ｇクエン酸ナトリウム、ＮａＯＨ
でｐＨを７．０に調整。
【００８５】プレハイブリダイゼーション後、32Ｐ−標
識オリゴヌクレオチド（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９）を、ハイブリダイゼーション溶液中の各オリゴヌク
レオチドの最終濃度が５００，０００ｃｐｍ／ｍｌにな
るように添加した。ハイブリダイゼーションは５０℃で
４８時間行った。濾紙は６×ＳＳＣ中、室温、１５分で
２回、５０℃、１５分で１回洗浄した。ついで乾燥し、
Ｘ線フィルムに４８時間露出した。ハイブリダイズした
ファージに相当するプラークを単離し、単一のプラーク
が隣接するハイブリダイズしていないプラークから容易
に分離できるようなファージ密度において上述の操作を
反復して精製した。ｐＴＯＭ１３ ｃＤＮＡ挿入体は、
製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の記述に従い、プラ
スミドベクターｐＢＳＳＫ−中に救出した。このプラス
ミドはｐＭＯＮ１１０２３と命名された。
識オリゴヌクレオチド（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９）を、ハイブリダイゼーション溶液中の各オリゴヌク
レオチドの最終濃度が５００，０００ｃｐｍ／ｍｌにな
るように添加した。ハイブリダイゼーションは５０℃で
４８時間行った。濾紙は６×ＳＳＣ中、室温、１５分で
２回、５０℃、１５分で１回洗浄した。ついで乾燥し、
Ｘ線フィルムに４８時間露出した。ハイブリダイズした
ファージに相当するプラークを単離し、単一のプラーク
が隣接するハイブリダイズしていないプラークから容易
に分離できるようなファージ密度において上述の操作を
反復して精製した。ｐＴＯＭ１３ ｃＤＮＡ挿入体は、
製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の記述に従い、プラ
スミドベクターｐＢＳＳＫ−中に救出した。このプラス
ミドはｐＭＯＮ１１０２３と命名された。
【００８６】ついで、ｐＴＯＭ１３ ｃＤＮＡ挿入体の
アンチセンス方向での発現のために設計されたベクター
を調製した。ｃＤＮＡ挿入体を隣接のポリリンカーとと
もに、ｐＭＯＮ１１０２３から制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切断することにより切り出
した。プラスミドのｃＤＮＡ含有部分をついで、Ｂｇｌ
IIおよびＣｌａＩで切断しウシ腸アルカリホシファター
ゼで処理したｐＭＯＮ９９９中にクローン化した。得ら
れたプラスミド、ｐＭＯＮ１１０２５は、ＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターに関してアンチセンス方向のｃＤＮＡ挿
入体およびノパリンシンターゼ３′転写ターミネーター
／ポリアデニル化部位を含有する。この遺伝子カセット
は単一の２．２Ｋｂ ＮｏｔＩフラグメントとして切り
出すことができる。このＮｏｔＩフラグメントをｐＭＯ
Ｎ１１０２５から切断し、ｐＭＯＮ１００２８のユニー
クＮｏｔＩ部位に配置してｐＭＯＮ１１０２７（図７）
を創製した。すなわち、このプラスミドは、アンチセン
スｐＴＯＭ１３遺伝子およびＣａＭＶ３５Ｓ／ＡＣＣデ
アミナーゼ遺伝子を含有する。このプラスミドを、上述
の三親交配を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢ
Ｉに導入し、トマト植物のトランスホーメーションに用
いた。
アンチセンス方向での発現のために設計されたベクター
を調製した。ｃＤＮＡ挿入体を隣接のポリリンカーとと
もに、ｐＭＯＮ１１０２３から制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで切断することにより切り出
した。プラスミドのｃＤＮＡ含有部分をついで、Ｂｇｌ
IIおよびＣｌａＩで切断しウシ腸アルカリホシファター
ゼで処理したｐＭＯＮ９９９中にクローン化した。得ら
れたプラスミド、ｐＭＯＮ１１０２５は、ＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターに関してアンチセンス方向のｃＤＮＡ挿
入体およびノパリンシンターゼ３′転写ターミネーター
／ポリアデニル化部位を含有する。この遺伝子カセット
は単一の２．２Ｋｂ ＮｏｔＩフラグメントとして切り
出すことができる。このＮｏｔＩフラグメントをｐＭＯ
Ｎ１１０２５から切断し、ｐＭＯＮ１００２８のユニー
クＮｏｔＩ部位に配置してｐＭＯＮ１１０２７（図７）
を創製した。すなわち、このプラスミドは、アンチセン
スｐＴＯＭ１３遺伝子およびＣａＭＶ３５Ｓ／ＡＣＣデ
アミナーゼ遺伝子を含有する。このプラスミドを、上述
の三親交配を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢ
Ｉに導入し、トマト植物のトランスホーメーションに用
いた。
【００８７】得られた形質転換植物は、植物中でのエチ
レン産生を有意に阻害すると考えられる。ＡＣＣデアミ
ナーゼ遺伝子とアンチセンスｐＴＯＭ１３遺伝子の組合
せによる作用は、実際にエチレンの合成を消失させ、果
実の成熟をさらに遅延させることが期待される。ＡＣＣ
デアミナーゼとｐＴＯＭ１３アンチセンス遺伝子の組合
せは、果実または植物におけるエチレンの形成の低下に
相乗作用を発揮することが期待される。
レン産生を有意に阻害すると考えられる。ＡＣＣデアミ
ナーゼ遺伝子とアンチセンスｐＴＯＭ１３遺伝子の組合
せによる作用は、実際にエチレンの合成を消失させ、果
実の成熟をさらに遅延させることが期待される。ＡＣＣ
デアミナーゼとｐＴＯＭ１３アンチセンス遺伝子の組合
せは、果実または植物におけるエチレンの形成の低下に
相乗作用を発揮することが期待される。
【００８８】実施例６ 植物組織におけるエチレン産生速度を低下させる他のア
プローチには、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）デ
カルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現があ
る。この酵素はＡＣＣの中間プレカーサーであるＳＡＭ
