JPH09276000A - 非ａ非ｂ非ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ヌクレオチド及びその検 出方法 - Google Patents
非ａ非ｂ非ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ヌクレオチド及びその検 出方法Info
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- JPH09276000A JPH09276000A JP8134117A JP13411796A JPH09276000A JP H09276000 A JPH09276000 A JP H09276000A JP 8134117 A JP8134117 A JP 8134117A JP 13411796 A JP13411796 A JP 13411796A JP H09276000 A JPH09276000 A JP H09276000A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィルスの検出
に有用な新規のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、ならびに、これらを用いる非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィ
ルスの検出方法に関する。 【構成】本発明は、日本人由来の非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウ
ィルスの全遺伝子配列を解明したことにもとづくもので
あって、配列番号１ないし４記載のポリヌクレオチドま
たはその部分配列、配列番号５ないし１５記載のオリゴ
ヌクレオチド、これらを用いた非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィ
ルスの検出方法、遺伝子型特異的遺伝子の検出方法に関
する。 【効果】本発明のヌクレオチドおよびこれを用いた検出
方法によって非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィルス、並びにその
遺伝子型特異的遺伝子を検出することができる。
に有用な新規のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、ならびに、これらを用いる非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィ
ルスの検出方法に関する。 【構成】本発明は、日本人由来の非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウ
ィルスの全遺伝子配列を解明したことにもとづくもので
あって、配列番号１ないし４記載のポリヌクレオチドま
たはその部分配列、配列番号５ないし１５記載のオリゴ
ヌクレオチド、これらを用いた非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィ
ルスの検出方法、遺伝子型特異的遺伝子の検出方法に関
する。 【効果】本発明のヌクレオチドおよびこれを用いた検出
方法によって非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウィルス、並びにその
遺伝子型特異的遺伝子を検出することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウ
イルス遺伝子に関する発明者の新たな知見にもとづいて
達成されたものであって、新規ポリヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチドの発明、ならびにこれらを使用したに非
Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウイルスを検出する方法に関する。
イルス遺伝子に関する発明者の新たな知見にもとづいて
達成されたものであって、新規ポリヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチドの発明、ならびにこれらを使用したに非
Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎ウイルスを検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９８８年、それまで不明であった血液
伝播性非Ａ非Ｂ（以下「ＮＡＮＢ」と略記する）型肝炎
の原因ウイルスとしてＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」と略記する）の一部遺伝子が解明されてＮＡＮＢ型
肝炎の研究に突破口が開かれた。その後ＨＣＶの全遺伝
子が解明され、各種診断法が開発されてからは疫学を含
めた臨床研究も進み、その結果、従来ＮＡＮＢ型肝炎と
診断されていた例の多くがＨＣＶ感染によるものである
ことが明らかになった。しかし同時にＨＣＶによらない
ＮＡＮＢ型肝炎（以下「ＮＡＮＢＮＣ型肝炎」と略記す
る）の存在も判明し、完全に血液伝播性肝炎を防止する
ためには原因ウイルスの更なる解明が望まれていた。１
９９５年、米国アボット社はＮＡＮＢＮＣ型肝炎の原因
ウイルス（以下「ＮＡＮＢＮＣＶ」と略記する）の一部
遺伝子を解明し、その後全遺伝子の配列を明らかにしＧ
Ｂウイルス（以下「ＧＢＶ」と略記する）と命名した。
ＧＢＶはその遺伝子配列の特徴からＨＣＶと同属のフラ
ビウイルス科に分類されると考えられる。現在までに遺
伝子配列が異なる３種類の株ＧＢＶ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの
存在が判明しているが、このうちヒトの肝炎との関連が
推定されるのはＧＢＶ−Ｃである。同年、米国ジーンラ
ブズテクノロジー社もＮＡＮＢＮＣＶ遺伝子を解明しＧ
型肝炎ウイルス（以下「ＨＧＶ」と略記する）と命名し
た。ＧＢＶ−ＣならびにＨＧＶの遺伝子配列の比較よ
り、両ウイルスは同種のウイルス（以下、両者を併せて
「ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ」と略記する）であると考えられ
ている。
伝播性非Ａ非Ｂ（以下「ＮＡＮＢ」と略記する）型肝炎
の原因ウイルスとしてＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」と略記する）の一部遺伝子が解明されてＮＡＮＢ型
肝炎の研究に突破口が開かれた。その後ＨＣＶの全遺伝
子が解明され、各種診断法が開発されてからは疫学を含
めた臨床研究も進み、その結果、従来ＮＡＮＢ型肝炎と
診断されていた例の多くがＨＣＶ感染によるものである
ことが明らかになった。しかし同時にＨＣＶによらない
ＮＡＮＢ型肝炎（以下「ＮＡＮＢＮＣ型肝炎」と略記す
る）の存在も判明し、完全に血液伝播性肝炎を防止する
ためには原因ウイルスの更なる解明が望まれていた。１
９９５年、米国アボット社はＮＡＮＢＮＣ型肝炎の原因
ウイルス（以下「ＮＡＮＢＮＣＶ」と略記する）の一部
遺伝子を解明し、その後全遺伝子の配列を明らかにしＧ
Ｂウイルス（以下「ＧＢＶ」と略記する）と命名した。
ＧＢＶはその遺伝子配列の特徴からＨＣＶと同属のフラ
ビウイルス科に分類されると考えられる。現在までに遺
伝子配列が異なる３種類の株ＧＢＶ−Ａ、−Ｂ、−Ｃの
存在が判明しているが、このうちヒトの肝炎との関連が
推定されるのはＧＢＶ−Ｃである。同年、米国ジーンラ
ブズテクノロジー社もＮＡＮＢＮＣＶ遺伝子を解明しＧ
型肝炎ウイルス（以下「ＨＧＶ」と略記する）と命名し
た。ＧＢＶ−ＣならびにＨＧＶの遺伝子配列の比較よ
り、両ウイルスは同種のウイルス（以下、両者を併せて
「ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ」と略記する）であると考えられ
ている。
【０００３】ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶはフラビウイルス科に
属するＲＮＡウイルスであることから、ＨＣＶと同様に
突然変異が多いと予想された。実際、フラビウイルス科
に属するＨＣＶでは極めて変異に富むことが示されてお
り、このことが特に診断法ならびに治療法の開発に大き
な障害となった。例えば、初期の限られた遺伝子配列の
知見に基づき開発された診断法では、異なる遺伝子特性
を有するＨＣＶ株に感染した例を検出できないことが明
らかになり、大きな障害となっている。また、ＨＣＶで
は地域遍在性を有する遺伝子型の存在も示されており、
地域毎の主要遺伝子型にあわせた診断法の確立が必要で
あることが示唆されている。また、抗ウイルス剤に対す
る感受性が遺伝子型により異なることも知られており、
遺伝子型特異的遺伝子の検出方法の開発が待望されてい
る。ウイルスの遺伝的多様性の有無の確認や遺伝子型の
存在の確認には、複数の同一種ウイルスについて、その
全遺伝子配列を決定し、これを相互比較することが重要
である。この研究を達成することにより初めて該ウイル
スに特異的で且つ保存性に富む領域を特定し、また各遺
伝子型に特異的な保存領域を特定することできる。この
様にして決定された領域が該ウイルスの検出法や治療法
の開発に、また遺伝子型の判定法や遺伝子型別治療法の
開発に応用できる。
属するＲＮＡウイルスであることから、ＨＣＶと同様に
突然変異が多いと予想された。実際、フラビウイルス科
に属するＨＣＶでは極めて変異に富むことが示されてお
り、このことが特に診断法ならびに治療法の開発に大き
な障害となった。例えば、初期の限られた遺伝子配列の
知見に基づき開発された診断法では、異なる遺伝子特性
を有するＨＣＶ株に感染した例を検出できないことが明
らかになり、大きな障害となっている。また、ＨＣＶで
は地域遍在性を有する遺伝子型の存在も示されており、
地域毎の主要遺伝子型にあわせた診断法の確立が必要で
あることが示唆されている。また、抗ウイルス剤に対す
る感受性が遺伝子型により異なることも知られており、
遺伝子型特異的遺伝子の検出方法の開発が待望されてい
る。ウイルスの遺伝的多様性の有無の確認や遺伝子型の
存在の確認には、複数の同一種ウイルスについて、その
全遺伝子配列を決定し、これを相互比較することが重要
である。この研究を達成することにより初めて該ウイル
スに特異的で且つ保存性に富む領域を特定し、また各遺
伝子型に特異的な保存領域を特定することできる。この
様にして決定された領域が該ウイルスの検出法や治療法
の開発に、また遺伝子型の判定法や遺伝子型別治療法の
開発に応用できる。
【０００４】しかし、現在までに全配列が解明されたＧ
ＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ株は米国と西アフリカに由来する３株
に過ぎず、日本人ＮＡＮＢＮＣＶ由来の遺伝子全配列に
関する知見はない。現在までに公表されている診断法は
上記の限られた遺伝子情報に基づき、同類異種のウイル
スとの遺伝子配列の比較から決定された領域を使用して
開発されている。その結果、診断法として特異性、感度
等の性能に問題があることが指摘されており、より多く
