JPH0928386A - 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法 - Google Patents

非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法

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JPH0928386A
JPH0928386A JP7341574A JP34157495A JPH0928386A JP H0928386 A JPH0928386 A JP H0928386A JP 7341574 A JP7341574 A JP 7341574A JP 34157495 A JP34157495 A JP 34157495A JP H0928386 A JPH0928386 A JP H0928386A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＧＢ型肝炎ウイルス（ＨＧＢＶ）の診断、治
療及びＨＧＢＶに特異的に結合する抗体の取得等に有用
な、ＨＧＢＶのゲノムに選択的にハイブリダイズする精
製ポリヌクレオチドを提供する。 【解決手段】 配列番号１の位置１〜８８のＨＧＢＶ−
Ｃのゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイズ
し得る、ＨＧＢＶから誘導された精製ポリヌクレオチド
またはそのフラグメント、及び該ポリヌクレオチドまた
はそのフラグメントからなるポリヌクレオチドプロー
ブ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトにおいて肝炎
を惹起する一群の感染性ウイルス性物質、特にかかるウ
イルス群から誘導されるポリヌクレオチド、それらにコ
ードされるポリペプチド、かかるポリペプチドに特異的
に結合する抗体、並びに、かかる材料を使用する診断薬
及びワクチンに係わる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】肝炎
は、血液製剤の輸血、臓器移植及び血液透析によってド
ナーからレシピエントに感染される最も重要な疾患の１
つである。また肝炎は、汚染された食物及び水の摂取
や、人同士の接触によっても感染し得る。ウイルス性肝
炎は固有のウイルス遺伝子及び複製モードを有する一群
のウイルス性物質を含み、種々の感染経路で肝損傷の程
度は様々であるが、肝炎を惹起することが知られてい
る。急性ウイルス性肝炎は、黄疸、肝圧痛及び、アスパ
ラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントラ
ンスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びイソクエン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＩＳＤ）のごとき肝トランスアミナーゼレベル
の上昇を含む特定の患者症状によって臨床診断される場
合もあるが、臨床的に顕在化しないこともあり得る。ウ
イルス性肝炎物質としては、肝炎Ａ型ウイルス（ＨＡ
Ｖ）、肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｃ型ウイルス
（ＨＣＶ）、肝炎δ型ウイルス（ＨＤＶ）、肝炎Ｅ型ウ
イルス（ＨＥＶ）、エプスタイン−バールウイルス（Ｅ
ＢＶ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げら
れる。
【０００３】１９６０年代後期に使用可能となった、献
血血液をＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の存在について
スクリーニングする特異的血清アッセイは、血液レシピ
エントの輸血後肝炎（ＰＴＨ）の発生を低減させること
において良い結果を与えてはいるが、ＰＴＨは相変わら
ず有意な率で発生している。Ｈ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ａ
ｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．７７：６９１−６９９（１９７
２）；Ｈ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：８
３８−８４１（１９７５）。研究者らは、これまでヒト
において肝炎を惹起することが知られているウイルス
（ＨＡＶ、ＨＢＡ、ＣＭＶ及びＥＢＶ）への暴露と関係
なくウイルス性肝炎を惹起する、「非Ａ非Ｂ型肝炎」
（ＮＡＮＢＨ）と名付けられた新規の物質を探し始め
た。例えばＳ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９２：７６７−７７０（１９７
５）；編者無記名，Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：６４−６５
（１９７５）；Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓのＦ．Ｂ．Ｈｏｌ
ｌｉｎｇｅｒ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅら，Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ
ｐ２２３９−２２７３（１９９０）参照。
【０００４】静脈内薬物使用者における急性ＮＡＮＢＨ
の多発性発症；輸血後ＮＡＮＢＨを獲得した患者の固有
の感染後潜伏期間；チンパンジー交差攻撃（ｃｒｏｓｓ
−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）実験の結果；感染チンパンジー
の超微細構造肝病理分析；及び疑似患者のクロロホルム
に対する抵抗性の差など、幾つかの疫学的及び実験的な
証拠により１種以上の非経口感染ＮＡＮＢ物質の存在が
示されている。Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒ
ｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８５：４３９−４６２（１９
８３）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｙ ８５，７４３−７６８（１９８
３）；Ｆ．Ｂ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｄｉｓ．１４２：４００−４０７（１９８０）；
Ｆ．ＣｈｉｓａｒｉのＤ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙ編，Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ｍａｓｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６
８−２８０（１９８４）；及び、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅ
ｙら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４８：２５４−２
６５（１９８３）。
【０００５】急性肝炎を発症した外科医から得た血清試
料は、タマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）に
接種すると肝炎を誘発することが示された。４匹のタマ
リンのうち４匹ともが接種後数週間以内に肝酵素の上昇
を生じ、これから、該外科医の血清中の物質がタマリン
に肝炎を誘発した可能性があることが判る。種々の非ヒ
ト霊長目動物において順次継代されることにより、この
肝炎は感染性物質によって惹起されることが判り、濾過
実験からはこの物質がウイルス性であることが示され
た。上記外科医及びタマリンにおいて肝炎の原因となっ
た感染性物質は「ＧＢ物質（ＧＢ ａｇｅｎｔ）」と名
付けられた。Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｅｘｐｅ
ｒ．Ｍｅｄ．１２５：６７３−６８８（１９６７）；
Ｆ．Ｄｉｅｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅ
ｄ．，前出；Ｅ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏ
ｌ．５：１０３−１０８（１９８０）；Ｒ．Ｏ．Ｗｈｉ
ｔｔｉｎｇｔｏｎら，Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ Ｎｏｎｈ
ｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２２１−２２
４（１９８３）。
【０００６】ＧＢ物質はヒトにおいてＮＡＮＢＨを惹起
する物質であり得ること、及びＧＢ物質は種々の実験室
で研究された既知のＮＡＮＢＨ物質とは関連のないこと
が示されているが、ＧＢ物質に関する決定的な、また最
終的な研究は知られておらず、ウイルス性物質は発見さ
れていないし、分子学的に特性分析されてもいない。
Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃ
ｉ．２７０：７３−８０（１９７５）；及びＪ．Ｌ．Ｄ
ｉｅｎｓｔａｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２６４：２６０−２
６１（１９７６）。更にＥ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｍｅ
ｄ．Ｖｉｒｏｌ．，前出；Ｅ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４０：７９４−７９７（１９７
９）；Ｒ．Ｏ．Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら，前出；及び
Ｐ．Ｋａｒａｙｉａｎｎｉｓら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ
９：１８６−１９２（１９８９）参照。
【０００７】初期の研究では、ＧＢ物質はいかなる既知
のヒト肝炎ウイルスとも無関係であるとされていた。
Ｓ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １８
２：１０２６−１０２８（１９７３）；Ｐ．Ｊ．Ｐｒｏ
ｖｏｓｔら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍ
ｅｄ．１４８；５３２−５３９（１９７５）；Ｊ．Ｌ．
Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ １８：
１０５−１０６（１９８２）；Ａ．Ｗ．Ｈｏｌｍｅｓ
ら，Ｎａｔｕｒｅ ２４３：４１９−４２０（１９７
３）；及び、Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｓｃｉ．，前出。しかしながら、ＧＢ物質がヒト
において肝炎感染を誘発するウイルスであるのか、また
はＧＢ血清によって活性化され、一旦活性化されると他
のタマリンに容易に継代してそれらに肝炎を誘発する潜
在的タマリンウイルスであるのかが問題とされた。ま
た、ＧＢ陽性血清を接種されたマーモセットの極一部は
臨床上肝炎を発症せず（５２匹のうち４匹，７．６
％）、かかる動物は自然免疫を有していた可能性があ
り、従ってＧＢ物質はマーモセットウイルスであり得る
ことも示された。Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｄｉｓ．１２０：５３９−５４７（１９６９）；
Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１
２０：５４８−５５９（１９６９）。形態的研究は不明
瞭であり、ある報告書の免疫電子顕微鏡調査では、ＧＢ
物質は、パルボウイルスの球構造と類似の、寸法分布が
２０〜２２ｎｍの免疫複合体を形成していると示されて
いるが、他の研究では、ＧＢ陽性タマリンの肝ホモジネ
ートから得られた免疫電子顕微鏡データから正二十面体
対称構造の３４〜３６ｎｍの凝集体（ａｇｇｒｅｇａｒ
ｅｓ）が検出され、ＧＢ物質はカリチ様ウイルスである
と報告されている。例えばＪ．Ｄ．Ａｌｍｅｉｄａら，
Ｎａｔｕｒｅ ２６１：６０８−６０９（１９７６）；
Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇら，Ｎａｔｕｒｅ，前出参
照。
【０００８】主に非経口感染によって生じるＨＣＶと、
腸内感染するＨＥＶとの２種類の肝炎を惹起するウイル
スが最近になって発見され報告された。例えば、Ｑ．
Ｌ．Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９−３
６２（１９８９），Ｇ．Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４：３６２−３６４（１９８９），欧州特許出願公開
第０３１８２１６号明細書（１９８９年３月３１日公
開），Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７：１３３５−１３３９（１９９０）参照。ＨＣＶは、
ＮＡＮＢＨ物質が原因とみられるＰＴＨの大部分及び輸
血によるものでない急性ＮＡＮＢＨの多くに関与してい
る。編者無記名，Ｌａｎｃｅｔ ３３５：１４３１−１
４３２（１９９０）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａ
ｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９９：１１７７−１１
８０（１９９０）；及び、Ｍ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，ＪＡ
ＭＡ ２６４：２２３１−２２３５（１９９０）。
【０００９】ドナー試料中のＨＣＶ抗体を検出すること
により、血液供給系におけるＮＡＮＢＨ感染血液の７０
〜８０％が除外されるが、ＨＣＶの発見及び検出によっ
て肝炎感染が完全に予防されているわけではない。Ｈ．
Ａｌｔｅｒら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
１４９４−１５００（１９８９）。最近の文献で、別の
肝炎物質がＰＴＨ、並びにＰＴＨと関連のない集団獲得
急性及び／または慢性肝炎の原因であり得るかどうかが
問題とされた。例えば、１９８８〜１９９０年にフラン
スで行われた予測臨床標本調査においてモニターとなっ
た１８１人の患者のうち、調査人は全部で１８のＰＴＨ
症例を記載している。これら１８人の患者のうちの１３
人は、抗ＨＣＶ抗体、ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ及びＨＣＶ核
酸について陰性であった。筆者らにはＰＴＨを惹起する
非Ａ非Ｂ非Ｃ型物質の潜在的な重要性が推量された。
Ｖ．Ｔｈｉｅｒｓら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １
８：３４−３９（１９９３）。１９８５〜１９８８年に
ドイツで行われた別の調査でモニターとなった１，４７
６人の患者のうち、記録された２２のＰＴＨ症例はＨＢ
ＶまたはＨＣＶ感染とは関係なかった。Ｔ．Ｐｅｔｅｒ
ｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３９：１３９−１４５
（１９９３）。
【００１０】肝炎を惹起する新規の固有のウイルス群か
ら誘導される物質、例えばポリヌクレオチド、そこにコ
ードされている組換え及び合成ポリペプチド、かかるポ
リペプチドに特異的に結合する抗体、並びにかかる物質
を使用する診断薬及びワクチンを同定及び提供すること
は有利となろう。このような物質により、急性及び／ま
たは慢性ウイルス性肝炎をより正確に診断する医療機関
の能力が著しく向上し、提供された血液及び臓器におい
て非Ａ、非Ｂ及び非Ｃ型肝炎を検出することにより、よ
り安全な血液及び臓器を供給し得るであろう。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、肝炎ＧＢウイ
ルス（ＨＧＢＶ）のゲノムまたはその相補体に選択的に
ハイブリダイズし得るＨＧＢＶから誘導された精製ポリ
ヌクレオチドまたはそのフラグメントであって、ＨＧＢ
Ｖ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から
選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率
（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、より好ましくは４０％の一致
率、更に好ましくは６０％の一致率、最も好ましくは８
０％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテイ
ンをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲ
ノムを特徴とする精製ポリヌクレオチドまたはそのフラ
グメントを提供する。更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢ
Ｖ）のゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイ
ズし得るＨＧＢＶから誘導される組換えポリヌクレオチ
ドまたはそのフラグメントも提供されるが、ここで、前
記ヌクレオチドはＨＧＢＶの少なくとも１つのエピトー
プをコードする配列を含んでおり、前記組換えヌクレオ
チドは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃ
からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３
５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテイ
ンをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲ
ノムを特徴とする。かかる組換えポリヌクレオチドは組
換えベクター内に含まれ、更に前記ベクターを用いて形
質転換された宿主細胞を構成する。
【００１２】本発明は更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢ
Ｖ）ゲノムから誘導されるヌクレオチド配列を含むＨＧ
ＢＶ組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメントで
あって、組換えベクター内に含まれ、更に前記ベクター
を用いて形質転換された宿主細胞を構成し、前記配列が
ＨＧＢＶのエピトープをコードするＨＧＢＶ組換えポリ
ヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。ＨＧ
ＢＶ組換えポリヌクレオチドは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢ
Ｖ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸
配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲ
Ｆ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。
【００１３】更に、固相及び／またはプローブを使用す
るＨＧＢＶ核酸検出用のアッセイキット及び方法も提供
される。更には、ワクチン、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢ
Ｖ）に感染させた組織培養増殖細胞、免疫応答を生じる
のに十分な量の少なくとも１つのＨＧＢＶエピトープを
含む単離免疫原性ポリヌクレオチドまたはそのフラグメ
ントを個体に投与することからなる、肝炎ＧＢウイルス
（ＨＧＢＶ）に対する抗体を産生させる方法も提供され
る。また、ポリヌクレオチドを含む診断試薬も提供され
る。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、新たに確認された病因
物質である非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、及び非Ｅ型肝炎を
惹起する物質、総称して「肝炎ＧＢウイルス」または
「ＨＧＢＶ」の特性分析法を提供する。本発明は、ＨＧ
ＢＶ病因物質の存在を判定する方法、ＨＧＢＶに感染し
たヒトまたはタマリンの個体由来の感染血清、血漿また
は肝ホモジネートから生成された病因物質の核酸を得、
これまでに単離されていないウイルス性物質のゲノムか
ら新たに合成される抗原を検出し、非感染個体と比較し
て感染個体のみに認められる生成物を産生したクローン
を選択する方法を提供する。
【００１５】ＨＧＢＶから誘導される核酸配列の部分
は、検査試料中のＨＧＢＶの存在を判定するため、及び
天然変種を単離するためのプローブとして有用である。
かかる配列により、ＨＧＢＶゲノム内にコードされてい
るＨＧＢＶ抗原のポリペプチド配列を得ることもできる
し、診断試験の標準または試薬として及び／またはワク
チンの成分として有用なポリペプチドを製造することも
できる。かかるポリペプチド配列内に含まれる少なくと
も１つのエピトープに対するモノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体もまた、診断試験及び治療薬に、抗ウ
イルス性物質のスクリーニングに、かかる核酸配列が誘
導されるＨＧＢＶ物質の単離に有用である。ＨＧＢＶゲ
ノムのその他の部分の単離及び配列決定も、かかる核酸
配列から誘導されるプローブまたはＰＣＲプライマーを
使用することにより行うことができ、従って、ＨＧＢＶ
の診断及び／または治療において予防薬及び治療薬とし
て有用となろうＨＧＢＶの別のプローブ及びポリペプチ
ドを製造することができる。
【００１６】本発明の１つの態様によれば、精製ＨＧＢ
Ｖポリヌクレオチド、組換えＨＧＢＶポリヌクレオチ
ド、ＨＧＢＶゲノムから誘導された配列を含む組換えポ
リヌクレオチド、ＨＧＢＶのエピトープをコードする組
換えポリペプチド、ＨＧＢＶのエピトープをコードする
合成ペプチド、上記組換えポリペプチドのいずれかを含
む組換えベクター、及び、かかるベクターを用いて形質
転換された宿主細胞が提供される。これらの組換えポリ
ペプチド及び合成ペプチドは単独でも組合せても使用す
ることができるし、或いは、ＨＧＢＶのエピトープを与
える他の物質と一緒に使用することもできる。
【００１７】本発明の別の態様においては、精製ＨＧＢ
Ｖ、精製ＨＧＢＶ由来のポリペプチドの調製物、精製Ｈ
ＧＢＶポリペプチド、ＨＧＢＶに含まれるエピトープと
免疫学的に同一であるエピトープを含む精製ポリペプチ
ドが提供される。
【００１８】本発明の更に別の態様においては、所望の
宿主と適合性である制御配列に操作可能に連結されてい
る、ＨＧＢＶゲノムまたはＨＧＢＶ ｃＤＮＡから誘導
されたＤＮＡの読取り枠（ＯＲＦ）を含む組換え発現
系、該組換え発現系を用いて形質転換された細胞、及
び、該形質転換細胞によって産生されたポリペプチドが
提供される。
【００１９】本発明の別の態様は、少なくとも１つの組
換えＨＧＢＶポリペプチド、ＨＧＢＶゲノムまたはＨＧ
ＢＶ ｃＤＮＡから誘導された配列を含む少なくとも１
つの組換えポリペプチド、ＨＧＢＶエピトープを含む少
なくとも１つの組換えポリペプチド、ＨＧＢＶポリペプ
チドを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。
【００２０】更に本発明は、ＨＧＢＶの少なくとも１つ
のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を
製造する方法、少なくとも１つのＨＧＢＶエピトープに
特異的に結合するポリクローナル抗体の精製調製物、並
びに、診断、予防及び治療用途を含む、かかる抗体を使
用する方法を提供する。
【００２１】本発明の更に別の態様においては、真核性
宿主中で産生されたときに粒子を形成し得るアミノ酸配
列を有する非ＨＧＢＶポリペプチドと、ＨＧＢＶエピト
ープとを含む、ＨＧＢＶ感染に対して免疫原性の粒子が
提供される。
【００２２】更に、ＨＧＢＶに対するポリヌクレオチド
プローブも提供される。
【００２３】本発明は、適当な容器に入った、ＨＧＢＶ
から誘導されたポリヌクレオチドの存在及び／または量
を検出するために使用し得る試薬であって、約８個また
はそれ以上のヌクレオチドからなるＨＧＢＶ由来のヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを含む試
薬；適当な容器に入った、ＨＧＢＶ抗原の存在及び／ま
たは量を検出するための試薬であって、検出すべきＨＧ
ＢＶ抗原に対する抗体を含む試薬；及び、適当な容器に
入った、ＨＧＢＶ抗原に対する抗体の存在及び／または
量を検出するための試薬であって、ＨＧＢＶ抗原中に存
在するＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドを含む試
薬を含むキットを提供する。種々のアッセイ形式のため
の他のキットも本明細書に記載の本発明によって提供さ
れる。
【００２４】本発明の他の態様として、固相に付着され
た少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを含むポリペプ
チドと、固相に付着されたＨＧＢＶエピトープに対する
抗体とが挙げられる。更に、ＨＧＢＶエピトープを含む
ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターを用
いて形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチドの発現
が可能となる条件下でインキュベートすることからな
る、ＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドを製造する
方法と、該方法によって製造されたＨＧＢＶエピトープ
を含むポリペプチドも本発明に含まれる。
【００２５】本発明は更に、本発明の組換えまたは合成
ポリペプチド及び本発明の抗体を、いずれもシグナル生
成化合物を使用し得る種々の形式で使用するアッセイを
提供する。検出手段を与えるためのシグナル生成化合物
を使用しないアッセイも提供される。記載の全てのアッ
セイは、通常は抗原もしくは抗体のいずれかまたは両方
を検出するものであり、検査試料を少なくとも１種の本
発明の試薬と接触させて少なくとも１種の抗原／抗体複
合体を形成させ、該複合体の存在を検出することを含
む。かかるアッセイについては詳述する。
【００２６】ＨＧＢＶエピトープを含む免疫原性ペプチ
ド、もしくはＨＧＢＶの不活化調製物、もしくはＨＧＢ
Ｖの弱毒化調製物を含むＨＧＢＶ感染治療用ワクチン、
または、ＨＧＢＶエピトープを発現する組換えワクチン
の使用、並びに／または合成ペプチドの使用も本発明に
含まれる。有効なワクチンにはこれらの免疫原性ペプチ
ドの組合せが使用され得る（例えば、組換え抗原、合成
ペプチド及び天然ウイルス性抗原のカクテルが同時にま
たは異なる時点で投与される）。これらのなかには、単
独で使用し得るものもあるし、後で免疫原性エピトープ
を別に与えて補い得るものもある。更に本発明には、Ｈ
ＧＢＶに対する抗体を産生させる方法であって、個体
に、接種個体において免疫応答を生起するのに十分な量
のＨＧＢＶエピトープを含む単離免疫原性ポリペプチド
を投与することからなる方法も含まれる。
【００２７】更に、ＨＧＢＶに感染した組織培養増殖細
胞も本発明によって提供される。
【００２８】本発明の更に別の態様においては、同定さ
れていない感染性物質のゲノムから誘導されたＤＮＡま
たはｃＤＮＡを単離する方法が提供されるが、該方法は
再現性相違分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＤＡ）の
他に類のない改良方法であって、これについては後述す
る。
【００２９】定義 本明細書において使用される「肝炎ＧＢウイルス」また
は「ＨＧＢＶ」なる用語は、ヒトにおいて非Ａ、非Ｂ、
非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎を惹起するウイルス種、及びそ
れらから誘導される弱毒化株または欠陥干渉粒子を総称
的に示す。これには更に、汚染された食物、飲料水など
によって感染された急性ウイルス性肝炎；（性行為、呼
吸及び非経口経路伝染を含む）人同士の接触または静脈
内薬物使用によって感染されるＨＧＢＶに起因する肝炎
も含まれる。本発明方法により、ＨＧＢＶを獲得した個
体の同定が可能となる。個々には、ＨＧＢＶ単離体を特
に「ＨＧＢＶ−Ａ」、「ＨＧＢＶ−Ｂ」及び「ＨＧＢＶ
−Ｃ」と表記する。本明細書においてＨＧＢＶゲノムは
ＲＮＡからなる。ＨＧＢＶのヌクレオチド配列及び推定
アミノ酸配列の分析から、このウイルス群はＦｌａｖｉ