を分解する。脱カルボキシル化されたＳＡＭはついで、
一般的にポリアミンであるスペルミジンに変換される。
ポリアミンはそれ自体、植物において抗老化作用を有す
ることが報告されているので、ＳＡＭデカルボキシラー
ゼは２つの方式で、すなわち（１）スペルミジンの産
生、および（２）エチレンへのプレカーサーの分解によ
り、成熟を防止できることが推測される。
プローチには、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）デ
カルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現があ
る。この酵素はＡＣＣの中間プレカーサーであるＳＡＭ
を分解する。脱カルボキシル化されたＳＡＭはついで、
一般的にポリアミンであるスペルミジンに変換される。
ポリアミンはそれ自体、植物において抗老化作用を有す
ることが報告されているので、ＳＡＭデカルボキシラー
ゼは２つの方式で、すなわち（１）スペルミジンの産
生、および（２）エチレンへのプレカーサーの分解によ
り、成熟を防止できることが推測される。
【００８９】図１５に示した（配列番号９）ＳＡＭデカ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子はクローン化され、
そのＤＮＡ配列が報告されている（Ｔａｂｏｒ ＆ Ｔ
ａｂｏｒ）。この遺伝子は、Ｅ８プロモーターの単離の
ためのプロトコール中に上述したように、ＰＣＲを用い
てクローニングした。大腸菌ＤＮＡは、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ６Ｇ５ゲノムＤＮＡの単離について上述したよ
うにして精製した。精製ＤＮＡは、プライマーとして以
下のオリゴヌクレオチドを用い、上述のようにＰＣＲに
付した。
ルボキシラーゼをコードする遺伝子はクローン化され、
そのＤＮＡ配列が報告されている（Ｔａｂｏｒ ＆ Ｔ
ａｂｏｒ）。この遺伝子は、Ｅ８プロモーターの単離の
ためのプロトコール中に上述したように、ＰＣＲを用い
てクローニングした。大腸菌ＤＮＡは、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ６Ｇ５ゲノムＤＮＡの単離について上述したよ
うにして精製した。精製ＤＮＡは、プライマーとして以
下のオリゴヌクレオチドを用い、上述のようにＰＣＲに
付した。
【００９０】 ５′オリゴヌクレオチド： GGAGAAGATA AGATCTATGA AAAAACTGAA ACTGC （配列番号６） ３′オリゴヌクレオチド GCAGAAGTAA ATAGATCTGG CGGAGCC （配列番号７） 使用された２つのプライマーにはそれぞれ、以後のクロ
ーニング工程を容易にするため、増幅したＤＮＡ配列に
Ｂｇｌ II 制限部位を導入した。増幅後、ＤＮＡをＢｇ
ｌ II で切断し、Ｂｇｌ II 切断ｐＭＯＮ７２５８（図
８）とリゲートした。得られたプラスミドｐＭＯＮ１１
０１４（図９）は、ＳＡＭデカルボキシラーゼ遺伝子を
含有した。この遺伝子を次に、構造的プロモーターたと
えばＦＭＶからの完全長転写プロモーターまたは果実特
異的プロモーターたとえば上述のＥ８プロモーターのい
ずれかの制御下にその遺伝子の発現を可能にする植物ト
ランスホーメーションベクター中にクローニングした。
構造的発現ベクターは、ＳＡＭデカルボキシラーゼを含
有するｐＭＯＮ１１０１４Ｂｇｌ II フラグメントを、
Ｂｇｌ II 切断ｐＭＯＮ９８１（図１０）にクローニン
グして構築した。得られたプラスミド、ｐＭＯＮ１１０
１６（図１１）は、その遺伝子を、植物中での発現のた
めに正しい方向で含有した。組織特異的発現ベクター、
ｐＭＯＮ１１０３２（図１２）は、ｐＭＯＮ１１０１４
からの同じＢｇｌ II フラグメントを、ＢａｍＨＩ切断
ｐＭＯＮ１００８６（図１３）中に挿入して構築した。
両トランスホーメーションベクターをついで、三親交配
を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩに導
入した。ｐＭＯＮ１１０１６またはｐＭＯＮ１１０３２
のいずれかを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を
ついで、上述のようにトマト植物のトランスホームに使
用した。
ーニング工程を容易にするため、増幅したＤＮＡ配列に
Ｂｇｌ II 制限部位を導入した。増幅後、ＤＮＡをＢｇ
ｌ II で切断し、Ｂｇｌ II 切断ｐＭＯＮ７２５８（図
８）とリゲートした。得られたプラスミドｐＭＯＮ１１
０１４（図９）は、ＳＡＭデカルボキシラーゼ遺伝子を
含有した。この遺伝子を次に、構造的プロモーターたと
えばＦＭＶからの完全長転写プロモーターまたは果実特
異的プロモーターたとえば上述のＥ８プロモーターのい
ずれかの制御下にその遺伝子の発現を可能にする植物ト
ランスホーメーションベクター中にクローニングした。
構造的発現ベクターは、ＳＡＭデカルボキシラーゼを含
有するｐＭＯＮ１１０１４Ｂｇｌ II フラグメントを、
Ｂｇｌ II 切断ｐＭＯＮ９８１（図１０）にクローニン
グして構築した。得られたプラスミド、ｐＭＯＮ１１０
１６（図１１）は、その遺伝子を、植物中での発現のた
めに正しい方向で含有した。組織特異的発現ベクター、
ｐＭＯＮ１１０３２（図１２）は、ｐＭＯＮ１１０１４
からの同じＢｇｌ II フラグメントを、ＢａｍＨＩ切断
ｐＭＯＮ１００８６（図１３）中に挿入して構築した。
両トランスホーメーションベクターをついで、三親交配
を使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩに導
入した。ｐＭＯＮ１１０１６またはｐＭＯＮ１１０３２
のいずれかを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を
ついで、上述のようにトマト植物のトランスホームに使
用した。
【００９１】ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をＳＡＭデカル
ボキシラーゼ遺伝子とともに発現させれば、植物中での
エチレンの産生が相乗的様式で阻害され、生成した植物
の成熟または老化過程は制御されて、この植物由来の商
品の貯蔵寿命は増大することが期待されている。