の遺伝子情報とこれに基づいた診断法の確立が望まれて
いた。また、わが国での遺伝子型の有無の確認とそれに
対応した診断法の確立が望まれていたが、未だ実現して
いない。
ＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ株は米国と西アフリカに由来する３株
に過ぎず、日本人ＮＡＮＢＮＣＶ由来の遺伝子全配列に
関する知見はない。現在までに公表されている診断法は
上記の限られた遺伝子情報に基づき、同類異種のウイル
スとの遺伝子配列の比較から決定された領域を使用して
開発されている。その結果、診断法として特異性、感度
等の性能に問題があることが指摘されており、より多く
の遺伝子情報とこれに基づいた診断法の確立が望まれて
いた。また、わが国での遺伝子型の有無の確認とそれに
対応した診断法の確立が望まれていたが、未だ実現して
いない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は日本人ＮＡＮ
ＢＮＣ型肝炎ウイルス感染例より分離したＧＢＶ−Ｃ／
ＨＧＶ株の全遺伝子配列を解明し、わが国における該ウ
ルイスの遺伝特性を解明し、さらに該ウイルスの塩基配
列の多様性を検討し該ウイルスに特異的且つ保存的な領
域を明らかにすることにより、従来の検査法に比べより
特異性・感度に優れ、また遺伝子型に特異的な遺伝子の
検出を可能とし、診断に利用可能なポリヌクレオチド、
オリゴヌクレオチドを提供することであり、さらにこれ
らを利用した診断法を提供するものである。
ＢＮＣ型肝炎ウイルス感染例より分離したＧＢＶ−Ｃ／
ＨＧＶ株の全遺伝子配列を解明し、わが国における該ウ
ルイスの遺伝特性を解明し、さらに該ウイルスの塩基配
列の多様性を検討し該ウイルスに特異的且つ保存的な領
域を明らかにすることにより、従来の検査法に比べより
特異性・感度に優れ、また遺伝子型に特異的な遺伝子の
検出を可能とし、診断に利用可能なポリヌクレオチド、
オリゴヌクレオチドを提供することであり、さらにこれ
らを利用した診断法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者はまず本発明者
らが開発し公開した（Ｌａｎｃｅｔ ３４６：１１３１
−２，１９９５）ＧＢＶ−Ｃ遺伝子検出法を用いてＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶに感染した日本人由来の血漿を選別し
た。 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性例２株をＧＴ２３０なら
びにＧＴ１１０と命名し、これらについて全遺伝子配列
を決定した。次に、上記２株の遺伝子配列について、前
記既知の３株の遺伝子配列との相同性を比較し、株間で
保存性に富むと考えられる領域を特定した。更に、株間
で相同性に富むと判断された領域について多数のＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿を対象に遺伝子配列を特定し、保
存性について検討を加え、保存領域を決定し本発明を完
成させた。
らが開発し公開した（Ｌａｎｃｅｔ ３４６：１１３１
−２，１９９５）ＧＢＶ−Ｃ遺伝子検出法を用いてＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶに感染した日本人由来の血漿を選別し
た。 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性例２株をＧＴ２３０なら
びにＧＴ１１０と命名し、これらについて全遺伝子配列
を決定した。次に、上記２株の遺伝子配列について、前
記既知の３株の遺伝子配列との相同性を比較し、株間で
保存性に富むと考えられる領域を特定した。更に、株間
で相同性に富むと判断された領域について多数のＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿を対象に遺伝子配列を特定し、保
存性について検討を加え、保存領域を決定し本発明を完
成させた。
【０００７】本発明は、前記ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ株ＧＴ
２３０ならびにＧＴ１１０の遺伝子配列に関する新たな
知見に基づいて特定した配列番号１ないし４記載のポリ
ヌクレオチド、これらのｃＤＮＡ、これらの部分配列を
構成するヌクレオチド、これらに相補的な配列を有する
ポリヌクレオチドに関するものである。また本発明はこ
れらＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶに特異的且つ保存的なオリゴヌ
クレオチド、該ウイルスの遺伝子型に特異的なオリゴヌ
クレオチドの発明である。さらにこれらのオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして利用し遺伝子増幅を行うこと
により該ウイルス遺伝子を検出する方法、ならびに同オ
リゴヌクレオチドをプローブとして使用することでサン
プル中の該ウイルス遺伝子を直接、あるいは増幅後の産
物として捕捉、検出する方法する。本発明は特に保存性
に優れた３’非翻訳領域（以下「３’ＵＴＲ」と略記す
る）を用いた上記遺伝子検出法に関するものである。
２３０ならびにＧＴ１１０の遺伝子配列に関する新たな
知見に基づいて特定した配列番号１ないし４記載のポリ
ヌクレオチド、これらのｃＤＮＡ、これらの部分配列を
構成するヌクレオチド、これらに相補的な配列を有する
ポリヌクレオチドに関するものである。また本発明はこ
れらＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶに特異的且つ保存的なオリゴヌ
クレオチド、該ウイルスの遺伝子型に特異的なオリゴヌ
クレオチドの発明である。さらにこれらのオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして利用し遺伝子増幅を行うこと
により該ウイルス遺伝子を検出する方法、ならびに同オ
リゴヌクレオチドをプローブとして使用することでサン
プル中の該ウイルス遺伝子を直接、あるいは増幅後の産
物として捕捉、検出する方法する。本発明は特に保存性
に優れた３’非翻訳領域（以下「３’ＵＴＲ」と略記す
る）を用いた上記遺伝子検出法に関するものである。
【０００８】本発明の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドならびにオリゴヌクレオチドについては、該領域に特
異的な配列を有する限りウイルスの変異に由来する少数
の置換を含むものであっても、本発明の範囲に含まれ
る。
ドならびにオリゴヌクレオチドについては、該領域に特
異的な配列を有する限りウイルスの変異に由来する少数
の置換を含むものであっても、本発明の範囲に含まれ
る。
【０００９】本発明においてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの検出
は、オリゴヌクレオチドプライマーのペアーを用いて該
ウイルス特異的な遺伝子領域を増幅することにより行う
ことができる。遺伝子増幅方法としては公知のポリメラ
ーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法のほか、リガー
ゼチェインリアクション（ＬＣＲ）法、３ＳＲ法などを
用いることができる。また増幅遺伝子の検出は電気泳動
による該当遺伝子バンドの有無の確認、あるいは増幅遺
伝子に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用い該増幅遺伝子を捕捉するとともに、標識
した検出プローブを用いるなど、適当な標識法を利用す
ることで視覚的あるいは化学的反応を用いて検出するこ
とができる。
は、オリゴヌクレオチドプライマーのペアーを用いて該
ウイルス特異的な遺伝子領域を増幅することにより行う
ことができる。遺伝子増幅方法としては公知のポリメラ
ーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法のほか、リガー
ゼチェインリアクション（ＬＣＲ）法、３ＳＲ法などを
用いることができる。また増幅遺伝子の検出は電気泳動
による該当遺伝子バンドの有無の確認、あるいは増幅遺
伝子に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用い該増幅遺伝子を捕捉するとともに、標識
した検出プローブを用いるなど、適当な標識法を利用す
ることで視覚的あるいは化学的反応を用いて検出するこ
とができる。
【００１０】
【作用】上記のように、本発明はＮＡＮＢＮＣ型肝炎の
原因ウイルスであるＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの遺伝子配列に
関する新たな知見にもとづくものであって、該肝炎ウイ
ルスの診断・治療に有用なポリヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチドを提供することができ、また従来法に比べ感
度・特異性に優れたウイルスならびに遺伝子型特異的遺
伝子の検出・診断を可能とする。これにより現時点では
何等の感染防止対策がなされていない該ウイルスについ
て効果的な診断・予防措置を講じることができる。本発
明のヌクレオチドは該肝炎ウイルスの検出に使用される
ほか、遺伝子組換えの技術により蛋白質またはペプタイ
ド発現に用いることができ、得られた蛋白質またはペプ
タイドをワクチン、抗体検出用試薬、ポリクローナルま
たはモノクローナル抗体作成の免疫源などに利用するこ
とができる。
原因ウイルスであるＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの遺伝子配列に
関する新たな知見にもとづくものであって、該肝炎ウイ
ルスの診断・治療に有用なポリヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチドを提供することができ、また従来法に比べ感
度・特異性に優れたウイルスならびに遺伝子型特異的遺
伝子の検出・診断を可能とする。これにより現時点では
何等の感染防止対策がなされていない該ウイルスについ
て効果的な診断・予防措置を講じることができる。本発
明のヌクレオチドは該肝炎ウイルスの検出に使用される
ほか、遺伝子組換えの技術により蛋白質またはペプタイ
ド発現に用いることができ、得られた蛋白質またはペプ
タイドをワクチン、抗体検出用試薬、ポリクローナルま
たはモノクローナル抗体作成の免疫源などに利用するこ
とができる。
【００１１】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１２】実施例１ 日本人由来ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ株の全遺伝子配列は次の
ようにして決定した。 （１）日本人由来ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ感染血漿の特定。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が異常高
