JPH0928398A - ｍＲＮＡの特異的決定のための方法と試薬 - Google Patents
ｍＲＮＡの特異的決定のための方法と試薬Info
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- JPH0928398A JPH0928398A JP8209144A JP20914496A JPH0928398A JP H0928398 A JPH0928398 A JP H0928398A JP 8209144 A JP8209144 A JP 8209144A JP 20914496 A JP20914496 A JP 20914496A JP H0928398 A JPH0928398 A JP H0928398A
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- mrna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】試料中の特異的なｍＲＮＡの決定のための
方法、及び該方法を用いる以下の組成物よりなるｍＲＮ
Ａの検出のためのキット、（ａ）溶解緩衝液及びハイブ
リダイゼーション緩衝液、（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な
配列を有する標識ヌクレオチドプローブを有する緩衝溶
液、（ｃ）洗浄緩衝液、（ｄ）逆転写活性を有する酵素
を含む混合物、（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡ
ポリメラーゼを含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つ
の被覆された、熱安定なＲＮアーゼフリーの反応容器を
有する装置。 【効果】本発明により、ｍＲＮＡの精製なしに、１つの
反応容器で逆転写反応とＰＣＲ反応を行う方法及びキッ
トが提供される。
方法、及び該方法を用いる以下の組成物よりなるｍＲＮ
Ａの検出のためのキット、（ａ）溶解緩衝液及びハイブ
リダイゼーション緩衝液、（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な
配列を有する標識ヌクレオチドプローブを有する緩衝溶
液、（ｃ）洗浄緩衝液、（ｄ）逆転写活性を有する酵素
を含む混合物、（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡ
ポリメラーゼを含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つ
の被覆された、熱安定なＲＮアーゼフリーの反応容器を
有する装置。 【効果】本発明により、ｍＲＮＡの精製なしに、１つの
反応容器で逆転写反応とＰＣＲ反応を行う方法及びキッ
トが提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｍＲＮＡの特異的
決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）のための方法と試
薬とキット、すなわち、被覆された固相上のポリ（Ａ）
配列を含む核酸に関する。本発明の方法は、全ＲＮＡの
混合物ならびに培養細胞及び組織細胞の抽出物からｍＲ
ＮＡを定量し検出するために使用することができる。本
発明の方法は、前処理としてｍＲＮＡの濃縮または単離
を必要としない。
決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）のための方法と試
薬とキット、すなわち、被覆された固相上のポリ（Ａ）
配列を含む核酸に関する。本発明の方法は、全ＲＮＡの
混合物ならびに培養細胞及び組織細胞の抽出物からｍＲ
ＮＡを定量し検出するために使用することができる。本
発明の方法は、前処理としてｍＲＮＡの濃縮または単離
を必要としない。
【０００２】
【従来の技術】真核細胞中に存在するほとんどすべての
ｍＲＮＡは、約２０〜２５０のアデノシンヌクレオチド
の末端配列を有し、この事実が大部分のｍＲＮＡの精製
法に利用されている。現在、ｍＲＮＡの標準的な検出及
び定量方法は、逆転写酵素とＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を
組み合わせて利用している（ラリック（Larrick,J.W.),
Trends Biotechnol.10,146-152(1992); カワサキ(Kawas
aki,E.S.),PCR Protocols:A Guide to Methods and App
lications(イニス(Innis,M.A.)ら編集),アカデミックプ
レス，サンジエゴ，カリフォルニア（1990))。ＲＴ−Ｐ
ＣＲに使用される酵素、特にポリメラーゼ類は、コンタ
ミネーションにより容易に阻害されるので、この方法の
出発物質は、精製全ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ）又は精製ｍＲＮＡである。ＲＮＡとｍＲＮＡの精
製法は、例えば、有機溶媒での抽出（フェノール／クロ
ロフォルム等）、オリゴ（ｄＴ）−セルロースによる精
製、又はオリゴ（ｄＴ）で被覆した磁気粒子を用いた単
離等のいくつかの方法が公知である（Sambrook,J.,Frit
sch,E.F.and T.Maniatis,Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Col
d Spring Harbor,N.Y., 2nd edition (1989)；Farell,
R.E.,RNA Modologies: A Laboratory Guide forIsolati
on and Characterization, Academic Press （1993))。
ｍＲＮＡは、約２０〜２５０のアデノシンヌクレオチド
の末端配列を有し、この事実が大部分のｍＲＮＡの精製
法に利用されている。現在、ｍＲＮＡの標準的な検出及
び定量方法は、逆転写酵素とＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を
組み合わせて利用している（ラリック（Larrick,J.W.),
Trends Biotechnol.10,146-152(1992); カワサキ(Kawas
aki,E.S.),PCR Protocols:A Guide to Methods and App
lications(イニス(Innis,M.A.)ら編集),アカデミックプ
レス，サンジエゴ，カリフォルニア（1990))。ＲＴ−Ｐ
ＣＲに使用される酵素、特にポリメラーゼ類は、コンタ
ミネーションにより容易に阻害されるので、この方法の
出発物質は、精製全ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ）又は精製ｍＲＮＡである。ＲＮＡとｍＲＮＡの精
製法は、例えば、有機溶媒での抽出（フェノール／クロ
ロフォルム等）、オリゴ（ｄＴ）−セルロースによる精
製、又はオリゴ（ｄＴ）で被覆した磁気粒子を用いた単
離等のいくつかの方法が公知である（Sambrook,J.,Frit
sch,E.F.and T.Maniatis,Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Col
d Spring Harbor,N.Y., 2nd edition (1989)；Farell,
R.E.,RNA Modologies: A Laboratory Guide forIsolati
on and Characterization, Academic Press （1993))。
【０００３】従って、これらの方法は複雑で自動化する
ことが困難である。さらに、精製は、ビオチン化オリゴ
（ｄＴ）を使用して、有核細胞ｍＲＮＡのポリ（Ａ）を
有する３' 末端とハイブリダイゼーションさせることに
よっても達成できる。それから、例えば、ビオチン−オ
リゴ（ｄＴ）とｍＲＮＡのハイブリッドをストレプトア
ビジンで被覆した粒子に結合させて単離できる。しか
し、それは、比較的大量のｍＲＮＡハイブリッドが存在
する場合のみ単離可能であるという不利な点がある。従
って、混合物は特異的ｍＲＮＡが検出できるほど感度が
良くない。そこで、固相法、すなわち、磁気粒子でのＲ
Ｔ−ＰＣＲ法が開発され、記載されている。しかし、こ
の方法の欠点は、ｍＲＮＡを結合し洗浄した後に、ＰＣ
Ｒに適する、特に熱に安定な反応容器に磁気粒子を移さ
なければならず、さらに別の分離工程が必要となること
である。
ことが困難である。さらに、精製は、ビオチン化オリゴ
（ｄＴ）を使用して、有核細胞ｍＲＮＡのポリ（Ａ）を
有する３' 末端とハイブリダイゼーションさせることに
よっても達成できる。それから、例えば、ビオチン−オ
リゴ（ｄＴ）とｍＲＮＡのハイブリッドをストレプトア
ビジンで被覆した粒子に結合させて単離できる。しか
し、それは、比較的大量のｍＲＮＡハイブリッドが存在
する場合のみ単離可能であるという不利な点がある。従
って、混合物は特異的ｍＲＮＡが検出できるほど感度が
良くない。そこで、固相法、すなわち、磁気粒子でのＲ
Ｔ−ＰＣＲ法が開発され、記載されている。しかし、こ
の方法の欠点は、ｍＲＮＡを結合し洗浄した後に、ＰＣ
Ｒに適する、特に熱に安定な反応容器に磁気粒子を移さ
なければならず、さらに別の分離工程が必要となること
である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、先行技術の方法にみられる欠点のないｍＲＮＡの決
定のための改良方法、およびキットを提供することにあ
る。
は、先行技術の方法にみられる欠点のないｍＲＮＡの決