ｒｉｄａｅファミリーと類似のゲノム構成を有すること
が明らかである。絶対的ではないが、基本的には、ゲノ
ム構成の類似性に基づき、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘ
ｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓは、このファミリー
がＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ及び肝
炎Ｃ型グループの３つの属からなると勧告している。ア
ミノ酸レベルでの類似性を探すと、肝炎ＧＢウイルスサ
ブクローンの配列は、少しではあるが一部が肝炎Ｃ型ウ
イルスのものと類似であることが判る。ここで与えられ
る情報は、ＨＧＢＶの他の株を分類するのに十分であ
る。
【００３０】ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの一遺伝子型ではな
いことを示す幾つかの証拠が挙がっている。第１に、Ｈ
ＧＢ−Ｃ配列を含む血清においてＨＣＶ抗体の存在を試
験した。ＨＣＶに暴露されたかまたは感染した個体の常
套検出方法は、ＨＣＶ−１由来の３つ以上の領域から誘
導される抗原を使用する抗体試験に依存する。かかる試
験により、ＨＣＶの既知の遺伝子型に対する抗体を検出
し得る（例えばＳａｋａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ．７５：１７６１−１７６８（１９９４）及びＳ
ｔｕｙｖｅｒら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０
９３−１１０２（１９９３）参照）。ＨＣＶ特異的ＥＬ
ＩＳＡでは８つのうち６つのケースでＧＢ−Ｃ配列を含
む血清を検出できなかった。第２に、ＨＣＶ抗体に対し
て血清反応陰性の幾つかのヒト血清は、高感度ＲＴ−Ｐ
ＣＲアッセイによるとＨＣＶゲノムＲＮＡに対して陽性
であることが判った（Ｓｕｇｉｔａｎｉ，Ｌａｎｃｅｔ
３３９：１０１８−１０１９（１９９２））。このアッ
セイでは、ＨＧＢ−Ｃ配列を含む８つの血清のうち７つ
でＨＣＶ ＲＮＡを検出できなかった（表Ａ）。即ち、
血清学的アッセイ及び分子学的アッセイのいずれによっ
てもＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの一遺伝子型ではない。
【００３１】ヘリカーゼ領域内のＨＧＢ−Ｃの推定翻訳
産物の一部をＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＣＶ−
１、及びＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅの別のメンバーの相
同領域と並べ、一致した配列を系統発生学的に分析する
と、ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶグループの他のメンバーより
ＨＧＢＶ−Ａに密接に関係することが判る。進化距離
（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓｔａｎｃｅ）０．
４２を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ａの配列は、進化
距離０．９２を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ｂほどは
離れていない。即ち、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−ＣはＧ
Ｂウイルスの１つのサブグループのメンバーであり、Ｈ
ＧＢＶ−Ｂはそれ自体で１つのサブグループのメンバー
であると考えられる。種々のＨＣＶ単離体由来のヘリカ
ーゼ配列を系統発生学的に分析すると、それらは、最大
進化距離が０．２０である分岐の小さいグループを形成
していることが判る。ＨＣＶグループとＨＧＢＶグルー
プとを比較すると、各グル−プからの任意の２つの配列
の最小進化距離は０．６９であることが判る。上記の距
離の値を使用し、系統樹を作成した。これらのウイルス
の分岐度が比較的高いことから、ＧＢウイルスは単に肝
炎Ｃ型グループ内のタイプまたはサブタイプをなすので
はなく、独自の系統発生学的グループを構成することが
判る。ＨＣＶウイルスゲノムの小部分から誘導される配
列情報を使用した系統発生学的分析は、新規の単離体を
遺伝子型グループに割当てる容認可能な方法であること
が示されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｈｅｐａｔｏｌ
ｏｇｙ １９：１３２１−１３２４（１９９４））。最
近の分析では、代表的なＨＣＶ単離体由来のヘリカーゼ
遺伝子内の１１０個のアミノ酸からなる配列を使用すれ
ば、それらは、それぞれの遺伝子型に適当に分類される
（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７
５：１０５３−１０６１（１９９４））。従って、示さ
れた進化距離は、多分、ＧＢウイルスと肝炎Ｃ型ウイル
スとの高度の分岐を正しく反映している。
【００３２】先行特許出願において、「ＨＧＢＶ株はポ
リペプチドレベルで同定可能であり、ＨＧＢＶ株はポリ
ペプチドレベルで４０％以上が相同、好ましくは約６０
％以上が相同、更に好ましくは約８０％以上が相同であ
る」と述べられていた。「相同」なる用語は、使用され
てはいるが、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド配列の関連の度合いを示す場合に曖昧であり、実際に
は進化上の関連性を示唆するものである。当分野の最近
の慣例によれば、「相同性」なる用語はもはや使用され
ず、代わりに、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」及
び／または「一致性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」なる用語を
使用して２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配
列の関連の度合いを示している。アミノ酸配列の「類似
性」及び／または「一致性」を決定する方法は当分野に
おいて公知であるが、例えば、アミノ酸配列を直接決定
し、それを本明細書に与えられた配列と比較したり、推
定ＨＧＢＶのゲノム材料のヌクレオチド配列を（通常は
ｃＤＮＡ中間体を介して）決定し、そこにコードされて
いるアミノ酸配列を決定し、対応領域を比較するなどが
挙げられる。通常、「一致性」とは、各ゲノム上の適当
な場所においてＨＧＢＶのヌクレオチド配列と別の株の
ヌクレオチド配列、またはＨＧＢＶのアミノ酸配列と別
の株のアミノ酸配列が正確に一致することを意味する。
通常、「類似性」とは、適当な場所においてＨＧＢＶの
アミノ酸配列と別の株のアミノ酸配列が正確に一致する
ことを意味するが、その場合、アミノ酸は同一または類
似の化学的及び／または物理的特性、例えば電荷または
疎水性を有する。（ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ，５３７１１から入手可能な）Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ，バージョン８において使用可能なプログラム、例
えばＧＡＰプログラムにより、２つのポリヌクレオチド
または２つのポリペプチドの配列間の一致率及び類似率
を計算し得る。２つの配列間の一致率及び類似率を計算
する他のプログラムも当分野において公知である。
【００３３】更に、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂまたは
ＨＧＢＶ−Ｃの株を同定することにおいて、以下のパラ
メーターを単独または組合せて使用し得る。ＨＧＢＶ株
は好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以
上の遺伝的関連性があり得ると考えられることから、Ｈ
ＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃとこれら
の肝炎ＧＢウイルスの１つの株との間のヌクレオチド配
列全体の一致率は約４５％以上であると推定される。
【００３４】更に、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４０％以
上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約８
０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられることか
ら、ＨＧＢＶ−ＡのゲノムとＨＧＢＶ−Ａのある株のゲ
ノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は約３５
％以上であろうと推定される。更に、２つ以上の連続配
列の組合せで与えられているであろう、少なくとも約１
３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。また、Ｈ
ＧＢＶ株は好ましくは約４０％以上、より好ましくは約
６０％以上、更に好ましくは約８０％以上の遺伝的関連
性があり得ると考えられることから、ＨＧＢＶ−Ｂのゲ
ノムとＨＧＢＶ−Ｂのある株のゲノムとのアミノ酸レベ
ルでの配列全体の一致率は約３５％以上であると推定さ
れる。更に、２つ以上の連続配列の組合せで与えられて
いるであろう、少なくとも１３ヌクレオチドからなる対
応連続配列がある。また、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４
０％以上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましく
は約８０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられる
ことから、ＨＧＢＶ−ＣのゲノムとＨＧＢＶ−Ｃのある
株のゲノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は
約３５％以上であろうと推定される。更に、２つ以上の
連続配列の組合せで与えられているであろう、少なくと
も約１３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。
【００３５】本発明の組成物及び方法により、ＨＧＢＶ
及びその存在し得る株の増殖、同定、検出及び単離が可
能となる。更に本発明の組成物及び方法により、ＨＧＢ
Ｖの存在し得る種々の株に対する診断薬及びワクチンの
製造が可能となり、抗ウイルス性物質のスクリーニング
処理に有用となる。情報は、ウイルス分類学者が該種に
属する他の株を同定するのに十分となろう。本発明者ら
は、ＨＧＢＶが本明細書に含まれる配列をコードすると
考えている。かかる配列の存在をアッセイする方法は当
分野において公知であり、例えばリガーゼ連鎖反応（Ｌ
ＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリ
ダイゼーションといった増幅方法が挙げられる。更に、
かかる配列は、免疫原性ウイルスエピトープを見い出し
得る読取り枠を含む。このエピトープは、他の既知の肝
炎誘発ウイルスと比較し、ＨＧＢＶに固有である。エピ
トープの固有性は、ＨＧＢＶに対する免疫学的反応性
と、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型ウイルスに対する免疫
学的反応性の欠如とによって判定し得る。免疫学的反応
性を判定する方法は当分野において公知であり、例えば
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）、血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏
光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が挙げられるが、適当な
方法の幾つかの例を本明細書に記載する。
【００３６】特定の配列、例えばＨＧＢＶ ｃＤＮＡま
たはＨＧＢＶゲノム「から誘導された」ポリヌクレオチ
ドとは、特定のヌクレオチド配列の領域に対応する、即
ち類似であるかまたは相補的である、おおよそ少なくと
も約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個
のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１
２個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５
〜２０個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチ
ド配列を指す。ポリヌクレオチドを誘導する領域の配列
は、ＨＧＢＶゲノムに固有の配列に類似または相補的で
あるのが好ましい。配列がＨＧＢＶゲノムに固有の配列
に相補的または類似であるか否かは、当業者には公知の
方法で判断し得る。特定の配列の固有性を決定する方法
として、例えばデータバンクにある配列との比較を行い
得る。配列を誘導し得る領域としては、限定的ではない
が、特異的エプトープをコードする領域、並びに非翻訳
及び／または非転写領域が挙げられる。
【００３７】誘導ポリヌクレオチドは必ずしもＨＧＢＶ
のヌクレオチド配列から物理的に誘導される必要はな
く、限定的ではないが、ポリヌクレオチドを誘導する領
域の塩基配列により与えられる情報に基づいた化学的合
成、複製、または逆転写もしくは転写を含む任意の方法
で生成し得る。更に、特定の配列に対応する領域の組合
せは、当分野において公知の方法で所期の用途に応じて
変更し得る。
【００３８】特定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから
誘導される「ポリペプチド」または「アミノ酸配列」と
は、配列内にコードされているポリペプチドと同一のア
ミノ酸配列を有するポリペプチド、または、少なくとも
３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１
０個のアミノ酸、更に好ましくは１５〜２０個のアミノ
酸からなり、配列内にコードされているポリペプチドと
免疫学的に一致し得る前記ポリペプチドの一部を指す。
【００３９】本明細書において使用される「組換えポリ
ペプチド」とは少なくとも、起源または操作によって、
天然もしくはライブラリーの形態で関連するポリペプチ
ドの全部または一部と関連せず、及び／またはそれが天
然で結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合し
ている、ゲノム、半合成または合成のポリペプチドを意
味する。組換えまたは誘導ポリペプチドは必ずしもＨＧ
ＢＶの特定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから翻訳さ
れる必要はない。組換えまたは誘導ポリペプチドは、化
学的合成もしくは組換え発現系の発現、または突然変異
ＨＧＢＶからの単離を含む任意の方法で生成することも
できる。
【００４０】本明細書において使用される「合成ペプチ
ド」なる用語は、当業者には公知の方法で化学的に合成
し得る、任意の長さの重合形態のアミノ酸を意味する。
かかる合成ペプチドは種々の用途に有用である。
【００４１】本明細書において使用される「ポリヌクレ
オチド」なる用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシ
リボヌクレオチドいずれかの任意の長さの重合形態のヌ
クレオチドを意味する。この用語は分子の一次構造のみ
を指す。従って該用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並
びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。更に、メチル
化及び／またはキャップ付加による修飾形態のポリヌク
レオチド、並びに未修飾形態のポリヌクレオチドも含ま
れる。
【００４２】「ｃＤＮＡに対応する配列を含むＨＧＢ
Ｖ」とは、ＨＧＢＶが、特定のＤＮＡ内の配列と類似ま
たは相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを意味す
る。該ｃＤＮＡに対する類似または相補の程度は約５０
％以上、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましく
は少なくとも約９０％である。対応する配列の長さは少
なくとも約７０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約
８０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約９０ヌ
クレオチドである。ＨＧＢＶとｃＤＮＡの対応は当分野
において公知の方法によって決定し得るが、例えば、配
列決定した物質を記載のｃＤＮＡと直接比較したり、ハ
イブリダイズし一本鎖ヌクレアーゼにより消化し、消化
されたフラグメントのサイズを決定することなどが挙げ
られる。
【００４３】「精製ウイルスポリヌクレオチド」とは、
ウイルスポリヌクレオチドが天然で関連するポリペプチ
ドを実質的に含まない、即ちその約５０％未満、好まし
くは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含ま
ないＨＧＢＶゲノムまたはそのフラグメントを指す。ウ
イルスポリヌクレオチドを精製する方法は当分野におい
て公知であり、例えば、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒ
ｏｐｉｃ）剤を用いて粒子を破壊し、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密
度沈降によってポリヌクレオチド及びポリペプチドを分
離することが挙げられる。「精製ウイルスポリペプチ
ド」とは、ウイルスポリペプチドが天然で関連する細胞
成分を実質的に含まない、即ちその約５０％未満、好ま
しくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含
まないＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメントを
意味する。精製方法は当業者には公知である。
【００４４】本明細書において使用される「ポリペプチ
ド」とはアミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さ産物を指
すものではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及
びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。しかし
ながらこの用語には、ポリペプチドの発現後の修飾、例
えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などは含まれ
ないものとする。
【００４５】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び単細胞物質と
して培養された微生物または高等真核細胞系を示す他の
同様の用語は、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡの
レシピエントとして使用され得る、または使用された細
胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の本来の子
孫をも含む。
【００４６】本明細書において使用される「レプリコ
ン」とは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自立単位と
して挙動する、プラスミド、染色体またはウイルスとい
った任意の遺伝子エレメントを意味する。即ちレプリコ
ンはそれ自体の制御下で複製し得る。
【００４７】「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセ
グメントが複製及び／または発現し得るように付加され
たレプリコンである。
【００４８】「制御配列」なる用語は、それらが結合し
ているコーディング配列の発現を行うのに必要なポリヌ
クレオチド配列を指す。制御配列の特性は宿主生物に応
じて異なる。原核細胞においては制御配列は一般にプロ
モーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含
み、真核細胞においては制御配列は一般にプロモータ
ー、ターミネーター、及び場合によってはエンハンサー
を含む。従って「制御配列」なる用語は、少なくともそ
の存在が発現に必要な全ての成分を含んでいるものと
し、更には、存在すれば有利な追加成分、例えばリーダ
ー配列を含んでもよい。
【００４９】「操作可能に結合された」とは、上記成分
が予定通りに機能し得る関係にある状況を指す。従って
例えば、コーディング配列に「操作可能に結合された」
制御配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング
配列の発現が行われるように連結されている。
【００５０】「読取り枠」または「ＯＲＦ」なる用語
は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の
領域を指す。この領域はコーディング配列の一部または
全コーディング配列を与え得る。
【００５１】「コーディング配列」は、適当な調節配列
の制御下に置かれたときにｍＲＮＡに転写される、及び
／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配
列である。コーディング配列の境界は、５’末端にある
翻訳開始コドンと３’末端にある翻訳終結コドンとによ
って決定される。コーディング配列としては、限定的で
はないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えポリヌクレ
オチド配列が挙げられる。
【００５２】「〜を用いて／として免疫学的に同定可能
な」なる用語は、特定のポリペプチド、通常はＨＧＢＶ
タンパク質中に存在し、これに固有であるエピトープ及
びポリペプチドが存在することを指す。免疫学的な一致
（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、抗体結合及び／または結合の
競合によって判定し得る。かかる方法は当業者には公知
であるし、本明細書にも記載される。エピトープの固有
性は、公知のデータバンク、例えばＧｅｎＢａｎｋにお
いてエピトープをコードするポリヌクレオチド配列をコ
ンピューター検索するか、または他の既知のタンパク質
とアミノ酸配列を比較することにより判定し得る。
【００５３】本明細書において使用される「エピトー
プ」とはポリペプチドの抗原決定基を意味する。恐ら
く、エピトープは、３個のアミノ酸をそのエピトープに
固有の空間的配置で含み得る。通常エピトープは少なく
とも５個のこのようなアミノ酸からなり、より一般的に
は少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。空間的配
置を調査する方法は当分野において公知であり、例えば
Ｘ線結晶分析及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００５４】ポリペプチド内に含まれる特定のエピトー
プを抗体が認識したことから抗体に結合するとき、該ポ
リペプチドは該抗体に対して「免疫学的に反応性であ
る」。免疫学的反応性は、抗体結合、特に抗体結合速
度、及び／または、該抗体に対するエピトープを含む既
知のポリペプチドを競合物質として使用する結合の競合
によって判定し得る。ポリペプチドが抗体に対して免疫
学的に反応性であるかどうかを決定する方法は当分野に
おいて公知である。
【００５５】本明細書において使用される「ＨＧＢＶエ
ピトープを含む免疫原性ポリペプチド」なる用語は、天
然ＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメント、並び
に、他の手段、例えば化学的合成または組換え微生物中
でのポリペプチドの発現によって製造されたポリペプチ
ドを意味する。
【００５６】「形質転換」なる用語は、挿入方法に関係
なく、外来ポリヌクレオチドを宿主細胞中に挿入するこ
とを指す。例えば、直接取込み、形質導入またはｆ−交
配（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）が含まれる。外来ポリヌクレオ
チドは、非組込みベクター、例えばプラスミドとして維
持することもできるし、或いは、宿主ゲノム中に組込む
こともできる。
【００５７】「治療」とは予防及び／または加療を指
す。
【００５８】本明細書において使用される「個体」なる
用語は、動物、特に哺乳動物種のものを指し、限定的で
はないが、家畜、競技用動物、霊長目及びヒトを含む
が、特に該用語はタマリン及びヒトを指す。
【００５９】本明細書において使用される「正鎖」（ま
たは「＋」）は、ポリペプチドをコードする配列を含む
核酸を示す。「負鎖」（または「−」）は、「正」鎖の
配列と相補的な配列を含む核酸を示す。
【００６０】ウイルスの「陽性鎖ゲノム」は、ＲＮＡで
あろうとＤＮＡであろうと、ゲノムが一本鎖であり、ウ
イルスポリペプチドをコードすることを示す。
【００６１】「検査試料」とは、被分析物（例えば問題
の抗体または問題の抗原）のソースとなる個体の成分を
指す。かかる成分は当分野において公知である。検査試
料には本発明の方法によって試験し得る生物試料が含ま
れるが、ヒト及び動物の体液、例えば全血、血清、血
漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、並びに、呼吸管、胃腸管
及び尿生殖管の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血
球、ミエローマなど、並びに、生物学的液体、例えば細
胞培養液上清、固定組織試料、固定細胞試料が挙げられ
る。
【００６２】「精製ＨＧＢＶ」とは、ウイルスが通常関
連する細胞構成物質、及び感染組織中に存在し得る他の
タイプのウイルスから単離されたＨＧＢＶの調製物を指
す。ウイルスを単離する方法は当業者には公知であり、
例えば遠心及びアフィニティークロマトグラフィーが挙
げられる。
【００６３】「ＰＮＡ」は、ある処理、例えばターゲッ
トの存在を判定するようなアッセイに使用し得る「ペプ
チド核酸類縁物」を指す。ＰＮＡは、ＲＮＡターゲット
またはＤＮＡに対する電気的に中性の物質である。例え
ばＤＮＡプローブの代わりにアッセイに使用されるＰＮ
Ａプローブは、ＤＮＡプローブを使用したときには得ら
れない利点を与える。かかる利点としては、製造可能
性、大規模標識、再現性、安定性、イオン強度の変化に
対する低感度性、及び、ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する
方法に存在する酵素分解に対する抵抗性が挙げられる。
ＰＮＡは、フルオレセイン、放射性核種、化学発光化合
物などのシグナル生成化合物で標識することができる。
ＰＮＡまたは他の核酸類縁物、例えばモルホリノ化合物
がＤＮＡまたはＲＮＡの代わりに方法に使用し得る。本
明細書にはＤＮＡを使用するアッセイを記載するが、必
要であればアッセイ試薬を適当に変更し、ＰＮＡをＲＮ
ＡまたはＤＮＡの代わりに使用することも常法の範囲内
である。
【００６４】一般用途 本発明の特定の組換えタンパク質、合成ペポチド、また
は精製ウイルスポリペプチドを製造したならば、その組
換えまたは合成ペプチドを使用し、ＨＧＢＶに対する抗
原または抗体の存在を検出する本明細書に記載のごとき
固有のアッセイを開発することができる。またかかる組
成物を使用し、所望するＨＧＢＶの免疫学的エピトープ
に特異的に結合する特異的組換えタンパク質または合成
ペプチドを用い、モノクローナル及び／またはポリクロ
ーナル抗体を開発することができる。少なくとも１種の
本発明のポリヌクレオチドを使用して、当分野において
公知の方法に従ってワクチンを開発することも考えられ
る。
【００６５】アッセイに使用される試薬は、アッセイに
使用されるモノクローナル抗体もしくはモノクローナル
抗体の混合物または（組換えもしくは合成）ポリペプチ
ドといった試薬を各々が含む１つ以上の容器、例えばバ
イアルやボトルを包含する試験キットの形態で提供され
得ると考えられる。当業者には公知の緩衝液、対照など
の他の構成成分をかかる試験キットに含めてもよい。
【００６６】「固相」（「固体支持体」）は当業者には
公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験管、ポリス
チレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリッ
プ、膜、微粒子（例えばラテックス粒子）、ヒツジ（ま