値を示す複数の日本人由来血漿について、本発明者らが
既に前記報告をしたＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ非構造領域遺伝
子検出法を用いてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子の有無を検
索した。その結果２血漿についてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺
伝子が検出された。具体的には各血漿１０ｍｌより本発
明者ら報告の方法（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６
０：２１５−２２，１９９０）を用いてリボ核酸（ＲＮ
Ａ）を抽出した。次に吸引乾燥させたＲＮＡをＲＮＡフ
リーの蒸留水にて溶解し、７０℃で１分間変性した。こ
の変性ＲＮＡを鋳型としてＧＢＶ−Ｃのヘリカーゼ領域
と推定される遺伝子領域より選定されたオリゴヌクレオ
チドアンチセンスプライマーを用いｃＤＮＡを常法に従
って作成した。得られたｃＤＮＡを９４℃で１５分間加
熱し変性させ、更にＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ （宝酒造）とＴａｑＳｔａｒｔ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌ
ｆ．）を用いて常法に従いＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてヘリカーゼ
と考えられる領域の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は９
４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒からなるサイ
クルを３５回繰り返し実施し、最後のサイクルの７２℃
は８分間実施した。必要に応じて増幅産物の一部を取り
出し、もう一度上記条件にて再増幅を実施した。いずれ
かの増幅によりヘリカーゼ領域と思われる遺伝子が増幅
された例をＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿とした。
ようにして決定した。 （１）日本人由来ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ感染血漿の特定。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が異常高
値を示す複数の日本人由来血漿について、本発明者らが
既に前記報告をしたＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ非構造領域遺伝
子検出法を用いてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子の有無を検
索した。その結果２血漿についてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺
伝子が検出された。具体的には各血漿１０ｍｌより本発
明者ら報告の方法（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６
０：２１５−２２，１９９０）を用いてリボ核酸（ＲＮ
Ａ）を抽出した。次に吸引乾燥させたＲＮＡをＲＮＡフ
リーの蒸留水にて溶解し、７０℃で１分間変性した。こ
の変性ＲＮＡを鋳型としてＧＢＶ−Ｃのヘリカーゼ領域
と推定される遺伝子領域より選定されたオリゴヌクレオ
チドアンチセンスプライマーを用いｃＤＮＡを常法に従
って作成した。得られたｃＤＮＡを９４℃で１５分間加
熱し変性させ、更にＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ （宝酒造）とＴａｑＳｔａｒｔ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌ
ｆ．）を用いて常法に従いＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてヘリカーゼ
と考えられる領域の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は９
４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒からなるサイ
クルを３５回繰り返し実施し、最後のサイクルの７２℃
は８分間実施した。必要に応じて増幅産物の一部を取り
出し、もう一度上記条件にて再増幅を実施した。いずれ
かの増幅によりヘリカーゼ領域と思われる遺伝子が増幅
された例をＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿とした。
【００１３】（２）ＧＴ２３０ならびにＧＴ１１０の遺
伝子配列の決定。 上記の手順により２例のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿を
得、それぞれＧＴ２３０ならびにＧＴ１１０と命名し
た。ＧＴ２３０ならびにＧＴ１１０の遺伝子配列を以下
の様にして決定した。まずＧＴ２３０については上記Ｐ
ＣＲに使用したヘリカーゼ領域のプライマーを用いて増
幅した領域１１（図１）について増幅し遺伝子配列を決
定した。得られた遺伝子配列よりプライマーを設定し、
市販キット（Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い図１に黒塗り矢
印で示す領域７、９、１３のｃＤＮＡを増幅し遺伝子配
列を決定した。更に決定された領域７、９、１３の配列
内にプライマーを設定、上記と同様の作業を繰り返し図
１に黒塗り矢印で示す一層５’側である遺伝子領域であ
る領域４、６、ならびに３’側領域である領域１７、１
８、１９を増幅しその塩基配列を決定した。以下同様に
領域２ならびに２０を決定した。上流方向の遺伝子増幅
にはアンチセンスプライマーを、下流方向の遺伝子配列
の増幅にはセンスプライマーを使用した。遺伝子配列決
定の正確性を期するため、いずれの領域も異なる３クロ
ーンの配列決定の結果が一致することを判定基準とし
た。図１に示す白塗りバーはこの作業のために別途ＰＣ
Ｒを用い増幅し遺伝子配列を決定した領域３、５、８、
１０、１２、１４、１５、１６、２１を示す。上記領域
の遺伝子配列で重なりあう配列を求め、その配列を参考
に各領域の配列を連結した。ＧＴ１１０については、Ｇ
Ｔ２３０とＧＴ１１０により得られた遺伝子配列に基づ
きプライマーを設定し領域ｂからｏまでの配列を決定し
た。
伝子配列の決定。 上記の手順により２例のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿を
得、それぞれＧＴ２３０ならびにＧＴ１１０と命名し
た。ＧＴ２３０ならびにＧＴ１１０の遺伝子配列を以下
の様にして決定した。まずＧＴ２３０については上記Ｐ
ＣＲに使用したヘリカーゼ領域のプライマーを用いて増
幅した領域１１（図１）について増幅し遺伝子配列を決
定した。得られた遺伝子配列よりプライマーを設定し、
市販キット（Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い図１に黒塗り矢
印で示す領域７、９、１３のｃＤＮＡを増幅し遺伝子配
列を決定した。更に決定された領域７、９、１３の配列
内にプライマーを設定、上記と同様の作業を繰り返し図
１に黒塗り矢印で示す一層５’側である遺伝子領域であ
る領域４、６、ならびに３’側領域である領域１７、１
８、１９を増幅しその塩基配列を決定した。以下同様に
領域２ならびに２０を決定した。上流方向の遺伝子増幅
にはアンチセンスプライマーを、下流方向の遺伝子配列
の増幅にはセンスプライマーを使用した。遺伝子配列決
定の正確性を期するため、いずれの領域も異なる３クロ
ーンの配列決定の結果が一致することを判定基準とし
た。図１に示す白塗りバーはこの作業のために別途ＰＣ
Ｒを用い増幅し遺伝子配列を決定した領域３、５、８、
１０、１２、１４、１５、１６、２１を示す。上記領域
の遺伝子配列で重なりあう配列を求め、その配列を参考
に各領域の配列を連結した。ＧＴ１１０については、Ｇ
Ｔ２３０とＧＴ１１０により得られた遺伝子配列に基づ
きプライマーを設定し領域ｂからｏまでの配列を決定し
た。
【００１４】５’末端の配列（領域１ならびにａ）は次
の様にして決定した。ｃＤＮＡ配列３’末端にターミナ
ルデオキシヌクオチヂルトランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｄＴＴＰあるいはｄＴＴＰの
ホモポリマーを重合させた。得られた修飾ｃＤＮＡを鋳
型とし、１７個の連続するチミン配列あるいはアデニン
配列を含む４３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（＃１７
１、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴ
ＡＡＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−
３’；＃１６５、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣ
ＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡ−３’）およびＧＴ２３０、ＧＴ１１０に特異
的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、本発明者らにより既に報告されている方法（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ．１９９２．１８８：３３１−４１）に
より領域１ならびにａを増幅した。ＧＴ２３０ではポリ
（Ｔ）テールを有する２７クローンとポリ（Ａ）テール
を有する３４ローンを得たが、前者２７クローンのうち
２２クローンが最長の長さを示し且つ５’端が全て同一
の５’ＴＧＡＣＧＴＧＧＧＧの配列を有することからこ
れらクローンがＧＴ２３０の５’末端を含む遺伝子断片
であると判定した。ＧＴ１１０ではポリ（Ａ）テールを
含む３３クローンとポリ（Ｔ）テールを含む２２クロー
ンを得、後者の２２クローンのうち１８クローンが最長
の長さを示し且つ５’端配列が上記ＧＴ２３０の５’端
配列と同一配列であったことから、これらクローンがＧ
Ｔ１１０の５’末端を含む遺伝子断片と判定した。
の様にして決定した。ｃＤＮＡ配列３’末端にターミナ
ルデオキシヌクオチヂルトランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｄＴＴＰあるいはｄＴＴＰの
ホモポリマーを重合させた。得られた修飾ｃＤＮＡを鋳
型とし、１７個の連続するチミン配列あるいはアデニン
配列を含む４３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（＃１７
１、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴ
ＡＡＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−
３’；＃１６５、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣ
ＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡ−３’）およびＧＴ２３０、ＧＴ１１０に特異
的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用い、本発明者らにより既に報告されている方法（Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ．１９９２．１８８：３３１−４１）に
より領域１ならびにａを増幅した。ＧＴ２３０ではポリ
（Ｔ）テールを有する２７クローンとポリ（Ａ）テール
を有する３４ローンを得たが、前者２７クローンのうち
２２クローンが最長の長さを示し且つ５’端が全て同一
の５’ＴＧＡＣＧＴＧＧＧＧの配列を有することからこ
れらクローンがＧＴ２３０の５’末端を含む遺伝子断片
であると判定した。ＧＴ１１０ではポリ（Ａ）テールを
含む３３クローンとポリ（Ｔ）テールを含む２２クロー
ンを得、後者の２２クローンのうち１８クローンが最長
の長さを示し且つ５’端配列が上記ＧＴ２３０の５’端
配列と同一配列であったことから、これらクローンがＧ
Ｔ１１０の５’末端を含む遺伝子断片と判定した。
【００１５】３’末端の配列（領域２２とｂ）は次の様
にして決定した。まず３’末端にポリ（Ａ）あるいはポ
リ（Ｕ）が付加されていると仮定し、前述の＃１７１、
＃１６５オリゴヌクレオチドを用いたｃＤＮＡ合成を実
施したが該当遺伝子が得られなかったことから、抽出Ｒ
ＮＡの３’末端にポリ（Ａ）ポリメラーゼ（宝酒造）を
用いて人為的に３’末端にポリ（Ａ）を重合させた。次
に４３ｍｅｒの連続する１７個のチミンを含むオリゴヌ
クレオチド＃１７１をプラマーとして用い、通常の方法
に従い逆転写反応を実施し該当遺伝子のｃＤＮＡを得
た。得られたｃＤＮＡを鋳型に先の５’末端遺伝子配列
の決定と同様にｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ法によ
って３’末端遺伝子の配列を決定した。この作業により
ＧＴ２３０より得られた２０クローンとＧＴ１１０より
得られた１７クローンはいずれも同一の３’端配列、−
ＧＧＧＴＴＣＴＡＣＴ−３’を有することからこれらク
ローンが３’末端遺伝子領域のクローンであると判定し
た。得られた各末端遺伝子の増幅産物は常法に従い電気
泳動により分離精製し、本発明者らにより既に報告され
ている方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：３３１−４
１，１９９２）に従ってＭ１３ファージにクローン化し
た。各ｃＤＮＡクローンの塩基配列は正・負両鎖ともに
ＡＬＦ ＡｕｔｏＲｅａｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）
ならびにＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｔ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙ
ｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ，Ｂｕｃｋｉ
ｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて決定
した。
にして決定した。まず３’末端にポリ（Ａ）あるいはポ
リ（Ｕ）が付加されていると仮定し、前述の＃１７１、
＃１６５オリゴヌクレオチドを用いたｃＤＮＡ合成を実
施したが該当遺伝子が得られなかったことから、抽出Ｒ
ＮＡの３’末端にポリ（Ａ）ポリメラーゼ（宝酒造）を
用いて人為的に３’末端にポリ（Ａ）を重合させた。次
に４３ｍｅｒの連続する１７個のチミンを含むオリゴヌ
クレオチド＃１７１をプラマーとして用い、通常の方法
に従い逆転写反応を実施し該当遺伝子のｃＤＮＡを得
た。得られたｃＤＮＡを鋳型に先の５’末端遺伝子配列
の決定と同様にｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ法によ
って３’末端遺伝子の配列を決定した。この作業により
ＧＴ２３０より得られた２０クローンとＧＴ１１０より
得られた１７クローンはいずれも同一の３’端配列、−
ＧＧＧＴＴＣＴＡＣＴ−３’を有することからこれらク
ローンが３’末端遺伝子領域のクローンであると判定し
た。得られた各末端遺伝子の増幅産物は常法に従い電気
泳動により分離精製し、本発明者らにより既に報告され
ている方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：３３１−４
１，１９９２）に従ってＭ１３ファージにクローン化し
た。各ｃＤＮＡクローンの塩基配列は正・負両鎖ともに
ＡＬＦ ＡｕｔｏＲｅａｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）
ならびにＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｔ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙ
ｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ，Ｂｕｃｋｉ
ｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて決定
した。
【００１６】上記の方法により決定した各領域の塩基配
列についてコンセンサス配列を決定し、それぞれ重複す
る配列を連結してＧＴ１１０ならびにＧＴ２３０の全塩
基配列を決定した。ＧＴ２３０は５５１塩基長の５’Ｕ
ＴＲ（非翻訳領域）、３１３塩基長の３’ＵＴＲ、８５
２６塩基長のＯＲＦ（翻訳領域）からなる全長９３９０
塩基長の遺伝子配列を有していた。同様にＧＴ１１０は
２８１塩基長の５’ＵＴＲと３１５塩基長の３’ＵＴ
Ｒ、８７９９塩基長のＯＲＦからなる全長９３９５塩基
長の遺伝子配列を有していた。図１に示す様にＧＴ２３
０およびＧＴ１１０のＯＲＦは同一長のＥ１（１９０ａ
ａ）、Ｅ２（３８７ａａ）、ＮＳ２（２８１ａａ）、Ｎ
Ｓ３（６７７ａａ）、ＮＳ４（３１６ａａ）、ＮＳ５ａ
（４１４ａａ）、ＮＳ５ｂ（５６３ａａ）を含んでお
り、両株のＯＲＦの違いは５’端の配列の長さの差によ
るものであった。本発明により解明されたＧＴ２３０な
らびにＧＴ１１０とこれまでにほぼ全長の遺伝子配列が
解明されているｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ＧＢＶ−Ｃ（Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４８：６０−７，１９９６）なら
びにＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１およびＨＧＶ−ＪＣ（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７１：５０５−８，１９９６）を比較し
た。その結果、５つの株では５’末端側配列の４カ所に
開始点となる配列が存在することが分かった。またその
開始点の有無は株により異なっていることも示された
（図２）。一方、ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ＧＢＶ−Ｃでは
ＮＳ５ｂ領域に３ｎｔの挿入が認められるが、上記領域
に連続するＥ１領域の開始点は全株に共通であることも
判明した。このことから５’末端側の構造遺伝子が株に
より異なることが分かった。３’末端側の配列を比較す
るとＧＴ２３０、ＧＴ１１０ならびにＨＧＶ−ＰＮＦ２
１６１では３’ＵＴＲの長さ、および遺伝子配列共によ
く保存されることが示された（図３）。ＨＧＶ−ＪＣで
は遺伝子配列は保存されていたが、３’ＵＴＲの長さが
上記３株に比べ２１６塩基短いことが判明した（図
３）。また、ｐｒｏｔｏｔｙｐｅＧＢＶ−Ｃは３’ＵＴ
Ｒの長さが他に比べ極めて短く、また塩基配列も他と大
きく異なっていることが示された（図３）。
列についてコンセンサス配列を決定し、それぞれ重複す
る配列を連結してＧＴ１１０ならびにＧＴ２３０の全塩
基配列を決定した。ＧＴ２３０は５５１塩基長の５’Ｕ
ＴＲ（非翻訳領域）、３１３塩基長の３’ＵＴＲ、８５
２６塩基長のＯＲＦ（翻訳領域）からなる全長９３９０
塩基長の遺伝子配列を有していた。同様にＧＴ１１０は
２８１塩基長の５’ＵＴＲと３１５塩基長の３’ＵＴ
Ｒ、８７９９塩基長のＯＲＦからなる全長９３９５塩基
長の遺伝子配列を有していた。図１に示す様にＧＴ２３
０およびＧＴ１１０のＯＲＦは同一長のＥ１（１９０ａ
ａ）、Ｅ２（３８７ａａ）、ＮＳ２（２８１ａａ）、Ｎ
Ｓ３（６７７ａａ）、ＮＳ４（３１６ａａ）、ＮＳ５ａ
（４１４ａａ）、ＮＳ５ｂ（５６３ａａ）を含んでお
り、両株のＯＲＦの違いは５’端の配列の長さの差によ
るものであった。本発明により解明されたＧＴ２３０な
らびにＧＴ１１０とこれまでにほぼ全長の遺伝子配列が
解明されているｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ＧＢＶ−Ｃ（Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４８：６０−７，１９９６）なら
びにＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１およびＨＧＶ−ＪＣ（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７１：５０５−８，１９９６）を比較し
た。その結果、５つの株では５’末端側配列の４カ所に
開始点となる配列が存在することが分かった。またその
開始点の有無は株により異なっていることも示された
（図２）。一方、ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ ＧＢＶ−Ｃでは
ＮＳ５ｂ領域に３ｎｔの挿入が認められるが、上記領域
に連続するＥ１領域の開始点は全株に共通であることも
判明した。このことから５’末端側の構造遺伝子が株に
より異なることが分かった。３’末端側の配列を比較す
るとＧＴ２３０、ＧＴ１１０ならびにＨＧＶ−ＰＮＦ２
１６１では３’ＵＴＲの長さ、および遺伝子配列共によ
く保存されることが示された（図３）。ＨＧＶ−ＪＣで
は遺伝子配列は保存されていたが、３’ＵＴＲの長さが
上記３株に比べ２１６塩基短いことが判明した（図
３）。また、ｐｒｏｔｏｔｙｐｅＧＢＶ−Ｃは３’ＵＴ
Ｒの長さが他に比べ極めて短く、また塩基配列も他と大
きく異なっていることが示された（図３）。
【００１７】（４）ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ株との相同性 本発明により解明されたＧＴ２３０ならびにＧＴ１１０
の遺伝子配列（配列番号１、２）を公知のＧＢＶ−Ｃ／
ＨＧＶ株の遺伝子配列であるＧＢＶ−Ｃ（Ｊ．Ｍｅｄ．