定のための改良方法、およびキットを提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、以下の
工程によって特徴付けられるポリ（Ａ）配列を含む核酸
の特異的決定法により達成される。
工程によって特徴付けられるポリ（Ａ）配列を含む核酸
の特異的決定法により達成される。
【０００６】即ち、本発明の要旨は、 〔１〕 試料中の特異的なｍＲＮＡの決定のための方法
であって、下記工程を含む方法、（ａ）溶解緩衝液及び
／又はハイブリダイゼーション緩衝液を適当な試料材料
に添加し、必要があればホモジナイズする工程、（ｂ）
ＲＮＡとハイブリダイズする標識ハイブリダイゼーショ
ンパートナーと、試料溶液を接触させる工程、（ｃ）該
ハイブリダイゼーションパートナーとｍＲＮＡ間のハイ
ブリッド複合体の一部を、ＲＮアーゼフリーでかつ該ハ
イブリダイゼーションパートナー上に結合する有機化合
物で被覆した熱安定な反応容器に移す工程、（ｄ）試料
が約４〜５０℃の温度範囲で少なくとも１０秒間インキ
ュベートされる工程、（ｅ）反応容器から上清を除去
し、該容器を適当な反応緩衝液で数回洗浄する工程、
（ｆ）逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する少なくとも１つ
の酵素及びヌクレオチドを含む混合物を添加する工程、
（ｇ）該容器を約３０〜７５℃で適当な時間インキュベ
ートする工程、（ｈ）混合物を除去し、容器を洗浄緩衝
液で洗浄する工程、（ｉ）少なくとも１つの熱安定ＤＮ
Ａポリメラーゼと２つの特異的プライマーとヌクレオチ
ドを含む別の混合物を添加し、反応容器を増幅を支持す
る条件下でインキュベートする工程、及び（ｊ）該ｍＲ
ＮＡを決定する工程、 〔２〕 一方が逆転写酵素（ＲＴ）活性を有し、他方が
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する両酵素を、ＲＴ活性と
ＤＮＡポリメラーゼ活性の二面的機能を有する熱安定酵
素に置き換えることにより、ＲＴ反応後中間の洗浄工程
なしに直接ＤＮＡ増幅を行うことを特徴とする前記
〔１〕記載の方法、 〔３〕 試料材料が全ＲＮＡ、培養細胞、動物もしくは
ヒト起源の組織細胞又は植物抽出物よりなる混合物であ
ることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕記載の方
法、 〔４〕 溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼーション
緩衝液が、ジスルフィド基の還元物質、ｐＨ７．０〜ｐ
Ｈ８．５の間で緩衝する物質、及び界面活性剤すなわち
変性剤、及び必要ならばＲＮアーゼ阻害剤を含むことを
特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の方法、 〔５〕 該緩衝液が０．５〜１５．０％（ｗ／ｖ）のド
デシル硫酸塩又は１〜７Ｍのグアニジニウムチオシアネ
ートを含むことを特徴とする、前記〔４〕記載の方法、 〔６〕 ハイブリダイゼーションパートナーがビオチン
で標識され、かつ、反応容器がストレプトアビジン又は
アビジンで被覆されていることを特徴とする、前記
〔１〕〜〔５〕いずれか記載の方法、 〔７〕 オリゴ（ｄＴ）誘導体又はオリゴ（Ｕ）誘導体
又はＰＮＡ誘導体が標識ハイブリダイゼーションパート
ナーとして使用されることを特徴とする、前記〔１〕〜
〔６〕いずれか記載の方法、 〔８〕 １５〜３０マーのヌクレオチドプローブが使用
され、及び／又はハイブリダイゼーションが約３７℃で
１〜１０分以内で行われることを特徴とする、前記
〔１〕〜〔７〕いずれか記載の方法、
であって、下記工程を含む方法、（ａ）溶解緩衝液及び
／又はハイブリダイゼーション緩衝液を適当な試料材料
に添加し、必要があればホモジナイズする工程、（ｂ）
ＲＮＡとハイブリダイズする標識ハイブリダイゼーショ
ンパートナーと、試料溶液を接触させる工程、（ｃ）該
ハイブリダイゼーションパートナーとｍＲＮＡ間のハイ
ブリッド複合体の一部を、ＲＮアーゼフリーでかつ該ハ
イブリダイゼーションパートナー上に結合する有機化合
物で被覆した熱安定な反応容器に移す工程、（ｄ）試料
が約４〜５０℃の温度範囲で少なくとも１０秒間インキ
ュベートされる工程、（ｅ）反応容器から上清を除去
し、該容器を適当な反応緩衝液で数回洗浄する工程、
（ｆ）逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する少なくとも１つ
の酵素及びヌクレオチドを含む混合物を添加する工程、
（ｇ）該容器を約３０〜７５℃で適当な時間インキュベ
ートする工程、（ｈ）混合物を除去し、容器を洗浄緩衝
液で洗浄する工程、（ｉ）少なくとも１つの熱安定ＤＮ
Ａポリメラーゼと２つの特異的プライマーとヌクレオチ
ドを含む別の混合物を添加し、反応容器を増幅を支持す
る条件下でインキュベートする工程、及び（ｊ）該ｍＲ
ＮＡを決定する工程、 〔２〕 一方が逆転写酵素（ＲＴ）活性を有し、他方が
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する両酵素を、ＲＴ活性と
ＤＮＡポリメラーゼ活性の二面的機能を有する熱安定酵
素に置き換えることにより、ＲＴ反応後中間の洗浄工程
なしに直接ＤＮＡ増幅を行うことを特徴とする前記
〔１〕記載の方法、 〔３〕 試料材料が全ＲＮＡ、培養細胞、動物もしくは
ヒト起源の組織細胞又は植物抽出物よりなる混合物であ
ることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕記載の方
法、 〔４〕 溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼーション
緩衝液が、ジスルフィド基の還元物質、ｐＨ７．０〜ｐ
Ｈ８．５の間で緩衝する物質、及び界面活性剤すなわち
変性剤、及び必要ならばＲＮアーゼ阻害剤を含むことを
特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の方法、 〔５〕 該緩衝液が０．５〜１５．０％（ｗ／ｖ）のド
デシル硫酸塩又は１〜７Ｍのグアニジニウムチオシアネ
ートを含むことを特徴とする、前記〔４〕記載の方法、 〔６〕 ハイブリダイゼーションパートナーがビオチン
で標識され、かつ、反応容器がストレプトアビジン又は
アビジンで被覆されていることを特徴とする、前記
〔１〕〜〔５〕いずれか記載の方法、 〔７〕 オリゴ（ｄＴ）誘導体又はオリゴ（Ｕ）誘導体
又はＰＮＡ誘導体が標識ハイブリダイゼーションパート
ナーとして使用されることを特徴とする、前記〔１〕〜
〔６〕いずれか記載の方法、 〔８〕 １５〜３０マーのヌクレオチドプローブが使用
され、及び／又はハイブリダイゼーションが約３７℃で
１〜１０分以内で行われることを特徴とする、前記
〔１〕〜〔７〕いずれか記載の方法、
〔９〕 ５ｐｍｏｌ以下のポリ（Ａ／ｄＴ）ハイブリッ
ドを含む一部がストレプトアビジンで被覆された相当す
るサイズの反応容器内に添加されることを特徴とする、
前記〔６〕〜〔８〕いずれか記載の方法、 〔１０〕 逆転写のために、混合物が０．０１〜５．０
Ｕ／μｌのＡＭＶ逆転写酵素又はＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵
素、ＳＨ試薬、ＲＮアーゼ阻害剤、カリウムイオンとマ
グネシウムイオン及び適当な緩衝物質を含むことを特徴
とする、前記〔１〕〜
ドを含む一部がストレプトアビジンで被覆された相当す
るサイズの反応容器内に添加されることを特徴とする、
前記〔６〕〜〔８〕いずれか記載の方法、 〔１０〕 逆転写のために、混合物が０．０１〜５．０
Ｕ／μｌのＡＭＶ逆転写酵素又はＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵
素、ＳＨ試薬、ＲＮアーゼ阻害剤、カリウムイオンとマ
グネシウムイオン及び適当な緩衝物質を含むことを特徴
とする、前記〔１〕〜
〔９〕いずれか記載の方法、 〔１１〕 ＲＴ反応が約３５℃〜４５℃で行われること
を特徴とする前記〔１〕又は〔１０〕記載の方法、 〔１２〕 ５〜３００ｍＵ／μｌの熱安定なＤＮＡポリ
メラーゼ、それぞれ約０．１〜１．０ｐｍｏｌ／ｌの特
異的プライマー、約０．０５〜０．６ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ、適当なＰＣＲ緩衝系及び、必要ならばマグネシウム
イオンの存在下で、ＰＣＲが行われることを特徴とす
る、前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の方法、 〔１３〕 ＲＴ活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を示
し、熱安定な酵素が使用され、かつ、ＰＣＲ反応を支持
する条件下で約５分〜１時間インキュベートされること
を特徴とする、前記〔１〕〜
を特徴とする前記〔１〕又は〔１０〕記載の方法、 〔１２〕 ５〜３００ｍＵ／μｌの熱安定なＤＮＡポリ
メラーゼ、それぞれ約０．１〜１．０ｐｍｏｌ／ｌの特
異的プライマー、約０．０５〜０．６ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ、適当なＰＣＲ緩衝系及び、必要ならばマグネシウム
イオンの存在下で、ＰＣＲが行われることを特徴とす
る、前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の方法、 〔１３〕 ＲＴ活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性を示
し、熱安定な酵素が使用され、かつ、ＰＣＲ反応を支持
する条件下で約５分〜１時間インキュベートされること
を特徴とする、前記〔１〕〜