たは他の動物）の赤血球、ｄｕｒａｃｙｔｅｓなどが挙
げられる。「固相」は限定的なものではなく、当業者に
よって選択され得る。即ち、ラテックス粒子、微粒子、
磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、
マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチ
ップ、ヒツジ（または他の適当な動物）の赤血球、及び
ｄｕｒａｃｙｔｅｓは全てが適当な例である。ペプチド
を固相上に固定する適当な方法としては、イオン性、疎
水性、共有結合性の相互作用などが挙げられる。本明細
書において使用される「固相」とは、不溶性であるかま
たは後続反応によって不溶性にし得る任意の材料を指
す。固相は、捕獲剤を引き付けて固定する固有の能力に
おいて選択され得る。或いは固相は、捕獲剤を引き付け
て固定する能力を有する補助的レセプターを保持し得
る。補助的レセプターは、捕獲剤自体または捕獲剤に結
合している帯電物質とは反対の電荷を有する帯電物質を
含み得る。或いはまたレセプター分子は、固相上に固定
（付着）されており、特異的結合反応によって捕獲剤を
固定する能力を有する任意の特異的結合メンバーとする
こともできる。アッセイ実施前またはアッセイ実施中
に、レセプター分子によって捕獲剤を固相材料に間接的
に結合することができる。固相は、プラスチック、誘導
体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラスまた
はシリコン表面を備えた試験管、マイクロタイターウェ
ル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または
他の適当な動物）の赤血球、ｄｕｒａｃｙｔｅｓ、並び
に、当業者には公知の他の構成とし得る。
【００６７】固相が、検出抗体がアクセスし得るに十分
な多孔性及び抗原を結合するのに適当な表面親和性を有
する任意の適当な多孔質材料からなることも考えられ、
本発明の範囲内である。一般には微孔質構造が好ましい
が、水和状態でゲル構造を有する材料も使用し得る。か
かる有用な固体支持体としては、天然ポリマー炭水化物
及びそれらの合成変性、架橋または置換誘導体、例えば
寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換架橋グアゴ
ム、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、
混合セルロースエステル、セルロースエーテル；窒素を
含む天然ポリマー、例えば架橋または変性ゼラチンを含
むタンパク質及び誘導体；天然炭化水素ポリマー、例え
ばラテックス及びゴム；適当な多孔質構造を有するよう
製造され得る合成ポリマー、例えばポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸
ビニルを含むビニルポリマー及びその部分加水分解誘導
体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記ポ
リ縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えばポリエ
ステル、ポリアミド、及び他のポリマー、例えばポリウ
レタンまたはポリエポキシド；多孔質無機材料、例えば
アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩または炭酸
塩（例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシ
ウム）、アルカリ及びアルカリ土類金属、アルミニウム
並びにマグネシウムのケイ酸塩；並びに、アルミニウム
またはケイ素の酸化物または水和物、例えばクレー、ア
ルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルま
たはガラス（これらの材料は上記ポリマー材料と一緒に
充填剤として使用し得る）；並びに、これらの混合物ま
たはコポリマー、例えば既存の天然ポリマー上で合成ポ
リマーの重合を開始することにより得られるグラフトコ
ポリマーが挙げられる。これらの材料は全てが、フィル
ム、シート、またはプレートといった適当な形状で使用
することもできるし、紙、ガラス、プラスチックフィル
ム、またはファイバーといった適当な不活性担体に被
覆、接着または積層することもできる。
【００６８】ニトロセルロースの多孔質構造は、モノク
ローナル抗体を含む広範囲の試薬に対して優れた吸収性
及び吸着性を示す。ナイロンも同様の特性を有してお
り、やはり適当である。上述のごとき多孔質固体支持体
は厚さが約０．０１〜０．０５ｍｍ、好ましくは約０．
１ｍｍのシートの形態であると考えられる。孔径は広範
囲で変えることができるが、約０．０２５〜１５μ、特
に約０．１５〜１５μであるのが好ましい。かかる支持
体の表面は、抗原または抗体と支持体との共有結合を惹
起する化学処理によって活性化し得る。一般には、あま
り理解されていない疎水性の力によって多孔質材料上に
吸着することにより、抗原または抗体は不可逆的に結合
される。適当な固体支持体は米国特許出願第２２７，２
７２号明細書にも記載されている。
【００６９】「指示薬」は、ＨＧＢＶの特異的結合メン
バーに結合（付着）した、外部手段によって検出し得る
測定可能シグナルを生成し得るまたは生成する「シグナ
ル生成化合物」（標識）を含む。本明細書において使用
される「特異的結合メンバー」とは特異的結合対、即ち
一方の分子が化学的または物理的手段を介して第２の分
子に特異的に結合する２つの分子のメンバーを意味す
る。ＨＧＢＶに対する特異的結合対の抗体メンバーであ
るほか、指示薬は、ハプテン−抗ハプテン系、例えばビ
オチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭
水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフ
ェクター分子またはレセプター分子、酵素補因子及び酵
素、酵素阻害物質または酵素などとし得る。免疫反応性
特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおいて
はＨＧＢＶに、競合アッセイにおいては捕獲剤に、また
間接アッセイにおいては任意の特異的結合メンバーに結
合し得る、抗体、抗原、または抗体／抗原複合体であり
得る。
【００７０】考えられる種々の「シグナル生成化合物」
（標識）としては、色原体、酵素のごとき触媒、フルオ
レセイン及びローダミンのごとき発光化合物、ジオキセ
タン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミ
ノールのごとき化学発光化合物、放射性元素、直接可視
標識が挙げられる。酵素の例としてはアルカリ性ホスフ
ァターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼなどが挙げられる。特定の標識の選択は限定的
ではなく、標識はそれ自体でまたは１種以上の他の物質
と一緒になってシグナルを生成することができる。
【００７１】本発明は、特異的結合メンバーを使用する
アッセイを提供する。本明細書において使用される「特
異的結合メンバー」は特異的結合対、即ち一方の分子が
化学的または物理的手段を介して第２の分子に特異的に
結合する２種類の異なる分子のメンバーである。従っ
て、一般的なイムノアッセイの抗原及び抗体特異的結合
対のほかに、他の特異的結合対として、ビオチンとアビ
ジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、
エフェクター分子とレポーター分子、補因子と酵素、酵
素阻害物質と酵素などを挙げ得る。特異的結合対には更
に、元の特異的結合対の類似物、例えば被分析物質類似
物であるメンバーも含まれ得る。免疫反応性特異的結合
メンバーとしては、組換えＤＮＡ分子によって形成され
るものを含み、抗原、抗原フラグメント、モノクローナ
ル及びポリクローナル抗体及び抗体フラグメント、これ
らの複合体が挙げられる。本明細書において使用される
「ハプテン」なる用語は、抗体に結合することはできる
が、担体タンパク質に結合していなければ抗体形成を誘
起し得ない部分抗原または非タンパク質結合メンバーを
指す。
【００７２】本明細書において使用される「被分析物
質」は、検査試料中に存在し得る検出すべき物質であ
る。被分析物質は、それに対して天然特異的結合メンバ
ー（例えば抗体）が存在するかまたはそれに対して特異
的結合メンバーを調製し得る物質であり得る。即ち、被
分析物質は、アッセイにおいて１つ以上の特異的結合メ
ンバーに結合し得る物質である。「被分析物質」として
は、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、及びこれらの
組合せが挙げられる。特異的結合対のメンバーとして、
被分析物質は天然特異的結合パートナー（対）によって
検出することができ、例えば、ビタミンＢ１２の測定に
は特異的結合対のメンバーとして固有因子タンパク質が
使用され、葉酸を測定するには葉酸塩結合タンパク質が
使用され、炭水化物の測定には特異的結合対のメンバー
としてレクチンが使用される。被分析物質としてはタン
パク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチドターゲット
などが挙げられる。
【００７３】種々の他の固相を使用する他の実施態様も
考えられ、それらも本発明の範囲内である。例えば、欧
州特許出願公開第０３２６１００号明細書に対応する同
時係属米国特許出願第１５０，２７８号明細書及び米国
特許出願第３７５，０２９号明細書（欧州特許出願公開
第０４０６４７３号明細書）に記載の、負電荷を有する
ポリマーを用いて固定可能な反応複合体を固定するイオ
ン捕獲法を本発明に従って使用し、高速液相（ｆａｓｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ）免疫化学反応を行う
ことができる。固定可能な免疫複合体は、負電荷を有す
るポリアニオン／免疫複合体と予め処理して正電荷をも
たせた多孔質マトリックスとのイオン相互反応によって
反応混合物の残りの部分から分離し、ＥＰＯ特許出願公
開第０，２７３，１１５号明細書に対応する同時係属米
国特許出願第９２１，９７９号明細書に記載のごとき化
学発光シグナル測定に記載のものを含む、文献明記の種
々のシグナル生成系を使用して検出し得る。
【００７４】また本発明方法は、固相が（磁性または非
磁性）微粒子からなる自動化及び半自動化系を含む、微
粒子技術を使用する系での使用にも適合し得る。このよ
うな系として、ＥＰＯ特許出願公開第０ ４２５ ６３
３号明細書及び同第０ ４２４ ６３４号明細書にそれ
ぞれ対応する係属米国特許出願第４２５，６５１号明細
書及び同第４２５，６４３号明細書に記載のものが挙げ
られる。
【００７５】イムノアッセイ用の走査型プローブ顕微鏡
（ＳＰＭ）を使用すると、本発明のモノクローナル抗体
を容易に適合し得る。走査型プローブ顕微鏡、特に原子
力（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ）顕微鏡においては、捕
獲相、例えば少なくとも１種の本発明のモノクローナル
抗体を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用
し、固相の表面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出す
る。走査型トンネル顕微鏡を使用すると、抗原／抗体複
合体を検出するために多くのイムノアアッセイ系に通常
は使用せねばならない標識が必要でなくなる。このよう
な系は係属米国特許出願第６６２，１４７号明細書に記
載されている。特異的結合反応をモニターするためにＳ
ＰＭは多くの態様で使用され得る。１つの実施態様にお
いては、特異的結合パートナーの１つのメンバー（本発
明のモノクローナル抗体である被分析物質特異的物質）
を走査に適した表面に付着させる。被分析物質特異的物
質の付着は、当業者には公知の方法に従って、プラスチ
ックまたは金属表面の固相からなる試験片に吸着させる
ことにより行い得る。或いは、誘導体化プラスチック、
金属、シリコン、またはガラスの固相からなる試験片に
特異的結合パートナー（被分析物質特異的物質）を共有
結合させることもできる。共有結合方法は当業者には公
知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に
結合する種々の手段を含む。試験片がシリコンまたはガ
ラスである場合、特異的結合パートナーを付着させる前
に表面を活性化する必要がある。トリエトキシアミノプ
ロピルシラン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）、トリエ
トキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（３−メ
ルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）といった活性化シラン化合物を使用し、それぞれア
ミノ、ビニル及びチオールといった反応性の基を導入す
ることができる。このような活性化表面を使用して結合
パートナーを（アミノまたはチオールの場合には）直接
に結合することもできるし、活性化表面を更に、グルタ
ルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、
ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル ３−［２−ピリジルジ
チオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル
−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−
カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４
−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及びＳＭＰＢ
（スクシンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブ
チレート）といったリンカーと反応させ、結合パートナ
ーを表面から離すこともできる。ビニル基は、酸化して
共有結合手段を与えることもできるし、特異的結合パー
トナーに対して複数の付着点を与え得るポリアクリル酸
のごとき種々のポリマーを重合するためのアンカーとし
て使用することもできる。アミノ表面を種々の分子量の
酸化デキストランと反応させ、種々のサイズ及び結合能
の親水性リンカーを与えることもできる。酸化可能なデ
キストランの例として、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−４０（分
子量４０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−１
１０（分子量１１０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａ
ｎＴ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、Ｄｅ
ｘｔｒａｎ Ｔ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダル
トン）（これら全てはＰｈａｒｍａｃｉａから入手可
能）、またはＦｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルト
ン）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）が挙げられる。また、１
９８８年１月２９日出願係属米国特許出願第１５０，２
７８号明細書及び１９８９年７月７日出願同第３７５，
０２９号明細書に記載の方法及び化学物質を使用し、高
分子電解質相互作用を使用して特定的結合パートナーを
試験片の表面に固定することもできる。好ましい付着方
法は共有結合によるものである。特異的結合メンバーを
付着させたあと、非特異的結合を最少限に抑えるために
表面を更に、血清、タンパク質、または他のブロッキン
グ剤で処理してもよい。該表面がアッセイに適している
か検証するため、それを製造場所または使用時点で走査
してもよい。走査方法は、試験片の特異的結合特性を変
化させないものとする。
【００７６】「サンドイッチ」イムノアッセイ及びプロ
ーブアッセイを含む種々の他のアッセイ形式を使用し得
る。例えば、本発明のモノクローナル抗体を種々のアッ
セイ系に使用して、検査試料中のＨＧＢＶタンパク質の
存在を、もしあるとするならば判定することができる。
与えられるかかるモノクローナル抗体のフラグメントを
使用してもよい。例えば高速アッセイ形式においては、
固相に被覆したポリクローナルもしくはモノクローナル
抗ＨＧＢＶ抗体またはそのフラグメントまたはこれらの
抗体の組合せを、ＨＧＢＶタンパク質を含み得る検査試
料と接触させ、混合物を形成する。この混合物を、抗原
／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でイ
ンキュベートする。シグナル生成化合物を付着させた、
ＨＧＢＶ領域に特異的に結合するモノクローナルもしく
はポリクローナル抗体またはそのフラグメントまたはこ
れらの抗体の組合せを含む指示薬を、抗原／抗体複合体
と接触させて第２の混合物を形成する。この第２の混合
物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時
間及び条件下でインキュベートする。検査試料中に存在
しており固相上に捕獲されたＨＧＢＶ抗原の存在は、も
しあるとすれば、シグナル生成化合物によって生成され
る測定可能なシグナルを検出することにより判定され
る。検査試料中に存在するＨＧＢＶ抗原の量は生成され
たシグナルに比例する。
【００７７】或いは、固体支持体に結合させたポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗ＨＧＢＶ抗体またはそ
のフラグメントまたはこれらの抗体の組合せと、検査試
料と、シグナル生成化合物を付着させた、ＨＧＢＶ抗原
に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクロー
ナル抗体またはそのフラグメントまたはこれらの抗体の
組合せを含む指示薬とを接触させて混合物を形成する。
この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに
十分な時間及び条件下でインキュベートする。検査試料
中に存在しており固相上に捕獲されたＨＧＢＶタンパク
質の存在は、もしあるとすれば、シグナル生成化合物に
よって生成される測定可能なシグナルを検出することに
より判定される。検査試料中に存在するＨＧＢＶタンパ
ク質の量は生成されたシグナルに比例する。
【００７８】更に別のアッセイ形式においては、１種ま
たは２種以上組合せた本発明のモノクローナル抗体を、
ＨＧＢＶタンパク質に対する抗体を検出するための競合
プローブとして使用し得る。例えばＨＧＢＶタンパク質
を単独でまたは組合せて固相に被覆することができる。
次いで、ＨＧＢＶ抗原に対する抗体を含む疑いのある検
査試料を、シグナル生成化合物と少なくとも１種の本発
明モノクローナル抗体とを含む指示薬と一緒に、検査試
料及び指示薬と固相、または指示薬と固相とで、抗原／
抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でイン
キュベートする。モノクローナル抗体の固相への結合の
低下を定量的に測定し得る。非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、
非Ｅ型肝炎陰性が確認されている検査試料から生成され
るシグナルと比較してシグナル低下が測定され得るなら
ば、検査試料中に抗ＨＧＢＶ抗体が存在することが判
る。
【００７９】更に別の検出方法においては、本発明のモ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の各々を、
免疫組織化学分析による固定組織片及び固定細胞におけ
るＨＧＢＶ抗原の検出に使用し得る。かかる抗体を直接
標識する（フルオレセイン、コロイド金、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）か、
または（本明細書に例示した種々の標識を用いた）第２
標識抗種抗体を使用して標識して疾患の履歴を追跡する
細胞化学分析も本発明の範囲内である。
【００８０】更に、モノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性
化セファロースと類似のマトリックスに結合し、細胞培
養物、または血液及び肝といった生物組織由来の特異的
ＨＧＢＶタンパク質のアフィニティー精製に使用し、組
換えまたは天然ウイルスＨＧＢＶ抗原及びタンパク質を
精製することもできる。
【００８１】本発明のモノクローナル抗体は、治療を目
的とするキメラ抗体の生成や、他の類似の用途に使用す
ることもできる。
【００８２】モノクローナル抗体またはそのフラグメン
トは、ＨＧＢＶ抗原を検出するために個々に提供され得
る。本明細書において与えられるモノクローナル抗体
（及びそのフラグメント）の組合せは、少なくとも１種
の本発明の抗ＨＧＢＶ抗体と、他のＨＧＢＶ領域に対す
る抗体との混合物または「カクテル」中の、各々が異な
る結合特異性を有する成分として一緒に使用され得る。
即ちこのカクテルは、ＨＧＢＶタンパク質に対する本発
明のモノクローナル抗体と、ＨＧＢＶゲノムの他の抗原
決定基に対する他のモノクローナル抗体とを含み得る。
【００８３】かかるアッセイ形式に使用し得るポリクロ
ーナル抗体またはそのフラグメントは、アッセイに使用
される特異的ＨＧＢＶ領域または他のＨＧＢＶタンパク
質に特異的に結合すべきである。使用されるポリクロー
ナル抗体は哺乳動物由来のものであるのが好ましく、ヒ
ト、ヤギ、ウサギまたはヒツジの抗ＨＧＢＶポリクロー
ナル抗体を使用し得る。最も好ましくは、ポリクローナ
ル抗体はウサギポリクローナル抗ＨＧＢＶ抗体である。
アッセイに使用されるポリクローナル抗体は単独でもポ
リクローナル抗体のカクテルとしても使用し得る。アッ
セイ形式に使用されるカクテルは異なるＨＧＢＶ特異性
を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
いずれかからなるので、それらは、ＨＧＢＶ感染の診
断、評価及び予防に、並びにＨＧＢＶタンパク質の分化
及び特異性の研究に有用となろう。
【００８４】全てのＨＧＢＶウイルスに共通な合成、組
換えまたは天然ペプチドを使用することにより、ＨＧＢ
Ｖ群のウイルスがアッセイにおいて検出可能となり得る
ことが考えられ、本発明の範囲内である。ＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃ、更には他のＨＧＢＶ
ウイルス由来の種々のエピトープを同定する種々の合
成、組換えまたは天然ペプチドをアッセイ形式に使用し
得ることも本発明の範囲内である。後者の場合、それら
を１つの固相に被覆してもよいし、各ペプチドをそれぞ
れ別個の固相、例えば微粒子上に被覆し、それらを合わ
せて、あとでアッセイに使用し得るペプチドの混合物を
形成してもよい。このようなアッセイ形式の変形は当業
者には公知であり、後述する。
【００８５】別のアッセイ形式においては、ＨＧＢＶに
対する抗体及び／または抗原の存在を以下のように同時
アッセイにおいて検出し得る。検査試料を、固相に付着
された第１被分析物質に特異的な第１結合メンバーを含
む第１被分析物質用捕獲剤と、第２固相に付着された第
２被分析物質に対する第１結合メンバーを含む第２被分
析物質用捕獲剤とに同時に接触させ、それによって混合
物を形成する。この混合物を、捕獲剤／第１被分析物質
複合体及び捕獲剤／第２被分析物質複合体を形成するの
に十分な時間及び条件下でインキュベートする。このよ
うに形成された複合体を、シグナル生成化合物で標識さ
れた第１被分析物質に特異的な結合対のメンバーを含む
指示薬と、シグナル生成化合物で標識された第２被分析
物質に特異的な結合対のメンバーを含む指示薬とに接触
させ、第２混合物を形成する。この第２混合物を、捕獲
剤／第１被分析物質／指示薬複合体及び捕獲剤／第２被
分析物質／指示薬複合体を形成するのに十分な時間及び
条件下でインキュベートする。１種以上の被分析物質の
存在は、検査試料中の１種以上の被分析物質の存在の指
標として、いずれか一方または両方の固相上に形成され
た複合体に関連して生成されたシグナルを検出すること
により判定される。このアッセイ形式においては、ヒト
発現系から誘導されたタンパク質を、本明細書に記載の
ごとき哺乳動物発現系から誘導されたタンパク質から生
成されるモノクローナル抗体と同様に使用し得る。かか
るアッセイ系は、欧州特許出願公開第０４７３０６５号
明細書に対応する係属米国特許出願第０７／５７４,８
２１号明細書、発明の名称“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ
Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＯｎｅＯ
ｒ Ｍｏｒｅ Ａｎａｌｙｔｅｓ”に詳述されている。
【００８６】更に別のアッセイ形式においては、組換え
タンパク質及び／または合成ペプチドを使用して検査試
料中の抗ＨＧＢＶの存在を検出し得る。例えば、検査試
料を、少なくとも１種の組換えタンパク質または合成ペ
プチドを付着させた固相と一緒にインキュベートする。
これらを、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間
及び条件下で反応させる。インキュベーション後、抗原
／抗体複合体を検出する。選択したアッセイ系に従い、
指示薬を使用して検出を容易にし得る。別のアッセイ形
式においては、検査試料を、本明細書に記載のごとく製
造された組換えタンパク質または合成ペプチドを付着さ
せた固相と接触させ、更に、好ましくは指示薬で標識さ
れた、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポ
リクローナル抗体と接触させる。抗体／抗原複合体が形
成されるのに十分な時間及び条件下でインキュベートし
た後、固相を遊離相から分離し、ＨＧＢＶ抗体の存在の
指標としての標識を固相または遊離相において検出す
る。本発明のタンパク質を使用する他のアッセイ形式も
考えられる。それらには、検査試料を、第１供給源由来
の少なくとも１種の抗原を付着させた固相と接触させ、
固相及び検査試料を、抗原／抗体複合体を形成するのに
十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いで固相
を、第１供給源とは異なる第２供給源から誘導された標
識抗原と接触させることを含む。例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ
のごとき第１供給源から誘導された組換えタンパク質を
固相上の捕獲抗原として使用し、検査試料をこのように
調製された固相に添加し、異なる供給源（即ちＥ.ｃｏ
ｌｉ以外）から誘導された組換えタンパク質を指示薬の
一部として使用する。同様に、固相上の組換え抗原と指
示薬相中の合成ペプチドとを組合せることもできる。第
１供給源由来のＨＧＢＶに特異的な抗原を捕獲抗原とし
て使用し且つ異なる第２供給源由来のＨＧＢＶに特異的
な抗原を使用するアッセイ形式も考えられる。組換え抗
原の種々の組合せ、並びに合成ペプチド、精製ウイルス
タンパク質の使用などが本発明の範囲に含まれる。この
ようなアッセイその他が本出願人名義の米国特許第５,
２５４,４５８号明細書に記載されており、その内容は
参照により本明細書に包含されるものとする。
【００８７】他のアッセイ系では、ウイルスゲノム（ま
たはそのフラグメント）を含むＨＧＢＶウイルス粒子ま
たはサブウイルス粒子に、特異的抗体とウイルスタンパ
ク質（ペプチドなど）の接触によって特異的に結合する
（ポリクローナル、モノクローナルまたは天然）抗体が
使用される。次いでこの捕獲された粒子をＬＣＲまたは
ＰＣＲなどの方法によって分析し、ウイルスゲノムが検
査試料中に存在するかどうかを判定することができる。
該方法に従って分析し得る検査試料としては、血液、
肝、痰、尿、便、唾液などが挙げられる。かかる抗原捕
獲増幅法を使用する利点は、特異的抗体を使用して検査
試料中のウイルスゲノムを他の分子から分離し得ること
である。このような方法は係属米国特許出願第０８／１
４１,４２９号明細書に記載されている。
【００８８】本発明を固相を使用する場合について記載
したが、本発明の抗体、タンパク質及びペプチドといっ
た試薬は非固相アッセイ系においても使用し得ると考え
られる。このようなアッセイ系は当業者には公知であ
り、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００８９】材料及び方法 一般方法 特に記載のない限り、本発明の実施には、分子生物学、