Ｖｉｒｏｌ．４８：６０−７，１９９６）、ＨＧＶ−Ｐ
ＮＦ２１６１およびＨＧＶ−ＪＣ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７
１：５０５−８，１９９６）と、その相同性を比較検討
した（表１）。ＧＴ２３０とＧＴ１１０との遺伝子全域
での相同性は８７．７％であった。５株に共通する領域
別の相同性では、ＮＳ５ｂと５’ＵＴＲ／Ｃが高い相同
性をしめした（それぞれ９０．３％、８９．５％）。し
かし、推定３’端まで塩基配列が決定され、ほぼ同一長
の３’ＵＴＲ領域を有する３株（ＧＴ２３０、ＧＴ１１
０ならびにＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１）の比較では３’Ｕ
ＴＲ領域が最も高い相同性を示した（９７．１％、表
１）。
の遺伝子配列（配列番号１、２）を公知のＧＢＶ−Ｃ／
ＨＧＶ株の遺伝子配列であるＧＢＶ−Ｃ（Ｊ．Ｍｅｄ．
Ｖｉｒｏｌ．４８：６０−７，１９９６）、ＨＧＶ−Ｐ
ＮＦ２１６１およびＨＧＶ−ＪＣ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７
１：５０５−８，１９９６）と、その相同性を比較検討
した（表１）。ＧＴ２３０とＧＴ１１０との遺伝子全域
での相同性は８７．７％であった。５株に共通する領域
別の相同性では、ＮＳ５ｂと５’ＵＴＲ／Ｃが高い相同
性をしめした（それぞれ９０．３％、８９．５％）。し
かし、推定３’端まで塩基配列が決定され、ほぼ同一長
の３’ＵＴＲ領域を有する３株（ＧＴ２３０、ＧＴ１１
０ならびにＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１）の比較では３’Ｕ
ＴＲ領域が最も高い相同性を示した（９７．１％、表
１）。
【００１８】
【表１】
【００１９】実施例２ （５）ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型の検索 全塩基配列が決定された前記５株のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ
について、その遺伝子配列の相同性を基にｕｎｗｅｉｇ
ｈｔｅｄ ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐ法を用いて分子系統樹
を作製し、遺伝子型の存在を検索した。その結果ＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶは大きく３つの遺伝子型に分類されること
が判明した。ＧＢＶ−Ｃ（以下「Ｇ１」型という）、Ｇ
Ｔ１１０およびＨＧＶ−ＪＣ／ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１
（以下「Ｇ２」型という）、ＧＴ２３０（以下「Ｇ３」
型という）である。従ってＧＴ２３０株はこれまでに明
らかにされていない、全く新しい遺伝子型に属するＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶ株であると判断された。以下詳述する様
に遺伝子型別の各領域の遺伝子配列の比較より５’ＵＴ
Ｒ／Ｃ領域が最も遺伝子型特異的配列を有する領域であ
ることが示された。
について、その遺伝子配列の相同性を基にｕｎｗｅｉｇ
ｈｔｅｄ ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐ法を用いて分子系統樹
を作製し、遺伝子型の存在を検索した。その結果ＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶは大きく３つの遺伝子型に分類されること
が判明した。ＧＢＶ−Ｃ（以下「Ｇ１」型という）、Ｇ
Ｔ１１０およびＨＧＶ−ＪＣ／ＨＧＶ−ＰＮＦ２１６１
（以下「Ｇ２」型という）、ＧＴ２３０（以下「Ｇ３」
型という）である。従ってＧＴ２３０株はこれまでに明
らかにされていない、全く新しい遺伝子型に属するＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶ株であると判断された。以下詳述する様
に遺伝子型別の各領域の遺伝子配列の比較より５’ＵＴ
Ｒ／Ｃ領域が最も遺伝子型特異的配列を有する領域であ
ることが示された。
【００２０】実施例３ （６）５’ＵＴＲ領域の遺伝子配列を用いた遺伝子型判
別法 ウイルスの遺伝子型は本来は全遺伝子配列に基づいて決
定されるものであるが、遺伝子型を決定するために常に
全配列を決定することは、手間、費用等の問題から困難
である。この様な事情から全配列を決定しないでも可能
な、簡便な遺伝子型決定方法を考案した。本発明者は遺
伝子配列が決定されているＧＢＶ−Ｃ／ＨＣＶの５株の
各遺伝子領域についてｔｗｏ−ｂｙ−ｔｗｏ ｃｏｍｐ
ａｒｉｓｏｎを分離し、各遺伝子領域がどれほどの相同
性を有していれば各遺伝子型に対応するかを検討した。
その結果５’ＵＴＲのｎｔ６４からｎｔ３７９までの遺
伝子の配列が９５％以上の相同性を有する場合には、そ
の５’ＵＴＲ領域配列より判定された遺伝子型と全遺伝
子配列より判定された遺伝子型が一致することが判明し
た。このことから５’ＵＴＲ領域のｎｔ６４からｎｔ３
７９の配列を分析することで遺伝子型が判定できること
が判明した。
別法 ウイルスの遺伝子型は本来は全遺伝子配列に基づいて決
定されるものであるが、遺伝子型を決定するために常に
全配列を決定することは、手間、費用等の問題から困難
である。この様な事情から全配列を決定しないでも可能
な、簡便な遺伝子型決定方法を考案した。本発明者は遺
伝子配列が決定されているＧＢＶ−Ｃ／ＨＣＶの５株の
各遺伝子領域についてｔｗｏ−ｂｙ−ｔｗｏ ｃｏｍｐ
ａｒｉｓｏｎを分離し、各遺伝子領域がどれほどの相同
性を有していれば各遺伝子型に対応するかを検討した。
その結果５’ＵＴＲのｎｔ６４からｎｔ３７９までの遺
伝子の配列が９５％以上の相同性を有する場合には、そ
の５’ＵＴＲ領域配列より判定された遺伝子型と全遺伝
子配列より判定された遺伝子型が一致することが判明し
た。このことから５’ＵＴＲ領域のｎｔ６４からｎｔ３
７９の配列を分析することで遺伝子型が判定できること
が判明した。
【００２１】実施例４ （７）地域遍在性。日本、中国ならびにブラジル人より
分離されるＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶと同じくフラビウイルス科に属する
と見なされているＨＣＶでは約７０種類にも及ぶ多数の
遺伝子型が存在し且つ地域偏在性を示すことが知られて
いる。また、ＨＣＶ診断では地域ごとの遺伝子型につい
ての知見と、それにあった検出法の選択が重要であるこ
とが示されている。一方、本発明により上記の如くＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶにも３つの遺伝子型が存在し、その遺伝
子型は５’ＵＴＲの解析により簡便に判定できることが
判明した。本発明者はＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子のより
効果的な検出法の開発を目的として日本、中国、ブラジ
ルの検体について、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型を調べ
た。具体的には次のようにして調べた。ヘリカーゼ領域
のプライマーを用いたＰＣＲ法に基づく遺伝子検出法に
よりＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性と判定された５２例より血
清ないし血漿を得、それぞれより所定の方法を用いてＲ
ＮＡを抽出した。配列番号５記載のオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用い所定の方法にてｃＤＮＡを作成
した。得られたｃＤＮＡを９５℃で１５分間加熱し変性
させた後に配列番号５および６記載のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとするＰＣＲ法を用いて上記プライマー
に挟まれる５’ＵＴＲ領域の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ
条件は９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃９０秒から
なるサイクルを３５回繰り返し実施し、最後のサイクル
の７２℃は８分間実施した。更に増幅産物の１／１０を
取り配列番号５および７記載のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとする２段階目のＰＣＲを実施した。２段階目
のＰＣＲの増幅条件は第一回目の条件と同じである。得
られた増幅産物を常法に従い電気泳動により分離精製
し、本発明者らにより既に報告されている方法（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，１８８：３３１−４１，１９９２）に従っ
てＭ１３ファージベクターにクローン化した。各ｃＤＮ
Ａクローンの塩基配列は正・負両鎖ともにＡＬＦ Ａｕ
ｔｏＲｅａｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ならびにＴｈ
ｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓ
ｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて決定した（図
５）。その結果、全体では５２株中Ｇ１型が４例、Ｇ２
型が４例、Ｇ３型が４４例であった。地域的に見れば、
日本、中国にはＧ３型が多く見られ、アジア地域の特性
ではないかと思われる。ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶのＧ３型遺
伝子は本発明によって初めて知見され、公表されるもの
である（表２）。
分離されるＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶと同じくフラビウイルス科に属する
と見なされているＨＣＶでは約７０種類にも及ぶ多数の
遺伝子型が存在し且つ地域偏在性を示すことが知られて
いる。また、ＨＣＶ診断では地域ごとの遺伝子型につい
ての知見と、それにあった検出法の選択が重要であるこ
とが示されている。一方、本発明により上記の如くＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶにも３つの遺伝子型が存在し、その遺伝
子型は５’ＵＴＲの解析により簡便に判定できることが
判明した。本発明者はＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子のより
効果的な検出法の開発を目的として日本、中国、ブラジ
ルの検体について、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型を調べ
た。具体的には次のようにして調べた。ヘリカーゼ領域
のプライマーを用いたＰＣＲ法に基づく遺伝子検出法に
よりＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性と判定された５２例より血
清ないし血漿を得、それぞれより所定の方法を用いてＲ
ＮＡを抽出した。配列番号５記載のオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用い所定の方法にてｃＤＮＡを作成
した。得られたｃＤＮＡを９５℃で１５分間加熱し変性
させた後に配列番号５および６記載のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとするＰＣＲ法を用いて上記プライマー
に挟まれる５’ＵＴＲ領域の遺伝子を増幅した。ＰＣＲ
条件は９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃９０秒から
なるサイクルを３５回繰り返し実施し、最後のサイクル
の７２℃は８分間実施した。更に増幅産物の１／１０を
取り配列番号５および７記載のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとする２段階目のＰＣＲを実施した。２段階目
のＰＣＲの増幅条件は第一回目の条件と同じである。得
られた増幅産物を常法に従い電気泳動により分離精製
し、本発明者らにより既に報告されている方法（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，１８８：３３１−４１，１９９２）に従っ
てＭ１３ファージベクターにクローン化した。各ｃＤＮ
Ａクローンの塩基配列は正・負両鎖ともにＡＬＦ Ａｕ
ｔｏＲｅａｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ならびにＴｈ
ｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓ
ｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて決定した（図
５）。その結果、全体では５２株中Ｇ１型が４例、Ｇ２
型が４例、Ｇ３型が４４例であった。地域的に見れば、
日本、中国にはＧ３型が多く見られ、アジア地域の特性
ではないかと思われる。ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶのＧ３型遺
伝子は本発明によって初めて知見され、公表されるもの
である（表２）。
【００２２】
【表２】
【００２３】実施例５ （８）３’ＵＴＲ領域を用いたＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝
子検出法の確立 次に上記記載のように、最も保存性の高い領域であるこ
とが判明した３’ＵＴＲ領域を用いた遺伝子検出法を確
立した。３’ＵＴＲ領域についてＧ２／Ｇ３型共通で、
且つ遺伝子検出法に使用可能な長さを有する配列を検索
した。その結果配列番号８ないし１１記載のオリゴヌク
レオチドを選定した。次にＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性を含
む人血漿１００μｌより市販のキット（ＩＳＯＧＥＮ−
ＬＳ，ニッポンジーン）を使用してＲＮＡを抽出、その
後５．３μｌのジエチルピロカーボネイト（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）処理した蒸留水で溶解し
た。溶解ＲＮＡを７０℃で１分間加熱後、氷冷し、配列
番号８記載のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライ
マーとし、Ｍｏｌｏｎｙ ｎｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ，ＧＩＢＣＯ−ＧＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した所定の方法によりｃＤＮＡ
を合成した。反応条件は５０℃１時間である。得られた
ｃＤＮＡを９５℃で１５分間加熱し、その半分量を第一
段階目のＰＣＲに用いた。配列番号９記載のオリゴヌク
レオチドをセンスプライマーとして加え所定の方法（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ，）にてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃
３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒からなるサイクル
を３５回繰り返し実施し、最後のサイクルの７２℃は８
分間実施した。ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿では本増幅
により２５３塩基対長の遺伝子が増幅された。この反応
物の１／１０量を取り第二段階目のＰＣＲを実施した。
配列番号１０および１１記載のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとし第一段階目増幅と同一の条件にて反応させ
た。サイクル数のみ３０回に変更した。この増幅の結
果、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿のみ１６９塩基対長の
遺伝子が増幅された。このことから配列番号８ないし１
１記載のオリゴヌクレオチドはＧ１型、Ｇ２型、Ｇ３型
のいずれの遺伝子型のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子の増幅
にも有用であることが示された（表３、４）。
子検出法の確立 次に上記記載のように、最も保存性の高い領域であるこ
とが判明した３’ＵＴＲ領域を用いた遺伝子検出法を確
立した。３’ＵＴＲ領域についてＧ２／Ｇ３型共通で、
且つ遺伝子検出法に使用可能な長さを有する配列を検索
した。その結果配列番号８ないし１１記載のオリゴヌク
レオチドを選定した。次にＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性を含
む人血漿１００μｌより市販のキット（ＩＳＯＧＥＮ−
ＬＳ，ニッポンジーン）を使用してＲＮＡを抽出、その
後５．３μｌのジエチルピロカーボネイト（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）処理した蒸留水で溶解し
た。溶解ＲＮＡを７０℃で１分間加熱後、氷冷し、配列
番号８記載のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライ
マーとし、Ｍｏｌｏｎｙ ｎｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ，ＧＩＢＣＯ−ＧＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した所定の方法によりｃＤＮＡ
を合成した。反応条件は５０℃１時間である。得られた
ｃＤＮＡを９５℃で１５分間加熱し、その半分量を第一
段階目のＰＣＲに用いた。配列番号９記載のオリゴヌク
レオチドをセンスプライマーとして加え所定の方法（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ，）にてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃
３０秒、５５℃３０秒、７２℃６０秒からなるサイクル
を３５回繰り返し実施し、最後のサイクルの７２℃は８
分間実施した。ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿では本増幅
により２５３塩基対長の遺伝子が増幅された。この反応
物の１／１０量を取り第二段階目のＰＣＲを実施した。
配列番号１０および１１記載のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとし第一段階目増幅と同一の条件にて反応させ
た。サイクル数のみ３０回に変更した。この増幅の結
果、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿のみ１６９塩基対長の
遺伝子が増幅された。このことから配列番号８ないし１
１記載のオリゴヌクレオチドはＧ１型、Ｇ２型、Ｇ３型
のいずれの遺伝子型のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子の増幅
にも有用であることが示された（表３、４）。
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【００２６】実施例６ （９）５’ＵＴＲ領域を用いたＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝
子検出法の確立 本研究者らは上記記載の３’ＵＴＲ以外の領域でＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子検出に有用な各株に保存された遺伝
子配列領域がないかを検索した。その結果、５’ＵＴＲ
内に保存性の高い配列番号１２ないし１５記載の遺伝子
配列を見いだした。以下実際の検出方法を記載する。Ｇ
ＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性を含む人血漿１００μｌより市販
のキット（ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ，ニッポンジーン）を使
用してＲＮＡを抽出、その後５．３μｌのジエチルピロ
カーボネイト処理した蒸留水（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｓ，ＭＯ）で溶解した。溶解ＲＮＡを７０℃で１分間
加熱後、氷冷し、配列番号１２記載のオリゴヌクレオチ
ドをアンチセンスプライマーとＭｏｌｏｎｙ ｎｕｒｉ
ｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素
（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ，ＧＩＢＣＯ−ＧＲ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した所定
の方法によりｃＤＮＡを合成した。反応条件は４２℃１
時間である。得られたｃＤＮＡを９５℃で１５分間加熱
し、その半分量を第一段階目のＰＣＲに用いた。配列番
号１３記載のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーと
して加え所定の方法（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｍ
ｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，）にてＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲ条件は９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃
６０秒からなるサイクルを３５回繰り返し実施し、最後