ボキシラーゼ遺伝子とともに発現させれば、植物中での
エチレンの産生が相乗的様式で阻害され、生成した植物
の成熟または老化過程は制御されて、この植物由来の商
品の貯蔵寿命は増大することが期待されている。
【００９２】実施例７ ＡＣＣ代謝酵素たとえばＡＣＣデアミナーゼはまた、ア
ンチセンスＡＣＣシンターゼ遺伝子と組合せて使用する
こともできる。ＡＣＣシンターゼのＤＮＡ配列は既知で
あり（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｓｔｒａｅｔｅｎら、１９９
０）、図１６に示す通りである（配列番号８）。通常の
操作により、適当なｃＤＮＡライブラリーからＡＣＣシ
ンターゼ遺伝子のｃＤＮＡを単離し、ＡＣＣシンターゼ
遺伝子をアンチセンス方向で含有するベクターを調製す
ることができる。このベクターは、アンチセンス方向で
のＡＣＣシンターゼ遺伝子およびＡＣＣ代謝酵素たとえ
ばＡＣＣデアミナーゼを、植物のトランスホーメーショ
ンを成功させるのに必要な他のＤＮＡフラグメントとと
もに含有することになる。アンチセンスＡＣＣシンター
ゼおよびＡＣＣデアミナーゼの両者は、果実特異的プロ
モーターたとえばＥ８の転写制御下にあることが好まし
い。
ンチセンスＡＣＣシンターゼ遺伝子と組合せて使用する
こともできる。ＡＣＣシンターゼのＤＮＡ配列は既知で
あり（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｓｔｒａｅｔｅｎら、１９９
０）、図１６に示す通りである（配列番号８）。通常の
操作により、適当なｃＤＮＡライブラリーからＡＣＣシ
ンターゼ遺伝子のｃＤＮＡを単離し、ＡＣＣシンターゼ
遺伝子をアンチセンス方向で含有するベクターを調製す
ることができる。このベクターは、アンチセンス方向で
のＡＣＣシンターゼ遺伝子およびＡＣＣ代謝酵素たとえ
ばＡＣＣデアミナーゼを、植物のトランスホーメーショ
ンを成功させるのに必要な他のＤＮＡフラグメントとと
もに含有することになる。アンチセンスＡＣＣシンター
ゼおよびＡＣＣデアミナーゼの両者は、果実特異的プロ
モーターたとえばＥ８の転写制御下にあることが好まし
い。
【００９３】得られた形質転換植物は、形質転換植物の
果実におけるエチレンの産生を有意に阻害するものと考
えられる。ＡＣＣ代謝酵素とＡＣＣシンターゼアンチセ
ンス遺伝子の組合せは、実際にエチレンの合成を消失さ
せ、果実の成熟をさらに遅延させることが期待される。
果実は、所望の時点で、通常の濃度のエチレンに暴露さ
せて成熟させることができる。
果実におけるエチレンの産生を有意に阻害するものと考
えられる。ＡＣＣ代謝酵素とＡＣＣシンターゼアンチセ
ンス遺伝子の組合せは、実際にエチレンの合成を消失さ
せ、果実の成熟をさらに遅延させることが期待される。
果実は、所望の時点で、通常の濃度のエチレンに暴露さ
せて成熟させることができる。
【００９４】実施例８ この実験は、植物中でＡＣＣデアミナーゼを高レベルに
発現させた場合の、エチレンレベルの低下作用を評価す
るために実施された。実施例３に記載した植物系統５６
７３および５８５４について、植物中でのエチレンの発
生、および植物中でのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の発現
の表現型への影響を調べた。エチレン発生のアッセイ
は、植物からの若い葉組織について、全部の葉または果
実を密閉した容器内に封入し、１時間後に気体サンプル
１．０ｍ１を抜取って行った。エチレンは、アルミニウ
ムカラムおよび水素炎イオン化検出器を装置したガスク
ロマトグラフィー（Ｗａｒｄら、１９７８）によって定
量した。エチレン発生アッセイの結果は以下の表３に示
す。
発現させた場合の、エチレンレベルの低下作用を評価す
るために実施された。実施例３に記載した植物系統５６
７３および５８５４について、植物中でのエチレンの発
生、および植物中でのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の発現
の表現型への影響を調べた。エチレン発生のアッセイ
は、植物からの若い葉組織について、全部の葉または果
実を密閉した容器内に封入し、１時間後に気体サンプル
１．０ｍ１を抜取って行った。エチレンは、アルミニウ
ムカラムおよび水素炎イオン化検出器を装置したガスク
ロマトグラフィー（Ｗａｒｄら、１９７８）によって定
量した。エチレン発生アッセイの結果は以下の表３に示
す。
【００９５】
【表３】
【００９６】植物系統５６７３のエチレンレベルは、若
い葉を用いた一つの実験では９０％、第二の実験では９
７％もの低下を生じた。植物系統５８５４では、約７８
％の低下を示した。これらのデータは、これらの植物系
統における遺伝子発現データと一致する。蛋白ゲルブロ
ット分析で測定すると、系統５６７３はＡＣＣデアミナ
ーゼとして可溶性蛋白約０．５％を含有し、一方、植物
系統５８５４はＡＣＣデアミナーゼとして可溶性蛋白約
０．０５％を含有した。
い葉を用いた一つの実験では９０％、第二の実験では９
７％もの低下を生じた。植物系統５８５４では、約７８
％の低下を示した。これらのデータは、これらの植物系
統における遺伝子発現データと一致する。蛋白ゲルブロ
ット分析で測定すると、系統５６７３はＡＣＣデアミナ
ーゼとして可溶性蛋白約０．５％を含有し、一方、植物
系統５８５４はＡＣＣデアミナーゼとして可溶性蛋白約
０．０５％を含有した。
【００９７】蛋白ゲルブロット分析は、蛋白サンプルを
ゲル負荷緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ７、１０
０ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳ、１０％グリセ
ロール、０．１％ブロモフェノールブルー）中３分間煮
沸し、４〜２０％ポリアクリルアミドＭＩＮＩＰＲＯＴ
ＥＩＮ II レディーゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上に流して
行った。蛋白を、製造業者の指示に従いＭｉｌｌｉＢｌ
ｏｔ−ＳＤＥ電気ブロティング装置を用いて、ニトロセ
ルロース膜に移した。膜を、１％ＢＳＡ、ＴＢＳＴ（１
０ｍＭトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中４℃で一夜インキュベートし
た。インキュベーションは室温で穏やかに撹拌して行
い、膜をハイブリダイズさせた。膜を、ＴＢＳＴに１：
１０００に希釈したヤギ血清中でインキュベートして、
一次ＡＣＣデアミナーゼ抗体を結合させた。ついで、Ｔ
ＢＳＴ中１０分間の洗浄を３回行った。膜を、ＴＢＳＴ
２０ｍｌ中５μＣの 125Ｉ−標識プロテインＧと３０分
間インキュベートして二次試薬を結合させた。膜を０．
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間４回洗浄し、
フィルムに露出した。ＡＣＣデアミナーゼ蛋白に対する
抗体は、本技術分野の熟練者にはよく知られた標準技術
により、ヤギに１．５ｍｇの蛋白を注射し、ヤギから抗
体を単離することにより得られた。
ゲル負荷緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ７、１０
０ｍＭジチオスレイトール、２％ＳＤＳ、１０％グリセ
ロール、０．１％ブロモフェノールブルー）中３分間煮
沸し、４〜２０％ポリアクリルアミドＭＩＮＩＰＲＯＴ
ＥＩＮ II レディーゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上に流して
行った。蛋白を、製造業者の指示に従いＭｉｌｌｉＢｌ
ｏｔ−ＳＤＥ電気ブロティング装置を用いて、ニトロセ
ルロース膜に移した。膜を、１％ＢＳＡ、ＴＢＳＴ（１
０ｍＭトリス、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中４℃で一夜インキュベートし
た。インキュベーションは室温で穏やかに撹拌して行
い、膜をハイブリダイズさせた。膜を、ＴＢＳＴに１：
１０００に希釈したヤギ血清中でインキュベートして、
一次ＡＣＣデアミナーゼ抗体を結合させた。ついで、Ｔ
ＢＳＴ中１０分間の洗浄を３回行った。膜を、ＴＢＳＴ
２０ｍｌ中５μＣの 125Ｉ−標識プロテインＧと３０分
間インキュベートして二次試薬を結合させた。膜を０．
１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間４回洗浄し、
フィルムに露出した。ＡＣＣデアミナーゼ蛋白に対する
抗体は、本技術分野の熟練者にはよく知られた標準技術
により、ヤギに１．５ｍｇの蛋白を注射し、ヤギから抗
体を単離することにより得られた。
【００９８】植物系統５６７３からのホモザイゴート植
物について、表現型効果も調べた。トランスジェニック
植物からの種子を通常のようにして発芽させたが、この
植物は表現型的に、対照と識別できなかった。この植物
には、開花または成熟の開始に遅延を認めなかった。し
かしながら、成熟の進行には著しい差がみられた。トラ
ンスジェニック植物の果実は対照果実と一致するエチレ
ン合成のピークを示したが、そのレベルは対照のわずか
１０％にすぎなかった。この結果を図１８に示した。ト
ランスジェニック植物によるエチレンの発生は−・−、
対照植物（ＵＣ８２Ｂ）によるエチレンの発生は−■−
で示されている。棒は特定の時点での平均±標準誤差を
示している。果実はブレーカー段階で摘取し、上述のよ
うにしてエチレンの発生を毎日測定した。ブレーカー段
階で摘取した果実の成熟の遅延も同様に有意であった。
対照果実は、ブレーカー段階から７日を経過すると完全
に赤色になり、わずか２週後には著しい軟化を示した。
トランスジェニックトマト果実は、２４日後に完全な赤
色の段階に到達し、ブレーカー段階から長期間にわたり
固いままであった。トランスジェニック植物からの果実
は４５日以上も固いままで離層しなかったが、一方、対
照果実は１４日後に離層した。これらのデータは表４に
示す。
物について、表現型効果も調べた。トランスジェニック
植物からの種子を通常のようにして発芽させたが、この
植物は表現型的に、対照と識別できなかった。この植物
には、開花または成熟の開始に遅延を認めなかった。し
かしながら、成熟の進行には著しい差がみられた。トラ
ンスジェニック植物の果実は対照果実と一致するエチレ
ン合成のピークを示したが、そのレベルは対照のわずか
１０％にすぎなかった。この結果を図１８に示した。ト
ランスジェニック植物によるエチレンの発生は−・−、
対照植物（ＵＣ８２Ｂ）によるエチレンの発生は−■−
で示されている。棒は特定の時点での平均±標準誤差を
示している。果実はブレーカー段階で摘取し、上述のよ
うにしてエチレンの発生を毎日測定した。ブレーカー段
階で摘取した果実の成熟の遅延も同様に有意であった。
対照果実は、ブレーカー段階から７日を経過すると完全
に赤色になり、わずか２週後には著しい軟化を示した。
トランスジェニックトマト果実は、２４日後に完全な赤
色の段階に到達し、ブレーカー段階から長期間にわたり
固いままであった。トランスジェニック植物からの果実
は４５日以上も固いままで離層しなかったが、一方、対
照果実は１４日後に離層した。これらのデータは表４に
示す。
【００９９】
【表４】
【０１００】表４のデータは、摘取後、特定の成熟段階
に到達するまでの日数を標準誤差とともに示している。
成熟段階は次のように定義された。
に到達するまでの日数を標準誤差とともに示している。
成熟段階は次のように定義された。
【０１０１】 ブレーカー 色の変化の最初の兆候 ３ 完全に橙色 ４ 橙色〜赤色 ５ 赤色部が５０％を越える ６ 完全に赤色実施例９ 本実施例は、花をもつ植物種におけるＡＣＣデアミナー
ゼ蛋白の発現を例示するものである。ＡＣＣデアミナー
ゼ遺伝子をペチュニア植物にトランスホームした。ペチ
ュニア植物は、トランスホームされた植物のグリフォゼ
ート上での直接選択を可能にするトランスホーメーショ
ンベクターでトランスホームした。ペチュニアの移植片
は、一般的に、実施例１においてタバコ植物について記
載したのと同様に、前培養のために調製した。１月齢の
ペチュニア植物からの葉を１０％Ｃｌｏｒｏｘプラス界
面活性剤の溶液中で１５分間表面殺菌したのち、蒸留水
で３回洗浄した。移植片は０．５ｃｍ平方に切り取り、
葉端、主脈、葉芽および葉柄端を除去し、均一組織型と
した。移植片をついで、上面を下にして単層に、２ｍｌ
の４ＣＯ５Ｋ培地を含有するＭＳ１０４プレート上に置