微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の分野における慣用
的な公知の技術及び方法が使用される。このような技術
は文献に詳述されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；
Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏ
ｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｍ．Ｊ．
Ｇａｉｔ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓら
編，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓら編，Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ，（１９８４）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，（１９８
６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；
Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（１
９８４）；シリーズ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｊ．Ｈ．Ｍｉ
ｌｌｅｒら編，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．（１９８７）；Ｗｕら編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４及び１５５；Ｍ
ａｙｅｒら編，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌ
ｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；及び、Ｄ．Ｗｅｉｒら
編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ（１９８
６）；Ｎ．Ｌｉｓｉｔｉｓｙｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５９：９４６−９５１（１９９３）参照。
【００９０】本発明の試薬及び方法は、本明細書に記載
のごとく改良された再現性相違分析によって単離され
た、タマリンまたはヒトであるＨＧＢＶ感染個体の血
漿、血清または肝ホモジネート中に存在する極めて関連
性のあるヌクレオチド配列群を与えることにより実現可
能となる。このヌクレオチド配列群は、未感染個体由来
のヒトまたはタマリンゲノムＤＮＡにはハイブリダイズ
しないこと、ＨＧＢＶ感染個体の肝（または肝ホモジネ
ート）、血漿または血清中にしか存在しないこと、及び
ＧｅｎＢａｎｋに存在しないことから、ヒトまたはタマ
リンに由来するものではない。更に、該配列群は、ＨＡ
Ｖ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ及びＨＥＶゲノム内に含ま
れる配列と核酸レベルで有意な一致を示さず、翻訳産物
でも一致レベルは有意とは考えられないほど低い。ＨＧ
ＢＶ感染ヒト由来の感染性血清、血漿または肝ホモジネ
ートはかかるポリヌクレオチド配列を含むが、未感染ヒ
ト由来の血清、血漿または肝ホモジネートはかかる配列
を含まない。これらのポリヌクレオチド配列の幾つかを
含む感染肝をノーザンブロット分析すると、それらがウ
イルスゲノムと同様のサイズの大きなＲＮＡ転写物から
誘導されていることが判る。ＨＧＢＶ感染ヒト由来の血
清、血漿または肝ホモジネートはこのポリペプチドに結
合する抗体を含むが、未感染ヒト由来の血清、血漿また
は肝ホモジネートはこのポリペプチドに対する抗体を含
まず、かかる抗体は、急性非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び
非Ｅ感染後の個体において誘起されている。これらを基
準にすると該配列は、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ
型肝炎を惹起する、またはこれに関連のあるウイルスの
配列であると考えられる。
【００９１】この核酸配列群を使用し得ることにより、
ＨＧＢＶ感染に起因する非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ
型肝炎を診断したり、血液ドナー、献血血液、血液製剤
及び個体を感染についてスクリーニングすることにおい
て有用なＤＮＡプローブ及びポリペプチドを構築し得
る。例えば、該配列から、例えばウイルスを保有する疑
いのある被験者の血清中のウイルスゲノムの存在を検出
するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣ
Ｒプライマーとして有用であったり、また献血血液中の
ウイルスの存在をスクリーニングするために有用な、約
８〜１０またはそれ以上のヌクレオチドのＤＮＡオリゴ
マーを合成し得る。当該核酸配列群により、ＨＧＢＶに
感染した際に生成される抗体の存在に対する診断試薬と
して有用な、ＨＧＢＶ特異的ポリペプチドを設計及び製
造し得る。該核酸配列から誘導される精製ポリペプチド
に対する抗体を使用し、感染個体及び血液中のウイルス
性抗原を検出することもできる。かかる核酸配列によ
り、ＨＧＢＶに対するワクチンとして、及び抗体を製造
するために使用し得るポリペプチドを設計及び製造する
ことが可能となり、そうすればそれを疾患の予防及び／
またはＨＧＢＶ感染個体の治療に使用し得る。
【００９２】かかる核酸配列群により、ＨＧＢＶゲノム
を更に特性分析することも可能となる。かかる配列から
誘導されるポリヌクレオチドプローブを使用し、ゲノム
またはｃＤＮＡライブラリーを別の重複核酸配列につい
てスクリーニングし、更にそれを使用して重複した配列
を得ることができる。ゲノムがセグメント化されていて
もセグメントが共通配列を欠いていることがなければ、
この方法を使用して全ゲノムの配列を得ることができ
る。しかしながら、ゲノムがセグメント化されている場
合、記載のごときＲＤＡクローニング処理を繰り返して
後述のごとく修飾するか、後述のごとくλ−ｇｔ１１血
清学的スクリーニング処理を繰り返して後述のクローン
を単離するか、或いは、精製ＨＧＢＶ粒子からゲノムを
単離することにより、ゲノムの他のセグメントを得るこ
とができる。
【００９３】上記配列から誘導されるｃＤＮＡ配列及び
ポリペプチド、並びにかかるポリペプチドに対する抗体
も、ＨＧＢＶ原因物質の単離及び同定に有用である。例
えば、かかる核酸配列から誘導されるポリペプチド中に
含まれるＨＧＢＶエピトープに対する抗体をアフィニテ
ィークロマトグラフィーに基づく方法に使用し、ウイル
スを単離することができる。或いは、抗体を使用し、他
の方法で単離されたウイルス粒子を同定することもでき
る。単離されたウイルス粒子中のウイルス性抗原及びゲ
ノム物質を更に特性分析することもできる。
【００９４】ＨＧＢＶゲノムを更に配列決定すること、
ＨＧＢＶ抗原を更に特性分析すること、及びゲノムを特
性分析することにより得られる情報により、ＨＧＢＶに
誘発される非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎の診
断、予防及び治療に、並びに感染血液及び血液関連製剤
のスクリーニングに使用し得る別のプローブ及びポリペ
プチド並びに抗体を設計及び合成することができる。
【００９５】かかる核酸配列群が誘導されるゲノムから
誘導される抗原、抗体及びポリヌクレオチドを含む、Ｈ
ＧＢＶに対するプローブが得られれば、ＨＧＢＶの生物
学的特性を明らかにすることに特に使用される組織培養
系の開発が可能となる。一旦これが既知となれば、ＨＧ
ＢＶの複製またはその感染を優先的に阻害する抗ウイル
ス性化合物をベースにして新規の治療方法を開発し得る
と考えられる。
【００９６】ＨＧＢＶの病因物質を同定及び単離するた
めに使用した１方法では、Ｎ．Ｌｉｓｉｔｓｙｎら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６−９５１（１９９３）に
より報告されているような再現相違分析（ＲＤＡ）とし
て知られる公知方法の変法によりＧＢ物質のクローニン
グ／単離を行った。この方法は控除ハイブリダイゼーシ
ョンの原理に基づいて２つの複合哺乳動物ゲノム間のＤ
ＮＡ相違をクローニングする。要約すると、この方法で
は２つの被験ゲノムを（該当ターゲット配列を含む）
「テスター」及び（正常ＤＮＡに相当する）「ドライバ
ー」と属的に区別する。ＲＤＡに関するＬｉｓｉｔｓｙ
ｎらの記述は類似する複合ＤＮＡバックグラウンド間の
ＤＮＡ相違の同定及びクローニングに限られている。こ
れらの相違は特定の細胞系、血液、血漿又は組織サンプ
ル中に存在し且つ非感染細胞系、血液、血漿又は組織サ
ンプル中に不在の任意の大きいＤＮＡウイルス（例えば
≧２５，０００ＤＮＡ塩基対）を含み得る。ＨＧＢＶは
≦１０，０００塩基のＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを含む小
さいウイルスであるらしいと先行文献に示されているの
で、小さいウイルスを検出できるようにＲＤＡプロトコ
ルを修正した。方法の主要段階を以下に記載する。
【００９７】要約すると、段階１では市販キットを使用
して全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を単離する。ＲＤＡで
はサンプルが高度に整合していることが必要である。理
想的には、テスター及びドライバー核酸サンプルを同一
源（動物、ヒト等）から得るべきである。高度に関連す
るものであれば、非同一材料をテスター及びドライバー
核酸源に使用してもよい。ＲＮＡのランダムに開始され
る逆転写とそれに続いてランダムに開始されるＤＮＡ合
成により全核酸から２本鎖ＤＮＡを生成する。この処理
は、１本鎖ＲＮＡウイルス及び１本鎖ＤＮＡウイルスを
ＲＤＡに使用可能な２本鎖ＤＮＡ分子に変換するもので
ある。未知ウイルスがＤＮＡ又はＲＮＡゲノムの一方を
有すると仮定するならば、文献に記載されているように
ＤＮＡ単独又はＲＮＡ単独抽出手順を使用して２本鎖Ｄ
ＮＡを生成することができる。
【００９８】段階２ではテスター及びドライバー核酸を
増幅し、予備接種及び感染性血漿源から抽出された全核
酸に相当する大量の材料（即ちテスターアンプリコン及
びドライバーアンプリコン）を生成する。これは、４ｂ
ｐ認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼ（例えばＳ
ａｕ３ＡＩ）で上記のように調製した２本鎖ＤＮＡを開
裂することにより達せられる。ＤＮＡフラグメントをオ
リゴヌクレオチドアダプター（セット＃１）に連結す
る。ＤＮＡフラグメントを末端充填し、ＰＣＲ増幅す
る。ＰＣＲ増幅後、オリゴヌクレオチドアダプター（セ
ット＃１）を制限エンドヌクレアーゼ消化（例えばＳａ
ｕ３Ａ Ｉ）により除去し、その後の控除ハイブリダイ
ゼーション法で使用する大量のテスター及びドライバー
核酸を遊離させる。
【００９９】段階３の実験の目的はテスターゲノムに固
有のＤＮＡを集積することである。これは控除ハイブリ
ダイゼーション及び動的集積を単一段階として組み合わ
せることにより達せられる。要約すると、オリゴヌクレ
オチドアダプターセット（＃２又は＃３）をテスターア
ンプリコンの５’末端に連結する。テスターアンプリコ
ンと過剰のドライバーアンプリコンを混合し、変性さ
せ、２０時間ハイブリダイズさせる。テスター及びドラ
イバーＤＮＡ間で共通して保存される大量の配列がこの
時間中にアニールする。更に、テスターアンプリコンに
特有な配列が再アニールする。しかし、テスターハイブ
リダイゼーション時間が制限されているため、多少の１
本鎖テスター及びドライバーＤＮＡが残存する。
【０１００】段階４では、再アニールしたテスター及び
ドライバーＤＮＡの３’末端を文献に記載されているよ
うに高温で熱安定ＤＮＡポリメラーゼで充填する。テス
ターに固有の再アニールした配列はアニールした配列の
両鎖上に連結されたアダプターを含む。こうしてこれら
の分子の３’末端充填により２つのＤＮＡ鎖上にＰＣＲ
プライマーに相補的な配列が生成される。従って、これ
らのＤＮＡ種はＰＣＲにかけると指数的に増幅される。
これとは対照的にテスター及びドライバーアンプリコン
間で共通に保存された配列を含む比較的大量のハイブリ
ッド分子（即ち一方の鎖はテスターアンプリコンに由来
し、一方の鎖はドライバーアンプリコンに由来する）は
ＰＣＲにより直線的に増幅される。これは、（テスター
アンプリコンに由来する）鎖のみが連結されたアダプタ
ー配列を含み、３’末端充填がドライバーアダプターに
由来する鎖上のＰＣＲプライマーに相補的な配列のみに
生起するためである。
【０１０１】段階５では、ＰＣＲを１０増幅サイクル使
用して該当２本鎖ＤＮＡを定量的に増量する。段階４で
記載したように、再アニールしたテスター配列は指数的
に増幅され、テスター及びドライバーアニール間で共通
して保存された配列は直線的に増幅される。
【０１０２】段階６では、文献に記載されているように
ヤエナリヌクレアーゼを使用して１本鎖ＤＮＡヌクレア
ーゼ消化により残存する１本鎖ＤＮＡを除去する。
【０１０３】段階７では、ヌクレアーゼ消化後に残存す
る２本鎖ＤＮＡを更に１５〜２５サイクルＰＣＲ増幅す
る。
【０１０４】最後に段階８ではこれらのＤＮＡ産物を制
限エンドヌクレアーゼで開裂し、オリゴヌクレオチドア
ダプターを除去する。その後、これらのＤＮＡ産物を
（前サイクルのＲＤＡで使用されなかったオリゴヌクレ
オチドアダプターを使用して段階＃３から開始する）次
回の増幅にかけるか、又は適切なプラスミドベクターに
クローニングし、更に分析する。
【０１０５】上記ＲＤＡ法は当業者に公知の再現相違分
析の変法である。予備接種及び感染性血清源からウイル
スクローンを単離するように方法を変形した。これらの
変形をテスター及びドライバーＤＮＡのアンプリコンの
調製に関して以下に説明する。まず第１に、出発材料は
従来報告されているように哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ
から得た２本鎖ＤＮＡではなく、タマリンから得た感染
性予備接種生物血液サンプルから抽出した全核酸であっ
た。他の生物サンプル（例えば臓器、組織、胆汁、糞便
又は尿）を核酸源として使用してテスター及びドライバ
ーアンプリコンを生成してもよい。第２に、出発核酸の
量は文献に記載されているよりも実質的に少量である。
第３に、６ｂｐでなく４ｂｐ認識部位を有する制限エン
ドヌクレアーゼを使用した。これは従来技術と実質的に
相違する。Ｌｉｓｉｔｓｙｎらの教示によると、ＲＤＡ
はアンプリコン（即ち再現物）の生成がハイブリダイズ
（即ち控除）されるＤＮＡの複合度を低下させるという
理由で有効である。
【０１０６】従来技術では、６ｂｐ認識部位を有する制
限酵素を使用してゲノムを分画した。これらの制限エン
ドヌクレアーゼは約４０００ｂｐ毎に開裂する。他方、
従来技術に記載されているＰＣＲ条件では配列の増幅寸
法は≦１５００ｂｐである。従って、６ｂｐ配列を認識
する制限酵素で分画されたＤＮＡの複合種（例えばゲノ
ム）のその後のＰＣＲ増幅の結果、制限エンドヌクレア
ーゼ消化後に寸法≦１５００ｂｐのＤＮＡのフラクショ
ンを含むアンプリコンが生成される。ＲＤＡのハイブリ
ダイゼーション段階が有効に行われるためにはＤＮＡ複
合度のこの低下（１０〜５０分の１と推定される）が必
要であると報告されている。複合度が低下しないなら
ば、控除段階中にテスター中の固有配列は有効にハイブ
リダイズすることができず、従って、これらの固有配列
はＲＤＡの後続ＰＣＲ段階中に指数的に増幅されない。
【０１０７】ＲＤＡを受ける核酸配列の複合度が低下す
ると、比較的小さいウイルスを単離するためにＲＤＡを
使用し難くなる。相互に１．５ｋｂ以内に２つの６ｂｐ
認識部位が存在する確率はかなり低いので、小さい（≦
１０ｋｂ）ウイルスを単離できない恐れがある（表
１）。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】これに対して本発明者らは、より切断頻度
の高い制限エンドヌクレアーゼを使用してＲＤＡ被験Ｄ
ＮＡを分画するならば、小さいウイルスのクローニング
にＲＤＡが有用であることを知見した。表１に示す通
り、４ｂｐ認識部位酵素をベースとするアンプリコン
は、約２５０ｂｐ毎に４ｂｐ認識部位フラグメントＤＮ
Ａを有する制限エンドヌクレアーゼのように、如何なる
小さいウイルスからも数個のフラグメントをほぼ確実に
含む。他方、ＤＮＡ種のほぼ全部は４ｂｐ認識制限エン
ドヌクレアーゼによる消化後に≦１５００ｂｐで即ちＰ
ＣＲ増幅されるので、アンプリコンはその生成起源であ
る核酸源と同程度の複合度であると思われる。相対ウイ
ルス配列コピー数は任意の特定又は内在配列コピー数よ
りも多いと予想されるので、テスターアンプリコン中に
存在する固有ウイルス配列はハイブリダイゼーション段
階（上記段階３）中に２本鎖分子を形成できるはずであ
る。従って、これらの配列は上記のように指数的に増幅
される。相対ウイルス配列コピー数がバックグラウンド
又は内在核酸配列コピー数に近づくので、重複６ｂｐ配
列を認識し（例えばＢｓｔＹＩ又はＨｉｎｃＩＩ）且つ
約１０００ｂｐ毎に開裂する制限エンドヌクレアーゼを
使用するか、又は６ｂｐ配列を認識する数個の制限エン
ドヌクレアーゼを同時に使用して、ＰＣＲによる増幅前
にＤＮＡを分画することができると推論される。こうし
て、テスターアンプリコンからウイルス配列を排除する
危険を最小限にしながら、ＲＤＡを受けるアンプリコン
の複合度を適度に低下させることができる。この方法の
有用性は、本明細書中に記載する感染性タマリン血漿か
らのＨＧＢＶ配列のクローニングにより立証される。
【０１１０】ＨＧＢＶ免疫反応性エピトープを同定する
ための免疫スクリーニング 以下に記載するような免疫スクリーニングも、ＨＧＢＶ
配列を同定する付加的手段であった。急性又は慢性ＨＧ
ＢＶ感染を有する下記パラメーター内で基準に合致する
個体からの個々の血清、血漿又は肝臓ホモジネート又は
そのプールを使用してウイルス粒子を単離する。これら
の粒子から単離した核酸をゲノムライブラリー及び／又
はウイルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーの構築
で鋳型として使用する。推定ＨＧＢＶ粒子を単離し、当
業者に公知のλ−ｇｔ１１又は類似のシステムでゲノム
及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用
する手順を以下に説明する。λ−ｇｔ１１はβ−ガラク
トシダーゼとの融合ポリペプチドとしての挿入ｃＤＮＡ
を特異的に発現させ、規定抗原に対する特異抗血清で以
って多数の組換えファージをスクリーニングするために
開発されたベクターである。ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプ
ールから生成されるλ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリ
ーを、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎既往個体か
らの血清と特異的に結合することが可能なコード化エピ
トープについてスクリーニングする。Ｖ．Ｈｕｎｙｈ
ら，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，
Ｅｎｇｌａｎｄ，ｐｐ．４９−７８（１９８５）を参照
されたい。約１０6〜１０7個のファージをスクリーニン
グして陽性ファージを同定、精製後、ＨＧＢＶ物質に先
に感染した各個体からの血清と結合する特異性を試験す
る。下記基準に合致する患者に由来し且つこれらの基準
に合致しない患者には存在しない血清又は血漿と選択的
に結合するファージがその後の試験に好適である。オー
バーラップする核酸配列を単離する方法を使用すること
により、付加的な上流及び下流ＨＧＢＶ配列を含むクロ
ーンが得られる。単離クローン内でコードされるＨＧＢ
Ｖ核酸配列のヌクレオチド配列を分析し、複合配列が１
つの長い連続ＯＲＦを含むか否かを決定する。
【０１１１】本明細書に記載するようなＨＧＢＶ配列か
ら回収される配列（及びその相補体）及びその配列又は
任意部分は、合成法を使用して調製してもよいし、本明
細書に記載すると同様の方法を使用して合成法を部分配
列の回収と組み合わせることにより調製してもよい。こ
の記載は、完全ＨＧＢＶゲノムに対応するゲノム又はｃ
ＤＮＡ配列を単離することが可能な方法に関する。しか
しながら、これらの配列を単離するための他の方法も当
業者に自明であり、本発明の範囲内であるとみなされ
る。
【０１１２】菌株寄託 ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの複製株（クローン
２、４、１０、１６、１８、２３及び５０）はブダペス
ト条約に基づき１９９４年２月１０日付けで１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請
求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれ
か最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記
載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎ
ず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために
必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列
は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは
以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付託された。クロー
ン２はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５６、クローン
４はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５７、クローン１
０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５８、クローン１
６はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５９、クローン１
８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６０、クローン２
３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６１、クローン５
０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６２を付与され
た。
【０１１３】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの複製
株（クローン１１、１３、４８及び１１９）はブダペス
ト条約に基づき１９９４年４月２９日付けで１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請
求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれ
か最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記
載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎ
ず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために
必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列
は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは
以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付託された。クロー
ン１１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１３、クロー
ン１３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１１、クロー
ン４８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１０、クロー
ン１１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１２を付与
された。
【０１１４】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの付加
的株（クローン４−Ｂ１．１、６６−３Ａ１．４９、７
０−３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ１．１７）はブダペス
ト条約に基づき１９９４年７月２８日付けで１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請
求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれ
か最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記
載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎ
ず、明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必
要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列は
参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以
下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付与された。クローン
４−Ｂ１．１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６６、
クローン６６−３Ａ１．４９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番
号６９６６５、クローン７０−３Ａ１．３７はＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６４、クローン７８−１Ｃ１．
１７はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６３を付与され
た。
【０１１５】クローンｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はブ
ダペスト条約に基づき１９９４年１１月８日付けで１２
３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分
譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのい
ずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書
に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過
ぎず、本明細書上の教示に鑑みて本発明を実施するため
に必要ではない。ｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はＡ．
Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９７１１を付与された。全寄託
材料中のＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列は参考資料として本明
細書の一部とする。
【０１１６】ウイルスポリペプチド及びフラグメントの
調製 核酸配列を入手できることにより、いずれかの鎖でコー
ドされるポリペプチドの抗原活性領域をコードする発現
ベクターを構築することができる。これらの抗原活性領
域は、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヌ
クレオチドポリメラーゼ、及びウイルス粒子の複製及び
／又はアセンブリに必要な他のウイルスタンパク質を含
むウイルスの非構造領域以外に、例えばエンベロープ
（コート）又はコア抗原を含むウイルスの構造領域から
誘導され得る。所望のポリペプチドをコードするフラグ
メントは慣用制限消化又は合成法によりゲノム又はｃＤ
ＮＡクローンから得られ、例えばβ−ガラクトシダーゼ