〔９〕いずれか記載の方
法、 〔１４〕 以下の組成物よりなるｍＲＮＡの検出のため
のキット、（ａ）溶解緩衝液及びハイブリダイゼーショ
ン緩衝液、（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な配列を有する標
識ヌクレオチドプローブを有する緩衝溶液、（ｃ）洗浄
緩衝液、（ｄ）逆転写活性を有する酵素を含む混合物、
（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡポリメラーゼを
含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つの被覆された、
熱安定なＲＮアーゼフリーの反応容器を有する装置、 〔１５〕 ＲＴ活性及び熱安定なＤＮＡポリメラーゼ活
性を持つ酵素を含む酵素混合物が使用されることを特徴
とする、前記〔１４〕記載のキット、 〔１６〕 オリゴ（ｄＴ）プローブがビオチンで標識さ
れ、かつ、反応容器がストレプトアビジン又はアビジン
で被覆されていることを特徴とする、前記〔１４〕又は
〔１５〕記載のキット、に関する。
法、 〔１４〕 以下の組成物よりなるｍＲＮＡの検出のため
のキット、（ａ）溶解緩衝液及びハイブリダイゼーショ
ン緩衝液、（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な配列を有する標
識ヌクレオチドプローブを有する緩衝溶液、（ｃ）洗浄
緩衝液、（ｄ）逆転写活性を有する酵素を含む混合物、
（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡポリメラーゼを
含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つの被覆された、
熱安定なＲＮアーゼフリーの反応容器を有する装置、 〔１５〕 ＲＴ活性及び熱安定なＤＮＡポリメラーゼ活
性を持つ酵素を含む酵素混合物が使用されることを特徴
とする、前記〔１４〕記載のキット、 〔１６〕 オリゴ（ｄＴ）プローブがビオチンで標識さ
れ、かつ、反応容器がストレプトアビジン又はアビジン
で被覆されていることを特徴とする、前記〔１４〕又は
〔１５〕記載のキット、に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下に本発明について説明する。
本発明の目的は、下記の工程を特徴とする試料中の特異
的なｍＲＮＡの決定のための方法により達成される、
（ａ）溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼーション緩
衝液を適当な試料材料に添加し、必要があればホモジナ
イズする工程、（ｂ）ＲＮＡとハイブリダイズする標識
ハイブリダイゼーションパートナーと、試料溶液を接触
させる工程、（ｃ）該ハイブリダイゼーションパートナ
ーとｍＲＮＡ間のハイブリッド複合体の一部を、ＲＮア
ーゼフリーでかつ該ハイブリダイゼーションパートナー
上に結合する有機化合物で被覆した熱安定な反応容器に
移す工程、（ｄ）試料が約４〜５０℃の温度範囲で少な
くとも１０秒間インキュベートされる工程、（ｅ）反応
容器から上清を除去し、該容器を適当な反応緩衝液で数
回洗浄する工程、（ｆ）逆転写酵素（ＲＴ）活性を有す
る少なくとも１つの酵素及びヌクレオチドを含む混合物
を添加する工程、（ｇ）該容器を約３０〜７５℃で適当
な時間インキュベートする工程、（ｈ）混合物を除去
し、容器を洗浄緩衝液で洗浄する工程、（ｉ）少なくと
も１つの熱安定ＤＮＡポリメラーゼと２つの特異的プラ
イマーとヌクレオチドを含む別の混合物を添加し、反応
容器を増幅を支持する条件下でインキュベートする工
程、及び（ｊ）該ｍＲＮＡを決定する工程。
本発明の目的は、下記の工程を特徴とする試料中の特異
的なｍＲＮＡの決定のための方法により達成される、
（ａ）溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼーション緩
衝液を適当な試料材料に添加し、必要があればホモジナ
イズする工程、（ｂ）ＲＮＡとハイブリダイズする標識
ハイブリダイゼーションパートナーと、試料溶液を接触
させる工程、（ｃ）該ハイブリダイゼーションパートナ
ーとｍＲＮＡ間のハイブリッド複合体の一部を、ＲＮア
ーゼフリーでかつ該ハイブリダイゼーションパートナー
上に結合する有機化合物で被覆した熱安定な反応容器に
移す工程、（ｄ）試料が約４〜５０℃の温度範囲で少な
くとも１０秒間インキュベートされる工程、（ｅ）反応
容器から上清を除去し、該容器を適当な反応緩衝液で数
回洗浄する工程、（ｆ）逆転写酵素（ＲＴ）活性を有す
る少なくとも１つの酵素及びヌクレオチドを含む混合物
を添加する工程、（ｇ）該容器を約３０〜７５℃で適当
な時間インキュベートする工程、（ｈ）混合物を除去
し、容器を洗浄緩衝液で洗浄する工程、（ｉ）少なくと
も１つの熱安定ＤＮＡポリメラーゼと２つの特異的プラ
イマーとヌクレオチドを含む別の混合物を添加し、反応
容器を増幅を支持する条件下でインキュベートする工
程、及び（ｊ）該ｍＲＮＡを決定する工程。
【０００８】上記の各工程について、さらに説明する。 − 溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼーション緩衝
液を適当な試料材料に添加し、必要があればホモジナイ
ズする工程、 − ポリ（Ａ）に相補的な少なくとも１つの配列、すな
わちオリゴもしくはポリヌクレオチド、又は試験対象と
なる核酸に相補的な対応する誘導体を有する、標識ポリ
もしくはオリゴヌクレオチドプローブ、又は標識ヌクレ
オチド誘導体と、試料溶液を接触させる工程、即ち、こ
こで使用される標識ハイブリダイゼーションパートナー
としては、標識ポリもしくはオリゴヌクレオチド、オリ
ゴ−ｄＴ、オリゴ−Ｕ及びそれらの誘導体、並びに、特
異的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする特異的プローブ
及びそれらの誘導体を含む。 − 約４〜５０℃の温度範囲で少なくとも１０秒間イン
キュベートされる、有機化合物で被覆された、熱安定で
ＲＮアーゼフリーの反応容器に混合物の一部を移す工
程、 − 該反応容器から上清を除去し、適当な緩衝溶液で数
回洗浄する工程、 − そして、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する酵素又は
ＲＴ活性及び熱安定なＤＮＡポリメラーゼ活性を有する
酵素を含む混合物とを合せて、約３０〜７５℃でインキ
ュベートする工程、 − 必要であれば、混合物を除去し、洗浄緩衝液で洗浄
する工程、 − 必要であれば、少なくとも１つの熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼと２つの特異的ＤＮＡプライマーを含む別の混
合物を反応容器に添加し、増幅を支持する条件下でイン
キュベートする工程、及び − 必要であれば、該混合物中に含まれるＤＮＡを、特
に電気泳動法を使用して個々に分離し次いで検出する工
程。
液を適当な試料材料に添加し、必要があればホモジナイ
ズする工程、 − ポリ（Ａ）に相補的な少なくとも１つの配列、すな
わちオリゴもしくはポリヌクレオチド、又は試験対象と
なる核酸に相補的な対応する誘導体を有する、標識ポリ
もしくはオリゴヌクレオチドプローブ、又は標識ヌクレ
オチド誘導体と、試料溶液を接触させる工程、即ち、こ
こで使用される標識ハイブリダイゼーションパートナー
としては、標識ポリもしくはオリゴヌクレオチド、オリ
ゴ−ｄＴ、オリゴ−Ｕ及びそれらの誘導体、並びに、特
異的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする特異的プローブ
及びそれらの誘導体を含む。 − 約４〜５０℃の温度範囲で少なくとも１０秒間イン
キュベートされる、有機化合物で被覆された、熱安定で
ＲＮアーゼフリーの反応容器に混合物の一部を移す工
程、 − 該反応容器から上清を除去し、適当な緩衝溶液で数
回洗浄する工程、 − そして、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する酵素又は
ＲＴ活性及び熱安定なＤＮＡポリメラーゼ活性を有する
酵素を含む混合物とを合せて、約３０〜７５℃でインキ
ュベートする工程、 − 必要であれば、混合物を除去し、洗浄緩衝液で洗浄
する工程、 − 必要であれば、少なくとも１つの熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼと２つの特異的ＤＮＡプライマーを含む別の混
合物を反応容器に添加し、増幅を支持する条件下でイン
キュベートする工程、及び − 必要であれば、該混合物中に含まれるＤＮＡを、特
に電気泳動法を使用して個々に分離し次いで検出する工
程。
【０００９】本発明の方法においては、逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）反応とそれに続くＰＣＲに使用できる容器内におい
て対象とする試料材料からｍＲＮＡを単離し精製してお
くことができることが特に有利である。そうすることに
より、試料の調製（単離と精製）及び転写及び／又は増
幅（ＲＴ−ＰＣＲ）が、ただ１つの反応容器内で行われ
る。
Ｔ）反応とそれに続くＰＣＲに使用できる容器内におい
て対象とする試料材料からｍＲＮＡを単離し精製してお
くことができることが特に有利である。そうすることに
より、試料の調製（単離と精製）及び転写及び／又は増
幅（ＲＴ−ＰＣＲ）が、ただ１つの反応容器内で行われ
る。
【００１０】精製ｍＲＮＡフラクションに加え、分析さ
れる試料物質は、天然及び人工の全ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、
ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ）混合物ばかりでなく、細胞培養物
及び組織細胞抽出物、及び／又はヒトあるいは動物起源
の組織ホモジネート、及び植物抽出物から得られたフラ
クション（細胞溶解物）をも含む。
れる試料物質は、天然及び人工の全ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、
ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ）混合物ばかりでなく、細胞培養物
及び組織細胞抽出物、及び／又はヒトあるいは動物起源
の組織ホモジネート、及び植物抽出物から得られたフラ
クション（細胞溶解物）をも含む。
【００１１】好適な溶解緩衝液及び／又はハイブリダイ
ゼーション緩衝液は、約５〜１０の間のｐＨ、好ましく
はｐＨ７．０〜８．５で良好な緩衝能力を示す緩衝物質
に基づくものである。このような緩衝物質としては、例
えば、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ又はＴ
ｒｉｓ・ホウ酸塩が挙げられる。
ゼーション緩衝液は、約５〜１０の間のｐＨ、好ましく
はｐＨ７．０〜８．５で良好な緩衝能力を示す緩衝物質
に基づくものである。このような緩衝物質としては、例
えば、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ又はＴ
ｒｉｓ・ホウ酸塩が挙げられる。
【００１２】さらに、本発明の方法に好適な緩衝液は、
ジチオエリスリトール、ジチオスレイトール、メルカプ
トエタノールのようなジスルフィド還元試薬を、好まし
くは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度で含んでもよい。
さらに、緩衝系が界面活性剤のような変性物質を比較的
高濃度で含むとき、有利であることがわかった。０．１
〜１５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸塩又はその誘導体が
特に有効である。ＲＮアーゼに富む組織を扱うときは、
約１〜７Ｍの濃度、特に１〜５Ｍの濃度のグアニジニウ
ムチオシアネート塩とその誘導体が顕著に有用である。
決定に使用する溶液が、ＲＮアーゼ活性をほとんどもた
ないときが特に有利であることが実験により示されてい
る。このことは、残存するＲＮアーゼ活性の最大値が５
％を超えてはならないことを意味する。
ジチオエリスリトール、ジチオスレイトール、メルカプ
トエタノールのようなジスルフィド還元試薬を、好まし
くは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度で含んでもよい。
さらに、緩衝系が界面活性剤のような変性物質を比較的
高濃度で含むとき、有利であることがわかった。０．１
〜１５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸塩又はその誘導体が
特に有効である。ＲＮアーゼに富む組織を扱うときは、
約１〜７Ｍの濃度、特に１〜５Ｍの濃度のグアニジニウ
ムチオシアネート塩とその誘導体が顕著に有用である。
決定に使用する溶液が、ＲＮアーゼ活性をほとんどもた
ないときが特に有利であることが実験により示されてい
る。このことは、残存するＲＮアーゼ活性の最大値が５
％を超えてはならないことを意味する。
【００１３】さらに、本発明の方法で使用される緩衝系
は、塩化リチウムのような塩類又は他の添加物をも含む
ことができる。胎盤から得られるようなＲＮアーゼ阻害
剤が追加されて存在すること、及び／又は緩衝溶液が、
使用前にジメチルジカルボネートあるいはジエチルピロ
カルボネートで滅菌及び／又は汚染除去されることが、
特に有利であることがわかった。
は、塩化リチウムのような塩類又は他の添加物をも含む
ことができる。胎盤から得られるようなＲＮアーゼ阻害
剤が追加されて存在すること、及び／又は緩衝溶液が、
使用前にジメチルジカルボネートあるいはジエチルピロ
カルボネートで滅菌及び／又は汚染除去されることが、
特に有利であることがわかった。
【００１４】ポリ（Ａ）に相補的な配列を有する標識ポ
リヌクレオチドプローブ及び／又はオリゴヌクレオチド
プローブ、あるいは標識ヌクレオチド誘導体としては、
オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドプローブやオリゴ（Ｕ）ヌ
クレオチドプローブ又はその対応するペプチド核酸誘導
体、例えば、ＰＮＡすなわち所望の長さのペプチドバッ
クボーンを有する核酸が特に使用可能である。好ましく
は１５〜３０マーであり、しばしば２０マーで充分であ
る。
リヌクレオチドプローブ及び／又はオリゴヌクレオチド
プローブ、あるいは標識ヌクレオチド誘導体としては、
オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドプローブやオリゴ（Ｕ）ヌ
クレオチドプローブ又はその対応するペプチド核酸誘導
体、例えば、ＰＮＡすなわち所望の長さのペプチドバッ
クボーンを有する核酸が特に使用可能である。好ましく
は１５〜３０マーであり、しばしば２０マーで充分であ
る。
【００１５】ヌクレオチドプローブの標識基としては、
ハプテン、抗原及び／又は抗体構造を有するタンパク質
を含むある種のマトリックスに連結又は結合できるすべ
ての基が可能である。オリゴ（ｄＴ）配列に結合するビ
オチンは、ストレプトアビジン又はアビジンと結合する
ことで固相に連結できるので、特に適していることがわ
かった。この場合、有機的な“被覆物質”はストレプト
アビジンであることを要する。あるいは、被覆物質は、
オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチド、又はハイブリダイゼーシ
ョンや複合体形成を介して対応するプローブを固定化さ
せるために適する適当なキレート化合物も可能である。
従って、ストレプトアビジンで被覆した固相及び／又は
反応容器にｍＲＮＡを固定することは、続く転写又は増
幅のために非常に簡単で確実なｍＲＮＡの抽出方法であ
る。さらに、固相に固定させる他の標識基も使用可能で
ある。例えば、オリゴ（ｄＴ）プローブのようなヌクレ
オチドプローブは、公知の方法に従って得ることができ
るし、また一般に知られている供給者から購入可能であ
る。
ハプテン、抗原及び／又は抗体構造を有するタンパク質
を含むある種のマトリックスに連結又は結合できるすべ
ての基が可能である。オリゴ（ｄＴ）配列に結合するビ
オチンは、ストレプトアビジン又はアビジンと結合する
ことで固相に連結できるので、特に適していることがわ
かった。この場合、有機的な“被覆物質”はストレプト
アビジンであることを要する。あるいは、被覆物質は、
オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチド、又はハイブリダイゼーシ
ョンや複合体形成を介して対応するプローブを固定化さ
せるために適する適当なキレート化合物も可能である。
従って、ストレプトアビジンで被覆した固相及び／又は
反応容器にｍＲＮＡを固定することは、続く転写又は増
幅のために非常に簡単で確実なｍＲＮＡの抽出方法であ
る。さらに、固相に固定させる他の標識基も使用可能で
ある。例えば、オリゴ（ｄＴ）プローブのようなヌクレ
オチドプローブは、公知の方法に従って得ることができ
るし、また一般に知られている供給者から購入可能であ
る。
【００１６】ポリアデニル化ｍＲＮＡを含む試料材料
は、例えば、標識オリゴ（ｄＴ）プローブを含む水溶液
と合わせる。ハイブリダイゼーションは、約３７℃で行
われるのが好ましく、通常わずか数秒後に完了する。た
いていの場合、ハイブリダイゼーションには１０秒〜１
０分間、好ましくは５分間で充分であることがわかって
いる。
は、例えば、標識オリゴ（ｄＴ）プローブを含む水溶液
と合わせる。ハイブリダイゼーションは、約３７℃で行
われるのが好ましく、通常わずか数秒後に完了する。た
いていの場合、ハイブリダイゼーションには１０秒〜１
０分間、好ましくは５分間で充分であることがわかって
いる。
【００１７】それから、ビオチン−オリゴ（ｄＴ）−ｍ
ＲＮＡハイブリッドの一部（アリコート）を、被覆し熱
安定な反応容器に直接加える。最適条件下で、被覆した
アリコートの体積は、それぞれの容器の体積内の大きさ
で、該ハイブリッドは約５ｐｍｏｌを超えて含んではな
らない。通常、約２０〜２００μｌの溶解物の試料で十
分である。被覆した固相への固定には、通常、わずか数
秒間のインキュベーション時間、すなわち約１０秒間と
約４〜５０℃、好ましくは約３７℃の温度で十分であ
る。安全策をとって、該工程を通常１〜１０分間続け
る。
ＲＮＡハイブリッドの一部（アリコート）を、被覆し熱
安定な反応容器に直接加える。最適条件下で、被覆した
アリコートの体積は、それぞれの容器の体積内の大きさ
で、該ハイブリッドは約５ｐｍｏｌを超えて含んではな
らない。通常、約２０〜２００μｌの溶解物の試料で十
分である。被覆した固相への固定には、通常、わずか数
秒間のインキュベーション時間、すなわち約１０秒間と
約４〜５０℃、好ましくは約３７℃の温度で十分であ
る。安全策をとって、該工程を通常１〜１０分間続け
る。
【００１８】次に、溶解物の残りを除去して結合したＲ
ＮＡを徹底的に洗浄し（約５回）、それから、逆転写反
応を行うことができるように洗浄緩衝液を定量的に除去
する。常法の緩衝物質と塩に加え、ＲＴ反応のための典
型的な混合物は、マグネシウムイオン、４つのデオキシ
ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）のすべて、ＲＴ活