き、表面を湿潤させ１〜２日間前培養した。移植片は、
１．２×１０9 細菌／ｍｌ ４ＣＯＯ５Ｋ培地の力価に
調整した植物トランスホーメーションベクター含有Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの一夜培養液を用いて接種し
た。移植片は遠沈管中に置き、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ懸濁液を加え、細菌と移植片の混合物を、細菌の均
一な侵入を保証するため、最大セッティングで２５秒間
「ボルテックス」した。細菌を流し出し、移植片は乾燥
滅菌濾紙の層の間にはさんで液を吸取り、過剰の細菌を
除去した。水分を吸取った移植片を、上面を下にしてＭ
Ｓ１０４プレート上に置き、これに４ＣＯＯ５Ｋ培地と
濾紙ディスクをアガールの頂部に加えて２〜３日共培養
した。移植片を、カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌおよ
びセフォタキシム１００ｍｇ／ｌを含有するＭＳ１０４
プレートに３日間移した。ついで移植片を、選択相とし
て、グリフォゼート０．０５ｍＭ、カルベニシリン１０
００ｍｇ／ｌおよびセフォタキシム１００ｍｇ／ｌを含
有する新鮮なＭＳ１０４培地に移した。４〜６週時に、
若芽をカルスから切断して、ＭＳＯとカルベニシリン５
００ｍｇ／ｌの発根培地に置いた。３〜５日で根が形成
され、この時点で、発根プレートから葉片を採取し、グ
リフォゼート耐性とその材料が形質転換されていること
を確認した。
ゼ蛋白の発現を例示するものである。ＡＣＣデアミナー
ゼ遺伝子をペチュニア植物にトランスホームした。ペチ
ュニア植物は、トランスホームされた植物のグリフォゼ
ート上での直接選択を可能にするトランスホーメーショ
ンベクターでトランスホームした。ペチュニアの移植片
は、一般的に、実施例１においてタバコ植物について記
載したのと同様に、前培養のために調製した。１月齢の
ペチュニア植物からの葉を１０％Ｃｌｏｒｏｘプラス界
面活性剤の溶液中で１５分間表面殺菌したのち、蒸留水
で３回洗浄した。移植片は０．５ｃｍ平方に切り取り、
葉端、主脈、葉芽および葉柄端を除去し、均一組織型と
した。移植片をついで、上面を下にして単層に、２ｍｌ
の４ＣＯ５Ｋ培地を含有するＭＳ１０４プレート上に置
き、表面を湿潤させ１〜２日間前培養した。移植片は、
１．２×１０9 細菌／ｍｌ ４ＣＯＯ５Ｋ培地の力価に
調整した植物トランスホーメーションベクター含有Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの一夜培養液を用いて接種し
た。移植片は遠沈管中に置き、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ懸濁液を加え、細菌と移植片の混合物を、細菌の均
一な侵入を保証するため、最大セッティングで２５秒間
「ボルテックス」した。細菌を流し出し、移植片は乾燥
滅菌濾紙の層の間にはさんで液を吸取り、過剰の細菌を
除去した。水分を吸取った移植片を、上面を下にしてＭ
Ｓ１０４プレート上に置き、これに４ＣＯＯ５Ｋ培地と
濾紙ディスクをアガールの頂部に加えて２〜３日共培養
した。移植片を、カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌおよ
びセフォタキシム１００ｍｇ／ｌを含有するＭＳ１０４
プレートに３日間移した。ついで移植片を、選択相とし
て、グリフォゼート０．０５ｍＭ、カルベニシリン１０
００ｍｇ／ｌおよびセフォタキシム１００ｍｇ／ｌを含
有する新鮮なＭＳ１０４培地に移した。４〜６週時に、
若芽をカルスから切断して、ＭＳＯとカルベニシリン５
００ｍｇ／ｌの発根培地に置いた。３〜５日で根が形成
され、この時点で、発根プレートから葉片を採取し、グ
リフォゼート耐性とその材料が形質転換されていること
を確認した。
【０１０２】ペチュニア植物を植物のトランスホーメー
ションベクターｐＭＯＮ１１０３０でトランスホームし
た。ｐＭＯＮ１１０３０の地図は図１９に示す。このプ
ラスミドは本質的には、プラスミドの大腸菌における複
製ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの導入および
その中での複製を可能にする上述の細菌レプリコン系か
らなるものである。図１９に示すように、このプラスミ
ドはさらに、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイ
シン選択可能マーカー遺伝子（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）を含有
し、Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーと左ボーダーの間には、ＦＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター−Ｅ９ ３′カセットにおけるＣ
ＴＰ２−ＣＰ４合成５−エノールピルビル−３−シキミ
酸ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子が配置
されている。ＣＴＰ２−ＣＰ４合成遺伝子はグリフォゼ
ートの存在下における生育能により、形質転換された細
胞の選択を可能にする。ＣＴＰ２は葉緑素輸送ペプチド
であり、そのＤＮＡ配列は図２０（配列番号１３）に示
す。グリフォゼートに対する抵抗性を付与できる遺伝
子、ＣＰ４ＥＰＳＰＳのＤＮＡ配列は、図２１（配列番
号１４）に示す。単離体６Ｇ５からのＡＣＣデアミナー
ゼ遺伝子は、ＦＭＶプロモーターとノパリンシンターゼ
３′領域の間に、ユニークなＮｏｔＩ部位への２．０Ｋ
ｂ ＮｏｔＩフラグメントとして配置され、ｐＭＯＮ１
１０３７を形成する。
ションベクターｐＭＯＮ１１０３０でトランスホームし
た。ｐＭＯＮ１１０３０の地図は図１９に示す。このプ
ラスミドは本質的には、プラスミドの大腸菌における複
製ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの導入および
その中での複製を可能にする上述の細菌レプリコン系か
らなるものである。図１９に示すように、このプラスミ