（β−ｇａｌ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）又はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）等の融
合配列の部分を含み得るベクターに連結される。ＳＯＤ
の融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法及び
ベクターは１９８６年１０月１日付け公開ＥＰＯ第０１
９６０５６号に記載されており、ＣＫＳの融合配列を含
むポリペプチドの製造に有用な方法及びベクターは１９
８９年９月１３日付け公開ＥＰＯ第０３３１９６１号に
記載されている。いずれかの方向の鎖においてオープン
リーディングフレームを含む核酸配列の任意の所望部分
は成熟又は融合タンパク質等の組換えタンパクとして得
られ、あるいはＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡでコードさ
れるポリペプチドを化学的合成により提供することもで
きる。
【０１１７】融合又は成熟形態のいずれかに関係なく、
また分泌を可能にするシグナル配列を含むか否かに関係
なく、所望のポリペプチドをコードする核酸配列を任意
の適当な宿主に適切な発現ベクターに連結することがで
きる。当該技術分野では真核及び原核両者の宿主系を使
用して組換えタンパク質を形成することができ、本明細
書にはこれらの宿主のいくつかを挙げる。次に溶解細胞
又は培地からポリペプチドを単離し、所期用途に必要な
程度まで精製する。精製は当業者に公知の方法により実
施することができ、特に塩析、イオン交換樹脂クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心
分離等を使用することができる。このようなポリペプチ
ドは診断薬として又は受動的免疫療法に使用することが
できる。更に、これらのポリペプチドに対する抗体は、
ＨＧＢＶ粒子を単離及び同定するために有用である。Ｈ
ＧＢＶ抗原はＨＧＢＶビリオンからも単離することがで
きる。これらビリオンは組織培養物又は感染個体中のＨ
ＧＢＶ感染細胞中で増殖させることができる。
【０１１８】抗原性ポリペプチドの調製及び固相との結
合 ポリペプチドの抗原性領域又はフラグメントは比較的小
さく、通常約８〜１０アミノ酸長又はそれ以下である。
５アミノ酸程度のフラグメントでも抗原性領域を特徴付
けることができる。これらのセグメントはＨＧＢＶ抗原
の複数の領域に対応し得る。ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮ
Ａ配列を基本として使用することにより、ＨＧＢＶポリ
ペプチドの短いセグメントをコードする核酸配列を融合
タンパク質又は単離ポリペプチドとして組換えにより発
現させることができる。これらの短いアミノ酸配列は、
化学的合成によっても得られる。化学的に合成された小
さいポリペプチドは、得られた合成ポリペプチドが適正
なエピトープを提供するように適正に配置されており且
つ抗原性となるには小さ過ぎる場合に適切なキャリヤー
分子に結合され得る。結合方法は当業者に公知であり、
非限定的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及び
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用
する。システイン残基を加えることにより、スルフヒド
リル基をもたないポリペプチドを修飾することができ
る。これらの物質は、該物質と一方のタンパク質上のペ
プチドシステイン残基の間にジスルフィド結合を生成
し、他方のタンパク質中のリシン上のε−アミノ又は他
の遊離アミノ基を介してアミド結合を生成する。このよ
うな種々のジスルフィド／アミド形成物質は公知であ
る。他の２官能カップリング剤はジスルフィド結合でな
くチオエステルを形成する。これらのチオエーテル形成
剤の多くは市販されており、当業者に公知である。その
カルボキシ基は、スクシンイミド又は１−ヒドロキシ−
２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と結合させる
ことにより活性化することができる。宿主に有害な抗体
の産生をそれ自体誘導しないものであれば、任意のキャ
リヤーを使用することができる。適切なキャリヤーとし
ては、特にタンパク質、多糖類（例えばラテックス官能
化セファロース、アガロース、セルロース、セルロース
ビーズ）、ポリマーアミノ酸（例えばポリグルタミン
酸、ポリリシン、アミノ酸コポリマー）及び不活性ウイ
ルス粒子を挙げることができる。タンパク質基質の例と
しては、血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、イム
ノグロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、
破傷風毒素及び当業者に公知の他のタンパク質を挙げる
ことができる。
【０１１９】ＨＧＢＶエピトープを含むハイブリッド粒
子免疫原の調製 ＨＧＢＶエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質
（例えばＨＢＶ表面抗原にあるような）と融合又は結合
した哺乳動物又は酵母系で調製することにより強化する
こともできる。粒子形成タンパク質をコードする配列に
ＨＧＢＶエピトープを直接結合した構築物は、ＨＧＢＶ
エピトープに対して免疫原性のハイブリッドを生成す
る。更に、調製されるＨＧＢＶに対して特異的なエピト
ープを含むすべてのベクターは、異なる程度の免疫原性
を有する。ＨＧＢＶ配列を含む粒子形成タンパク質から
構築される粒子はＨＧＢＶ及びＨＢＶに対して免疫原性
がある。
【０１２０】Ｂ型肝炎表面抗原はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ及び哺乳動物細胞中で形成されて粒子に結合するこ
とが確認され、これらの粒子の形成はモノマーサブユニ
ットの免疫原性を強化することが報告されている。Ｐ．
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３３
４（１９８２）； Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｉ．
Ｍｉｌｌｍａｎら編，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ，Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２２５−２３６（１９８
４）。構築物はＨＢｓＡｇの免疫優性エピトープを含み
得る。このような構築物は酵母で発現可能であることが
報告されており、酵母発現のための異種ウイルス配列を
含むハイブリッドが開示されている。例えばＥＰＯ第１
７４，４４４号及びＥＰＯ第１７４，２６１号を参照さ
れたい。これらの構築物はチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞で発現され得ることも
報告されている。Ｍｉｃｈｅｌｌｅら，Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｒａｌ
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，１９８４を参照されたい。ＨＧ
ＢＶにおいては粒子形成タンパク質をコードする配列の
部分を、ＨＧＢＶエピトープをコードするコドンで置換
することができる。この置換では、酵母又は哺乳動物中
で免疫原性粒子を形成するための単位の凝集を媒介する
ために不要な領域を削除し、こうしてＨＧＢＶエピトー
プとの競合から付加的なＨＧＢＶ抗原部位を排除するこ
とができる。
【０１２１】ワクチン製造 ワクチンは、ＨＧＢＶ核酸配列又は該核酸配列に対応す
るＨＧＢＶゲノムに由来する１種以上の免疫原性ポリペ
プチド又は核酸から製造することができる。ワクチンは
ＨＧＢＶのエピトープを含む組換えポリペプチドを含み
得る。これらのポリペプチドは細菌、酵母又は哺乳動物
細胞中で発現させてもよいし、あるいはウイルス調製物
から単離してもよい。種々の構造タンパク質が防御抗Ｈ
ＧＢＶ抗体を誘導するＨＧＢＶのエピトープを含み得る
ことも予想される。こうして、これらのワクチンの製造
時には合成ペプチドも使用することができる。従って、
ＨＧＢＶの少なくとも１個のエピトープを含むポリペプ
チドをＨＧＢＶワクチン中で単独又は組み合わせて使用
することができる。更に、非構造タンパク質及び構造タ
ンパク質は、中和抗体を産生しないとしても、ウイルス
病原性に対する防御を提供し得ると予想される。
【０１２２】上記に鑑み、ＨＧＢＶに対する多価抗体は
１種以上の構造タンパク質及び／又は１種以上の非構造
タンパク質を含み得る。これらのワクチンは例えば組換
えＨＧＢＶポリペプチド及び／又はビリオンから単離さ
れたポリペプチド及び／又は合成ペプチドから構成され
得る。これらの免疫原エピトープは組み合わせて使用す
ることができ、即ち組換えタンパク質、合成ペプチド及
び／又はビリオンから単離されたポリペプチドの混合物
として使用することができ、これらのワクチンは同一又
は異なる時刻に投与することができる。更に、ワクチン
に不活化ＨＧＢＶを使用することも可能であり得る。こ
のような不活化はウイルス溶解物を調製してもよいし、
肝炎様ウイルスの不活化を生じることが当業者に知られ
ている他の手段、例えば有機溶媒もしくは界面活性剤に
よる処理、又はホルマリン処理により実施してもよい。
本発明では弱毒ＨＧＢＶ株調製物も開示する。ＨＧＢＶ
におけるタンパク質には他の公知ウイルスと交差反応で
きるものもあり、従って、ＨＧＢＶと他のウイルスとの
間に共有エピトープが存在し、これらの病原物質により
生じる疾患の１種以上に対する防御抗体をもたらすと予
想される。この確信に基づいて多重目的ワクチンを設計
できることが予想される。
【０１２３】少なくとも１種の免疫原性ペプチドを活性
成分として含むワクチンの調製は当業者に公知である。
典型的には、このようなワクチンは溶液又は懸濁液とし
ての注射剤として調製される。注射前に液体に溶解又は
懸濁するのに適切な固体形態も製造可能である。調製物
を乳化してもよいし、タンパク質をリポソームに封入し
てもよい。活性免疫原性成分は多くの場合には活性成分
と適合可能な医薬的に許容可能な賦形剤と混合する。適
切な賦形剤の非限定的な例としては、水、食塩水、デキ
ストロース、グリセロール、エタノール等が挙げられ、
種々の量のこれらの賦形剤を組み合わせて使用してもよ
い。ワクチンは更に、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び
／又はワクチンの効力を強化するアジュバント等の少量
の補助物質も含有し得る。例えば、このようなアジュバ
ントとしては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ム
ラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ
−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、別称ｎ
ｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル
−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，
２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキ
シホスホリルオキシ）エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５
Ａ、別称ＭＴＰ−ＰＥ）及びＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ
＋ＣＷＳ）の２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録
商標）エマルジョンが挙げられる。アジュバントの効力
は、同様に種々のアジュバントから構成されるワクチン
中のポリペプチドを投与する結果としてＨＧＢＶ抗原配
列を含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定
することにより決定することができる。
【０１２４】ワクチンは通常、静脈内又は筋肉内注射に
より投与される。他の投与方法に適切な別の製剤には座
薬があり、場合によっては経口製剤でもよい。座薬の場
合、慣用バインダー及びキャリヤーの非限定的な例とし
てはポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙
げられる。このような座薬は約０．５％〜約１０％、好
ましくは約１％〜約２％の活性成分を含有する混合物か
ら形成することができる。経口製剤は例えば医薬グレー
ドのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マ
グネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸
マグネシウム等のような一般に使用される賦形剤を含有
する。これらの組成物は溶液、懸濁液、タブレット、ピ
ル、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態をとることでが
き、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０
％の活性成分を含有し得る。
【０１２５】ワクチン中で使用するタンパク質は中性又
は塩形態としてワクチンに配合され得る。医薬的に許容
可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基と共に形
成され且つ）無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機
酸（酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸）と共に形成され
る酸付加塩や、当業者に公知の他の塩を使用することが
できる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は無機
塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化鉄（ＩＩ
Ｉ）等）及び有機塩基（例えばイソプロピルアミン、ト
リメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチ
ジン、プロカイン）及び当業者に公知の他の塩基から誘
導され得る。
【０１２６】ワクチンは剤形に適合可能な方法で且つ予
防及び／又は治療上有効な量を投与される。投与量は一
般に１回に抗原約５μｇ〜約２５０μｇであり、被投与
患者、患者の免疫系の抗体合成能力及び所望の防御度に
依存する。投与するために必要な活性成分の厳密な量は
処方医の判断にも依存し、患者毎に異なる。ワクチンは
単一投与スケジュールで投与してもよいし、多重投与ス
ケジュールで投与してもよい。多重投与では、１〜１０
回に分けて一次ワクチン接種過程を実施した後、免疫応
答を維持及び／又は強化するために必要な期間後、例え
ば１〜４カ月後に二次投与を実施し、個体が必要とする
場合には更に数カ月後にも投与する。投与計画は少なく
とも一部には個体の必要により決定され、処方医の判断
による。免疫原性ＨＧＢＶ抗原を含有するワクチンは他
の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと併用投与し得る
ことが予想される。
【０１２７】ＨＧＢＶエピトープに対する抗体の製造 本明細書中に記載するように調製した免疫原性ペプチド
を使用してポリクローナル又はモノクローナル抗体を製
造する。ポリクローナル抗体を製造する際には、選択し
た哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を
少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを有する免疫原性
ポリペプチドで免疫感作する。免疫感作した動物からの
血清を適当なインキュベーション時間後に収集し、公知
手順に従って処理する。ＨＧＢＶエピトープに対するポ
リクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗
体を含有する場合には、例えばイムノアフィニティーク
ロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製する
ことができる。ポリクローナル抗体を製造及び処理する
ための方法は当業者に公知であり、特にＭａｙｅｒとＷ
ａｌｋｅｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｌｏｎｄｏｎ （１９８７）に記載されている。ポリク
ローナル抗体は先にＨＧＢＶに感染した哺乳動物からも
得られる。アフィニティークロマトグラフィーを使用し
てＨＧＢＶに感染した個体の血清からＨＧＢＶエピトー
プに対する抗体を精製するための方法の１例をここに記
載する。
【０１２８】ＨＧＢＶエピトープに対するモノクローナ
ル抗体も当業者により製造することができる。このよう
な抗体を製造するための一般方法は周知であり、例えば
ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９４（１９７５）に記載されており、Ｊ．Ｇ．
Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｃｏ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ
（１９８２）に考察されており、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓ
ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：６０４−６１９（１９９
０）により教示されている。不死化抗体産生細胞系は細
胞融合により作成することができ、オンコジーンＤＮＡ
によるＢリンパ球の直接形質転換又はエプスタイン−バ
ールウイルスによるトランスフェクション等の他の方法
により作成することもできる。同様にＭ．Ｓｃｈｒｅｉ
ｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
Ｓｃｏｐｅｓ （１９８０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄＰｒ
ａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）； Ｈａｍｍｅｒｌ
ｉｎｇら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （１９８０）を参照された
い。モノクローナル抗体の使用及び技術の例は米国特許
出願第７４８，２９２号、７４８，５６３号、６１０，
１７５号、６４８，４７３号、６４８，４７７号及び６
４８，４７５号に開示されている。
【０１２９】こうして開発されたＨＧＢＶエピトープに
対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は診断及
び予後用途に有用であり、更に中和抗体は受動的免疫療
法で有用である。モノクローナル抗体は特に抗イディオ
タイプ抗体を製造するために使用することができる。こ
れらの抗イディオタイプ抗体は防御が所望される感染物
質の抗原の「内部像」を有するイムノグロブリンであ
る。例えば、Ａ．Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２１：３９７−４
０６（１９８１）及びＤｒｅｅｓｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：７６１（１９８５）を参照さ
れたい。このようなイディオタイプ抗体を誘導するため
の方法は当業者に公知であり、例えばＧｒｙｃｈら，Ｎ
ａｔｕｒｅ３１６：７４（１９８５）； ＭａｃＮａｍ
ａｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１３２５（１９８
４）；及びＵｙｔｄｅｈａａｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３４：１２２５（１９８５）に例示されている。
これらの抗イディオタイプ抗体はＨＧＢＶ感染の治療及
びＨＧＢＶ抗原の免疫原性領域の解明にも有用であり得
る。
【０１３０】診断オリゴヌクレオチドブローブ及びキッ
ト 単離したＨＧＢＶ核酸配列の所定部分を基材として用い
て、ＨＧＢＶゲノムとハイブリダイズし、ウイルス剤の
同定、ウイルスゲノムの更なる特性分析、及び羅患した
個体でのウイルス検出に有用である約８ヌクレオチド以
上のオリゴマーを切り出し又は合成により産生すること
ができる。ＨＧＢＶポリヌクレオチド用の天然又は誘導
プローブは、ハイブリダイゼーションによる単一ウイル
ス配列の検出を可能とする長さである。６〜８ヌクレオ
チドが処理可能な長さであり得るが、１０〜１２ヌクレ
オチドの配列が好ましく、約２０ヌクレオチドの配列が
最も好ましいものであり得る。これらの配列が異質性に
欠けた領域から誘導されることが好ましい。これらのプ
ローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含む常
用の標準的な方法を用いて製造することができる。ＨＧ
ＢＶゲノムの任意の単一部分の相補体は満足すべきもの
であろう。完全相補性は、断片長さが増せば不要であり
得るが、プローブとして使用するには望ましい。
【０１３１】診断試薬として使用するときには、血液又
は血清のような分析すべき試験試料を処理してもよく、
例えば試料内に含まれる核酸を抽出する。試料から得ら
れた核酸をゲル電気泳動又は他のサイズ分離技術に付し
てもよいし、核酸試料をサイズ分離せずにドットブロッ
トしてもよい。次いで、プローブを標識する。ラベルを
プローブに付着させるための適切なラベル及び方法は当
業界では公知であり、ニックトランスレーション又はキ
ナーゼ反応（kinasing）により取り込まれる放射性ラベ
ル、ビオチン、蛍光及び化学発光プローブが含まれる
が、これらに限定はされない。これらのラベルの例は多
数本明細書に開示されている。次いで、試料から抽出し
た核酸を、適切な厳密度のハイブリダイゼーション条件
下にて標識プローブで処理する。
【０１３２】プローブをＨＧＢＶゲノムに対して完全に
相補的にすることができる。従って、通常は偽陽性を回
避するために厳密度の高い条件が望ましい。しかしなが
ら、厳密度の高い条件は、プローブが異質性に欠けたＨ
ＧＢＶゲノムの領域に相補的である場合にのみ使用すべ
きである。ハイブリダイゼーションの厳密度は、洗浄手
順中の幾つかの要素（例えば温度、イオン強度、時間及
びホルムアミド濃度）により決定される。例えばＪ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ（上掲）を参照されたい。ハイブリダイ
ゼーションは幾つかの様々な技術により実施することが
できる。増幅は、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカー
ゼ、ＮＡＳＢＡ等により実施することができる。
【０１３３】ＨＧＢＶゲノム配列は、例えば約１０2〜
１０3個の配列／ｍｌの比較的低レベルで、感染した個
体の血清中に存在し得ると考えられる。このレベルで
は、ハイブリダイゼーションアッセイで、リガーゼ連鎖
反応又はポリメラーゼ連鎖反応のような増幅技術を使用
する必要があり得る。このような技術は当業界では公知
である。例えば、“バイオブリッジ”系は末端デオキシ
ヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、非改変３’
−ポリ−ｄＴ−テールを核酸プローブに付加する（Ｅｎ
ｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）。ポリ−ｄＴ−テ
ールを有するプローブを標的ヌクレオチド配列にハイブ
リダイズし、次いでビオチン改変ポリ−Ａにハイブリダ
イズする。更には、被分析物質を、酵素標識オリゴヌク
レオチドと相補的な一本鎖ＤＮＡプローブにアニーリン
グし、得られたテール付き二本鎖を酵素標識オリゴヌク
レオチドにハイブリダイズするＤＮＡハイブリダイゼー
ションアッセイがヨーロッパ特許第１２４２２１号に記
載されている。ヨーロッパ特許第２０４５１０号は、被
分析物質ＤＮＡを、テール（例えばポリ−ｄＴ−テー
ル）を有するプローブ、及びプローブのテールにハイブ
リダイズする配列（例えばポリ−Ａ配列）を有し、複数
の標識鎖と結合し得るアンプリファイア鎖と接触させる
ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを記載してい
る。この技術はまず、血清中の標的ＨＧＢＶ配列を約１
０6個の配列／ｍｌに増幅することからなり得る。これ
は、Ｓａｉｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３（１
９８６）に記載の方法に従って実施され得る。次いで、
増幅した配列を、当業界では公知のようなハイブリダイ
ゼーションアッセイを用いて検出することができる。標
識され得るプローブ核酸配列を含む診断キットにプロー
ブをパッケージすることができる。あるいは、プローブ
を標識せずに、標識用成分をキットに含ませてもよい。
キットは更に、特定のハイブリダイゼーションプロトコ
ルに必要な又は望ましい他の適切にパッケージされた試
薬や材料、例えばアッセイ実施のための標準物や指示書
を含み得る。
【０１３４】本発明で使用できる他の公知の増幅方法に
は、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８（１
９９０）に教示され、Ｎａｔｕｒｅ：３５０（Ｎｏ．６
３１３）：９１−９２（１９９１）でも議論されている
いわゆる“ＮＡＳＢＡ”又は“３ＳＲ”技術や、Ｑ−β
レプリカーゼが含まれるが、これらに限定はされない。
【０１３５】本明細書に記載する試薬を用いて、蛍光イ
ンシトウハイブリダイゼーション（“ＦＩＳＨ”）を実
施することもできる。インシトウハイブリダイゼーショ
ンは、核酸ハイブリダイゼーション法により形態の損な
われていない組織、細胞又は染色体を採取して、特殊な
遺伝情報の存在や、個体細胞内での前記情報の特定位置
を実証することからなる。これは細胞の均質化及び標的
配列の抽出を必要としないので、細胞集団中での配列の
正確な位置や分布が判明する。インシトウハイブリダイ
ゼーションは、細胞中に集中して含まれる問題の配列を
同定し得、更には該配列を含む異質細胞集団中の細胞の
タイプやフラクションを同定し得る。ＤＮＡ及びＲＮＡ
を同一のアッセイ試薬で検出することができる。ＰＮＡ
をＦＩＳＨ法で使用して、増幅せずに標的を検出するこ
とができる。シグナルの増加が望ましければ、多数の発
蛍光団を使用してシグナルを増し、方法の感度を高める
ことができる。多数のオリゴヌクレオチドを用いる一工
程法又は従来の多工程法を含む様々なＦＩＳＨ法が知ら
れている。これらのタイプの方法を様々な手段（例えば
フローサイトメトリー及び画像分析）により自動化でき
ることは本発明の範囲内である。
【０１３６】イムノアッセイ及び診断キット ＨＧＢＶ抗体及びその複合体を含む血清と免疫反応する
ポリペプチド、及びこれらのポリペプチド中のＨＧＢＶ
特異エピトープに対する抗体は共に、生物試験試料中で
のＨＧＢＶ抗体の存在又はウイルス及び／もしくはウイ
ルス抗原の存在を検出するイムノアッセイで有用であ
る。これらのイムノアッセイの設計は変形を受けること
が多く、これらの変形は当業界では公知である。これら
の変形は本明細書に記載する。イムノアッセイは、１個
のウイルス抗原（例えばＨＧＢＶ核酸配列を含むクロー
ン、又はこれらのクローン中のＨＧＢＶ核酸配列に由来
する複合核酸配列、又はこれらのクローン中の核酸配列
のソースであるＨＧＢＶゲノムから誘導されるポリペプ
チド）を使用し得る。あるいは、このイムノアッセイ
は、これらのソースから誘導されるウイルス抗原を組み
合わせて使用してもよい。イムノアッセイは例えば、同
一ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体、又は異な
るウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得
る。アッセイには、競合アッセイ、直接反応アッセイ又
はサンドイッチ型アッセイに基づくものが含まれるが、
これらに限定はされない。アッセイは、固相を使用して
もよいし、免疫沈殿又は固相を使用しない他の任意の方
法で実施してもよい。ラベルをシグナル生成化合物とし
て使用するアッセイや、これらのラベルの例は本明細書
に記載する。シグナルは更に、係属中の米国特許出願第
６０８，８４９号、第０７０，６４７号、第４１８，９
８１号、及び第６８７，７８５号に記載のビオチン及び
アビジン、酵素ラベル又はビオチン抗ビオチン系を使用
して増幅してもよい。ＨＧＢＶの免疫優性領域に由来す
るエピトープを含む組換えポリペプチドは、感染個体の