性を有する酵素、すなわちテルムス テルモフィルス
（Ｔｔｈ）由来のＤＮＡポリメラーゼのようなＲＴ活性
と熱安定なＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含
み、さらにＲＮアーゼ阻害剤を含むと有利である。それ
から、約２０〜２００μｌの該混合物の一部を反応容器
に加える。ＡＭＶ−ＲＴ又はＭ−ＭｕＬＶ−ＲＴ、後者
は特にＲＮアーゼＨ- 型（ＵＳ特許第５．２４４．７９
７号）であるもの、をＲＴ活性を有する酵素として特に
使用し、好ましくは０．０１〜５Ｕ／μｌの濃度で使用
する。好ましいＲＴの最終濃度は、０．１〜１．０Ｕ／
μｌである。さらに、他のウイルス型やウイルス源のＲ
Ｔも本発明で使用できることが実験により示されてい
る。
ＮＡを徹底的に洗浄し（約５回）、それから、逆転写反
応を行うことができるように洗浄緩衝液を定量的に除去
する。常法の緩衝物質と塩に加え、ＲＴ反応のための典
型的な混合物は、マグネシウムイオン、４つのデオキシ
ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）のすべて、ＲＴ活
性を有する酵素、すなわちテルムス テルモフィルス
（Ｔｔｈ）由来のＤＮＡポリメラーゼのようなＲＴ活性
と熱安定なＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を含
み、さらにＲＮアーゼ阻害剤を含むと有利である。それ
から、約２０〜２００μｌの該混合物の一部を反応容器
に加える。ＡＭＶ−ＲＴ又はＭ−ＭｕＬＶ−ＲＴ、後者
は特にＲＮアーゼＨ- 型（ＵＳ特許第５．２４４．７９
７号）であるもの、をＲＴ活性を有する酵素として特に
使用し、好ましくは０．０１〜５Ｕ／μｌの濃度で使用
する。好ましいＲＴの最終濃度は、０．１〜１．０Ｕ／
μｌである。さらに、他のウイルス型やウイルス源のＲ
Ｔも本発明で使用できることが実験により示されてい
る。
【００１９】ｃＤＮＡ合成のためのインキュベーション
は、約３０〜７５℃で行うことができ、好ましくは３５
〜４５℃の間であり、通常３０〜１２０分かかる。多く
の場合、約４２℃のインキュベーション温度が特に有利
であることがわかった。
は、約３０〜７５℃で行うことができ、好ましくは３５
〜４５℃の間であり、通常３０〜１２０分かかる。多く
の場合、約４２℃のインキュベーション温度が特に有利
であることがわかった。
【００２０】反応完了後、反応溶液を除去し、残留物を
再び徹底的に洗浄緩衝液で洗浄する。続いて、ＰＣＲ混
合物の一定容量、通常２０〜２００μｌを被覆した反応
容器に入れ、より厳格でない条件で、インキュベートす
る。最適のＰＣＲ混合物は、好適な緩衝系を含む。例え
ば、マニアティス（Maniatis) ら（第２版、1989、s.o.
14.15 頁〜14.17 頁) により示された緩衝液組成物、約
０．５〜５．０ｍＭの濃度範囲のマグネシウムイオン、
規定量、好ましくは約５〜３００ｍＵ／μｌの熱安定Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、各濃度が０．０５〜０．６ｍＭ、好
ましくは各濃度が約０．２ｍＭのすべての４つのｄＮＴ
Ｐｓ、及び０．１〜１．０ｐｍｏｌ／μｌ、好ましくは
各濃度が約０．４ｐｍｏｌ／μｌの少なくとも２つのＤ
ＮＡプライマーである。
再び徹底的に洗浄緩衝液で洗浄する。続いて、ＰＣＲ混
合物の一定容量、通常２０〜２００μｌを被覆した反応
容器に入れ、より厳格でない条件で、インキュベートす
る。最適のＰＣＲ混合物は、好適な緩衝系を含む。例え
ば、マニアティス（Maniatis) ら（第２版、1989、s.o.
14.15 頁〜14.17 頁) により示された緩衝液組成物、約
０．５〜５．０ｍＭの濃度範囲のマグネシウムイオン、
規定量、好ましくは約５〜３００ｍＵ／μｌの熱安定Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、各濃度が０．０５〜０．６ｍＭ、好
ましくは各濃度が約０．２ｍＭのすべての４つのｄＮＴ
Ｐｓ、及び０．１〜１．０ｐｍｏｌ／μｌ、好ましくは
各濃度が約０．４ｐｍｏｌ／μｌの少なくとも２つのＤ
ＮＡプライマーである。
【００２１】ＰＣＲ反応それ自体は、熟練者に既知の方
法に従って行い（いわゆる標準ＰＣＲ）、第１サイクル
が９５℃（５分）、５０℃（２分）、７２℃（３分）、
それから、次のサイクル（全部で約４０サイクル）を９
５℃（１分）、５０℃（２分）及び７２℃（３分、最後
のサイクルでは１０分）というスキームに従って行うこ
とができる。
法に従って行い（いわゆる標準ＰＣＲ）、第１サイクル
が９５℃（５分）、５０℃（２分）、７２℃（３分）、
それから、次のサイクル（全部で約４０サイクル）を９
５℃（１分）、５０℃（２分）及び７２℃（３分、最後
のサイクルでは１０分）というスキームに従って行うこ
とができる。
【００２２】ＰＣＲ反応完了後、転写され増幅されたＤ
ＮＡを含む溶液を反応容器から取り除き、例えば、電気
泳動的に分離し、例えば、臭化エチジウムで検出する。
ＮＡを含む溶液を反応容器から取り除き、例えば、電気
泳動的に分離し、例えば、臭化エチジウムで検出する。
【００２３】別の有利な態様は、ＲＴ反応とＰＣＲ反応
を逐次に行わずに、中間の洗浄工程のない結合反応とし
て行うことである。そのような同時工程では、ＲＴ溶液
をＲＴ反応終了後取り除く必要はない。特に有利な態様
では、ＲＴ活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を示
し、熱安定な複機能をもつ酵素を使用する。１容器／１
緩衝液のような態様では、約５分〜１時間までのインキ
ュベーション時間が特に有利であることがわかった。
を逐次に行わずに、中間の洗浄工程のない結合反応とし
て行うことである。そのような同時工程では、ＲＴ溶液
をＲＴ反応終了後取り除く必要はない。特に有利な態様
では、ＲＴ活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を示
し、熱安定な複機能をもつ酵素を使用する。１容器／１
緩衝液のような態様では、約５分〜１時間までのインキ
ュベーション時間が特に有利であることがわかった。
【００２４】マニアティス（Maniatis) らが、モレキュ
ラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールド
スプリングハーバー、N.Y.、第２版(1989)に記載したＲ
Ｔ反応及び／又はＰＣＲ反応の条件が特に好適であるこ
とがわかった。
ラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールド
スプリングハーバー、N.Y.、第２版(1989)に記載したＲ
Ｔ反応及び／又はＰＣＲ反応の条件が特に好適であるこ
とがわかった。
【００２５】本発明により得られたＤＮＡ混合物は、電
気泳動的分離後適当なハイブリダイゼーション法（サザ
ンブロット、ＥＬＩＳＡ）を用いて通常検出される。し
かし、先に分離しなくてもＤＮＡ混合物を直接検出する
ことも可能である。熟練者はそのような方法に精通して
いる。従って、本発明の方法により１個未満の細胞のｍ
ＲＮＡを検出することが可能となった。
気泳動的分離後適当なハイブリダイゼーション法（サザ
ンブロット、ＥＬＩＳＡ）を用いて通常検出される。し
かし、先に分離しなくてもＤＮＡ混合物を直接検出する
ことも可能である。熟練者はそのような方法に精通して
いる。従って、本発明の方法により１個未満の細胞のｍ
ＲＮＡを検出することが可能となった。
【００２６】被覆した固相及び／又は被覆した反応容器
の調製は、熟練者に既知である（例、ＥＰ特許第０３３
１１２７号）。ストレプトアビジン及び／又はアビジン
で被覆した担体材料を用いるとき、ＥＰ特許第０３４４
５７８号に開示された反応容器が特に有利であることが
わかった。
の調製は、熟練者に既知である（例、ＥＰ特許第０３３
１１２７号）。ストレプトアビジン及び／又はアビジン
で被覆した担体材料を用いるとき、ＥＰ特許第０３４４
５７８号に開示された反応容器が特に有利であることが
わかった。
【００２７】本発明の別の目的は、下記組成物を含むｍ
ＲＮＡの決定のための試薬及び／又はキットである、
（ａ）溶解緩衝液及びハイブリダイゼーション緩衝液、
（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な配列を有する標識ヌクレオ
チドプローブを含む緩衝溶液、（ｃ）洗浄緩衝液、
（ｄ）逆転写酵素活性を有する酵素を含む混合物、
（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡポリメラーゼを
含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つの被覆され、Ｒ
Ｎアーゼフリーの反応容器を有する装置。
ＲＮＡの決定のための試薬及び／又はキットである、
（ａ）溶解緩衝液及びハイブリダイゼーション緩衝液、
（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な配列を有する標識ヌクレオ
チドプローブを含む緩衝溶液、（ｃ）洗浄緩衝液、
（ｄ）逆転写酵素活性を有する酵素を含む混合物、
（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡポリメラーゼを
含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つの被覆され、Ｒ
Ｎアーゼフリーの反応容器を有する装置。
【００２８】本発明の方法は、ビオチン標識オリゴ（ｄ
Ｔ）プローブが使用され、ハイブリッドの固定に適する
固相がストレプトアビジン及び／又はアビジンで被覆さ