のサイクルの７２℃は８分間実施した。ＧＢＶ−Ｃ／Ｈ
ＧＶ陽性血漿では本増幅により２４２塩基対長の遺伝子
が増幅した。この増幅遺伝子の１／１０量を取り第二段
階目のＰＣＲを実施した。配列番号１４（センスプライ
マー）および１５記載（アンチセンスプライマー）のオ
リゴヌクレオチドをプライマーとし第一段階目増幅と同
一の条件にて反応させた。サイクル数のみ２５回に変更
した。この増幅の結果ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿のみ
２０９塩基対の遺伝子が増幅された。このことから配列
番号１２ないし１５記載のオリゴヌクレオチドはＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子の増幅に有用であることが示された
（表３、４）。
子検出法の確立 本研究者らは上記記載の３’ＵＴＲ以外の領域でＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子検出に有用な各株に保存された遺伝
子配列領域がないかを検索した。その結果、５’ＵＴＲ
内に保存性の高い配列番号１２ないし１５記載の遺伝子
配列を見いだした。以下実際の検出方法を記載する。Ｇ
ＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性を含む人血漿１００μｌより市販
のキット（ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ，ニッポンジーン）を使
用してＲＮＡを抽出、その後５．３μｌのジエチルピロ
カーボネイト処理した蒸留水（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｓ，ＭＯ）で溶解した。溶解ＲＮＡを７０℃で１分間
加熱後、氷冷し、配列番号１２記載のオリゴヌクレオチ
ドをアンチセンスプライマーとＭｏｌｏｎｙ ｎｕｒｉ
ｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素
（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ，ＧＩＢＣＯ−ＧＲ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用した所定
の方法によりｃＤＮＡを合成した。反応条件は４２℃１
時間である。得られたｃＤＮＡを９５℃で１５分間加熱
し、その半分量を第一段階目のＰＣＲに用いた。配列番
号１３記載のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーと
して加え所定の方法（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｍ
ｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，）にてＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲ条件は９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃
６０秒からなるサイクルを３５回繰り返し実施し、最後
のサイクルの７２℃は８分間実施した。ＧＢＶ−Ｃ／Ｈ
ＧＶ陽性血漿では本増幅により２４２塩基対長の遺伝子
が増幅した。この増幅遺伝子の１／１０量を取り第二段
階目のＰＣＲを実施した。配列番号１４（センスプライ
マー）および１５記載（アンチセンスプライマー）のオ
リゴヌクレオチドをプライマーとし第一段階目増幅と同
一の条件にて反応させた。サイクル数のみ２５回に変更
した。この増幅の結果ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性血漿のみ
２０９塩基対の遺伝子が増幅された。このことから配列
番号１２ないし１５記載のオリゴヌクレオチドはＧＢＶ
−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子の増幅に有用であることが示された
（表３、４）。
【００２７】実施例７ （１０）３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲを対象としたＧＢ
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子検出法の各遺伝子型別検出特異性
・感度の検討 上記実施例にて確立した遺伝子検出法の各遺伝子型での
検出感度・特異性について検討した。実施例３記載の
５’ＵＴＲのｎｔ６４−３７９（ＧＴ１１０の５’端を
ｎｔ１とした場合の塩基位置）の配列を用いた遺伝子型
判定法によりＧ１，Ｇ２，Ｇ３型と判定された検体なら
びにＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陰性検体について実施例５なら
びに６記載の方法にしたがってＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝
子の有無を調べた（表３）。その結果、いずれの方法も
いずれの遺伝子型についても１００％の感度を有してい
た。本来該当遺伝子配列が存在しないＧ１型でも３’Ｕ
ＴＲ内プライマーを用いた検出系にてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧ
Ｖ遺伝子が検出されたことから、これらＧ１型例である
２検体（ブラジル由来）について３’ＵＴＲ領域の遺伝
子をクローニング・配列決定を行ったところＧ１型にも
Ｇ２型ならびにＧ３型と相同性の高い３’ＵＴＲが存在
していることが判明したことから、３’ＵＴＲを対象と
した遺伝子検出法も５’ＵＴＲを対象とした方法同様に
ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの全ての遺伝子型に適用できる遺伝
子検出法であることが判明した。
Ｖ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子検出法の各遺伝子型別検出特異性
・感度の検討 上記実施例にて確立した遺伝子検出法の各遺伝子型での
検出感度・特異性について検討した。実施例３記載の
５’ＵＴＲのｎｔ６４−３７９（ＧＴ１１０の５’端を
ｎｔ１とした場合の塩基位置）の配列を用いた遺伝子型
判定法によりＧ１，Ｇ２，Ｇ３型と判定された検体なら
びにＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陰性検体について実施例５なら
びに６記載の方法にしたがってＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝
子の有無を調べた（表３）。その結果、いずれの方法も
いずれの遺伝子型についても１００％の感度を有してい
た。本来該当遺伝子配列が存在しないＧ１型でも３’Ｕ
ＴＲ内プライマーを用いた検出系にてＧＢＶ−Ｃ／ＨＧ
Ｖ遺伝子が検出されたことから、これらＧ１型例である
２検体（ブラジル由来）について３’ＵＴＲ領域の遺伝
子をクローニング・配列決定を行ったところＧ１型にも
Ｇ２型ならびにＧ３型と相同性の高い３’ＵＴＲが存在
していることが判明したことから、３’ＵＴＲを対象と
した遺伝子検出法も５’ＵＴＲを対象とした方法同様に
ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの全ての遺伝子型に適用できる遺伝
子検出法であることが判明した。
【００２８】
【効果】本発明は日本人由来の複数のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧ
Ｖ株の全遺伝子配列を解明したことに基づくものであ
り、従来知られていなかったＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子
検出に有用なヌクレオチドを提供し、それらを用いた遺
伝子検出法、また遺伝子型特異的遺伝子検出法を開発し
たものである。本発明により提供されるヌクレオチドは
上記の検出法に供することができる。
Ｖ株の全遺伝子配列を解明したことに基づくものであ
り、従来知られていなかったＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子
検出に有用なヌクレオチドを提供し、それらを用いた遺
伝子検出法、また遺伝子型特異的遺伝子検出法を開発し
たものである。本発明により提供されるヌクレオチドは
上記の検出法に供することができる。
【００２９】
配列番号：１ 配列の長さ：９３９０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００３０】
配列番号：２ 配列の長さ：９３９５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【配列表】配列番号：３ 配列の長さ：９３９０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００３２】
配列番号：４ 配列の長さ：９３９５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００３３】
配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ９０）
【００３４】
配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ４３）
【００３５】
配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１３５）
【００３６】
配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１２９）
【００３７】
【配列表】 配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１３８）
【００３８】
配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮ
Ａ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１２７）
Ａ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１２７）
【００３９】
配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮ
Ａ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１２８）
Ａ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１２８）
【００４０】
配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ７５）
【００４１】
配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ５８）
【００４２】
配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１３４）