生物試験試料でウイルス抗体を検出するのに有用であり
得る。抗体は、急性感染と非急性感染とを識別するのに
有用であり得るとも考えられる。適切な材料（例えばＨ
ＧＢＶエピトープ又はＨＧＢＶエピトープに対する抗体
を含む本発明のポリペプチド）を、アッセイの実施に必
要な他の試薬や材料、及び適切なアッセイ指示書と一緒
に適切な容器にパッケージングすることにより、適切な
試薬を含んだ免疫診断に適したキットを製造する。
【０１３７】本明細書に詳述する組換えタンパク質を使
用するアッセイ方式を設計することができる。本発明者
らはＣＫＳタンパク質を記載しているが、本発明でスー
パーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等のような他の発
現系を使用して、様々な方法で使用できる融合タンパク
質、例えばイムノアッセイの抗原、抗体産生用免疫原等
を産生できるとも考えられる。ヒト試験試料中の特異被
分析物質（例えばウイルスのような感染物質）に対する
抗体の存在を検出するためのアッセイ方式では、ヒト試
験試料を、少なくとも１種の組換えタンパク質（ポリペ
プチド）でコーティングした固相と接触させてインキュ
ベートする。試験試料中に抗体が存在すれば、この抗体
は抗原ポリペプチドと複合体を形成して、固相に固定化
する。複合体の形成後、固相を洗浄して未結合の物質や
試薬を除去する。複合体を指示試薬と反応させて、第２
の複合体形成のための時間及び条件下でインキュベート
する。生成したシグナルを検出して、試験試料中でのＣ
ＫＳ組換えポリペプチドに対する抗体の存在を調べる。
カットオフ値より高いシグナル生成は、試験試料中に被
分析物質に対する抗体が存在することを示す。酵素のよ
うな多数の指示試薬を用いると、存在する抗体の量は生
成するシグナルに比例する。試験試料の種類によって
は、試験試料を適切な緩衝試薬で希釈してもよいし、濃
縮してもよいし、操作せずに（“ニート”）固相と接触
させてもよい。例えば通常は、予め希釈した血清もしく
は血漿試料を試験するか又は尿のような試料を濃縮し
て、抗体の存在及び／又は存在する抗体の量を調べるこ
とが好ましい。
【０１３８】更には、研究中の感染物質のウイルスゲノ
ムの様々な抗原エピトープに対するＣＫＳ融合タンパク
質を使用して特異感染物質に対する抗体の存在を試験す
る前述のアッセイ方式では、２種以上の組換えタンパク
質を使用することができる。従って、特異ウイルス抗原
領域内のエピトープと、ウイルスゲノム由来の他の抗原
領域に由来するエピトープとを含んでいる組換えポリペ
プチドを使用して、１種のエピトープに由来するポリペ
プチドを用いるよりも感度が増し、恐らくは特異性の高
いアッセイを提供することが好ましいであろう。このよ
うなアッセイは、確認（confirmatory）アッセイとして
使用することができる。この特定のアッセイ方式では、
既知量の試験試料を、組換えタンパク質／抗体複合体を
形成するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１種の
組換えタンパク質でコーティングされた既知量の少なく
とも１種の固相と接触させる。反応を生起するための時
間、適切な条件下で、複合体を既知量の適切な指示試薬
と接触させる。生成したシグナルを陰性試験試料と比較
して、試験試料中での被分析物質に対する抗体の存在を
調べる。微粒子のようなある種の固相を使用するときに
は、アッセイで使用される各組換えタンパク質が、個々
の微粒子や、種々の被覆微粒子を合わせて製造される前
記微粒子の混合物に付着して、各アッセイのために最適
化され得る。
【０１３９】前述のアッセイ方式の変形には、各被分析
物質に対する抗体の存在を検出するための同一又は異な
る固相に付着した種々の被分析物質のＣＫＳ組換えタン
パク質（例えば同一又は異なる固相上にコーティングさ
れた１種の感染物質のある抗原領域に特異的なＣＫＳ組
換えタンパク質）を、異なる感染物質のある抗原領域に
特異的なＣＫＳ組換えタンパク質と共に取り込んで、一
方（又は両方）の感染物質の存在を検出することが挙げ
られる。
【０１４０】他のアッセイ方式としては、抗原エピトー
プを含むＣＫＳ組換えタンパク質が、中和アッセイのよ
うな競合アッセイで有用である。中和アッセイを実施す
るには、ウイルスのような感染物質の抗原領域のエピト
ープを示す組換えポリペプチドを可溶化し、試料希釈液
と混合して、０．５〜５０．０μｇ／ｍｌの最終濃度に
する。所要により希釈した既知量の試験試料（好ましく
は１０μｌ）を反応ウェルに添加し、次いで組換えポリ
ペプチドを含む試験希釈液４００μｌを添加する。所望
とあれば、混合物を約１５分〜２時間プレインキュベー
トしてもよい。次いで、本明細書に記載のＣＫＳ組換え
タンパク質でコーティングした固相を反応ウェルに加
え、約４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、既
知量の指示試薬、例えば結合希釈液中のペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ ２００μｌを添加し、４０℃
で１時間インキュベートする。洗浄後、前述のような酵
素結合体を使用するときには、酵素基質（例えばＯＰＤ
基質）を添加して、室温で３０分間インキュベートす
る。１Ｎ硫酸のような停止剤を反応ウェルに添加して、
反応を停止させる。４９２ｎｍで吸光度を読み取る。特
異ポリペプチドに対する抗体を含む試験試料では、溶液
中でのペプチドと前記抗体との競合結合によるシグナル
生成は減少する。競合結合のパーセンテージは、組換え
ポリペプチドの存在下での試料の吸光度値を、同一希釈
度の組換えポリペプチドの不在下でアッセイした試料の
吸光度値と比較して計算することができる。従って、組
換えタンパク質の存在下の試料と、組換えタンパク質の
不在下の試料との間で生じるシグナルの差は、抗体の存
在又は不在を調べるために使用する尺度となる。
【０１４１】他のアッセイ方式としは、イムノドットブ
ロットアッセイ系で組換えタンパク質を使用することが
できる。イムノドットブロットアッセイ系は、ニトロセ
ルロース固相担体上に並置された精製組換えポリペプチ
ドのパネルを使用する。製造した固相担体を試料と接触
させ、組換えタンパク質（他の特異結合要素）に対する
特異抗体（特異結合要素）を捕捉して、特異結合要素対
を形成する。捕捉した抗体は、指示試薬と反応させて検
出する。１９８８年８月２日出願の米国特許出願第０７
／２２７，４０８号に記載されている機器内でレフレク
タンスオプチックスアセンブリーを用いて、結合体特異
反応を定量することが好ましい。関連米国特許出願第０
７／２２７，５８６号及び第０７／２２７，５９０号
（共に１９８８年８月２日出願）は更に、本出願人によ
るものであり、参考として本明細書に組み入れる米国特
許第５，０７５，０７７号（１９８８年８月２日出願の
米国特許出願第０７／２２７，２７２号）と同様に、イ
ムノドットアッセイを実施するのに有用な特定方法や装
置を記載している。簡潔に言えば、ニトロセルロースベ
ースの試験カートリッジを多数の抗原ポリペプチドで処
理する。各ポリペプチドは、試験カートリッジ上の特異
反応ゾーン内に含まれている。全ての抗原ポリペプチド
がニトロセルロース上に置かれた後に、ニトロセルロー
ス上の過剰結合部位を阻止する。次いで、試験カートリ
ッジを試験試料と接触させて、試験試料が適切な抗体を
含めば各反応ゾーンの各抗原ポリペプチドが反応するよ
うにする。反応後、試験カートリッジを洗浄し、よく知
られた適切な試薬を用いて、任意の抗原抗体反応を同定
する。本明細書に引用した特許及び特許出願に記載され
ているように、全プロセスは自動化可能である。イムノ
ドットブロットアッセイを実施するための方法及び装置
に関連する前記出願明細書は参考として本明細書に組み
入れる。
【０１４２】試験試料中に被分析物質の特異抗原に対す
る抗体を検出するために後述する第１及び第２の固相担
体を使用するアッセイでＣＫＳ融合タンパク質を使用す
ることができる。このアッセイ方式では、試験試料の第
１のアリコートを、組換えタンパク質／被分析物質抗体
複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、被分析
物質に特異的なＣＫＳ組換えタンパク質でコーティング
された第１の固相担体と接触させる。次いで、複合体
を、組換え抗原に特異的な指示試薬と接触させる。指示
試薬を検出して、試験試料中での組換えタンパク質に対
する抗体の存在を調べる。その後、試験試料の第２のア
リコートを、組換えタンパク質／第２の抗体の複合体を
形成するのに十分な時間及び条件下で、第２の抗体に特
異的なＣＫＳ組換えタンパク質でコーティングされた第
２の固相担体と接触させて、同一被分析物質の異なる抗
原決定基の存在を調べる。複合体を、複合体の抗体に特
異的な第２の指示試薬と接触させる。シグナルを検出し
て、試験試料中での抗体の存在を調べる。一方又は両方
の被分析物質組換えタンパク質に対する抗体の存在は、
試験試料中に抗被分析物質が存在することを示してい
る。固相担体を同時に試験できるとも考えられる。
【０１４３】ハプテンの使用は当業界では公知である。
ＣＫＳ融合タンパク質を用いるアッセイでハプテンを使
用して、アッセイの性能を高めることもできると考えら
れる。
【０１４４】プローブを用いたＨＧＢＶゲノム、ビリオ
ン及びウイルス抗原の更なる特性分析 ＨＧＢＶ核酸配列を使用して、ＨＧＢＶゲノムの配列、
並びにＨＧＢＶ剤の同定及び単離について更なる情報を
得ることができる。従って、この知識は、ＨＧＢＶの特
性（例えばＨＧＢＶゲノムの種類、ウイルス粒子の構
造、及びＨＧＢＶを構成する抗原の種類）の分析に役立
つと考えられる。この情報により、付加的なポリヌクレ
オチドプローブ、ＨＧＢＶゲノムに由来するポリペプチ
ド、及びＨＧＢＶエピトープに対する抗体を得ることが
できる。これらは、ＨＧＢＶにより発病する非Ａ型、非
Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の診断及び／又は
治療に有益である。
【０１４５】核酸配列情報は、ＨＧＢＶゲノムの非画定
領域に由来する付加的な核酸配列の単離用プローブ又は
ＰＣＲプライマーの設計に有用である。例えば、８個以
上、好ましくは２０個以上のヌクレオチドの配列を含
み、ＨＧＢＶ核酸配列ファミリーの５’末端又は３’末
端に近い領域に由来するＰＣＲプライマー又は標識プロ
ーブを使用して、重複核酸配列をＨＧＢＶゲノム又はｃ
ＤＮＡライブラリーから単離してもよいし、ウイルス核
酸から直接単離してもよい。次いで、ＨＧＢＶ核酸配列
と重複するが、該ＨＧＢＶ核酸配列のソースではないゲ
ノムの領域に由来する配列を更に含んでいる前記配列を
使用して、必ずしもクローン中の核酸配列とは重複しな
い他の重複断片を同定するためのプローブを合成しても
よい。ＨＧＢＶゲノムがセグメント化されず、セグメン
トに共通配列がなければ、ウイルスゲノムに由来する重
複核酸配列の単離技術を使用して、全ウイルスゲノムの
配列を決定することが可能である。あるいは、精製した
ＨＧＢＶ粒子から単離したウイルスゲノムから、ゲノム
セグメントの特性分析を行うことができる。ＨＧＢＶ粒
子を精製し、精製手順中に該粒子を検出する方法は本明
細書に記載する。ウイルス粒子からポリヌクレオチドゲ
ノムを単離する手順は当業界ではよく知られている。次
いで、単離したゲノムセグメントをクローニングして配
列決定することができる。従って、ＨＧＢＶゲノムをそ
の種類とは関係なくクローニングして配列決定すること
が可能である。
【０１４６】ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡライブラリー
の構築方法は当業界では公知であり、このために有用な
ベクターも当業界では公知である。これらのベクターに
は、λ−ｇｔ１１、λ−ｇｔ１０等が含まれる。単離し
たポリヌクレオチドを適切な制限酵素で消化して、ＨＧ
ＢＶゲノム又はｃＤＮＡ由来のプローブにより検出され
るＨＧＢＶ由来の核酸配列をクローンから単離し、配列
決定してもよい。
【０１４７】これらの重複ＨＧＢＶ核酸配列に由来する
配列情報は、ウイルスゲノム内の相同性エリア及び異質
性エリアを決定するのに有用である。これは、種々のゲ
ノム株及び／又は欠陥粒子集団の存在を示し得る。これ
は、本明細書に記載の技術を使用して、ＨＧＢＶの単離
中に、生物試料中のＨＧＢＶ又はＨＧＢＶ抗原又はＨＧ
ＢＶ核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブの設計にとっても有用である。重複核酸配列を使用
して、ＨＧＢＶゲノム由来のポリペプチドに対する発現
ベクターを産生してもよい。ＨＧＢＶに対して単一であ
ると考えられるエピトープを含む抗原は核酸配列ファミ
リー内にコードされる。即ち、これらの抗原に対する抗
体は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶに感染した個
体には存在せず、ＧｅｎＢａｎｋのゲノム配列を用いれ
ば、これらの核酸配列と前記ソースのポリヌクレオチド
配列との間に最小の相同性が存在することを示すと考え
られる。従って、ＨＧＢＶ核酸配列でコードされた抗原
に対する抗体を使用して、感染個体から単離した非Ａ
型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型粒子を同定して
もよい。更には、これらはＨＧＢＶ物質の単離にも有用
である。
【０１４８】ＨＧＢＶ粒子は、例えばサイズ識別をベー
スとする技術（例えば沈降もしくは排除法）、又は密度
をベースとする技術（例えば密度勾配超遠心分離、もし
くはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような物質に
よる沈殿、もしくはアニオンもしくはカチオン交換材料
や、疎水性相互反応により結合する材料、及び親和性カ
ラムのような様々な材料でのクロマトグラフィー）を含
む当業界で公知の任意の方法により、感染個体の血清又
は細胞培養物から単離することができる。単離手順中
に、ＨＧＢＶ核酸配列に由来するプローブを用いて抽出
ゲノムのハイブリダイゼーション分析を行って、又はＨ
ＧＢＶ核酸配列ファミリー内にコードされたＨＧＢＶ抗
原に対する抗体をプローブとして使用するイムノアッセ
イによりＨＧＢＶの存在を検出することができる。抗体
はポリクローナルであっても、モノクローナルであって
もよく、抗体をイムノアッセイで使用する前に精製する
ことが所望され得る。固相に固定化したＨＧＢＶ抗原に
対する前記抗体は、イムノアフィニティークロマトグラ
フィーによるＨＧＢＶの単離に有用である。イムノアフ
ィニティークロマトグラフィー法は当業界では公知であ
り、免疫選択活性を保持するように抗体を固相に固定化
する方法を含んでいる。これらの方法には、吸着及び共
有結合が含まれる。抗体の抗原結合部位が接近可能なま
まであるように、二官能価カップリング剤にスペーサー
基を含ませてもよい。
【０１４９】精製手順中に、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮ
Ａ配列ファミリー、及び重複ＨＧＢＶ核酸配列に由来す
るポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして使
用して、ＨＧＢＶの存在を核酸ハイブリダイゼーション
又はＰＣＲにより検出及び／又は検証してもよい。ウイ
ルス粒子の破壊を引き起こす条件下で、例えばキレート
化剤の存在下で洗剤を使用して画分を処理し、ウイルス
核酸の存在をハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲに
より調べる。個体（好ましくはタマリン）に単離したウ
イルス粒子を感染させ、次いで本明細書に記載の非Ａ
型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の症状が感
染によるものかどうかを調べることにより、単離した粒
子がＨＧＢＶ感染誘発物質である別の確証が得られ得
る。
【０１５０】次いで、精製した調製物から得た前述のウ
イルス粒子の特性を更に分析することができる。ゲノム
核酸を精製すれば、これを試験して、ＲＮＡｓｅ又はＤ
ＮＡｓｅ■に対する感度を調べることができる。これら
の試験に基づいて、ＨＧＢＶをＲＮＡゲノム又はＤＮＡ
ゲノムとして調べてもよい。当業界で公知の方法によ
り、例えば電子鏡検法による可視化、密度勾配による移
動及び沈降特性により、鎖の数及び環状性又は非環状性
を調べることができる。ＨＧＢＶゲノムのハイブリダイ
ゼーションから、精製核酸の陰性又は陽性鎖数（strand
edness）を調べることができる。更には、ゲノム材料が
ＲＮＡならば、公知の技術（例えば逆転写酵素）により
精製核酸をクローニングして配列決定することができ
る。次いで、ウイルス粒子に由来する核酸を用いて、全
ゲノムをセグメント化の如何を問わず配列決定すること
が可能である。
【０１５１】保存された配列を含むポリペプチドの決定
は、ＨＧＢＶゲノムと結合して、単離させ得るプローブ
を選択するのに有用であり得る。更には、保存された配
列を、ＨＧＢＶ核酸配列に由来する配列と一緒に使用し
て、ゲノム配列を増幅する系で使用するプライマーを設
計してもよい。更には、ＨＧＢＶの構造を調べて、その
成分を単離してもよい。例えば電子鏡検法により形態及
び寸法を調べることができる。抗原が主要ウイルス成分
中に存在するのか、少量ウイルス成分中に存在するのか
を確かめ、単離した核酸配列内にコードされた特異抗原
に対する抗体をプローブとして使用して、特異ウイルス
ポリペプチド抗原［例えばエンベロープ（コート）抗原
又は内部抗原（例えば核酸結合タンパク質もしくはコア
抗原）］や、ポリヌクレオチドポリメラーゼを同定して
位置を調べることもできる。この情報は、診断及び治療
用途に有用であり得る。例えば、ワクチン調製物中に外
部抗原を含めることが好ましく、又は恐らく多価ワクチ
ンは、構造タンパク質をコードするゲノムに由来するポ
リペプチド、及びゲノムの他の部分に由来するポリペプ
チド（例えば非構造ポリペプチド）からなり得る。
【０１５２】ＨＧＢＶ複製用の細胞培養系及び動物モデ
ル系 一般に、ＨＧＢＶの培養に適した細胞又は細胞系は、サ
ル腎臓細胞（例えばＭＫ２及びＶＥＲＯ）、ブタ腎臓細
胞系（例えばＰＳ）、ハムスター乳児腎臓細胞系（例え
ばＢＨＫ）、マウスマクロファージ細胞系（例えばＰ３
８８Ｄ１、ＭＫ１及びＭｍ１）、ヒトマクロファージ細
胞系（例えばＵ−９３７）、ヒト末梢血白血球、ヒト付
着単球、肝細胞系（例えばＨＵＨ７及びＨｅｐＧ２）、
胚もしくは胚細胞（例えばニワトリ胚線維芽細胞）、又
は無脊椎動物、好ましくは昆虫に由来する細胞系（例え
ばＤｒｏｓｏｐｈｉａ細胞系）、更に好ましくは節足動
物に由来する細胞系（例えば蚊細胞系もしくはマダニ細
胞系）を含み得る。一次肝細胞を培養し、次いでこれに
ＨＧＢＶを感染させることも可能である。あるいは、肝
細胞培養物を、感染個体（ヒト又はタマリン）の肝臓か
ら誘導することができる。後者の場合は、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ感染させてｉｎ ｖｉｔｒｏ継代させた細胞系の例で
ある。更には、種々の不死化方法を使用して、肝細胞培
養物に由来する細胞系を得ることができる。例えば、
（肝細胞集団の増菌前後の）一次肝臓培養物を種々の細
胞と融合して、安定性を維持することができる。更に
は、培養物に形質転換ウイルスを感染させるか、形質転
換遺伝子をトランスフェクトして、永続的な又は半永続
的な細胞系を生成してもよい。更には、肝臓培養物中の
細胞を融合して、ＰｅｈＧ２のような確立した細胞系に
してもよい。細胞融合方法は当業者にはよく知られてお
り、とりわけＰＥＧ及びセンダイウイルスのような融合
剤の使用を含んでいる。
【０１５３】細胞系のＨＧＢＶ感染は、細胞内へのウイ
ルス侵入を可能とする条件下で、細胞をウイルス調製物
と共にインキュベートするような技術により達成され得
ると考えられる。細胞に、単離したウイルスポリヌクレ
オチドをトランスフェクトさせてウイルス調製物を得る
ことも可能であり得る。組織培養細胞をトランスフェク
トする方法は当業界では公知であり、エレクトロポレー
ション及びＤＥＡＥ−デキストラン又はリン酸カルシウ
ムによる沈殿を使用する技術が含まれるが、これに限定
はされない。クローニングしたＨＧＢＶゲノム又はｃＤ
ＮＡによるトラスフェクションでウイルスが複製され、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖する。培養した細胞の他に、ウイ
ルス複製に動物モデル系を使用してもよい。従って、Ｈ
ＧＢＶ複製はチンパンジー、更には例えばマーモセット
及び乳児マウスで生起し得る。
【０１５４】ＨＧＢＶ抗ウイルス剤のスクリーニング ＨＧＢＶ用の細胞培養系及び動物モデル系が利用できる
ことから、ＨＧＢＶ複製を阻害する抗ウイルス剤、特に
好ましくはウイルス複製を阻害しつつ細胞増殖を可能と
する物質のスクリーニングも可能となる。これらのスク
リーニング方法は当業界では公知である。一般に、ウイ
ルス複製を支える細胞培養系で抗ウイルス剤がウイルス
複製の阻止に及ぼす作用、次いで感染性又はウイルス病
原性の阻害、また低レベルの毒性について、抗ウイルス
剤を様々な濃度で動物モデル系にて試験する。本明細書
に記載するＨＧＢＶ抗原及びＨＧＢＶポリヌクレオチド
の検出のための方法及び組成物は、抗ウイルス剤のスク
リーニングに有用である。何故ならば、これらは、抗ウ
イルス剤のウイルス複製への作用の検出については、細
胞プラークアッセイ又はＩＤ50アッセイよりも恐らく高
感度の代替手段となるからである。例えば、本明細書に
記載するＨＧＢＶポリヌクレオチドプローブを使用し
て、細胞培養物中に産生されるウイルス核酸の量を定量
してもよい。これは、感染細胞核酸を標識したＨＧＢＶ
ポリヌクレオチドプローブでハイブリダイズ又は競合ハ
イブリダイズすることにより実施され得る。更には、抗
ＨＧＢＶ抗体を使用して、本明細書に記載するイムノア
ッセイにより、細胞培養物中のＨＧＢＶ抗原を同定、定
量してもよい。更には、競合アッセイにより感染細胞培
養物中のＨＧＢＶ抗原を定量することが所望され得るの
で、本明細書に記載するＨＧＢＶ核酸配列内にコードさ
れるポリペプチドはこれらのアッセイで有用である。一
般に、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡに由来する組換えＨ
ＧＢＶポリペプチドを標識し、細胞培養系で産生された
抗原による、前記標識ポリペプチドとＨＧＢＶポリペプ
チドとの結合の阻害を監視する。これらの方法は、ＨＧ
ＢＶが細胞死を起こさずに細胞系で複製し得る場合に特
に有用である。
【０１５５】ＨＧＢＶ弱毒化株の調製 本明細書に記載する組織培養系及び／又は動物モデル系
を用いて、ＨＧＢＶ弱毒化株を単離することが可能であ
り得る。これらの弱毒化株は、ワクチンとして又はウイ
ルス抗原の単離に有用である。弱毒化株は、細胞培養物
及び／又は動物モデルに何度も継代させた後に単離する
ことができる。感染した細胞又は個体での弱毒化株の検
出は、当業界で公知の以下の方法に従って達成可能であ
り、検出には、ＨＧＢＶにコードされた１種以上のエピ
トープに対する抗体のプローブとしての使用、又は長さ
が少なくとも約８ヌクレオチドのＨＧＢＶ配列を含むポ
リヌクレオチドのプローブとしての使用が含まれ得る。
これに加え又はこれに代わって、本明細書に記載するＨ
ＧＢＶのゲノム情報を使用し、また組換え技術を使用し
て弱毒化株を構築してもよい。通常、ウイルス複製では
なく、病原性に関連するポリペプチドをコードするゲノ
ムの領域を欠失させる。ゲノムを構築すれば、ＨＧＢＶ
に対する中和抗体を産生するエピトープを発現させるこ
とができる。次いで、変性ゲノムを使用して、ＨＧＢＶ
複製を可能とする細胞を形質転換して、細胞をウイルス
複製を可能とする条件下で増殖させることができる。弱
毒化ＨＧＢＶ株はワクチン用としてだけでなく、ウイル
ス抗原の商業的産生のソースとしても有用である。何故
ならば、これらのウイルスの処理は、ウイルス産生及び
／又はウイルス製品の製造に係わる従業員に対してそれ
ほど厳密な保護措置を必要としないからである。
【０１５６】宿主及び発現制御配列 ゲノムをウイルスから抽出し、ゲノムライブラリーを作
成、プロービングし、クローンの配列を決定し、発現ベ
クターを構築し、細胞を形質転換し、免疫アッセイを実
施し、培養物中で細胞を増殖させるために使用する一般
的な技術は当業界では公知であり、本発明に包含する。
【０１５７】指定の宿主と適合する適切な制御配列を使
用すれば、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方を、所
望のコード化配列の発現のために使用することができ
る。原核宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉが最も頻繁に使用
される。原核生物の発現制御配列には、場合によってオ
ペレーター部分を含むプロモーターや、リボソーム結合
部位が含まれる。原核宿主と適合するトランスファーベ
クターは通常、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン
耐性を付与するオペロンを含むプラスミドｐＢＲ３２２
や、更に抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含む種
々のｐＵＣベクターから誘導される。これらのマーカー
を使用して、選択により良好な形質転換細胞を得ること
ができる。通常使用される原核生物制御配列には、β−
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモー
ター系（Ｃｈａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５
６［１９７７］）、（Ｇｏｅｄｄｅｌ等，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ ８：４０５７［１９８０］により
報告されている）トリプトファンプロモーター系、λ誘
導Ｐ１プロモーター及びＮ遺伝子リボソーム結合部位
（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ等，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２
８［１９８１］）、並びにｔｒｐ及びｌａｃＵＶ５プロ
モーターの配列に由来するハイブリッドＴａｃプロモー
ター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２９２：１２８［１９８３］）が
含まれる。前述の系は、特にＥ．ｃｏｌｉに適合し得る
が、所望とあれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株又はＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ株のような他の原核宿主を対応する制御配
列と共に使用してもよい。
【０１５８】真核宿主は、培養系の酵母及び哺乳動物細
胞を含んでいる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓが最も一般的に使用されてい
る酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。酵母適合
性ベクターは、栄養要求突然変異株を原栄養性とするか
又は野生型株に重金属耐性を付与して良好な形質転換細
胞の選択を可能とするマーカーを保有する。酵母適合性
ベクターは、２ミクロンの複製源（Ｂｒｏａｃｈ等，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１；３０７［１９８３］）、ＣＥ
Ｎ３とＡＲＳ１の組み合わせ、又は複製を行うための他
の手段（例えば宿主細胞ゲノム内への適切な断片の取り
込みをもたらす配列）を使用し得る。酵母ベクターの制
御配列は当業界では公知であり、３−ホスホフィセレー
トキナーゼ（phosphophycerate kinase）用プロモータ
ーを含む解糖酵素合成用プロモーターを含んでいる。例
えば、Ｈｅｓｓ等，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅ
ｇ．７：１４９（１９６８）、Ｈｏｌｌａｎｄ等，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００（１９７８）及
びＨｉｔｚｅｍａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
５：２０７３（１９８０）を参照されたい。Ｈｏｌｌａ
ｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５（１
９８１）に報告されているエノラーゼ遺伝子に由来する
ようなターミネーターも含まれ得る。特に有用な制御系
は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター又はアルコールデヒ
ドロゲネーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモーター、更にＧ