れているとき、特に好ましいことがわかった。さらに、
好ましいキットは、２つの混合物（ｄ）及び（ｅ）の代
わりに１つの混合物（ｄ' ）を含むものである。ここ
で、該混合物（ｄ' ）は、ＲＴ活性と熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を有する酵素を含む。さらに、本発明の方
法に関連して開示した特徴は、キットについても当ては
まる。
Ｔ）プローブが使用され、ハイブリッドの固定に適する
固相がストレプトアビジン及び／又はアビジンで被覆さ
れているとき、特に好ましいことがわかった。さらに、
好ましいキットは、２つの混合物（ｄ）及び（ｅ）の代
わりに１つの混合物（ｄ' ）を含むものである。ここ
で、該混合物（ｄ' ）は、ＲＴ活性と熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼ活性を有する酵素を含む。さらに、本発明の方
法に関連して開示した特徴は、キットについても当ては
まる。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例をもってさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。
【００３０】実施例１ ストレプトアビジン被覆ＰＣＲ容器を使用し、ＲＮＡを
前もって単離することなしに細胞から直接ＲＴ−ＰＣＲ
を行う。細胞を溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼー
ション緩衝液中で溶解させ、ＤＮＡを分離し、ｍＲＮＡ
のポリＡ+ の尾とＢｉｄＴ20をハイブリダイズさせ、反
応容器内のストレプトアビジンマトリックスに結合させ
ることによりｍＲＮＡを固定した。対応するｃＤＮＡの
合成は逆転写酵素により行った。特異的プライマーを用
いてＰＣＲにより特異的転写物を増幅し、アガロースゲ
ル中で臭化エチジウム染色等により定量した。
前もって単離することなしに細胞から直接ＲＴ−ＰＣＲ
を行う。細胞を溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼー
ション緩衝液中で溶解させ、ＤＮＡを分離し、ｍＲＮＡ
のポリＡ+ の尾とＢｉｄＴ20をハイブリダイズさせ、反
応容器内のストレプトアビジンマトリックスに結合させ
ることによりｍＲＮＡを固定した。対応するｃＤＮＡの
合成は逆転写酵素により行った。特異的プライマーを用
いてＰＣＲにより特異的転写物を増幅し、アガロースゲ
ル中で臭化エチジウム染色等により定量した。
【００３１】本実施例は、Ｇ３ＰＤＨのｍＲＮＡの検出
のために、ヒトＫ５６２細胞からの直接的なＲＴ−ＰＣ
Ｒ法について述べる。ヒトＧ３ＰＤＨ−ｍＲＮＡ（９８
３ｂｐ）のためのＰＣＲプライマー（クローンテック社
（Ｎｏ．５４０６−１）より購入）を除き、使用したす
べての組成物は、ベーリンガー マンハイムＧｍｂＨ社
により製造された。緩衝液（溶解緩衝液／ハイブリダイ
ゼーション緩衝液）並びにＲＴとＰＣＲ混合物は、以下
のように調製した。
のために、ヒトＫ５６２細胞からの直接的なＲＴ−ＰＣ
Ｒ法について述べる。ヒトＧ３ＰＤＨ−ｍＲＮＡ（９８
３ｂｐ）のためのＰＣＲプライマー（クローンテック社
（Ｎｏ．５４０６−１）より購入）を除き、使用したす
べての組成物は、ベーリンガー マンハイムＧｍｂＨ社
により製造された。緩衝液（溶解緩衝液／ハイブリダイ
ゼーション緩衝液）並びにＲＴとＰＣＲ混合物は、以下
のように調製した。
【００３２】１）溶解緩衝液／ハイブリダイゼーション
緩衝液 ａ）界面活性剤緩衝液（２５０ｍｌを調製するための
量）： ２５．０ｍｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１Ｍ，ｐＨ７．５
（４℃） １５．０ｍｌ ＬｉＣｌ，５Ｍ ５．０ｍｌ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ，ｐＨ８．０ ２５．０ｍｌ ドデシル硫酸リチウム，１０％（ｗ／
ｖ） １９３．０ｍｇ １，４−ジチオエリスリトール １８０．０ｍｌ 再留水 （オートクレーブした貯蔵溶液は室温で安定） ｂ）ＧＴＣ緩衝液 ４．０Ｍ グアニジニウム チオシアネート（ＧＴＣ） ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０ １．０％ １，４−ジチオスレイトール（ｗ／ｖ） ０．５％ ラウロイルサルコシン（ｗ／ｖ） （−２０℃で貯蔵）
緩衝液 ａ）界面活性剤緩衝液（２５０ｍｌを調製するための
量）： ２５．０ｍｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１Ｍ，ｐＨ７．５
（４℃） １５．０ｍｌ ＬｉＣｌ，５Ｍ ５．０ｍｌ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ，ｐＨ８．０ ２５．０ｍｌ ドデシル硫酸リチウム，１０％（ｗ／
ｖ） １９３．０ｍｇ １，４−ジチオエリスリトール １８０．０ｍｌ 再留水 （オートクレーブした貯蔵溶液は室温で安定） ｂ）ＧＴＣ緩衝液 ４．０Ｍ グアニジニウム チオシアネート（ＧＴＣ） ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０ １．０％ １，４−ジチオスレイトール（ｗ／ｖ） ０．５％ ラウロイルサルコシン（ｗ／ｖ） （−２０℃で貯蔵）
【００３３】２）ビオチン標識オリゴ（ｄＴ）プローブ （２０μｌを調製するための量） １９．０μｌ 再留水 １．０μｌ ビオチン−オリゴ（ｄＴ）20プローブ（１
００ｐｍｏｌ）
００ｐｍｏｌ）
【００３４】３）洗浄溶液 （２５０ｍｌを調製するための量） ２．５ｍｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１Ｍ，ｐＨ７．８５
（４℃） １０．０ｍｌ ＬｉＣｌ，５Ｍ ０．５ｍｌ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ，ｐＨ８．０ ２３７．０ｍｌ 再留水
（４℃） １０．０ｍｌ ＬｉＣｌ，５Ｍ ０．５ｍｌ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ，ｐＨ８．０ ２３７．０ｍｌ 再留水
【００３５】４）ＲＴ混合物 （１ｍｌを調製するための量） ２０４．１μｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１０ｍＭ，ｐＨ
７．４ ５１．０μｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１Ｍ，ｐＨ８．３
（４２℃） １４２．９μｌ ＫＣｌ，１Ｍ ４０．８μｌ ＭｇＣｌ2 ，２５０ｍＭ １０２．０μｌ ｄＮＴＰｓ，各１０ｍＭ ４０．８μｌ １，４−ジチオエリスリトール，１００
ｍＭ ２０．０μｌ ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ） ３９８．４μｌ 再留水 ３２．０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（２５Ｕ／μｌ）
７．４ ５１．０μｌ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，１Ｍ，ｐＨ８．３
（４２℃） １４２．９μｌ ＫＣｌ，１Ｍ ４０．８μｌ ＭｇＣｌ2 ，２５０ｍＭ １０２．０μｌ ｄＮＴＰｓ，各１０ｍＭ ４０．８μｌ １，４−ジチオエリスリトール，１００
ｍＭ ２０．０μｌ ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ） ３９８．４μｌ 再留水 ３２．０μｌ ＡＭＶ逆転写酵素（２５Ｕ／μｌ）
【００３６】５）ＰＣＲ混合物 （１ｍｌを調製するための量） １００．０μｌ Ｔａｑ緩衝液（１０Ｘ） ２０．０μｌ ｄＮＴＰｓ，各１０ｍＭ ４．０μｌ プライマー，各１００ｐｍｏｌ／μｌ ８６７．０μｌ 再留水 ５．０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） これらの調製に使用するすべての溶液及び／又は再留水
は、ジメチルジカルボネート（ＤＭＤＣ）又はジエチル
ピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理し、ＲＮアーゼが
存在する可能性を除いた。
は、ジメチルジカルボネート（ＤＭＤＣ）又はジエチル
ピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理し、ＲＮアーゼが
存在する可能性を除いた。
【００３７】細胞の溶解とＳＡ被覆反応容器内でのｍＲ
ＮＡの固定化 Ｋ５６２細胞は、３×１０5 細胞／ｍｌで対数的増殖を
示した。１ｍｌの細胞懸濁液を分取して３００ｇで５分
間遠心分離し、氷冷したＰＢＳで１回洗浄し、ペレット
を液体窒素中で保存した。凍結したペレットを２００μ
ｌの溶解緩衝液に再懸濁させ、０．８ｍｌのシリンジに
６回通すことによりＤＮＡを剪断した。溶解液から、２
０μｌをピペットで分取して準備した１８０μｌの溶解
緩衝液に移すことにより、ｌｏｇ10の連続希釈液を調製
した。ＢｉｄＴ20の５ｐｍｏｌを該混合物にピペットで
加え、３７℃で５分間ハイブリダイズした。混合物の５
０μｌをストレプトアビジン被覆ＰＣＲ容器にピペット
で加え、３７℃で３分間結合させた。続いて、ピペッテ
ィングで溶液を除去し、容器を氷上で４回、それぞれ２
５０μｌの洗浄緩衝液で洗った。
ＮＡの固定化 Ｋ５６２細胞は、３×１０5 細胞／ｍｌで対数的増殖を
示した。１ｍｌの細胞懸濁液を分取して３００ｇで５分
間遠心分離し、氷冷したＰＢＳで１回洗浄し、ペレット