ドはさらに、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイ
シン選択可能マーカー遺伝子（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）を含有
し、Ｔ−ＤＮＡ右ボーダーと左ボーダーの間には、ＦＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター−Ｅ９ ３′カセットにおけるＣ
ＴＰ２−ＣＰ４合成５−エノールピルビル−３−シキミ
酸ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子が配置
されている。ＣＴＰ２−ＣＰ４合成遺伝子はグリフォゼ
ートの存在下における生育能により、形質転換された細
胞の選択を可能にする。ＣＴＰ２は葉緑素輸送ペプチド
であり、そのＤＮＡ配列は図２０（配列番号１３）に示
す。グリフォゼートに対する抵抗性を付与できる遺伝
子、ＣＰ４ＥＰＳＰＳのＤＮＡ配列は、図２１（配列番
号１４）に示す。単離体６Ｇ５からのＡＣＣデアミナー
ゼ遺伝子は、ＦＭＶプロモーターとノパリンシンターゼ
３′領域の間に、ユニークなＮｏｔＩ部位への２．０Ｋ
ｂ ＮｏｔＩフラグメントとして配置され、ｐＭＯＮ１
１０３７を形成する。
【０１０３】トランスホームされたペチュニア組織にお
けるＡＣＣデアミナーゼ蛋白の存在は、実施例８に記載
した葉ディスクのイムノブロット分析によって確認され
た。再生ペチュニア植物６個中５個の葉組織にＡＣＣデ
アミナーゼが検出された。
けるＡＣＣデアミナーゼ蛋白の存在は、実施例８に記載
した葉ディスクのイムノブロット分析によって確認され
た。再生ペチュニア植物６個中５個の葉組織にＡＣＣデ
アミナーゼが検出された。
【０１０４】ｐＭＯＮ１１０３０でトランスホームされ
たトランスジェニックペチュニア植物のエチレンレベル
についても、ＡＣＣデアミナーゼ発現ペチュニア植物で
測定した。この植物におけるエチレンレベルは、トラン
スホームされていない対照植物におけるエチレンレベル
の約半分に減少していた。エチレン発生アッセイの結果
を以下の表５に示す。
たトランスジェニックペチュニア植物のエチレンレベル
についても、ＡＣＣデアミナーゼ発現ペチュニア植物で
測定した。この植物におけるエチレンレベルは、トラン
スホームされていない対照植物におけるエチレンレベル
の約半分に減少していた。エチレン発生アッセイの結果
を以下の表５に示す。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】これらのデータは、ＡＣＣデアミナーゼ蛋
白を発現するトランスジェニック植物では、葉組織のエ
チレンレベルが低下していることを例証するものであ
る。このような植物では、非トランスジェニック植物に
比べて、花および葉の老化は減弱することが期待され
る。
白を発現するトランスジェニック植物では、葉組織のエ
チレンレベルが低下していることを例証するものであ
る。このような植物では、非トランスジェニック植物に
比べて、花および葉の老化は減弱することが期待され
る。
【０１０７】本明細書中で言及した報文および特許は、
それらの報文および特許ごとにとくにその旨述べていな
いが、すべて参考として本明細書に導入される。
それらの報文および特許ごとにとくにその旨述べていな
いが、すべて参考として本明細書に導入される。
【０１０８】以上の記述から、本発明は、前述の本発明
の目的および対象のすべてを達成するために十分適合す
るものであること、ならびに本発明の自明のまた本発明
に固有の利点が明白であろう。
の目的および対象のすべてを達成するために十分適合す
るものであること、ならびに本発明の自明のまた本発明
に固有の利点が明白であろう。
【０１０９】ある種の特徴および組合せについてはとく
に触れていないが、それらが有用であり、容易に採用で
きるものであることは明らかであろう。これらは、本発
明によって予想されるものであり、本発明の範囲に包含
される。
に触れていないが、それらが有用であり、容易に採用で
きるものであることは明らかであろう。これらは、本発
明によって予想されるものであり、本発明の範囲に包含
される。
【０１１０】本発明は、その範囲から逸脱することなく
多くの実施態様をとることが可能であり、本明細書およ
び図面に掲げたすべての記載は例示の目的であって、い
かなる意味においても本発明を限定するものではないこ
とを理解すべきである。
多くの実施態様をとることが可能であり、本明細書およ
び図面に掲げたすべての記載は例示の目的であって、い
かなる意味においても本発明を限定するものではないこ
とを理解すべきである。
【０１１１】以下に参考文献を挙げる。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
【表８】
【０１１５】
配列番号：１ 配列の長さ：１０７９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１１６】
【化２】
【０１１７】
【化３】
【０１１８】配列番号：２ 配列の長さ：３１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１１９】
【化４】
【０１２０】配列番号：３ 配列の長さ：３２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１２１】
【化５】
【０１２２】配列番号：４ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１２３】
【化６】
【０１２４】配列番号：５ 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１２５】
【化７】
【０１２６】配列番号：６ 配列の長さ：３５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１２７】
【化８】
【０１２８】配列番号：７ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１２９】
【化９】
【０１３０】配列番号：８ 配列の長さ：１８００塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ〜ｍＲＮＡ 配列：