ＡＰＤＨから誘導されるターミネーター、また分泌が望
ましければ、酵母αファクターに由来するリーダー配列
を含む系であると考えられる。更には、操作可能に連結
した転写調節領域及び転写開始領域は、野生型生物で先
天的に関連しないようなものであり得る。
【０１５９】発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞
系は当業界では公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可
能な多数の不死化細胞系が含まれる。これらには、Ｈｅ
Ｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ハムスター乳児腎臓（ＢＨＫ）細胞等が含まれる。
哺乳動物細胞に適したプロモーターも当業界では公知で
あり、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス
肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、
ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）に由来するようなウイルスプロモーターが含
まれる。哺乳動物細胞は更に、ターミネーター配列及び
ポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増加させるエン
ハンサー配列を含めてもよいし、遺伝子の増幅を誘発す
る配列も所望され得る。これらの配列は当業界では公知
である。哺乳動物細胞の複製に適したベクターは、ウイ
ルスレプリコン、又は非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ
型、非Ｅ型エピトープをコードする適切な配列の宿主ゲ
ノム内への取り込みを確実にする配列を含み得る。ＨＣ
Ｖの哺乳動物発現系の一例は、１９９２年１月３１日出
願の米国特許出願第０７／８３０，０２４号に記載され
ている。
【０１６０】形質転換 形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する
ための公知の方法によって可能であり、ポリヌクレオチ
ドをウイルス内にパッケージングし、宿主細胞にウイル
スをトランスデュースし、ポリヌクレオチドを直接取り
込むことからなる。選択する形質転換手順は、形質転換
すべき宿主に依存する。直接の取り込みによる細菌の形
質転換は一般に、塩化カルシウム又は塩化ルビジウムに
よる処理を使用する。Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９
７２）。Ｇｒａｈａｍ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５
２６（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法又はその変
形を用いて、直接の取り込みによる酵母形質転換を実施
してもよい。
【０１６１】ベクター構築 ベクター構築は当業界で公知の方法を使用する。一般に
は、市販酵素の製造業者により一般に規定されている条
件下にて、適切な制限酵素で処理して、部位特異的ＤＮ
Ａ開裂を実施する。通常、約２０μｌの緩衝溶液中の１
〜１０単位の酵素を用いて３７℃で１〜２時間インキュ
ベートすることにより、約１マイクログラム（μｇ）の
プラスミド又はＤＮＡ配列を開裂する。制限酵素と共に
インキュベートした後に、フェノール／クロロホルム抽
出によりタンパク質を除去し、エタノールと共に沈殿さ
せてＤＮＡを回収する。開裂断片は、当業者に公知の方
法により、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気
泳動法を用いて分離してもよい。
【０１６２】混合物中に存在する適切なデオキシヌクレ
オチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で，Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウ）を用いて
付着端開裂断片をブラント末端にしてもよい。Ｓ１ヌク
レアーゼによる処理を使用して、一本鎖ＤＮＡ部分を加
水分解してもよい。
【０１６３】Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰを用い、
標準的な緩衝液及び温度条件下で結合する。付着端結合
は、ブラント末端結合ほどＡＴＰやリガーゼを必要とし
ない。ベクター断片を結合混合物の一部として使用する
ときは、ベクター断片をしばしば細菌アルカリ性ホスフ
ァターゼ（ＢＡＰ）又は仔ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼで処理して、５’−ホスフェートを除去し、ベクタ
ーの再結合を妨げる。あるいは、所望しない断片の制限
酵素消化を使用して、結合を妨げることができる。結合
混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉや、抗生物質耐性を含む方法に
より選択された良好な形質転換細胞のような適切なクロ
ーニング宿主内に形質転換し、次いで正しい構築につい
てスクリーニングする。
【０１６４】望ましいＤＮＡ配列の構築 Ｗａｒｎｅｒ，ＤＮＡ ３：４０１（１９８４）が記載
するような自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて、
合成オリゴヌクレオチドを産生してもよい。所望とあれ
ば、標準的な反応条件を用いて、32Ｐ−ＡＴＰの存在下
にてポリヌクレオチドキナーゼで処理して、合成鎖を32
Ｐで標識することができる。ＤＮＡ配列（例えばゲノム
又はｃＤＮＡライブラリーから単離したＤＮＡ配列）
を、公知の方法［例えばＺｏｌｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０：６４８７（１９８２）に記
載の特定部位の突然変異誘発］により改変してもよい。
簡潔に言えば、改変すべきＤＮＡを一本鎖配列としてフ
ァージ内にパッケージングし、改変すべきＤＮＡ部分に
相補的であり、自身の配列に所望の改変を含む合成オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡポリメ
ラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複
製を含む形質転換細菌の培養物を寒天平板培養して、プ
ラークを得る。理論的には新しいプラークの５０％が、
突然変異配列を有するファージを含み、残りの５０％は
元の配列を有する。非改変配列ではなく、正しい鎖との
ハイブリダイゼーションに適した温度及び条件下で、プ
ラーク複製物を標識した合成プローブにハイブリダイズ
する。ハイブリダイゼーションにより同定された配列を
回収して、クローニングする。
【０１６５】プローブとのハイブリダイゼーション Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：３９６１
（１９７５）に記載の手順を用いて、ＨＧＢＶゲノム又
はＤＮＡライブラリーをプロービングしてもよい。簡潔
に言えば、プロービングすべきＤＮＡをニトロセルロー
スフィルター上に固定化し、変性し、０〜５０％ホルム
アミド、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナト
リウム、それぞれ０．０２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、ポリビニルピロリドン及びＦｉｃｏ
ｌｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．
１％ＳＤＳ並びに１００μｇ／ｍｌキャリヤー変性ＤＮ
Ａを含む緩衝液でプレハイブリダイズする。緩衝液中の
ホルムアミドのパーセンテージ、及びプレハイブリダイ
ゼーションやその後のハイブリダイゼーション工程の時
間／温度条件は、必要とされる厳密度に依存する。厳密
度条件が低くてもよいオリゴマープローブは一般に、ホ
ルムアイドを低率に、温度をより低く、ハイブリダイゼ
ーション時間をより長くして使用する。ｃＤＮＡ又はゲ
ノム配列から誘導されるような３０又は４０個以上のヌ
クレオチドを含むプローブは一般に、例えば約４０〜４
２℃のより高温と、例えば５０％と高率のホルムアミド
を使用する。プレハイブリダイゼーションの後に、32Ｐ
標識オリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し、ハ
イブリダイゼーション条件下でフィルターをこの混合物
中でインキュベートする。洗浄後、被処理フィルターを
オートラジオグラフィーにかけて、ハイブリダイズした
プローブの位置を示す。元の寒天プレート上の対応位置
にあるＤＮＡを所望のＤＮＡのソースとして使用する。
【０１６６】構築の検証及び配列決定 標準的なベクター構築では、結合混合物をＥ．ｃｏｌｉ
株ＸＬ−１ブルー又は他の適切な宿主内に形質転換し、
良好な形質転換細胞を抗生物質耐性又は他のマーカーに
より選択する。次いで、通常はＣｌｅｗｅｌｌ等，Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０：６６７（１９７２）に記
載のようなクロラムフェニコール増幅の後に、Ｃｌｅｗ
ｅｌｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ６２：１１５９（１９６９）の方法で、形質転換
細胞由来のプラスミドを産生する。ＤＮＡを単離し、通
常は制限酵素分析及び／又は配列決定により分析する。
Ｍｅｓｓｉｎｇ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．９：３０９（１９８１）にも記載されているＳａｎ
ｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７４：５４６３（１９７７）のよく知られたジデ
オキシ法により、又はＭａｘａｍ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５：４９９（１９８
０）に記載の方法により、配列決定してもよい。ＧＣに
富む領域で時々観察されるバンド圧縮の問題は、Ｂａｒ
ｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：４２８（１９
８６）に記載の方法により、Ｔ−デアゾグアノシンを用
いて克服される。
【０１６７】エンザイムリンクドイムノソーベントアッ
セイ エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）を使用して、抗原濃度又は抗体濃度を測定するこ
とができる。この方法は、酵素ラベルと抗原又は抗体と
の結合に依存し、結合酵素活性（生成シグナル）を定量
ラベル（測定可能な生成シグナル）として使用してい
る。酵素をラベルとして使用する方法、及びこのような
酵素ラベルの例は本明細書に記載する。
【０１６８】ＨＧＢＶ核酸配列の作成 非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型物質のソース
は、本明細書に記載する臨床学的実験基準に合致するＨ
ＧＢＶウイルスに感染したヒト又はタマリンからの個々
の血漿、血清もしくは肝臓ホモジネート又はそのプール
である。あるいは、以下に記載する基準に合致する非Ａ
型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型肝炎に羅患した他の個体の
血液をタマリンに実験的に感染させることができる。高
レベルのアラニントランスフェラーゼ活性を含む個々の
血漿、血清又は肝臓ホモジネート試料を多数合わせてプ
ールを調製することができる。この活性は、ＨＧＢＶ感
染による肝炎性損傷によるものである。本発明者らの実
験のひとつで計算したウイルスのＴＩＤ（タマリン感染
価）は４×１０5個／ｍｌ以上であった（以下の実施例
２を参照）。
【０１６９】例えば、高力価であることが好ましいが、
必ずしもそうでなくてもよい血漿、血清又は肝臓ホモジ
ネートに由来する核酸ライブラリーを以下の方法で作成
する。まず血漿、血清又は肝臓ホモジネートからウイル
ス粒子を単離する。次いで、アリコートを緩衝溶液（例
えば５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝溶液）中に希
釈する。例えば１５，０００×ｇ、２０℃で２０分間の
遠心分離により破片を除去する。次いで、当業者により
慣用的に決定され得る適切な条件下で遠心分離を行っ
て、得られた上清中のウイルス粒子をペレット化する。
ウイルスゲノムを放出するために、ペレットをＳＤＳ懸
濁液［例えば１％ＳＤＳ、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含み、更に２ｍｇ
／ｍｌのプロテイナーゼＫを含んでいる懸濁液］のアリ
コート中に懸濁させ、次いで適切な条件下で、例えば４
５℃で９０分間インキュベートして粒子を破壊する。例
えば０．８μｇ ＭＳ２バクテリオファージＲＮＡをキ
ャリヤーとして添加し、この混合物をフェノール：クロ
ロホルム［０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．１
％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノロンで飽和させたフェノー
ル］の１：１混合物で４回抽出し、次いでクロロホルム
で２回抽出して核酸を単離する。水性相を例えば１−ブ
タノールで濃縮した後に、２．５容量の無水エタノール
と共に−２０℃で一晩沈殿させる。例えばＢｅｃｋｍａ
ｎ ＳＷ４１ローターにて、４０，０００ｒｐｍ、４℃
で９０分間遠心分離にかけて核酸を回収し、これを水に
溶解し、０．０５％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネー
トで処理して、オートクレーブ処理する。
【０１７０】前記手順により得られた核酸を、例えば１
７．５ｍＭ ＣＨ3ＨｇＯＨで変性し、次いでこの変性
核酸を鋳型として用いてｃＤＮＡを合成し、例えばＨｕ
ｙｎｈ（１９８５、上掲）に記載の方法を用いてファー
ジλ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位内にクローニングす
る。但し、逆転写酵素により第１核酸鎖の合成中にラン
ダムプライマーをオリゴ（ｄＴ）１２−１８に代える
（Ｔａｙｌｏｒ等，［１９７６］参照）。得られた二本
鎖核酸配列を、例えばセファロースＣＬ−４Ｂカラム上
でのサイジングにより分別する。平均寸法が約４００、
３００、２００及び１００塩基対の溶離材料をゲノムプ
ール内にプールする。少なくとも１つのプール内のｃＤ
ＮＡから、λ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーを作成
する。あるいは、病因剤がＤＮＡウイルスの場合、ゲノ
ムＤＮＡのクローニング方法が有用であり、これは当業
者には公知である。
【０１７１】このようにして作成されたλ−ｇｔ１１ゲ
ノムライブラリーを、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型
肝炎既往個体（以下で説明する基準に合致する）からの
血清、血漿又は肝臓ホモジネートと特異結合し得るエピ
トープについてスクリーニングする。Ｈｕｙｎｇ等（上
掲）の方法を用いて、約１０4〜１０7個のファージを血
清、血漿又は肝臓ホモジネートと共にスクリーニングす
る。125Ｉ又は他の適切なリポーター分子（例えばＨＲ
ＰＯ、アルカリ性ホスファターゼ等）で放射性標識した
ヒツジ抗ヒトＩｇ抗血清で結合ヒト抗体を検出すること
ができる。陽性ファージを同定して、精製する。次い
で、同一方法を用い、先にＨＧＢＶ物質に感染した所定
人数の各ヒトの血清との結合の特異性について、前記フ
ァージを試験する。理想的には、ファージは、試験する
血清、血漿又は肝臓ホモジネートの全て又は大半と反応
するポリペプチドをコードし、ＨＧＢＶ物質やＡ型、Ｂ
型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎について本明細書に記載した
基準により“陰性”であることが確定した個体からの血
清、血漿又は肝臓ホモジネートとは反応しない。これら
の手順に従って、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非
Ｅ型であると同定された患者からの血清、血漿又は肝臓
ホモジネートにより免疫学的に特異認識されるポリペプ
チドをコードするクローンを単離することができる。
【０１７２】
【実施例】以下で本発明を実施例により説明する。これ
らの実施例は例示的であって、本発明の範囲を限定する
ものではない。
【０１７３】ＨＧＢＶの伝播性に関しては、米国特許第
０８／２８３，３１４号、米国特許第０８／２４２，６
５４号、及び米国特許第０８／１９６．０３０号に記載
のような初期の研究が行われている。前記特許は全て予
め参考として本明細書に組み入れる。更なる感染性の研
究は、前述の３件の特許出願や、共に１９９４年１１月
２３日出願の米国特許第０８／３４４，１８５号及び第
０８／３４４，１９０号に開示されている。この２件の
特許出願も予め参考として本明細書に組み入れる。前述
の特許出願は更に、ＨＧＢＶクローン配列の伸長（ＨＧ
ＢＶ配列の作成、ＨＧＢＶ中に２種のＨＣＶ様ウイルス
が存在する証拠、ＧＢ−Ａ及びＧＢ−Ｂが２つの異なる
ＲＮＡ種及び異なるウイルスを示す証拠、及びＨＧＢＶ
−Ａ及びＨＧＢＶ−Ｂがフラビウイルス因子である証
拠）に関する実施例；免疫原ＨＧＢＶポリペプチドの発
現及び検出のためのＣＫＳベースの発現ベクター系、組
換えタンパク質やその精製プロトコルを使用し、ポリス
チレンビーズコーティング手順を含んでいた血清学的研
究、ＨＧＢＶに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ
プロトコル、並びに感染個体（例えばヒト及びタマリ
ン）の血清中でのＨＧＢＶ誘導ＲＮＡの検出を詳述する
実施例；ヒト集団でのＨＧＢＶ暴露の証拠（例えば使用
する実験プロトコル、カットオフ測定、補足試験、危険
性の低い試験片や世界各国で肝炎の“危険性あり”と判
定された個体からの試験片により得られた血清学的デー
タ、及び試験から得られた血清学的結果の統計学的有意
性）を詳述する実施例；ヒト集団でのＨＧＢＶ暴露を証
拠付ける付加的な研究（例えば使用する実験プロトコ
ル、カットオフ測定、補足試験、危険性の低い試験片で
得られた血清学的データ、肝炎の“危険性がある”個体
から得られた血清学的データ、及び血清学的結果の統計
学的有意性）を詳述する他の実施例；ヒトでのＧＢ関連
ウイルスの同定、この同定の詳細な科学的論証、長さが
計５１６３ｂｐのヌクレオチド配列：ＨＧＢＶ−ＣのＮ
Ｓ３様領域の詳細なクローニング、ＧＢ−Ｃが外因性で
あるという結果をもたらす科学的実験、ＧＢ−Ｃを付加
的なヒト血清試料で検出できる実験、ＨＧＢＶ−Ｃ配列
（全ては５１６３ｂｐの核酸配列及び６フレーム翻訳と
して示された）を伸長するために使用されるＰＣＲウォ
ーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）技術を詳述する実験を説明
する他の実施例を開示している。これらの配列は、予め
参考として本明細書に組み入れた１９９４年１１月２３
日出願の米国特許第０８／３４４，１９０号に記載され
ている。この配列は、米国特許第０８／３４４，１９０
号に記載の、先に１９９４年１１月８日付けでＡ．Ｔ．
Ｃ．Ｃ．に寄託され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９７
１１を付与されたクローンｐＨＧＢ−Ｃクローン＃１か
ら得られたものである。これらの配列は米国特許第０８
／３４４，１９０号では、配列番号７６及びその考えら
れる６個のリーディングフレームとして同定されてい
る。１９９５年１月３０日出願の米国特許第０８／３７
７，５５７号（予め参考として本明細書に組み入れる）
は、５１６３ｂｐの配列を８０８７ｂｐの長さに伸長
し、更には８０８７ｂｐ配列の３個のフォワードリーデ
ィングフレームの翻訳を提供した。米国特許第 号
（代理人事件整理番号５５２７．ＰＣ．０１、１９９５
年２月１４日出願）は、８０８７ｂｐのＨＧＢＶ−Ｃを
９０３４ｂｐに伸長し、更にはＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ
−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃに関する付加的な血清学的データ
を提供した。以下の実施例では、ＨＧＢＶ−Ｃ配列を８
８ｂｐ伸長し、従って配列を９１２２ｂｐまで伸長し、
更には西アフリカでのＰＣＲ結果と抗体検出とを相関さ
せ、ボランティア血液ドナー、Ｉ．Ｖ．薬使用者及び非
Ａ−Ｅ型肝炎個体でのＰＣＲ結果を要約することにより
ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃの血清学
的データを更新する。かくして、以下の実施例は例示的
であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１７４】実施例１．ＧＢＶ−Ｃゲノムの５’末端の
伸長 逆ＰＣＲ（Ｍ．Ｚｅｉｎｅｒ及びＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：１０５１−１０５
３［１９９４］）のような公知の技術を使用して、ＧＢ
Ｖ−Ｃウイルスゲノムの５’末端に位置する新たな配列
を単離した。全核酸を２５マイクロリットルのＧ１３１
血清（ＵＳＢＤＮＡ／ＲＮＡ単離キット）から抽出し
た。（Ｍ．Ｚｅｉｎｅｒ及びＵ．Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，上掲に記載の）ＢＭＢから得
られたキットを用いて、ＧＢ特異的プライマー（配列番
号４）を使用する逆転写反応を実施した。但し、核酸は
７０℃で５分間変性し、次いで氷上に置いてから、ＲＴ
反応を開始した。Ｍ．Ｚｅｉｎｅｒ及びＵ．Ｇｅｈｒｉ
ｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，上掲に記載の方法
で二本鎖環状ｃＤＮＡを生成した。これらの環状ｃＤＮ
Ａ分子は、その後のＰＣＲ反応の鋳型として機能した。
第１のＰＣＲ反応（ＰＣＲ−１）では、２個のプライマ
ー（配列番号７及び８）を使用した。一方のプライマー
（配列番号７）は、市販キットを製造業者の指示通りに
用いてビオチニル化した。ビオチニル化したプライマー
を取り込んだＰＣＲ−１生成物を、磁気粒子（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて精製した。こ
れらの精製産物を第２のＰＣＲ反応（ＰＣＲ−２）の鋳
型として使用した。ＰＣＲ−２プライマーを配列番号９
及び１０として同定した。
【０１７５】ＰＣＲ−２の産物をＥ．ｃｏｌｉベクター
ｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）中にクローニングし、ＵＳＢ製配列決定キットを
用いて配列決定した。同一の８８ｂｐインサートを有
し、両端部に予想されるプライマー配列を含む２個のク
ローンが得られた。その後の“ウォークバック”実験用
のこの新たな配列に基づくＰＣＲプライマーを設計し
て、この新たな配列がＧＢＶ−Ｃゲノムと隣接し且つそ
れらがＧＢＶ−Ｃゲノムの５’末端に由来することを検
証した。“ウォークバック”実験＃１では、特定のＰＣ
Ｒプライマー（配列番号１１及び１２）を用いて予想さ
れる産物寸法（約２２０ｂｐ）を得た。“ウォークバッ
ク”実験＃２では、特定のプライマー（配列番号１３及
び１４）を用いて予想される配列を得た。結論として
は、“ウォークバック”実験１及び２から得られた産物
の配列により、新たな配列がＧＢＶ−Ｃ配列と隣接する
（即ち重複する）ことが確定した。
【０１７６】実施例２．非Ａ−Ｅ型肝炎ヒトでのＨＧＢ
Ｖ−Ｃの存在 本発明者らが以前に米国特許第 号（代理人事件整
理番号５５２７．ＰＣ．０１、１９９５年２月１４日出
願）に記載したように、ＨＧＢＶ−Ｃ特異的ＥＬＩＳＡ
の生成により、非Ａ−Ｅ型肝炎患者の免疫陽性血清を同
定することができた（ＨＧＢＶ−Ｃ血清試験の実施
例）。これらの血清を、報告された非Ａ−Ｅ型肝炎症例
の個体からの数種のＨＧＢＶ−Ａ及び／又はＨＧＢＶ−
Ｂ免疫陽性血清（表２）と共に、ＨＧＢＶ−Ｃ配列につ
いてＲＴ−ＰＣＲで調べた。ＨＧＢＶ−Ｃ変異体の検出
の可能性を増すために、第１ラウンドの増幅で変性ＮＳ
３オリゴヌクレオチドプライマーを、次いで第２ラウン
ドの増幅ではネスティッド（nested）ＧＢ−Ｃ特異的プ
ライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。簡潔に言え
ば、２ｍＭ ＭｇＣｌ2及び１μＭプライマーｎｓ３．
２−ｓｌ及びｎｓ３．２−ａｌ（それぞれ配列番号５及
び６）を用いて、実施例６に記載の方法で生成した血清
ｃＤＮＡ産物で第１ラウンドの増幅を実施した。反応
を、４０サイクルの変性−アニーリング−伸長［（９４
℃で３０秒間、３７℃で３０秒間、２分の勾配で７２
℃、７２℃で３０秒間）を３サイクル、次いで（９４℃
で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を
３７サイクル］に付し、次いで７２℃で１０分間の伸長
に付した。完了した反応を４℃で保持した。２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、１μＭ ＧＢ−Ｃ特異的プライマー（配列番
号２及び３）、第１の４％ＰＣＲ産物を鋳型として用い
て第２ラウンドの増幅を実施した。第２ラウンドの増幅
は、増幅すべき鋳型とは不適合の塩基対を含み得るオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて特異産物を増幅する
ように設計されたサーモサイクリングプロトコルを用い
た［Ｒｏｕｘ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：
８１２−８１４（１９９４）］。特に、反応物を、４３
サイクル（９４℃で２０秒間、０．３℃／サイクル／３
０秒間で５５℃まで下温、７２℃で１分間）、次いで１
０サイクル（９４℃で２０秒間、４０℃で３０秒間、７
２℃で１分間）、最後に７２℃で１０分間伸長の熱処理
を施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離
し、核酸をエチジウムブロマイドで直接染色した後に紫
外線で可視化し、次いでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフ
ィルターにサザントランスファーした後に放射性標識し
たプローブにハイブリダイズした。ＰＣＲ産物を文献に
記載の方法によりクローニングし、配列決定した。
【０１７７】前述の方法を用いて、ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ
−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６及びＧＢ−Ｃ．７を得た。これ
らの配列は、ＧＢ−Ｃ（配列番号４００、米国特許第
号、代理人事件整理番号５５２７．ＰＣ．０１、１９９
５年２月１４日出願の塩基４１６７−４３６５）、即ち
本明細書の配列番号１の塩基４２５５〜４４５３と８
２．１〜８６．６％同一である。予測される３塩基組成
のコドンでＧＢ−Ｃの相同領域に整列したＧＢ−Ｃ．
４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６及びＧＢ−Ｃ．７の配
列が異なることは、ヌクレオチドの違いの大半がＧＢ−
Ｃからのアミノ酸変化をもたらさないことを示してい
る。アミノ酸レベルでこのように配列全体が保存されて
いることは、ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．
６及びＧＢ−Ｃ．７が、同一ウイルスＨＧＢＶ−Ｃの異
なる株から誘導されたことを示唆している。更には、ヌ
クレオチドレベルでの配列相違のレベルは、これらのＰ
ＣＲ産物が、予め同定されたＧＢ−Ｃ配列のどれかと汚
染した結果ではないことを示している。
【０１７８】これらの個体のうち３つ（ＧＢ−Ｃ．４、
ＧＢ−Ｃ．５及びＧＢ−Ｃ．７のソース）は、Ａ型肝炎
ウイルス感染の証拠も、Ｂ型肝炎ウイルス感染の証拠
も、Ｃ型肝炎ウイルス感染の証拠もなかった。病因の不
明な肝炎に羅患したこれらの個体にＧＢ−Ｃ配列が存在
することは、ＨＧＢＶ−Ｃがヒト肝炎の病因のひとつで
あることを示唆している。（ＧＢ−Ｃ．４及びＧＢ−Ｃ
５を含む）２個体で、連続試料が使用可能である。これ
らの試料でＨＧＢＶ−Ｃ配列をフォローするために、ク
ローン特異的ＲＴ−ＰＣＲが開発された。簡潔に言え
ば、予め参考として本明細書に組み入れる米国特許第
号（代理人事件整理番号５５２７．ＰＣ．０１、１