を液体窒素中で保存した。凍結したペレットを２００μ
ｌの溶解緩衝液に再懸濁させ、０．８ｍｌのシリンジに
６回通すことによりＤＮＡを剪断した。溶解液から、２
０μｌをピペットで分取して準備した１８０μｌの溶解
緩衝液に移すことにより、ｌｏｇ10の連続希釈液を調製
した。ＢｉｄＴ20の５ｐｍｏｌを該混合物にピペットで
加え、３７℃で５分間ハイブリダイズした。混合物の５
０μｌをストレプトアビジン被覆ＰＣＲ容器にピペット
で加え、３７℃で３分間結合させた。続いて、ピペッテ
ィングで溶液を除去し、容器を氷上で４回、それぞれ２
５０μｌの洗浄緩衝液で洗った。
【００３８】ｃＤＮＡ合成 １回に５０μｌのＲＴ混合液を別々の容器の区分にピペ
ットで加えて、４２℃で約２時間インキュベートした。
対照として、最高のＲＮＡ濃度を含み、逆転写酵素のな
いＲＴ混合液を１つの区分に置き、別の対照として、逆
転写酵素を含み、ＲＮＡを含まないＲＴ混合液を別の区
分に置いた。次に、ＲＴを６５℃で１０分間熱変性さ
せ、１回毎に２５０μｌの洗浄緩衝液で４回洗った。
ットで加えて、４２℃で約２時間インキュベートした。
対照として、最高のＲＮＡ濃度を含み、逆転写酵素のな
いＲＴ混合液を１つの区分に置き、別の対照として、逆
転写酵素を含み、ＲＮＡを含まないＲＴ混合液を別の区
分に置いた。次に、ＲＴを６５℃で１０分間熱変性さ
せ、１回毎に２５０μｌの洗浄緩衝液で４回洗った。
【００３９】ＰＣＲによる増幅 １回に５０μｌのＰＣＲ混合液を別々の容器の区分にピ
ペットで加えて、製造者の説明書に従って、サーモサイ
クラーでＰＣＲ操作を行った。ＰＣＲ産物を２％アガロ
ースゲル（臭化エチジウムを添加）中、１００Ｖで３５
分間分離した後、ヒトＧ３ＰＤＨ−ｍＲＮＡ由来の増幅
産物を検出した。
ペットで加えて、製造者の説明書に従って、サーモサイ
クラーでＰＣＲ操作を行った。ＰＣＲ産物を２％アガロ
ースゲル（臭化エチジウムを添加）中、１００Ｖで３５
分間分離した後、ヒトＧ３ＰＤＨ−ｍＲＮＡ由来の増幅
産物を検出した。
【００４０】実施例２ 実施例１の同様の方法と溶液を用いて、β−アクチン−
ｍＲＮＡを決定した。要約すると、β−アクチンｍＲＮ
Ａの検出感度は、１個の細胞中のβ−アクチンＲＮＡ等
量より低かった。
ｍＲＮＡを決定した。要約すると、β−アクチンｍＲＮ
Ａの検出感度は、１個の細胞中のβ−アクチンＲＮＡ等
量より低かった。
【００４１】
【発明の効果】本発明により、ｍＲＮＡの精製なしに、
１つの反応容器で逆転写反応とＰＣＲ反応を行う方法及
びキットが提供される。
１つの反応容器で逆転写反応とＰＣＲ反応を行う方法及
びキットが提供される。
【図１】図１は、実施例１の結果を示す臭化エチジウム
染色した電気泳動ゲルの図である。図中、レーン１〜７
は、次の試料を示す、レーン１：細胞を含みＲＴを含ま
ない対照、レーン２〜５：本発明の方法実施後に得られ
た、細胞溶解物の連続希釈についての結果（オリジナル
のレーン４においては、１つのレーンだけが見える）、
各レーンには次の量を適用した。レーン２：７５００細
胞、レーン３：７５０細胞、レーン４：７５細胞、レー
ン５：７．５細胞、レーン６：細胞を含まず、１×ＲＴ
混合液を含む対照、レーン７：ＤＮＡの分子量標準Ｎ
ｏ．４（ベーリンガーマンハイム社）。 上流のプライマー：5 ' CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA
TGA C 3 ' 下流のプライマー：5 ' AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC
AGA C 3 '
染色した電気泳動ゲルの図である。図中、レーン１〜７
は、次の試料を示す、レーン１：細胞を含みＲＴを含ま
ない対照、レーン２〜５：本発明の方法実施後に得られ
た、細胞溶解物の連続希釈についての結果（オリジナル
のレーン４においては、１つのレーンだけが見える）、
各レーンには次の量を適用した。レーン２：７５００細
胞、レーン３：７５０細胞、レーン４：７５細胞、レー
ン５：７．５細胞、レーン６：細胞を含まず、１×ＲＴ
混合液を含む対照、レーン７：ＤＮＡの分子量標準Ｎ
ｏ．４（ベーリンガーマンハイム社）。 上流のプライマー：5 ' CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA
TGA C 3 ' 下流のプライマー：5 ' AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC
AGA C 3 '
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 フリットン，ハンス−ペーター ドイツ連邦共和国 メーレンバッハ デー −69509ベートーベンシュトラーセ 14ア ー (72)発明者 ヴィットール，ハイコ ドイツ連邦共和国 ツーツィング デー− 82327 リンデマンシュトラーセ 25
Claims (16)
- 【請求項１】 試料中の特異的なｍＲＮＡの決定のため
の方法であって、下記工程を含む方法、（ａ）溶解緩衝
液及び／又はハイブリダイゼーション緩衝液を適当な試
料材料に添加し、必要があればホモジナイズする工程、
（ｂ）ＲＮＡとハイブリダイズする標識ハイブリダイゼ
ーションパートナーと、試料溶液を接触させる工程、
（ｃ）該ハイブリダイゼーションパートナーとｍＲＮＡ
間のハイブリッド複合体の一部を、ＲＮアーゼフリーで
かつ該ハイブリダイゼーションパートナー上に結合する
有機化合物で被覆した熱安定な反応容器に移す工程、
（ｄ）試料が約４〜５０℃の温度範囲で少なくとも１０
秒間インキュベートされる工程、（ｅ）反応容器から上
清を除去し、該容器を適当な反応緩衝液で数回洗浄する
工程、（ｆ）逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する少なくと
も１つの酵素及びヌクレオチドを含む混合物を添加する
工程、（ｇ）該容器を約３０〜７５℃で適当な時間イン
キュベートする工程、（ｈ）混合物を除去し、容器を洗
浄緩衝液で洗浄する工程、（ｉ）少なくとも１つの熱安
定ＤＮＡポリメラーゼと２つの特異的プライマーとヌク
レオチドを含む別の混合物を添加し、反応容器を増幅を
支持する条件下でインキュベートする工程、及び（ｊ）
該ｍＲＮＡを決定する工程。 - 【請求項２】 一方が逆転写酵素（ＲＴ）活性を有し、
他方がＤＮＡポリメラーゼ活性を有する両酵素を、ＲＴ
活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の二面的機能を有する熱
安定酵素に置き換えることにより、ＲＴ反応後中間の洗
浄工程なしに直接ＤＮＡ増幅を行うことを特徴とする請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 試料材料が全ＲＮＡ、培養細胞、動物も
しくはヒト起源の組織細胞又は植物抽出物よりなる混合
物であることを特徴とする、請求項１又は２記載の方
法。 - 【請求項４】 溶解緩衝液及び／又はハイブリダイゼー
ション緩衝液が、ジスルフィド基の還元物質、ｐＨ７．
０〜ｐＨ８．５の間で緩衝する物質、及び界面活性剤す
なわち変性剤、及び必要ならばＲＮアーゼ阻害剤を含む
ことを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項５】 該緩衝液が０．５〜１５．０％（ｗ／
ｖ）のドデシル硫酸塩又は１〜７Ｍのグアニジニウムチ
オシアネートを含むことを特徴とする、請求項４記載の
方法。 - 【請求項６】 ハイブリダイゼーションパートナーがビ
オチンで標識され、かつ、反応容器がストレプトアビジ
ン又はアビジンで被覆されていることを特徴とする、請
求項１〜５いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 オリゴ（ｄＴ）誘導体又はオリゴ（Ｕ）
誘導体又はＰＮＡ誘導体が標識ハイブリダイゼーション
パートナーとして使用されることを特徴とする、請求項
１〜６いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 １５〜３０マーのヌクレオチドプローブ
が使用され、及び／又はハイブリダイゼーションが約３
７℃で１〜１０分以内で行われることを特徴とする、請
求項１〜７いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 ５ｐｍｏｌ以下のポリ（Ａ／ｄＴ）ハイ
ブリッドを含む一部がストレプトアビジンで被覆された
相当するサイズの反応容器内に添加されることを特徴と
する、請求項６〜８いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 逆転写のために、混合物が０．０１〜
５．０Ｕ／μｌのＡＭＶ逆転写酵素又はＭ−ＭｕＬＶ逆
転写酵素、ＳＨ試薬、ＲＮアーゼ阻害剤、カリウムイオ
ンとマグネシウムイオン及び適当な緩衝物質を含むこと
を特徴とする、請求項１〜９いずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１１】 ＲＴ反応が約３５℃〜４５℃で行われ
ることを特徴とする請求項１又は１０記載の方法。 - 【請求項１２】 ５〜３００ｍＵ／μｌの熱安定なＤＮ
Ａポリメラーゼ、それぞれ約０．１〜１．０ｐｍｏｌ／
ｌの特異的プライマー、約０．０５〜０．６ｍＭのｄＮ
ＴＰｓ、適当なＰＣＲ緩衝系及び、必要ならばマグネシ
ウムイオンの存在下で、ＰＣＲが行われることを特徴と
する、請求項１〜１１いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 ＲＴ活性及びＤＮＡポリメラーゼ活性
を示し、熱安定な酵素が使用され、かつ、ＰＣＲ反応を
支持する条件下で約５分〜１時間インキュベートされる