【００４３】
配列番号：１５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮ
Ａ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１３１）
Ａ 配列を決定した方法：Ｅ 配列（＃Ｇ１３１）
【図１】 ＧＴ１１０ならびにＧＴ２３０の遺伝子配列
決定に用いたクローンの全遺伝子配列中の位置と推定さ
れる遺伝子構成。
決定に用いたクローンの全遺伝子配列中の位置と推定さ
れる遺伝子構成。
【図２】 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ５株の５’端の遺伝子配
列の比較とプライマー位置
列の比較とプライマー位置
【図３】 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ５株の３’端の遺伝子配
列の比較とプライマー位置
列の比較とプライマー位置
【図４】 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ５株の遺伝子型
【図５】 ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ陽性例の５’ＵＴＲ領域
遺伝子配列。このうち、４７）はＨＧＶ−ＰＮＦ２１６
１株、４８）はＨＧＶ−ＪＣ株、５３）はＧＢＶ−Ｃ
株。その他の５２株は本発明において初めて決定された
配列であり、１）〜３２）、４５）、４６）、５１）、
５２）は日本由来の検体から分離した株、３３）〜４
３）、５０）は中国由来の検体から分離した株、４
４）、４９）、５４）、５５）はブラジル由来の検体か
ら分離した株である。このうち１）はＧＴ２３０株、４
５）がＧＴ１１０株。
遺伝子配列。このうち、４７）はＨＧＶ−ＰＮＦ２１６
１株、４８）はＨＧＶ−ＪＣ株、５３）はＧＢＶ−Ｃ
株。その他の５２株は本発明において初めて決定された
配列であり、１）〜３２）、４５）、４６）、５１）、
５２）は日本由来の検体から分離した株、３３）〜４
３）、５０）は中国由来の検体から分離した株、４
４）、４９）、５４）、５５）はブラジル由来の検体か
ら分離した株である。このうち１）はＧＴ２３０株、４
５）がＧＴ１１０株。
Claims (36)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドまたはその部分配列。 - 【請求項２】配列番号２記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドまたはその部分配列。 - 【請求項３】請求項１または２記載のポリヌクレオチド
と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。 - 【請求項４】配列番号３記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドまたはその部分配列。 - 【請求項５】配列番号４記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドまたはその部分配列。 - 【請求項６】請求項３または４記載のポリヌクレオチド
と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。 - 【請求項７】請求項１ないし６記載のポリヌクレオチド
中、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの３′非翻訳領域に属し、保存
性の高い２０個以上のヌクレオチドから成るオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項８】請求項１ないし６記載のポリヌクレオチド
中、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの５′非翻訳領域に属し、保存
性の高い２０個以上のヌクレオチドから成るオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項９】請求項１ないし６記載のポリヌクレオチド
中、ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの非構造蛋白５ｂ領域に属し、
保存性の高い２０個以上のヌクレオチドから成るオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項１０】配列番号５記載のオリゴヌクレオチド＃
Ｇ９０ - 【請求項１１】配列番号６記載のオリゴヌクレオチド＃
Ｇ４３ - 【請求項１２】配列番号７記載のオリゴヌクレオチド＃
Ｇ１３５ - 【請求項１３】配列番号８記載のオリゴヌクレオチド＃
Ｇ１２９ - 【請求項１４】配列番号９記載のオリゴヌクレオチド＃
Ｇ１３８ - 【請求項１５】配列番号１０記載のオリゴヌクレオチド
＃Ｇ１２７ - 【請求項１６】配列番号１１記載のオリゴヌクレオチド
＃Ｇ１２８ - 【請求項１７】配列番号１２記載のオリゴヌクレオチド
＃Ｇ７５ - 【請求項１８】配列番号１３記載のオリゴヌクレオチド
＃Ｇ５８ - 【請求項１９】配列番号１４記載のオリゴヌクレオチド
＃Ｇ１３４ - 【請求項２０】配列番号１５記載のオリゴヌクレオチド
＃Ｇ１３１ - 【請求項２１】配列番号５ないし１５記載のオリゴヌク
レオチドのいずれかに相補的な配列を有するオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項２２】請求項７ないし９記載のオリゴヌクレオ
チドのいずれかを使用するＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子検
出方法 - 【請求項２３】配列番号５および６記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用する遺伝子増幅法による
請求項２２記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項２４】配列番号５ないし７記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用する遺伝子増幅法による
請求項２４記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項２５】配列番号８および９記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして遺伝子増幅法による請求項２
２記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項２６】配列番号８ないし１１記載のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして使用する遺伝子増幅法によ
る請求項２２記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項２７】配列番号１２および１３記載のオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして使用する遺伝子増幅法に
よる請求項２２記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項２８】配列番号１２ないし１５記載のオリゴヌ
クレオチドをプライマーとして使用する遺伝子増幅法に
よる請求項２２記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項２９】ＰＣＲ法により遺伝子を増幅する請求項
２２ないし２８記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項３０】請求項７ないし２１記載のオリゴヌクレ
オチドを捕捉プローブとして使用する請求項２２ないし
２８記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項３１】請求項７ないし２１記載のオリゴヌクレ
オチドを検出用プローブとして使用する請求項２２ない
し２８記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項３２】標識された請求項７ないし２１記載のオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項３３】請求項３２記載のオリゴヌクレオチドを
使用する請求項２２ないし３１記載の遺伝子検出方法。 - 【請求項３４】ＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶの遺伝子型に特異的
な配列を有する５′非翻訳領域に属するオリゴヌクレオ
チドを使用するＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型特異的遺伝
子検出方法。 - 【請求項３５】オリゴヌクレオチドをプライマーとして
使用する遺伝子増幅法による請求項３４記載のＧＢＶ−
Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型特異的遺伝子検出方法。 - 【請求項３６】ＰＣＲ法により遺伝子を増幅する請求項
３５記載のＧＢＶ−Ｃ／ＨＧＶ遺伝子型特異的遺伝子検
出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8134117A JPH09276000A (ja) | 1996-04-18 | 1996-04-18 | 非ａ非ｂ非ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ヌクレオチド及びその検 出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8134117A JPH09276000A (ja) | 1996-04-18 | 1996-04-18 | 非ａ非ｂ非ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ヌクレオチド及びその検 出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09276000A true JPH09276000A (ja) | 1997-10-28 |
Family
ID=15120867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8134117A Pending JPH09276000A (ja) | 1996-04-18 | 1996-04-18 | 非ａ非ｂ非ｃ型肝炎ウィルス遺伝子ヌクレオチド及びその検 出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09276000A (ja) |
-
1996
- 1996-04-18 JP JP8134117A patent/JPH09276000A/ja active Pending
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