９９５年２月１４日出願）の実施例７と同様のランダム
ヘキサマーを用いて、血清から抽出した核酸を逆転写し
た。得られたｃＤＮＡを４０サイクルの増幅（９４℃で
３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、次
いで７２℃で１０分間の伸長に付した。ＧＢ−Ｃ．４又
はＧＢ−Ｃ．５特異的ＰＣＲプライマー（それぞれＧＢ
−Ｃ．４−ｓ１及びＧＢ−Ｃ．４−ａ１、又はＧＢ−
Ｃ．５−ｓ１及びＧＢ−Ｃ．５−ａ１）を１．０μＭ濃
度で使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で
分離し、核酸をエチジウムブロマイドで直接染色した後
に紫外線で可視化し、次いでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロ
ンフィルターにサザントランスファーした後に放射性標
識したプローブにハイブリダイズした。
【０１７９】ＧＢ−Ｃ．４は、エジプト人急性非Ａ−Ｅ
型肝炎患者の血清中で検出された。この患者はＨＧＢＶ
−Ａタンパク質に対して血清陽性であった。エジプト人
患者からの５個の連続試料のＲＴ−ＰＣＲはウイルス血
症を示し、これは血清ＡＬＴ値の正常化以後少なくとも
２０日間続いた（表３）。血清ＡＬＴの正常化後にＧＢ
−Ｃ配列が存在することは、ＨＧＢＶ−Ｃがある個体で
慢性感染をおこし得ることを示唆していた。しかしなが
ら、この患者からの別の試料がないため、慢性ＨＧＢＶ
−Ｃに関する結論を出すことはできない。この問題を解
決するため別の試料を試験する。
【０１８０】ＧＢ−Ｃ．５は、カナダ人肝炎関連無形成
性貧血患者から入手した。この患者からの各試料は、
Ｃ．７ＥＬＩＳＡ（予め参考として本明細書に組み入れ
る米国特許第 号［代理人事件整理番号５５２７．
ＰＣ．０１、１９９５年２月１４日出願］の実施例２
０）で血清陽性であった。ＧＢ−Ｃ．５は、ＧＢ−Ｃ．
５特異的プライマー（ＧＢ−Ｃ．５−ｓ１及びＧＢ−
Ｃ．５−ａ１）を用いて、カナダ人無形成性貧血患者か
ら発症中（発症から１３日後）及び死亡時に得た試料中
で検出された。しかしながら、ＧＢ−Ｃ．５特異的ＰＣ
Ｒでは、発症時（０日、急性肝炎）及び３日目（肝不
全）にＧＢ−Ｃ．５配列を検出することはできなかっ
た。従って、第１試料中に検出限界以下のＧＢ−Ｃ．５
が存在したかどうかは不明である。存在するとすれば、
ＨＧＢＶ−Ｃがこの患者の無形成性貧血の病因であっっ
たかもしれない。しかしながら、ＧＢ−Ｃ．５は骨髄性
無形成発症中にのみＲＴ−ＰＣＲにより検出されたの
で、ＧＢ−Ｃ．５は貧血治療のために投与された血液製
剤によりもたらされたものかもしれない。この場合、Ｈ
ＧＢＶ−Ｃと無形成性貧血との関連は、ＨＣＶと同様で
あろう［Ｈｉｂｂｓ等，ＪＡＭＡ２６７：２０５１−２
０５４（１９９２）］。
【０１８１】ＨＧＢＶ−ＣとＨＣＶとは関連性が少ない
ために、現在のＨＣＶ感染検出方法がＨＧＢＶ−Ｃを含
むヒト試料を認識するかどうかを調べることが重要であ
った。ＨＣＶにさらされた又は感染した個体の現行の検
出は、ＨＣＶ−１の３カ所以上の領域に由来する抗原を
使用する抗体試験に依存する。ＨＣＶ配列（“ＨＣＶ−
１”）はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｍ６２３
２１（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２：３４
４１−３４４４（１９９４））から入手できる。これら
の試験により、大半の個体でＨＣＶの全ての既知の遺伝
子型に対する抗体を検出することができる（Ｓａｋａｍ
ｏｔｏ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７６１−
１７６８［１９９４］）；Ｓｔｕｙｖｅｒ等，Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０９３−１１０２（１９９
３）］。予め参考として本明細書に組み入れる米国特許
第 号（代理人事件整理番号５５２７．ＰＣ．０
１、１９９５年２月１４日出願）の実施例１０及び本明
細書の表２に記載するＨＧＢＶ−Ｃを含む試料で、ＨＣ
Ｖに対する第２世代のＥＬＩＳＡを実施した。ＨＧＢＶ
−Ｃを含む４個の試料のうち１個は、ＨＣＶ抗原に対し
て血清陽性であった。ＨＣＶに対して血清陰性を示す限
定された数のヒト血清は、高感度ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ではＨＣＶゲノムＲＮＡに対し陽性を示した（Ｓｕｇｉ
ｔａｎｉ，Ｌａｎｃｅｔ ３３９：１０１８−１０１９
［１９９２］）。（予め参考として本明細書に組み入れ
る米国特許第 号（代理人事件整理番号５５２７．
ＰＣ．０１、１９９５年２月１４日出願）の実施例９に
記載する）同様のＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、血清陽
性試料中にＨＣＶウイルス血症が存在することが確定し
た。しかしながら、ＨＣＶ血清陰性試料のいずれも、Ｈ
ＣＶウイルス血症ではなかった。従って、ＨＧＢＶ−Ｃ
配列を含む４個体のうち１つはＨＣＶ感染の証拠を示し
たが、ＨＣＶの存在を調べる現行のアッセイは、ＨＧＢ
Ｖ−Ｃの存在を正確には予示しなかった。一人のＨＣＶ
陽性患者は同時にＨＧＢＶ−Ｃにも感染しているように
思える。この患者で確認された肝炎がＨＣＶ、ＨＧＢＶ
−Ｃ又はこれらのウイルスの両方の存在によるものであ
ったのかどうかは不明である。このＨＧＢＶ−Ｃ及びＨ
ＣＶが同一患者で検出されるということは、これらの感
染に対して共通の危険因子が存在することを示唆し得
る。
【０１８２】前述のＰＣＲプロトコルを用いて、前述の
ＧＢ−Ｃ単離物と約８５％同一のＧＢ−Ｃ配列を、１９
９４年に得られた２人の自発的な米国人ボランティアド
ナーの“正常な”血液ユニットで同定した。これらのユ
ニットは、ＨＢＶ、ＨＣＶに対する試験で陰性を示し、
また正常な血清ＡＬＴ値を示した。しかしながら、これ
らのユニットは１．４ＥＬＩＳＡ試験では陽性であっ
た。免疫スクリーニングした約１０００ユニットのうち
少なくとも２ユニットの“正常”血液でＨＧＢＶ−Ｃが
検出されたことは、このウイルスが現在米国の血液供給
物中に存在することを示唆している。しかしながら、本
発明者らは、ＨＧＢＶタンパク質から開発されたＥＬＩ
ＳＡ及びＨＧＢＶ配列に由来するヌクレオチドプローブ
を用いて、これらの血液ユニットを同定できることを実
証する。
【０１８３】様々なＧＢ−Ｃ配列中で多量の配列変動が
確認された。ウイルス核酸用のＰＣＲベースのアッセイ
は、高感度ではあるが、オリゴヌクレオチドプライマー
とウイルス鋳型との配列適合に依存する。従って、この
研究で使用されるＰＣＲプライマーは、様々な単離物中
にうまく保存されていないＨＧＢＶ−Ｃゲノムの領域に
位置するために、全てのＨＧＢＶ−Ｃウイルス血症試験
試料が、今回使用したＲＴ−ＰＣＲアッセイで検出でき
たわけではない。ＨＧＢＶ−Ｃゲノムのうまく保存され
た領域に由来するＰＣＲプライマーを使用すると、ＨＣ
Ｖ５’未翻訳領域での検出のように［Ｃｈａ等，Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２９：２５２８−２５３
４（１９９１）］、ＨＧＢＶ−Ｃウイルス血症試料のよ
り正確な検出が可能となるはずである。
【０１８４】
【表２】
【０１８５】
【表３】
【０１８６】（米国特許第 号（代理人事件整理番
号５５２７．ＰＣ．０１、予め参考として本明細書に組
み入れる）に記載するように、幾つかのカテゴリーのヒ
ト集団（例えば静脈内薬使用者（ＩＶＤＵ）、西アフリ
カ居住者、ボランティア血液ドナー及び非Ａ非Ｅ型肝炎
個体）の各々で血清陽性試験片を検出した。血清陽性個
体をＲＴ−ＰＣＲで試験すると、幾つかがウイルスＲＮ
Ａに対して陽性であることが確認された。本発明者ら
は、抗体とウイルスＲＮＡ検出との関係を調べることに
した。先にＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ又はＨＣＶ−１
に対して血清陰性であった西アフリカ由来の５２全ての
試験片が、ＲＴ−ＰＣＲでも陰性であった。２個のプラ
イマー（配列番号１５及び配列番号１６）を用いると、
先に西アフリカ由来のＨＧＢＶ−Ｃに対して血清陽性を
示した８０の試験片のうち１４個がＲＴ−ＰＣＲではＨ
ＧＢＶ−Ｃに対し陽性であった。データはこのように、
抗体の存在とウイルスＲＮＡの検出との間の相関関係を
示している。この研究を拡張して、他のカテゴリーの個
体を含めた。先にＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又
はＨＣＶ−１に対して血清陰性を示した計７７人のボラ
ンティア血液ドナーをＲＴ−ＰＣＲで試験した。２個の
プライマー（配列番号１５及び配列番号１６）を用いる
と、１個の個体がＲＴ−ＰＣＲではＨＧＢＶ−Ｃに対し
陽性であることが判明した。２個のプライマー（配列番
号１５及び配列番号１６）を用いると、先にＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又はＨＣＶ−１に対して陽性で
あった１０人のボランティア血液ドナーのうち、１個体
がＲＴ−ＰＣＲでＨＧＢＶ−Ｃに対し陽性であった。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ及び２個のプライマー（配列番号１５、配列
番号１６）を用いると、ＩＶＤＵから得たＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又はＨＣＶ−１に対して血清陽
性の１３個の試料のうち、２個の試料がＨＧＢＶ−Ｃに
対しても陽性であった。ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及
び／又はＨＣＶ−１に対して血清陰性のＩＶＤＵ試料は
試験しなかった。最後に、ＲＴ−ＰＣＲでは、先にＨＧ
ＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｃ及び／又はＨＣＶ−１に対して
血清陰性であった４０個の非Ａ−Ｅ型肝炎試験片中にウ
イルスＲＮＡは検出されなかった。ＲＴ−ＰＣＲ及び２
個のプライマー（配列番号１５、配列番号１６）を用い
ると、先にＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又はＨＣ
Ｖ−１に対して陽性であった３７個の非Ａ−Ｅ型肝炎試
料のうち、９個がＨＧＢＶ−Ｃに対して陽性であった。
データはこのように、抗体の存在とウイルスＲＮＡの検
出との間の相関関係を示している。
【０１８７】本発明はこのように、試験試料中でＨＧＢ
Ｖ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又はＨＧＢＶ−Ｃの存在を
調べるための試薬及び方法を提供する。本明細書に記載
のＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又はＨＧＢＶ−Ｃ
に特異的なポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（も
しくはその断片）、又はこれらのポリペプチド及びポリ
ヌクレオチドから産生される抗体を慣用的なアッセイ試
薬と合わせて、これらのウイルスに対する抗体を検出す
るための現行のアッセイ手順に組み込むことができると
考えられ、これは本発明の範囲内である。あるいは、本
明細書に記載するＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び／又
はＨＧＢＶ−Ｃに特異的なポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド（もしくはその断片）、又はこのようなポリ
ペプチド及びポリヌクレオチド（もしくはその断片）か
ら産生される抗体を、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及び
ＨＧＢＶ−Ｃウイルスの検出に使用することができる。
【０１８８】特許内容を考慮すれば、本発明の他の使用
又は変形は当業者には自明であろう。従って、本発明は
上述の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとす
る。
【０１８９】
【配列表】
配列番号１： 配列の長さ：９１２２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列：
【０１９０】
【表４】
【０１９１】
【表５】
【０１９２】
【表６】
【０１９３】
【表７】
【０１９４】
【表８】
【０１９５】
【表９】
【０１９６】配列番号２： 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GACGTTGGTG AGATCCCCTT 20 配列番号３： 配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CGAAGTTTCC TGTGTACCC 19 配列番号４： 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCAGAGCCAC CAGGCATCCG C 21 配列番号５： 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴 特徴を表す記号：イノシン 存在位置：３，６，９ 配列： GCIACIGCIA CNCCNCCNGG 20 配列番号６： 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴 特徴を表す記号：イノシン 存在位置：６，８，９ 配列： ATGGTIAIIG TNGGRTCHAR R 21 配列番号７： 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCTATAGTGG CATCCAGGAT GACG 24 配列番号８： 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GCTACGGTCC CTCTTGCGCA TATG 24 配列番号９： 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCATCCACCA CCTTT 15 配列番号１０： 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCTGGAGGAC ATAGGCTTCT GCCTG 25 配列番号１１： 配列の長さ：２２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCAACACCTG TGGACCGTGC GC 22 配列番号１２： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCAGAAACCG ACGCCTACTG AGG 23 配列番号１３： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CACTGGTCCT TGTCAACTCG CCG 23 配列番号１４： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GCCTACTGAA GTAGACGTAA TGG 23 配列番号１５： 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGNRMKRTYC CYTTTTATGG GCATGG 26 配列番号１６： 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ＡＣＮＡＣＮＡＧＧＴ ＣＮＣＣＲＴＣＹＴＴ ＧＡＴ
ＧＡＴ ２６
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/10 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/531 Ａ 33/531 33/566 33/566 33/576 Ｚ 33/576 33/577 Ｂ 33/577 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 タミ・ジエイ・パイロツト−マテイアス アメリカ合衆国、イリノイ・60048、グリ ーン・オークス、クランブルツク・ロー ド・2100 (72)発明者 ジヨージ・ジエイ・ドーソン アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、サウス・ダイモンド・ロー ド・914 (72)発明者 ジヨージ・ジー・シユローダー アメリカ合衆国、イリノイ・60076、スコ ークル、カーロブ・7640 (72)発明者 シユアシユ・エム・デサイ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、アミイ・レイン・1408 (72)発明者 トーマス・ピー・リーリイ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノーシヤ、ワンハンドレツド・セブン ス・アベニユー・6820 (72)発明者 アンソニイ・スコツト・ミユアホフ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノーシヤ、シツクステイ・エイス・プレ イス・611 (72)発明者 シエリ・エル・ビイク アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク、プリンストン・コート・ 660 (72)発明者 ジエイムズ・カール・アーカー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、ヘイ ンズビル、ノース・ホワイト・テイル・ド ライブ・359 (72)発明者 アイザ・ケー・ミユウシヤワー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク・アーバー・ブールバード・ 18790

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１の位置１〜８８の肝炎ＧＢウ
    イルス（ＨＧＢＶ）−Ｃのゲノムまたはその相補体に選
    択的にハイブリダイズし得る、ＨＧＢＶから誘導された
    精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、ＨＧＢＶ−Ｃ
    のアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するア
    ミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠
    （ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする請求項
    １に記載の精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグメン
    ト。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、ＨＧＢＶ−Ｃ
    のアミノ酸配列と少なくとも４０％の一致率を有するア
    ミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠
    （ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする請求項
    １に記載の精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグメン
    ト。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、ＨＧＢＶ−Ｃ
    のアミノ酸配列と少なくとも６０％の一致率を有するア
    ミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠
    （ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする請求項
    １に記載の精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグメン
    ト。
  5. 【請求項５】 配列番号１の位置１〜８８の肝炎ＧＢウ
    イルス（ＨＧＢＶ）−Ｃのゲノムまたはその相補体に選
    択的にハイブリダイズし得る、ＨＧＢＶから誘導された
    組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
  6. 【請求項６】 ＨＧＢＶ−Ｃの少なくとも１つのエピト
    ープをコードする配列を含む請求項５に記載の組換えポ
    リヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 組換えベクター内に含まれている請求項
    ５に記載の組換えポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 更に、前記ベクターを用いて形質転換さ
    れた宿主細胞を包含する請求項７に記載のポリヌクレオ
    チド。
  9. 【請求項９】 配列番号１の位置１〜８８の肝炎ＧＢウ
    イルス（ＨＧＢＶ）−Ｃゲノムから誘導されたヌクレオ
    チド配列を含むＨＧＢＶ組換えポリヌクレオチドまたは
    そのフラグメント。
  10. 【請求項１０】 前記ポリヌクレオチドが組換えベクタ
    ー内に含まれている請求項９に記載のＨＧＢＶ組換えポ
    リヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 更に、前記ベクターを用いて形質転換
    された宿主細胞を包含する請求項９に記載のＨＧＢＶ組
    換えポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 前記配列がＨＧＢＶ−Ｃのエピトープ
    をコードする請求項９に記載のＨＧＢＶ組換えポリヌク
    レオチド。
  13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチドが組換えベクタ
    ー内に含まれている請求項１２に記載のＨＧＢＶ組換え
    ポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 更に、前記ベクターを用いて形質転換
    された宿主細胞を包含する請求項１３に記載のＨＧＢＶ
    −Ｃ組換えポリヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）から誘
    導されたＤＮＡまたはＲＮＡの読取り枠を含む組換え発
    現系であって、前記読取り枠が、配列番号１の位置１〜
    ８８のＨＧＢＶ−ＣゲノムまたはｃＤＮＡの配列を含み
    且つ所望の宿主と適合性を示す制御配列に操作可能に連
    結されている発現系。
  16. 【請求項１６】 更に、前記組換え発現系を用いて形質
    転換された細胞を包含する請求項１５に記載の発現系。
  17. 【請求項１７】 配列番号１の位置１〜８８を含む精製
    肝炎ＧＢウイルス−Ｃ（ＨＧＢＶ−Ｃ）。
  18. 【請求項１８】 配列番号１の位置１〜８８の肝炎ＧＢ
    ウイルス（ＨＧＢＶ）−Ｃのアミノ酸配列と少なくとも
    ３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテ
    インをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡ
    ゲノムを特徴とするＨＧＢＶに対するポリヌクレオチド
    プローブ。
  19. 【請求項１９】 肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）ポリヌ
    クレオチドを含む疑いのある検査試料中の前記ポリヌク
    レオチドの存在を判定するためのキットであって、配列
    番号１の位置１〜８８のＨＧＢＶ−Ｃのアミノ酸配列と
    少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含む
    ポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む
    正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするヌクレオチド配列を含む
    ポリヌクレオチドプローブを含む容器を具備するキッ
    ト。
  20. 【請求項２０】 肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）を含む
    疑いのある検査試料においてＨＧＢＶ核酸を検出する方
    法であって、 ａ．検査試料を、ＨＧＢＶ−Ｃのアミノ酸配列と少なく
    とも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプ
    ロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖Ｒ
    ＮＡゲノムを特徴とする、配列番号１の位置１〜８８の
    ＨＧＢＶまたはそのフラグメントの配列によってコード
    されるＨＧＢＶポリヌクレオチドに対するプローブと、
    前記プローブと当該検査試料中のＨＧＢＶ核酸との間で
    複合体が形成され得る条件下及び時間で反応させ； ｂ．前記プローブを含む複合体を検出することからなる
    方法。
  21. 【請求項２１】 更に、前記ステップ（ａ）のプローブ
    をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅する
    ステップを含む請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 更に、前記ステップ（ａ）のプローブ
    をリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法によって増幅するステ
    ップを含む請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 医薬上容認可能な賦形剤中に、薬理上
    有効量の、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）−Ｃのアミノ
    酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配
    列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲ
    Ｆ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする、配列番号１
    の位置１〜８８の免疫原性ＨＧＢＶポリペプチドまたは
    そのフラグメントを含むＨＧＢＶ感染治療用ワクチン。
  24. 【請求項２４】 肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）感染治
    療用ワクチンであって、医薬上容認可能な賦形剤中に薬
    理上有効量の不活化または弱毒化された配列番号１の位
    置１〜８８のＨＧＢＶ−Ｃを含むワクチン。
  25. 【請求項２５】 配列番号１の位置１〜８８を含む肝炎
    ＧＢウイルス−Ｃ（ＨＧＢＶ−Ｃ）に感染した組織培養
    増殖細胞。
  26. 【請求項２６】 前記ＨＧＢＶ−Ｃが細胞中にトランス
    フェクトされている請求項２５に記載の組織培養増殖細
    胞。
  27. 【請求項２７】 前記ＨＧＢＶがＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子の
    サブゲノムフラグメントを含む請求項２５に記載の組織
    培養増殖細胞。
  28. 【請求項２８】 配列番号１の位置１〜８８の肝炎ＧＢ
    ウイルスから誘導されたポリヌクレオチドを含む診断試
    薬であって、前記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメ
    ントが、ＨＧＢＶの少なくとも１つのエピトープをコー
    ドし、且つＨＧＢＶ−Ｃのアミノ酸配列と少なくとも３
    ５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテイ
    ンをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲ
    ノムを特徴とする診断試薬。
  29. 【請求項２９】 配列番号１５を含むポリヌクレオチド
    またはその相補体。
  30. 【請求項３０】 配列番号１６を含むポリヌクレオチド
    またはその相補体。
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