【０１３１】
【化１０】
【０１３２】
【化１１】
【０１３３】
【化１２】
【０１３４】配列番号：９ 配列の長さ：９００塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１３５】
【化１３】
【０１３６】
【化１４】
【０１３７】配列番号：１０ 配列の長さ：１１３８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１３８】
【化１５】
【０１３９】
【化１６】
【０１４０】配列番号：１１ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１４１】
【化１７】
【０１４２】配列番号：１２ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（合成） 配列：
【０１４３】
【化１８】
【０１４４】配列番号：１３ 配列の長さ：３１８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１４５】
【化１９】
【０１４６】配列番号：１４ 配列の長さ：１３７７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１４７】
【化２０】
【０１４８】
【化２１】
【０１４９】
【化２２】
【０１５０】配列番号：１５ 配列の長さ：１０２９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１５１】
【化２３】
【０１５２】
【化２４】
【０１５３】配列番号：１６ 配列の長さ：３３８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列：
【０１５４】
【化２５】
【０１５５】
【化２６】
【０１５６】配列番号：１７ 配列の長さ：５９７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１５７】
【化２７】
【図１】ＡＣＣデアミナーゼのスクリーニングに使用さ
れた細菌コレクションの目録を例示する。
れた細菌コレクションの目録を例示する。
【図２】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏａｐｈ
ｉｓ（単離株６Ｇ５）からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子
のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
ｉｓ（単離株６Ｇ５）からのＡＣＣデアミナーゼ遺伝子
のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図３】ｐＭＯＮ９７７のプラスミド地図を例示する。
【図４】ｐＭＯＮ１００２８のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図５】ｐＭＯＮ１００３７のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図６】ｐＭＯＮ１００５４のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図７】ｐＭＯＮ１１０２７のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図８】ｐＭＯＮ７２５８のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図９】ｐＭＯＮ１１０１４のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図１０】ｐＭＯＮ９８１のプラスミド地図を例示す
る。
る。
【図１１】ｐＭＯＮ１１０１６のプラスミド地図を例示
する。
する。
【図１２】ｐＭＯＮ１１０３２のプラスミド地図を例示
する。
する。
【図１３】ｐＭＯＮ１００８６のプラスミド地図を例示
する。
する。
【図１４】５′Ｈｉｎｄ IIIおよび３′ＢｇｌII制限部
位（下線）を有する果実特異的プロモーターＥ８のヌク
レオチド配列（配列番号１０）を例示する。
位（下線）を有する果実特異的プロモーターＥ８のヌク
レオチド配列（配列番号１０）を例示する。
【図１５】Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）デカル
ボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）
を例示する。
ボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）
を例示する。
【図１６】ＡＣＣシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列
（配列番号８）を例示する。
（配列番号８）を例示する。
【図１７】単離株３Ｆ２から単離されたＡＣＣデアミナ
ーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）を例示
する。
ーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１５）を例示
する。
【図１８】対照トマト果実とＡＣＣデアミナーゼを発現
するトランスジェニックトマト果実におけるエチレンレ
ベル間の関係をグラフで示す。
するトランスジェニックトマト果実におけるエチレンレ
ベル間の関係をグラフで示す。
【図１９】ｐＭＯＮ１１０３０のプラスミド地図を例示
する。
する。
【図２０】葉緑体トランジットペプチドＣＴＰ２のＤＮ
Ａ配列（配列番号１３）を例示する。
Ａ配列（配列番号１３）を例示する。
【図２１】ＣＰ４合成５−エノールピルビル−３−シキ
ミ酸ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子のＤ
ＮＡ配列（配列番号１４）を例示する。
ミ酸ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子のＤ
ＮＡ配列（配列番号１４）を例示する。
【図２２】ゴマノハグサモザイクウィルスからの完全長
転写プロモーターのＤＮＡ配列（配列番号１７）を例示