ことを特徴とする、請求項１〜９いずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１４】 以下の組成物よりなるｍＲＮＡの検出
のためのキット、（ａ）溶解緩衝液及びハイブリダイゼ
ーション緩衝液、（ｂ）ポリ（Ａ）に相補的な配列を有
する標識ヌクレオチドプローブを有する緩衝溶液、
（ｃ）洗浄緩衝液、（ｄ）逆転写活性を有する酵素を含
む混合物、（ｅ）少なくとも１つの熱安定なＤＮＡポリ
メラーゼを含む混合物、及び（ｆ）少なくとも１つの被
覆された、熱安定なＲＮアーゼフリーの反応容器を有す
る装置。 - 【請求項１５】 ＲＴ活性及び熱安定なＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を持つ酵素を含む酵素混合物が使用されること
を特徴とする、請求項１４記載のキット。 - 【請求項１６】 オリゴ（ｄＴ）プローブがビオチンで
標識され、かつ、反応容器がストレプトアビジン又はア
ビジンで被覆されていることを特徴とする、請求項１４
又は１５記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19526431.2 | 1995-07-21 | ||
| DE19526431A DE19526431A1 (de) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | Verfahren und Reagenz zur spezifischen Bestimmung von mRNA |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0928398A true JPH0928398A (ja) | 1997-02-04 |
Family
ID=7767284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8209144A Pending JPH0928398A (ja) | 1995-07-21 | 1996-07-18 | ｍＲＮＡの特異的決定のための方法と試薬 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5955271A (ja) |
| EP (1) | EP0754764B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0928398A (ja) |
| AT (1) | ATE236995T1 (ja) |
| CA (1) | CA2181417C (ja) |
| DE (2) | DE19526431A1 (ja) |
| ES (1) | ES2193215T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6004755A (en) * | 1998-04-07 | 1999-12-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Quantitative microarray hybridizaton assays |
| AT414209B (de) * | 2000-03-17 | 2006-10-15 | Greiner Bio One Gmbh | Sammelgefäss für flüssigkeiten |
| US20030098271A1 (en) * | 2001-11-26 | 2003-05-29 | Ralph Somack | Capsule and tray systems for combined sample collection, archiving, purification, and PCR |
| CN1316036C (zh) * | 2003-01-06 | 2007-05-16 | 徐定邦 | 一种以聚合酶链式反应为基础的基因定量方法 |
| WO2005003346A1 (en) * | 2003-06-06 | 2005-01-13 | Applera Corporation | Purification device for ribonucleic acid in large volumes, and method |
| WO2010088517A1 (en) * | 2009-01-30 | 2010-08-05 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and systems for purifying transferring and/or manipulating nucleic acids |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5354657A (en) * | 1988-01-12 | 1994-10-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the highly specific detection of nucleic acids in solid |
| IE64286B1 (en) * | 1988-05-25 | 1995-07-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable vessel therefor |
| GB8827160D0 (en) * | 1988-11-21 | 1988-12-29 | Apothekernes Lab | Detection & quantitative determination of rna & dna |
| JP3046837B2 (ja) * | 1989-03-10 | 2000-05-29 | バイシス・インコーポレーテツド | 固定化されたオリゴヌクレオチドのプローブおよびそれらの使用 |
| KR920700360A (ko) * | 1989-03-22 | 1992-02-19 | 하리크 프리드리히 | 미끄럼 베어링 |
| DE69232753T2 (de) * | 1991-11-01 | 2003-05-15 | Diatech Pty. Ltd., Brisbane | Feststoff-phase erweiterungsverfahren |
| EP0675965A4 (en) * | 1992-01-29 | 1999-01-20 | Hitachi Chemical Co Ltd | CARRIERS FOR IMMOBILIZING POLYNUCLEOTIDES. |
| US5424189A (en) * | 1993-03-05 | 1995-06-13 | Kansas State University Research Foundation | Bovine respiratory syncytial virus detection and primers |
| JPH06261800A (ja) * | 1993-03-10 | 1994-09-20 | Hitachi Ltd | Ｒｎａウィルスの検出方法 |
-
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- 1995-07-21 DE DE19526431A patent/DE19526431A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-07-17 CA CA002181417A patent/CA2181417C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-18 AT AT96111586T patent/ATE236995T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-07-18 DE DE59610324T patent/DE59610324D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-18 EP EP96111586A patent/EP0754764B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-18 JP JP8209144A patent/JPH0928398A/ja active Pending
- 1996-07-18 ES ES96111586T patent/ES2193215T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-22 US US08/681,015 patent/US5955271A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
| EP0754764A2 (de) | 1997-01-22 |
| CA2181417A1 (en) | 1997-01-22 |
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| CA2181417C (en) | 2009-09-22 |
| ES2193215T3 (es) | 2003-11-01 |
| DE19526431A1 (de) | 1997-01-23 |
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| DE59610324D1 (de) | 2003-05-15 |
| ATE236995T1 (de) | 2003-04-15 |
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