する。
転写プロモーターのＤＮＡ配列（配列番号１７）を例示
する。
Claims (1)
- 【請求項１】 植物の花の老化を遅延させる方法であっ
て、該花内でのエチレンの産生を減じさせるのに充分な
量の１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミ
ナーゼを該植物体内で発現させることを含んでなる方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63244090A | 1990-12-26 | 1990-12-26 | |
| US632440 | 1990-12-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4502000A Division JPH06504668A (ja) | 1990-12-26 | 1991-12-17 | 果実の成熟および植物の老化の制御 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09238689A true JPH09238689A (ja) | 1997-09-16 |
Family
ID=24535534
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4502000A Pending JPH06504668A (ja) | 1990-12-26 | 1991-12-17 | 果実の成熟および植物の老化の制御 |
| JP8095744A Pending JPH09238689A (ja) | 1990-12-26 | 1996-04-17 | 植物の花の老化の制御 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4502000A Pending JPH06504668A (ja) | 1990-12-26 | 1991-12-17 | 果実の成熟および植物の老化の制御 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5512466A (ja) |
| EP (1) | EP0564524A1 (ja) |
| JP (2) | JPH06504668A (ja) |
| AU (1) | AU9113791A (ja) |
| BR (1) | BR9107191A (ja) |
| CA (1) | CA2096637A1 (ja) |
| FI (1) | FI932960A7 (ja) |
| WO (1) | WO1992012249A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003516753A (ja) * | 1999-12-16 | 2003-05-20 | モンサント テクノロジー エルエルシー | 植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物 |
Families Citing this family (139)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6329570B1 (en) | 1989-07-19 | 2001-12-11 | Calgene, Llc | Cotton modification using ovary-tissue transcriptional factors |
| US5859330A (en) * | 1989-12-12 | 1999-01-12 | Epitope, Inc. | Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype |
| US5723746A (en) * | 1989-12-12 | 1998-03-03 | Epitope, Inc. | Reduced ethylene synthesis and delayed fruit ripening in transgenic tomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase |
| US5750864A (en) * | 1994-06-17 | 1998-05-12 | Epitope, Inc. | Regulated expression of heterologous genes in plants |
| ATE181964T1 (de) * | 1990-04-26 | 1999-07-15 | Calgene Llc | Methoden und reagentien um das ethylenniveau in pflanzen zu modulieren |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| US6207881B1 (en) * | 1990-09-10 | 2001-03-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Agriculture | Control of fruit ripening through genetic control of ACC synthase synthesis |
| BR9107191A (pt) * | 1990-12-26 | 1994-06-14 | Monsanto Co | Controle de amadurecimento de frutos e senescência em plantas |
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| NZ269640A (en) | 1993-07-01 | 1997-08-22 | California Inst Of Techn | Transformed plants containing modified ethylene response nucleic acid and coding sequences therefor |
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